KR100252197B1 - 세라시아 마르세센스 균주의 배양액으로 부터 분리한 면역억제제용 프로디지오신 - Google Patents

세라시아 마르세센스 균주의 배양액으로 부터 분리한 면역억제제용 프로디지오신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia Marcescens)의 배양액으로부터 분리한 하기 화학식(Ⅰ)로 표시되는 분자량 323인 면역억제제용 프로디지오신(Prodigiosin)에 관한 것으로 조직 및 장기이식 등의 면역억제를 필요로하는 치료분야에서의 면역억제약물로서의 이용 및 이들의 기초기전연구를 위한 면역억제 약물로서의 이용 나아가 프로디지오신의 면역억제효과를 응용한 면역학 기초연구를 위한 면역억제 시료로서의 이용에 관한 것이다.

Description

세라시아 마르세센스 균주의 배양액으로부터 분리한 면역억제제용 프로디지오신 {Prodigiosin purified from culture broth of serratia marcescens strain for immun inhibition agent}
본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescens)의 배양액으로부터 분리한 면역억제제용 프로디지오신 (Prodigiosin)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 조직 및 장기이식 등의 면역억제를 필요로 하는 치료분야에서의 면역억제 약물로서의 이용 및 이들의 기초기전연구를 위한 면역억제 약물로서의 이용 나아가 프로디지오신의 면역억제효과를 응용한 면역학 기초연구를 위한 면역억제 시료로서의 이용에 관한 것이다.
면역억제 물질은 면역세포 및 면역반응의 연구 및 면역억제를 필요로 하는 질환을 치료하기 위하여 최근 수년간 지속적으로 연구되어 왔으며 사이토카인 생성반응, T 세포의 활성화반응, 항체생성반응, 세포의 죽음, DNA 합성반응, 면역세포의 분화반응, 세포내의 신호전달반응 등의 모든 면역반응을 연구하기 위하여 면역억제 물질이 널리 사용되어 왔다. 또한 과민성면역반응, 알레르기 등 면역반응의 증대에 의해 발생하는 질환을 치료하기 위해서 면역억제 약물이 사용되고 있다. 그밖에도 신장, 간장, 췌장, 골수, 심장, 피부, 폐 등의 장기이식시에도 과도하게 일어나는 면역반응을 억제하기 위하여 면역억제제가 사용되고 있다. 현재까지 널리 사용되고 있는 면역억제제로서는 사이클로스포린 에이, 사이클로포스파마이드, 라파마이신, 에프케이506 등이며, 이들과 유사한 또는 다른 억제양상을 나타내는 새로운 면역억제제에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
한편 스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 세라시아(Serratia) 속의 미생물들은 피롤릴피로메텐골격의 붉은색 물질들을 생산하는데 이들 중에는 프로디지오신, 메타사이클로프로디지오신, 프로디지오센, 데스메톡시프로디지오신, 프로디지오신 25-C등이 포함 되어 있다. 이들 물질들은 항균제 및 항말라리아 등의 효과와 특히 프로디지오신 25-C는 면역억제작용이 있다는 것이 일부 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 프로디지오신의 치료적 응용을 위한 기초사실을 제공하는데 있다. 즉, 조직 및 장기이식 등의 면역억제를 필요로하는 치료분야에서의 면역억제약물로서 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 면역억제를 필요로 하는 질환의 기초기전연구에 프로디지오신을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 프로디지오신의 면역억제시료로서의 학문적 응용을 위한 실험적 사실을 제공하는데 있다. 특히 면역학 기초연구를 위한 면역활성억제물질로의 용도를 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 신규한 면역억제물질을 분리하기 위하여 우리나라 해안토양으로부터 신규한 미생물인 세라시아 마르세센스를 분리하고 이 균주의 배양액으로터 프로디지오신을 분리한 다음 면역억제효과를 규명하므로써 본 발명을 완성하였다. 이하, 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 설명한다.
본 발명은 미생물 균주를 분리하는 단계와; 이균의 균학적 성질을 규명하는 단계와; 유기용매 추출법, 실리카 겔 칼럼 및 박층 크로마토그래피를 이용하여 활성물질인 프로디지오신을 순수분리하는 단계와; 핵자기공명 시험을 통하여 구조결정을 하는 단계와; 프로디지오신의 면역억제물질 용도를 규명하는 단계로 구성된다.
본 발명의 프로디지오신의 면역억제 활성은 한국과학기술원 생명공학연구소 유전자원센터의 무균실험동물인 BDF1 및 B6C3F1 마우스를 이용하여 검증되었다. 프로디지오신의 면역억제 효과에 대한 생체외 실험결과, 프로디지오신은 300 nM 이상의 농도에서는 세포독성을 나타냈으나 100 nM 이하의 농도에서는 세포독성이 없었다. 세포독성이 없는 농도에서는 B 세포의 면역반응을 억제하지 못했다. B 세포의 항체생성 및 증식은 프로디지오신의 영향을 받지 않았다. 그러나 T 세포의 증식 및 활성은 강하게 억제되었다. 이와같은 T 세포의 선택적인 면역반응억제는 T 세포에 대한 선택적인 세포독성에 기인하지 않았다. 한편, 생체내 실험에서도 생체외 실험결과와 동일하게 면역반응을 억제했다. 이종이식시험계 및 T 세포 의존성 항체생성시험계를 이용해 T 세포의 활성을 측정했을때, 면역반응이 억제되었으며 동물에 대해서는 독성이 없었다. 따라서, 프로디지오신의 면역억제 효과는 프로디지오신이 T 세포의 활성을 선택적으로 억제하는 것으로 나타났다.
프로디지오신과 유사한 계열의 면역억제물질로서 구조식 및 분자량이 다른 프로디지오신 25-C는 T 세포의 증식을 억제하지만 B 세포의 증식을 억제하지 않으며 T 세포중에서도 CD8 T 세포는 억제하나 CD4 T 세포는 억제하지 않는 물질로 알려져 있다.
그러나 본 발명의 프로디지오신은 CD8 T 세포 뿐만아니라 CD4 T 세포의 면역활성도 억제하였다. 이와같은 면역억제현상은 기존의 면역억제제들과 비슷한 활성이다. 또, 현재 시판중인 면역억제 물질인 사이클로스포린 에이, 사이클로포스파마이드, 에프케이 506, 라파마이신 등은 T 세포의 면역반응을 선택적으로 억제하는 것들이나 본 발명의 프로디지오신도 상기의 면역억제제와 비슷한 활성을 나타내었다.
본 발명에서 사용한 시험계들은 프로디지오신의 면역학 기초연구에서의 응용에 대한 예시일 뿐 프로디지오신의 사용을 한정하는 것은 아니다. 현재 사용되는 면역억제제의 용도는 매우 다양하다. 예를 들면, 면역억제를 필요로 하는 질환치료 분야 및 기초연구분야가 그것이다. 조직 및 장기 이식시 수반되는 면역거부반응을 없애기 위해서도 면역억제 약물이 사용된다. 또 다른 응용분야는 면역세포와 관련된 기초연구분야이다. 사이토카인 연구, 면역세포 활성화 및 분화 연구, 세포내 신호전달 연구 등이 그 대상이 되고 있다. 사이클론스포린 에이, 사이클로포스파마이드, 에프케이506, 라파마이신 등이 이 분야에 사용되고 있다. 본 발명의 프로디지오신은 상기에서 언급한 면역억제제와 비슷한 활성을 나타내고 있으므로 상기의 여러 응용분야서 치료제 및 표준물질로 사용할 수 있다. 프로디지오신의 분자량은 323이며 구조결정결과 하기와 같은 화학식1을 갖는 화학물질로 확인되었다.
[화학식 1]
Figure pat00002
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위는 이에만 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 세라시아 마르세센스 균주의 분리 동정 및 프로디지오신의 분리
전라남도 목포지역의 갯벌 토양시료를 증류수에 단계적으로 희석하여 미생물분리배지(Yeast extract 0.1%, polypeptone 0.5%, K2HPO40.05%, KH2PO40.05%, MgSO4ㆍ7H2O 0.02%, Agar 1.5%, pH 7.2)를 멸균 후 50℃정도로 식힌 후 첨가항생제로 colistin 을 5㎎/ℓ 농도로 증류수에 녹이고, Nalidixic acid를 10㎎/ℓ농도로 메탄올에 녹인 용액을 멸균한 배지 1ℓ당 1㎖ 씩 넣어 굳힌 배지에서 미생물을 분리하여 활성 탐색계에서 활성이 있는 활성미생물의 성상과 당 이용도 등 특성을 조사한 결과 분리한 균주를 세라시아 마르세센스 B-1231로 명명하고 1997년 9월 19일 생명공학연구소 유전자원센터에 기탁하였다(KCTC 0386BP).
면역억제물질을 생산하기 위하여 본원발명의 생산 균주 세라시아 마르세센스 B-1231을 1 리터 용량 삼각 플라스크에서 28 ℃에서 62 시간 동안 배양하였다. 배지는 가용성 전분 1%, 파마메이드 0.5%, 포도당 0.2%, 황산암모늄 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7배 결정수 0.05%, 염화칼슘 0.1%, 염화나트륨 0.3%로 조성된 기초배지를 사용하였다. 배양초기 pH는 7.0이었다. 프로디지오신을 추출하기 위하여 발효액과 동량의 에틸아세테이트를 가하여 30분간 혼합한 후 유기용매층을 얻었다. 그 후 감압하에서 농축하여 적색의 물질을 얻었으며, 그 후 실리카겔 칼럼에서 클로르포름:메탄올액을 이용하여 활성물질을 분리정제 했으며, 실리카겔 박층크로마토그래피를 통하여 목적물질을 순수 분리하였다.
실시예 2: 프로디지오신의 면역세포에 대한 세포독성 생체외 실험
무균실험동물의 비장으로 부터 면역세포를 분리하였으며 생체외에서 배양했다. 프로디지오신의 농도를 3 nM 에서 30,000 nM까지 다양하게 처리하여 배양 첫날 부터 3일간 세포의 생존율을 측정했다. 그 결과는 하기 표 1에 나타냈다. 표 1에서 볼 수 있는 바와같이 300 nM이상의 농도에서 생존율이 감소했다. 각각 측정한 날에 프로디지오신 미처리군과 비교해 보면 300 nM이상의 농도에서는 면역세포의 생존율이 급격히 감소했다. 면역세포의 최초 생존율을 100%로 계산했으며, 각각 실험군의 생존율을 최초생존율에 대해 비율로 계산했다. 이하의 면역활성 실험에서는 면역억제효과만을 측정하기 위하여 세포독성이 없는 농도인 100 nM 이하의 농도에서 실험을 실시하였다.
프로디지오신의 면역세포의 생존율에 대한 영향
프로디지오신의 농도(nM) 생존율(%)
1일째 2일째 3일째
프로디지오신 미처리군프로디지오신 처리군310301003001,0003,00010,00030,000 9396898982687461324 79868270701414944 77797981701814844
실시예 3: 프로디지오신의 면역세포 증식에 대한 생체외 실험
프로디지오신에 의한 면역세포의 증식 효과를 측정하기 위하여 3 종류의 표준 증식 유도물질을 사용했다. B 세포의 증식을 유도하기 위하여 리포폴리사카라이드를 5 ㎍/ml의 농도로 처리했으며, T 세포의 증식을 유도하기 위하여 콘카나발린 에이를 5 ㎍/ml의 농도로 처리했으며, B 및 T 세포의 증식을 동시에 유도하기 위하여 포크위드마이토젠을 5 ㎍/ml의 농도로 처리했다. 프로디지오신을 처음부터 상기의 표준 물질과 동시에 처리하였으며 3일 후 면역세포의 증식정도를 DNA 합성량으로 측정했다. 프로디지오신은 세포독성이 없는 농도인 100 nM이하의 농도로 처리했다. 프로디지오신의 면역세포의 증식에 대한 영향을 표 2에 나타냈다. 프로디지오신 미처리군의 증식도를 100%로 계산했을때의 프로디지오신 처리군의 증식도를 비율로 계산했다. 표 2에서 보듯, 프로디지오신은 30 nM 내지 100 nM의 농도에서 콘카나발린 에이를 이용한 T 세포의 증식을 96% 내지 98% 이상 강하게 억제하고, 리포폴리사카라이드를 이용한 B 세포의 증식은 13% 내지 19% 정도 억제했으며 포크위드마이토젠을 이용한 B/T 세포의 증식은 45% 내지 83% 억제했다. 이상의 결과는 프로디지오신이 T 세포의 증식을 선택적으로 강력하게 억제함을 입증한다.
프로디지오신의 면역세포의 증식에 대한 영향
프로디지오신의 농도(nM) 면역세포의 증식정도(%)
B세포 T세포 B/T세포
프로디지오신 미처리군프로디지오신 처리군31030100 1001011058781 100774642 100100865517
실시예 4: 프로디지오신의 면역반응에 대한 생체외실험
프로디지오신의 면역세포기능에 대한 영향을 측정하기 위하여 3 가지 시험계를 사용했다. 첫 번째로, B 세포의 면역반응을 측정하기 위하여 리포폴리사카라이드로 B 세포를 자극한 후 3일째에 항체생성능력을 측정했다. 리포폴리사카라이드는 B 세포 자체를 자극하여 항체생성을 유도하는 것으로 T 세포의 도움이 필요없다. 두 번째로, T 세포의 면역반응을 측정하기 위하여 혼합면역세포반응 (mixed lymphocyte response)을 유발했으며, 이반응은 B 세포의 도움이 필요없는 반응이다. 조직적합성항원이 상이한 두종류의 이종면역세포를 혼합하여 T 세포의 활성을 증가시킨 후, 3일째에 T 세포의 면역반응을 측정했다. 세 번째로, B 세포 및 T 세포의 면역반응을 동시에 측정하기 위하여 T 세포 의존성 항체생성반응을 측정했으며, 이 시험법은 B 및 T 세포의 기능이 동시에 필요한 시험계이다. 면양 적혈구를 이용하여 면역세포를 면역화 시킨 후 5일째에 항체생성능력을 측정했다. 프로디지오신의 면역반응에 대한 영향은 표 3에 나타냈으며, 표 3에서 보듯, T 세포가 관여하는 면역반응은 심하게 억제되었으나, B 세포의 면역반응은 모든 농도에서 전혀 억제되지 않았다. 프로디지오신을 처리하지 않았을 때의 면역반응을 100%로 계산하였으며 프로디지오신의 처리에 의한 면역반응의 억제는 비율로 계산했다. 실시예 3과 실시예 4의 결과로서 프로디지오신은 T 세포의 증식 및 면역반응이 선택적으로 강력하게 억제함을 입증한다.
프로디지오신의 면역반응에 대한 영향
프로디지오신의 농도(nM) 면역반응(%)
B세포 T세포 B/T세포
프로디지오신 미처리군프로디지오신 처리군31030100 10011610810097 1001111106730 10081746434
실시예 5: 프로디지오신의 B, CD4 T, 및 CD8 T 세포에 대한 선택적 독성
프로디지오신의 T 세포에 선택적인 면역억제 효가가 T 세포에 대한 선택적인 독성에서 기인하는 지의 여부를 각각 세포의 구성비율을 측정하여 검증했다. 프로디지오신을 면역세포에 처리한 후 3일 째에 각각세포의 구성비율을 측정했다. T 세포는 CD4 T 세포(도움 T 세포, helper T cell)와 CD8 T 세포(세포독성 T 세포, cytotoxic T cell)로 구성되어 있다. 본 실시예에서는 두종류의 T 세포 및 B 세포의 구성비율을 측정했다. 결과는 표 4에 나타냈으며, B 세포, CD4 T 세포, 및 CD8 T 세포의 구성비율이 일정했다. 실험 결과 프로디지오신이 세포에 선택적인 독성이 없음을 나타냈으며, T 세포에 선택적 면역억제는 세포독성이 아닌 면역반응의 억제에서 기인함을 나타내었다. 실시예 5와 실시예 2의 결과는 프로디지오신이 유효실험농도에서는 독성이 없음을 입증한다.
프로디지오신의 B, CD4 T, 및 CD8 T 세포에 대한 독성
프로디지오신의 농도(nM) 구성비율(%)
B세포 CD4T세포 CD8T세포
프로디지오신 미처리군프로디지오신 처리군31030100 4747495052 3131313129 1213131210
실시예 6. 프로디지오신의 T 세포에 대한 생체내 실험 (이종이식시험계)
생체 내에서의 프로디지오신의 면역억제효과를 이종이식시험계(graft vesus host reaction)를 이용하여 측정했다. 이종이식시험계는 T 세포의 면역반응을 측정할 수 있는 시험계이다. 조직적합성 항원이 상이한 BDF1 마우스의 면역세포를 B6C3F1 마우스에 이식한 후 6일째에 림프절의 무게를 측정하는 것으로 T 세포의 이식된 이종면역세포에 대한 면역반응을 측정할 수 있다. 프로디지오신을 30 mg/kg 내지 100 mg/kg의 농도로 5일동안 복강으로 주사했으며 양성대조군으로 사이클로포스파마이드를 유효농도인 100 mg/kg의 농도로 5 일동안 복강으로 주사했다. 프로디지오신과 사이클로포스파마이드의 독성을 측정하기 위하여 몸무게를 측정했다. 결과는 표 5에 나타냈으며, 프로디지오신이 강력하게 T 세포의 면역기능을 억제함을 알 수 있다. 양성대조물질인 사이클로포스파마이드도 강력하게 T 세포의 활성을 억제했다. 독성의 지표인 동물 체중을 살펴보면 프로디지오신은 유효농도에서 몸무게의 변화가 없었으며, 이 결과는 프로디지오신이 생체내에서 독성이 없이 T 세포의 면역기능을 억제함을 입증한다. 반면, 사이클로포스파마이드는 유효농도에서 동물체중을 감소시켜 독성이 있음을 입증하였다.
프로디지오신의 이종이식시심계에 대한 영향
프로디지오신의 농도(㎎/㎏) 림프절의 무게(㎎) 동물의 무게(g)
프로디지오신 미처리군프로디지오신 처리군1030양성대조군(사이클로포스파마이드)100 3.541.120.980.06 22202118
실시예 7: 프로디지오신의 생체내에서 T세포에 대한 영향 (T 세포 의존성 면역반응 시험계)
실시예 6에 이어서 프로디지오신의 생체 내에서의 T 세포에 대한 영향을 T 세포 의존성 면역반응을 측정하여 확인했다. 동물에 면양적혈구를 복강으로 주사하여 면역화시켰으며 4일 후에 항체생성세포수를 측정했다. 프로디지오신은 매일 복강으로 투여했다. 프로디지오신을 투여하지 않은 동물의 면역세포중의 항체생성세포수를 100%로 계산했으며 프로디지오신을 투여한 동물의 항체생성세포수는 비율로 계산했다. 프로디지오신의 동물에 대한 독성을 검증하기 위하여 비장무게의 체중에 대한 비율을 측정했다. 양성대조군으로 사이클로포스파이드를 사용했다. 결과는 표 6에 나타냈으며, 프로디지오신의 처리에 의해 항체생성세포수가 강력하게 억제되었으며, 양성대조물질인 사이클로포스파마이드도 강력하게 억제했다. 비장무게의 체중에 대한 비율을 살펴보면 프로디지오신은 면역반응억제를 나타내는 유효농도에서 독성이 없었다. 반면 사이클로포스파마이드는 유효농도에서 심한독성이 있었다.
프로디지오신의 T 세포 의존성 면역반응에 대한 영향
프로디지오신의 농도(㎎/㎏) 면역반응(%) 비장무게/몸무게(%)
프로디지오신 미처리군프로디지오신 처리군1030양성대조군(사이클로포스파마이드)100 10032277 100948426
본 발명은, 상기 실시예를 통한 실험결과에서 알 수 있는 바와 같이, 프로디지오신은 생체내 및 생체외에서 모두 T 세포의 면역기능을 선택적으로 강력하게 억제하는 효과가 있으며, 면역억제를 나타내는 유효농도에서 독성이 없는 것으로 나타났으므로 면역억제를 필요로하는 질환치료분야 및 기초연구분야는 물론, 조직 및 장기 이식수술 기타 면역세포와 관련된 기초연구분야에서 치료제 또는 표준 물질로 사용될 수 있어 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (2)

  1. 세라시아 마르세센스 B-1231(KCTC 0386BP)의 배양액으로부터 분리한 하기 화학식(Ⅰ)로 표시되는 분자량 323인 면역억제제용 프로디지오신(Prodigiosin).
    Figure pat00003
    ‥‥(Ⅰ)
  2. 세라시아 마르세센스 B-1231(KCTC 0386BP)을 가용성 전분 1%, 파마메이드 0.5%, 포도당 0.2%, 황산암모늄 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7배 결정수 0.05%, 염화칼슘 0.1%, 염화나트륨 0.3%로 조성된 배지를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하고, 온도 28℃에서 62 시간동안 배양한 다음 발효액과 동량의 에틸아세테이트를 가하여 30분간 혼합한 후 유기용매층을 얻은 후, 감압하에서 농축하여 적색의 물질을 얻은 다음 활성물질을 분리정제한 다음 다시 실리카겔 박층크로마토그래피를 통하여 순수 분리함을 특징으로 하는 제2항 기재의 프로디지오신의 제조방법.
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