JPH05500817A - マイコバクテリウムケロナエの極性糖ペプチド脂質に基づく免疫刺激薬 - Google Patents
マイコバクテリウムケロナエの極性糖ペプチド脂質に基づく免疫刺激薬Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
マイコバクテリウム ゲロナエの極性糖ペプチド脂質に基づく免疫刺激薬
1叫立欠ヱ
本発明は、活性成分としてマイコバクテリウム ケロナL止匹吐旦困し憇ユ鳳旦
ユ射の極性糖ペプチド脂質(GPLp)を有する新規な免疫刺激薬に関する。
九肌立!遣
本発明は、活性成分としてマイコバクテリウム ケロナエ(H cobacte
riulIlchelonae)の極性糖ペプチド脂質(GPLII)を有する
新規な免疫刺激薬に関する。
非定型マイコバクテリアの細胞壁に存在するGPLI)は、高い種特異性を有す
ることが知られている。
GPLは脂肪酸、ペプチドおよび糖を結合する化合物である。
GP[についての広範囲な研究が、マイコバクテリアを分類しかつ同定すること
を自損して行われてきた。
において、非特異的マイトジェン(mitoqen)によって引き起こされた増
殖応答の減少を示した(ブラウンバックおよびバロウ(Brownback a
nd Barrow)、インフエクションアンド イムニティ、第56巻、10
44〜1050頁、1988年(Infectionand Illunity
, 56.1044−1050.1988)参照)。同じ研究者らは、細胞かイ
ン ヒト口(in VitrO)で上記のGP[pおよびマイトジェンで共同刺
激されたfco−stinu lated)ときに、これらの細胞の増殖応答の
減少を示した。
免疫適格細胞における生きたM.ケロナエの免疫刺激特性が証明された(ビオラ
イ(Biozzi)ら、Rev. Franc。
Etudes Clin.Biol.、 5, 867−890 (1960)
;ビレットおよびゴレット(Pilet and Goret) − J.R
etiCIJIOendOth. Soc.。
九五二!刃
本発明に関連して、M.アビウムとは違ってM.ケロナほとんどの非定型マイコ
バクテリアのGPLは、共通して次のような構造を有することが知られている:
PheーaThr一八la−Alaniへolここで、PheのN−末端アミノ
基は長鎖脂肪酸でアシル化されており、アラニノール基は糖に結合しており、そ
してアロ(alto)一スレオニン基(aThr)は糖に結合しているかく非極
性GPLの場合》、またはオリゴ糖に結合している( GPLp の場合)、こ
の糖ペプチド脂質構造は同じであり、特に14AIs (マイコバクテリウム
アビウム l1ll胞内 スクロフラセウム(scrofu Iaceull)
)複合体におけるすべてのマイコバクテリアおよびマイコバクテリウム ケロ
ナエの2つの亜種においてそうである(ブレナンおよびゴーレン(Brenna
n and Goren) 、J.Biol. Chem.、254. 420
5−4211(1979) ;ブレナン[Brennan) 、Rev. In
fect. Dis.、 3。
905−913 (1981) ;ブレナン(Brennan)−ザ マイコバ
クチ(κubica and Wayne)m、マーセル デツカ−(Harc
elDekker) 、ニューヨーク アンド バーゼル(New Yorka
nd Basel)、467−489 (1984) 、ファンDsang)ら
、匪J.S st. Bacteriol.、34.35−44 ;ならびにア
セリニューアンド アセリ:ーユ−(Asselineau and Asse
lineau) − +F’マイコバクテリア:ア ソース ブック、クビカ
アンド ウニイン編、マーセル デツカ−、ニューヨーク アンド バーゼル、
345−360 、(1984)参照)。
M.ゲロナエのGPLDは、上記引用文中にファン(TSanQ)らによって述
べられた.非定型マイコバクテリアにおけるGPLDの種の変化はオシド部分(
osidic part)に関係するので、同じ著者はy.ゲロナエにおけるオ
シド部分を研究し、オリゴ糖について次の構造を提示した:3,4ージー0ーメ
チルラムノースー(1−>?)一ラムノース−(α−1−) 2)−6−デソキ
シタロース。
aptpは、薄層クロマトグラフィ−(上記引用文中ファンら)およびELIS
A法(ヤナギハラら、1985 J. CIin。
Microbiol.、21, 569−574)によって、M.7オーツイタ
ムfH,fortuitun) −M 、ケロナエ複合体においてM、ゲロナ玉
を同定および区別する際に用いられた。
本質的に、M、ゲロナエのGPLIIは、式1に一致する;R−Co−NH−0
,−Phe−D−aThr−D−^1a−L−Alaninol−0−糖オリゴ
糖
ここで、Pheはフェニルアラニンを表し、aThrはアロ(allo)〜スレ
オニンを表し、Alaはアラニンを表し、
糖は3,4−ジー0−メチルラムノースであり、オリゴ糖は次の横道を有する:
3.4−ジー0−メチルラムノース−ラムノース−6−デソキシタロース、およ
び
R−CO−は脂肪酸のアシル基であり、ここで、3,4−ジー0−メチルラムノ
ース基は、aThrおよびアラニノールのそれぞれにグリコシド結合によって結
合され、そしてアラニンのC末端C0OH基はアミド結合によってアラニノール
に結合される。
オリゴ糖についての最も正確な横道は、上記したようにファンらによって与えら
れたものであるか、それにおいてラムノースとジメチルラムノースの間の結合の
位置は知られていない。
天然のGPLpにおいては、オリゴ糖部分の糖はアセチル化されている。
のGPLにおけるように、脂肪酸の性質は培地、温度および培養期間に依存する
(例えばラドレッジ(Rat 1edae)、1982−「リピッド:セル コ
ンポジション、ファティ アシッドバイオシンセシスfLipids: Ce1
l Co1position、 Fatty^cid Biosynthese
s)」、「サ バイオロジー オブ ザマイコバクテリア(The Biolo
gy of the Hycobacteria) 4中、第1巻、ラドレッジ
アンド スタンフォード(Ratledge and 5tanford)編
、アカデミツク プレス(Acader6+ic Press)、ロンドン(L
ondon)(1982)、53−93 、および上記に引用した参考文献を参
照)。
天然GPLI)は実際には式1の成分の混合物であり、ここで脂肪酸のアシル基
R−CO−は可変性である。これらの脂肪酸は少なくとも16個のC原子、かつ
一般には36個より少ないC原子を有する。
したかって、本発明の原則特許請求した内容は、活性成分として少なくとも1の
、M、ケロナエのGPLDまたはその誘導体が免疫刺激剤として活性なM、ケロ
ナエのGPLDの誘導体を含む免疫刺激薬を含む。
本発明の薬に存在するGPLDは、少なくとも部分的に精製された、公知の方法
にしたがって得られたM、ケロナエの細胞壁からのGPLpの抽出画分を含むこ
とができる。但し、本発明を、M、ケロナエからのGPLpの唯一の供給源とし
て、生きているもしくは殺したM、ケロナエ、またはM5ゲロ力王の細胞壁全体
または細胞壁の断片を含む薬に広げるものではない。
少なくとも部分的に精製されたGPLpの抽出画分(この画分は本発明の薬にお
いて活性成分として使用される)は−M、ゲロナエの細胞壁からのGPLの抽出
物であることができ、この抽出物は例えは冷メタノール、特に+4°Cのメタノ
ールに可溶である。
これらは特に、18〜50°Cでクロロホルム対メタノールの比2:1の混合物
の助けによってM、ゲロナエの細胞もしくは細胞壁から抽出により得ることがで
きるGPL画分であり、この両分は冷メタノールに可溶である。例えはメタノー
ル対クロロホルムの体積比が少なくと65:1であるように、冷メタノール(4
℃)の添加後に可溶なままである。これらの両分はまた、先に示したように抽出
とそれに続くシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによる精製によって得るこ
とができる。
本発明の目的は特に、活性成分として少なくと61の式1の化合物またはその活
性誘導体を含む薬である。
本発明の薬に存在するGPLDは、単に天然にアセチル化されたGPLDである
必要はなく、GPLpの活性誘導体、特に対応する脱アセチル化(de−ace
tylated)誘導体であることかで本発明の薬の活性成分を構成するGPL
OまたはGPLOの誘導ンから得られるニ
ー−NCTC(ナショナル コレクション オブ タイプ 力ルチャーズ(Na
t、Co11ection of Type Cu1tures) )−−AT
CC(アメリカン タイプ カルチャー コレクション(^ier、 Type
Cu1ture Co11ection) ) (米国)、寄−−CIPT
(コレクション インスティテユート パスツール チューバーキュo−ス(C
ollection In5titutPasteur Tuberculos
e))、(パリ、フランス)、寄託番号140420019 (M 、ケロナエ
ブスピーシーズゲロナx (H,chelonae 5ubs 、 chel
onae) ) ;−−CIPT(コレクション インスティテユート パスツ
ール チューバーキュo−ス(Collection In5titutPas
teur Tuberculose))、(パリ、フランス)、寄託番号140
420020 (M 、ゲロナエ サブスピーシーズ二A立二之二区−上工匝旦
皿り旦迩l」迫阻且且且)M、ゲロナエは、ローエンシュタインーイエンセン培
地(Lowenstein−Jensen l1ediu11) (パリのイン
ステ、イテユートパスツール)に保持するこ・とができ、ルーボトル/Roux
bottle)においたサラトン培地(Sauton 1lediu11)に培
養することができ、次いで1.5%のバクトーアガー(Bact。
−ager) (ディフコfDifco) )を添加することにより凝固させる
ことができる0M、ケロナエはまた、発酵装置で、またはフィルム培養の助けに
よって、または任意の他の類似の方法でも培養することができる4
M、ゲロナエからGPL(lを抽出する方法は、上記したようにそれ自体公知で
ある。それは、生きているもしくは殺したバクテリアまたはバクテリ≠の壁から
脂質複合体の全体を抽出することから成る。抽出は、バクテリアまたは凍結乾燥
したバクテリアに接触される、例えばクロロホルムとメタノールの混合物の助け
によって、成し遂げることができる。
次に、少なくとも部分的に糖脂質、カロチノイドおよび遊離の脂質を除去するこ
とができる9例えば、すべての脂質複合体のクロロホルム溶液に、多重の冷メタ
ノールを添加することにより進めることができる。これによって、いくらかの糖
脂質、カロチノイドおよび遊離の脂質の沈殿が引き起こされる。 GPLpおよ
び非極性GPL −リン脂質および残留している遊離の脂質が溶液中に残る。
この段階で、公知のやり方で、希釈したまたは穏やかなアルカリで処理すること
(NaOHのメタノール溶液の添加)によって脱アセチル化を進めることは有効
である2例えば、0,2MのNaOHのメタノール溶液を、複合体がクロロホル
ムとメタノールの混合物(2:1)の溶液中にあるところの前段階から得た脂質
複合体に添加する。ここで、添加するNaOH−メタノール溶液の体積は、脂質
複合体の溶液の体積に等しい。脱アセチル化は、マイコバクテリアのGPLに特
異的であり、これは脱アセチル化をさらに越えた分解(degradat 1o
n)に抵抗する。一方、除去したい他の脂質(リン脂質、カロチノイドおよび他
の望ましくない脂質)は分解される。このように脱アセチル化は、カラムもしく
は薄層クロマトグラフィーにより所望のGPLの分離およびさらに精製を促進す
る。アルカリ処理の後、混合物を酸、例えば濃酢酸で中和する。この段階で有機
相を、クロロホルム、メタノールおよび水(4:2:1)の混合物または同様の
混合物で洗浄することは有利である。次に、洗浄した有機相を、カラムクロマト
グラフィーにより、または上記引用文中のファンらの方法により、またはJ、
Chronato。
工377ユ345−349 (1986)のディミドリヤピッチ(Diiitr
ijevich)らの方法により、精製に供することができる。
この方法でM、ゲロナエのGPLI)を含む、部分的に精製された両分を得るこ
とができる。カラムクロマトグラフィーにより、次のものを分離できる:アルカ
リ処理による分解を逃れた望ましくない脂質、GPLDおよび、場合により、ト
レハロースを含む糖脂質(これらは冷メタノールでの沈殿を行わなかった場合に
存在する)。
M、ゲロナエの非極性糖ペプチド脂質は、溶媒の最前部近くの両分であり、TL
Cのオルシノール試験で桃色がかった黄色に着色される。それらは種特異的では
ない(例えば上記引用文中のファンら参照)。
種特異的であるM、ケロナエのGPLpは、溶媒の最前部から遠い画分てあり、
薄層クロマトグラフィー(TLC)でのオルシノール試験において、M、ケロナ
エ サブスピーシーズ ケロナx fH,chelonae 5ubsp、 c
helonae) cf)場合は金色がかった栗色に着色され、M、ゲロナエ
サブスピーシーズ アブセラシュス (H,chelonae 5ubso、
abscessus)の場合は暗橙色に着色される(例えば上記引用文中のファ
ンら参照)。
本発明の組成物の活性成分はまた、少なくとも1の、ペプチドおよび糖合成の古
典的手法にしたがう合成もしくは半合成によって得られた式1の化合物であり得
る。
本発明の組成物は慣用のガレヌスの方法(qalenic!1ethod)にし
たがって調製される。
GPLoもしくはこれを含む抽出画分は、適当な液体媒質中で、波長8ミクロン
およびaptp濃度1〜20 B/nlで20〜50分間、超音波の作用にさら
して生成物を均質化することができる。
本発明の組成物における活性成分(GPLD)は一般に、組成物の総重量に対し
て0.07〜81量%の量で存在する。
本発明の組成物は、特に、適当な液体薬剤媒質中の懸濁物として提供され得る。
この懸濁物は、薬剤に使用し得る界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、例え
ばソルビタンポリオキシエチレンモノオレエート(例えば商標Tween80)
を含むことができる。液体組成物は、任意的に凍結乾燥前を添加して凍結乾燥に
供することができ、凍結乾燥しな形で貯蔵することができ、そして使用時に再構
成することができる。使用の準備かできた時の液体組成物は一般に、0.2〜8
011g/nlのGPLpを含む(使用する投与の方法に依存する)。
懸濁物はまた、0.2体積%までの界面活性剤を含むことかできる5本発明の組
成物は一般に、有効量の通例の防腐剤、例えはメルチオレート(nerthio
late)を含むことができる。
本発明の組成物は、特に、飲用に適したもしくは注射可能な懸濁物の形状のまた
は局所用の施与のための組成物、または鼻もしくは結膜による投与のための組成
物であり得る。
本発明の組成物はまた、ゲルカプセル、錠剤、粉末、生薬、歯肉のペースト、ま
たはクリームの形状でも提供されのGPLDは、有機体の非特異的防御の刺激剤
である。それはまた、特異的な免疫反応を非特異的に刺激することができる(補
足の効果)。
本発明の組成物はこのように、人間または動物において免疫刺激薬として使用可
能である。それはまた、特に、ワクチンにより与えられた免疫を促進するための
アジュバントとして、および抗生物質療法の強化剤としても使用可能である。
本発明の組成物はまた、動物および人間における成長因子および/または同化因
子として使用できる。
それは特に、非経口の方法(例えば腹膜精織内の、皮下の、筋肉内の、静脈内の
、経皮の方法)により、口により、鼻により、結膜的に、直腸により、または舌
により(perl ir+aual ly)投与され得る。
それはまた、特に口内の空洞の疾患(歯槽m漏、歯肉炎、歯根膜炎(per”1
doriti t is)等)の非特異的免疫療法において、口内に入゛れると
分解する歯肉のペーストまたは錠剤の助けによって、局所的に使用されることも
できる。
通常の薬量学では、1回以上の投与で例えば1日当たり0.1〜12、好ましく
は0.5〜10 ng/kg体重でありうる0例えば最も頻繁の投与では、非経
口投与について0 、5〜3u/ltg 、0ニよれば4〜10ng/kg 、
および鼻への投与では2〜4 u/kqである。本発明の薬は、特に、二次的な
免疫疾患の場合に免疫刺激処置として;局所または全身の伝染病において補助薬
処置として;特に抗ウイルス処置に関連してエイズの補助薬処置として;寄生虫
病または癌の状態の場合の補助薬処置として;および抗癌療法の免疫抑制効果(
特に白血球減少症により証明されたもの)のための矯正的処置として、効果的な
投与量で投与される。
本発明の薬はまた、上記した種々の場合において、予防法として、特に耳鼻咽喉
科学領域での再発感染防止のために、また慢性病状態における感染の危険防止の
ために、ならびにワクチンにおけるアジュバントとしても投与され得る。
それはまた、動物および人間の体重の増加または減少を促進するために使用する
こともできる。
M、ケロナエのGPLI)は、特に、成長および/または感染への抵抗を促進す
ることを意図して、動物に食物添加物として使用することもできる。
本発明の主に特許請求された内容のさらなる要素は、非特異的免疫刺激薬または
同化作用薬の調製における活性成分としての、またはワクチ゛ン製造の際のもし
くは栄餐組成物製造の際のアジュバントとしての、前記したような性エゲロナエ
のGPlpの使用である。
本発明は特に、抗癌療法の免疫抑制効果(例えば化学的に誘発された白血球減少
症)を正すことを意図して、非特異的免疫刺激薬の調製における活性成分として
、M、ゲロ−f−xのGPlpを使用することに関する。
以下の実施例により本発明を説明するが、いかなるやり方でも本発明を限定する
ものではない:マイコバクテリウム ケロナエ サブスピーシーズ ヶロナl−
(HC0baCteriLIl chelonae 5ubsp、 chelo
nae を、上記した培地で35゛Cで、安定した状態になるまで培養した9次
に、5eooxuでの遠心分離によりこれを集め、洗浄した0次いで細胞を乾燥
しもしくは凍結乾燥し、その後できるたけ短い時間内に抽出を行った。
すべての脂質イ合物の抽出。
およびゴーレフ(Brennan and Goren) 、J、Biol、
Chem、。
vol、254. No、10.4205−4211 (1979)により述べ
られたのと同様の手法で行った。
抽出には、凍結乾燥したマイコバクテリア グラム当たり混合物4011の量で
、クロロホルム:メタノール 2:1混合物を使用し、熱水浴中に浸したフラス
コ中で50°Cで18時間行った。抽出物は、ワットマン紙No、3で濾過する
ことにより回収した。残渣を、同様の方法だがたった4時間続けただけの方法に
より、二次的な抽出に供した。
抽出物を一緒にして、溶媒を蒸発させた。乾燥抽出物を次の段階まで+4℃で貯
蔵した。
糖脂 、カロチノイドおよび遊離の脂質の除去全脂質複合体を十分な量のクロロ
ホルムで溶解し、実質量のメタノールを÷4°Cで添加した。沈殿が観察された
。
メタノールの量は、さらにメタノールを添加してもさらに沈殿を引き起こさない
ほど十分でなければならない。この沈殿は糖脂質、力ロチノドおよび遊離の脂質
を含む。G P L p、非極性GPL 、リン脂質および池の遊離の脂質が溶
液中に残存した。
遠心分離により沈殿を除去した後、上澄の溶媒を蒸発さ先の段階で生成物を蒸発
して得られな残渣を、穏やかなアルカリ処理(脱−アセチル化)に供し、得られ
た混合物を、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物で洗浄しな。
この目的のために、前の段階で得られた残渣を−クロロホルム:メタノール 2
:1の混合物に再び溶解させ一等量の0.2MのNaOHメタノール溶液を添加
した。37°Cで30分後、この混合物を12.5μm / m lの濃酢酸で
中和し、次いで洗浄した。洗浄混合物は、クロロホルム:メタノール:水 4:
2:1であった。撹拌および生成した気体の放出後、この混合物を1時間静置し
た。水性相を捨て、有機相を抜き、蒸発に供した。残渣を4°Cで貯蔵した。
脂質複合体g当たりシリカゲル60(粒子径0.063−0.200 ml)
100 gを含むガラスカラムを調製した。方法は、上記引用文中のファンらの
方法と同様であり、ここで、純クロロホルムから始めてクロロホルム中のメタノ
ールの割合を増やしたものを使用することによって、成分を分離した。上記引用
文中のディミドリヤピッチらの方法を使用することも可能であり、そこでは、ク
ロロホルム中のメタノールの割合を固定して(10%)、クロマトグラフィーを
行う、流速は約1.511/分に固定した0画分を分析的TICにて分析した。
同じ移動性の両分を合わせ、重量を測定し、そして好ましくは4℃で貯蔵した。
薄層クロマトクラフィー(TLC):
使用前に110°Cで30分間加熱して活性化したTLCグレート(20x20
cnで厚さillのカラスプレート)(メルク(Herk))を使用した。
先の段階で得られた画分を、クロロホルム:メタノール2:1の混合物中にLO
ng/lに調整したう次にこの調製品を、グレートの低い方の端、がら1〜2c
lの位置に、等距離(最短でLcmの距M)の点に置いた。この点は、両端を引
き伸し、曲げたパスツールピペットを用いて形成した。
このプレートを次に、移動溶媒(60:12:1 /クロロホルム:メタノール
:水)を含むトレーに置いた4この溶媒がプレートの上の端より1または2cl
下に移動したとき、移動を終えた。プレートを空気を通したフード中で乾燥し、
現像試薬(developina reaqent)を噴霧した。 GPLpノ
ための試薬は、2度蒸留した水での40%硫酸水溶液中の0.1%の微粉状オル
シノールである。加熱キャビネット中で110〜130°Cで3〜1o分間加熱
した後、■、ゲロナエの特異的GPLI)か金色ががっな栗色に着色された。な
お、非極性糖ペプチド脂質は桃色ががった黄色に着色された。クロマトグラフィ
ーにより、単離した抽出物の純度を監視することができる。
GPLpの同定および純度の監視のために、以下の分析的方法を使用することが
できる:
IN、HClでの酸加 分解
IN HCIの存在下でのM、ゲロナエの特異的GPLpの酸加水分解により、
(ワットマン No、1での)ペーパクロマトグラフィーおよびカスフェースク
ロマトグラフィーによって同定することかできる特定の1!(メチルラムノース
、ラムノースおよびデツキシタロース)を遊離させることができる。
6N HCIでの酸加水分解
先の段階の残渣の6N HCIでの加水分解により、マイコバクテリアのGPL
の特定のアミノ酸を遊離させることができる。このアミノ酸はTLCにより同定
することかできる1M、ケロナエの場合、非定型のマイコバクテリアの場合のよ
うに、これらのアミノ酸はフェニルアラニン、アラニン、アラニノールおよびア
ロスレオニンである6IRスペクトルによるGPLpの分析
M、ゲロナエの脱アセチル化したG P、L pの分析は、上記引用文中のブレ
ナンおよびゴーレン(1979)により、および上記引用文中のブレナン(19
84)により記載されたものと類似して、糖ペプチド脂質のペプチド結合の特性
ピークを示す。
K土璽ユ
注射可Ff、の 遣
実施例1で得たGPLDをクロロホルムに再度溶解し、超音波処理管中で、窒素
雰囲気下で2度蒸発した。
生理的血清(例えば無発熱源の(apyrogenlc)s 、 5%NaCl
溶液)のような注射可能な溶液の製造のために適した液体に残渣を懸濁した。非
経口投与に適合性の界面活性剤、例えばTween 80 (商標)もまた、0
.1−0.2体積%の量で添加できる。この界面活性剤を添加する目的は、材料
の懸濁を促進するためである。
このようにして得られた懸濁物を次に、生成物を均質化する目的で、GPLDJ
度1〜20no/n lで、振幅8ミクロンにて約20〜50分間超音波処理に
供した。
注射可能な懸濁物は、他の許容できる媒質、例えは標準リン酸塩M養液または同
様の媒質を用いて調製することもできる。
GPLpLニア)4度は、投与に依存して、例えば0.2〜80mq/nlに調
整される。長期の貯蔵のためには、調製物は凍結乾燥した後、認め得る活性の損
失なしに生理的血清中に再構成されることができる6
乱臣■ユ
M、ゲロナエのGPLDの薬理“自試験実施例1で得られたGPLI)を用いて
これらの試験を行った。
1、リンパ ′″F−(l nphoblastic transfornat
ion)のための刺激的効果
この効果は、細胞における直接的効果(M、ケロナエのGPLf)であらかじめ
処理したマウスの胛細胞および胸腺細胞のリンパ球芽球転換における増加によっ
て)または間接的効果(マイトジェンに対する増殖応答における増加)によって
評価される。これらの効果は、トリチウム化したチミジンの組み込みを経て測定
される。
この試験は、メスのBa l b/c マウスに行った。
生成物を、動物5体の群に、経口により12u/kgで、または皮下に2.51
′Og/kgで、各3日間隔で4投与(経口)または3日間隔で3投与(皮下)
の方針で投与した。対照群は溶媒のみで処理した。
畝上:
GPLpは、皮下の処理(P≦0.001)および経口処理(P≦0.05)に
おいてマウスの牌MU版のリンパ球芽球転換を刺激した。
マイトジェンに対するマウス牌細胞の応答は、コンカナバリンA(ConA、I
BF−LKB) (P≦0.02);植物性血球凝集素(PHA;Difco)
(P≦0.01) ;およびリボ多糖B(LPS。
Difco)(P≦0.001)について、皮下刺激において増加した。
そのような増加はまた、同じ3種のマイトジェンについて、経口刺激においても
観察された(ConA 、 PHAおよびLPSについてP≦o、ooi)。
マイトジェンに対するマウスの胸腺細胞の応答もまた、コンカナバリン Aおよ
びLPSについて、著しく増加した(ConA 、PHAおよびtpsにライて
P≦0.001)。
マクロファージか免疫刺激効果を有する抗原またはマイトジェンと接触すると、
モノカイン(インターロイキン−1および腫瘍壊死因子、TNF )の分泌によ
り応答する。腹膜マクロファージによるモノカインの誘発の試験はこのように、
これらの細胞における免疫刺激生成物の効果を評価する方法である。
級1:
あらかじめGPLIIで処理したマウスからの腹膜マクロファージのtpsでの
活性化は、C3H/Hej マウス(LPSに敏感でないマウス)の胸腺細胞の
転換において、インターロイキン−1(IL−1)の活性の非常に著しい誘発(
107単位/llに等しい)を示したう
これらのマクロファージの上澄はまた、TNFの作用に敏感である、w1#Ik
系統[929の4fl胞に毒性効果を有する( 20000単位/mlに等しい
量)。
3日間隔で各3投与で、2.5ng/kaの投与量でのGPLpによるBa l
b/c マウスの腹膜組織内刺激は、これらの動物の血清にTNF活性の著し
い誘発をもたらし、これはII癌糸系統929の細胞への毒性(34000単位
/1に等しいTNFの址に対応する毒性)により評価した。
イン ビボまたはイン ビトロで、1III1111胞を免疫刺激効果を有する
抗原またはマイトジェンと接触させると、リンホカインの分泌により応答する。
最も知られているリンホカインはインターロイキン−2(It−2)であり、こ
れはI[−2依存性細胞毒性Tリンパ球の系統(マウス胸腺腫) (CTLL−
2)の生存および繁殖のために不可欠である。
虹1:
2.5u/kqの投与ff1(3日間隔で各3投与)でのapt、pによるBa
1b/c マウスの皮下の刺激は、48時間後に牌細胞の上澄に測定されるIt
−2活性の著しい徴候を与えた<5.55単位/nlに等しい量)。
遅延型過敏性反応<H3R>は1.初期の静脈感作に続いて、(足底の内証に)
局所的に注入されたアレルゲンにより誘発される。動物が、Tリンパ球に作用す
る非特異的免疫刺激剤で処理されると、アレルゲンが2回目に局所的に導入され
たときに、遅延型過敏性が増加することが観察される。
この試験では、アレルゲンの第2の注入に続く足底の内証の体積の増加を分析す
る。使用したアレルゲンは羊の赤血球であった。(腹膜組織内または皮下に)研
究した生成物でマウスを最後に刺激した2日後、およびDHR試験試験前日前こ
れらを静脈に注射した。刺激したマウスは試験生成物を(腹膜組織内または皮下
に)、−8日、−5日および一2日の各日に2 、5 ig/kgの投与量で受
けた。対照マウスは、標準食塩水のみを受け入れた。0日には、すべてのマウス
が静脈に百方の羊赤血球の単一投与を受けた。
+4日には、マウスは足底の内証に注入した羊赤血球1083日間隔で3回投与
した生成物によるC57BL/6マウスの腹膜組織内および皮下刺激は、(72
時間で1リ一デイングfreading)を除いた)対照マウスに関してDHR
を増加させ(P≦o、ooi > 、その増加量は、BCGによるものに匹抗体
応答の程度は、抗原の性質および免疫系の性質および条件に依存する。免疫系が
免疫!lIl激剤によって、またはアジュバントの存在下での抗原によって刺激
されると、抗体応答は増加する。行った試験において、GPLpのこの性質を、
C47BL/6マウスの羊赤血球に対する抗体応答により分析した。ここで、マ
ウスは試験生成物であらかじめ刺激しておいた。処理されたマウスは、−8日、
−5日および一2日の各日に2゜5 u/kgの投与量で、腹膜組織内および皮
下に試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清のみを受けな。
0日には、各マウスは羊赤血球106の単一静脈内投与を受けた2次いで0日〜
+43日に血清試料を取り、これらを羊赤血球溶血能について試験した。
紅玉:
3日間隔で3回投与したGPLDによるC57BL/6マウスの静脈および皮下
刺激は、腹膜組織内刺激の場合には7.11および25日に取った血清試料につ
いて、また皮下刺激の場合には7.20および25日に取った血清試料について
、羊赤血球の抗体応答の非常に著しい増加を引き起こした。
6、Q先1肱1五工1
a)マウスにおけるタレブジーラ ニューモニアエklebsiella pn
eumoniae)による感染に対する防護試@:マウスに特に適合したに、ニ
ューモニアエ(K、 pneuloniae)の腹膜組織内への注入は−24−
48時間以内に致命的な敗血症を引き起こす、試験は一対照に比べて処理したマ
ウスの生存時間を測定することにある。処理マウスは、−8日、−5日および一
2日の各日に2.511CI/kgの投与量で、腹膜組織内に試験生成物を受け
た。対照マウスは生理的血清のみを受けた。0日に、すべてのマウスは1つの適
当なに、ニューモニアエの腹膜組織内投与を受けた。その後、続く5日間に死亡
数を観察した61:
3日間隔で3回それぞれ2.51(]/kgの投与量でのGPLI)による腹膜
組織内刺激は、K、ニューモニアエの50x 1050で感染したCDIマウス
を非常に著しく防護した。事実、動物は試験中病気の徴候を全く示さなかった。
試験は、対照マウスに対して処理したB6D2/Flマウスの生存時間を測定す
ることからなる。
L−1210白血病細胞は、試験に先立って適切な培地で培養した。
処理マウスは、−8日、−5日および一2日の各日に2 、5 u/kqの投与
量で、腹膜組織内に試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清のみを受け入
れた。0日に各マウスは、生存能力のあるL−1210Al[l胞を106の投
与量で腹膜組織内への1回投与を受けた。生存時間を測定した。
級迷:
3日間隔で3回それぞれ2 、5 u/kqの投与量でのGPLDによる腹膜組
織内刺激は、L−1210白血病細胞を接種したB602/F1マウスの生存時
間を非常に著しく延長した。延長は、対照マウスの生存時間に関して33%であ
った。
7、マウスへの 下投与における同化作用の効果(anabolic elec
t)の評価3日間隔で3回それぞれ2 、5 ng/kgの投与量で、生成物を
皮下に注入した。マウスの重量を10日間毎日記録し、全体の重量増加を評価し
た。処理マウスは、−10、−7および−4の各日に2 、51g/kgの投与
量でGPLtlを受けた。
対照マウスは生理的血清のみを受けた。
(I:
3日間隔で3回それぞれ2 、51g/kgの投与量でのGPLpによる皮下刺
激は、Ba l b/cマウスにおいて著しい同化作用効果を有していたくP≦
0.02)。
8、マウスのイ学的に; された 血球2小症におけるGPLDの 白血球゛ノ
1症 果
この試験は、まずアドリブラスチン(Adriblastine)(ドクソルビ
シン クロロハイドレート ラクトース(doxorubicin chlor
hydrate 1actose)、アンスラサイクリン(anthracyc
linel類の群の細胞増殖抑制性の生成物)の助けにより、マウスに白血球の
涸渇(dep let 1on)を誘発することからなる。その後、同じマウス
を、これらの血液細胞か標準状態に復帰するまで、GPLDおよび正の対照とし
て使用した池の生成物(ケンサイム(Genzyle)により提供されたマウス
のGM−C3F ’)で処理した。
Ba1b/c7ウスを、0および+1の各日に、51g!J/kg/日(体積5
0μL)の量で静脈内に、アドリブラスチンで処理した。同じマウスは次に、0
.15 nlの体積で、GPLp、GM−C3Fまたは生理的血清を受けた。こ
の処理は、2.5.8.11.14.17および20日に行われた。それぞれの
動物において、0.2.5.8.11.14.17.20および28日に、循環
する白血球の計測を行った。
綾1:
Ba l b/cマウスのGPLpでの腹膜組織内刺激は、アドリブラスチンで
の前処理により誘発された白血球減少症を、マウスGM−CSFの場合に匹敵す
る程度に非常に著しく緩和した。
9、食細 作用の試 −m−コロイド状 素の除去におけL虹旦五遁1
この試験は、食細胞による血液からのコロイド状炭素の粒子の除去の動力学の研
究を可能にする4処理マウスは、−8日、−5日および−2日の各日に12 u
/kqの経口投与で試験生成物を受けた。対照マウスは生理的血清のみを受けた
。0日に、各マウスはゼラチン中4%の懸濁物においてコロイド状炭素(ペリカ
ン「エンフレ デ キネ」ブラック(Pelikan ”Encre de C
hine”、black))の単一静脈内投与を受けた。投与量は、161(1
/体重100qであった。0.2.4.6.8.10および12分の時間に、血
液試料(各0.02511)を取った。試料は、分光光度計により630ミクロ
ンの波長で測定した。これは血液中の懸濁物に残存する炭素粒子の測定を可能に
する。
級迷ニ
−8日、−5日および一2日の各日に12 In(1/klJの経口投与で、a
ptpでのCDIマウスの刺激は、コロイド状炭素の清掃に著しい増加を引き起
こした。
ヰ・幻ネ
acterium chelonae)の極性糖ペプチド脂質の少なくとも部分
的に精製された抽出画分を活性成分として含む薬剤組成物。この組成物は、人間
および動物における非特異的免疫を刺激するために特に使用することができる。
R−Co−NH−D−Phe−D−aThr−D−A 1a−L−A 1ani
no 1−0−糖オリゴ糖
国際調査報告
″′″″″″″1°8°m* HaρC工/FRQl /11+1jjQ
Claims (15)
- 1.活性成分として、少なくとも部分的に精製された、マイコバクテリウムケロ ナエ(Mycobacterimchelonae)からのGPLpの抽出画分 または、免疫刺激剤として活性な誘導体であるM.ケロナエのGPLpの誘導体 を含むことを特徴とする薬剤組成物。
- 2.少なくとも部分的に精製された画分が+4℃でメタノールに可溶な画分であ ることを特徴とする請求項1記載の組成物。
- 3.上記画分が、18〜50℃の温度でクロロホルム:メタノール2:1の混合 物の助けによって、M.ケロナエの細胞もしくは細胞壁の抽出によって得ること ができる画分であり、この画分は4℃のメタノールに可溶であることを特徴とす る請求項1記載の組成物。
- 4.活性成分として、少なくとも1つの次式1:【配列があります】(1) ここで、Pheはフェニルアラニンを表し、aThrはアロースレオニンを表し 、 Alaはアラニンを表し、 糖は3,4−ジ−O−メチルラムノースであり、オリゴ糖は次の構造を有する: 3,4−ジ−O−メチルラムノース−ラムノース−6−デソキシタロース、そし て R−CO−は脂肪酸のアシル基であり、ここで、3,4−ジ−O−メチルラムノ ース基は、aTHrおよびアラエノールのそれぞれにグリコシド結合によって結 合され、そしてアラニンのC末端COOH基はアミド結合によってアラエノール に結合される の糖ペプチド脂質を含むことを特徴とする前記請求項のいずれか1項に記載の組 成物。
- 5.R−CO−が、少なくとも16個の炭素原子を有する脂肪酸のアシル基を表 すことを特徴とする請求項4記載の組成物。
- 6.R−CO−が、36個未満の炭素原子を有する脂肪酸のアシル基を表すこと を特徴とする請求項5記載の組成物。
- 7.該脂肪酸が、1以上の二重結合および/または分枝および/またはベータ− ヒドロキシもしくはベータ−メトキシ置換基を含むことを特徴とする請求項5ま たは6に記載の組成物。
- 8.該誘導体が、脱アセチル化された誘導体であることを特徴とする前記請求項 のいずれか1項に記載の組成物。
- 9.上記の少なくとも1つの式(1)の化合物が、合成または半合成によって得 られるものであることを特徴とする請求項4〜8のいずれか1項に記載の組成物 。
- 10.ゲルカプセル、錠剤、粉末、坐薬、歯肉のベースト、もしくはクリームま たは、鼻もしくは結膜による投与に適した組成物の形状に製造されることを特徴 とする前記請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 11.液体薬剤媒体中の懸濁物の形状または凍結乾燥物の形状に製造される請求 項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 12.有効量の防腐剤および/または界面活性剤をさらに含むことを特徴とする 前記請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 13.活性成分を、組成物全重量に対して0.02〜8%の量で含むことを特徴 とする前記請求項のいずれか1項に記載の組成物。
- 14.非特異的免疫刺激薬もしくは同化作用薬の製造における活性成分として、 ワクチンの製造におけるアジュバントとしてまたは栄養組成物の製造における添 加物として、請求項1〜9のいずれか1項に記載の、M.ケロナエのGPLpの 少なくとも部分的に精製された画分を使用する方法。
- 15.抗癌療法の免疫抑制効果を矯正することを意図した薬の製造における請求 項14記載の方法。
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