KR100674222B1

KR100674222B1 - 세라시아 마르세센스 ｂ-1231 ｋｃｔｃ 0386ｂｐ로부터분리한 프로디지오신을 유효성분으로 포함한 급성이식편대숙주병의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100674222B1
Application number: KR1020050062287A
Authority: KR
Inventors: 김환묵; 한상배; 이창우; 이기훈; 박성규; 이기호; 강종순; 윤원기; 김영국
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2005-07-11
Publication date: 2007-01-24
Also published as: US20090048328A1; WO2007008016A1; JP2009500447A; KR20070007579A

Abstract

본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescense) B-1231 KCTC 0386BP에서 분리한 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease) 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 프로디지오신은 T세포의 활성화에 필요한 IL-2의 수용체의 발현을 억제함으로서 T세포의 증식을 선택적으로 억제하는 면역억제 활성을 가지는 것으로 단독투여의 경우뿐만 아니라 사이클로스포린에이와 그 작용기전이 상이하여 병용투여도 가능하며 이 경우에는 면역억제 효과가 현저히 증대하므로 본 발명의 프로디지오신은 급성 이식편대숙주병의 예방 및 치료에 효과적인 조성물이다.

세라시아 마르세센스, 프로디지오신, 급성 이식편대숙주병

Description

세라시아 마르세센스 Ｂ-1231 ＫＣＴＣ 0386ＢＰ로부터 분리한 프로디지오신을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병의 예방 및 치료용 조성물{A compound comprising prodigiosin isolated from Serratia marcescence B-1231 KCTC 0386BP for provention and treatment of acute graft-versus-host disease}

도 1 및 도 2는 급성 이식편대숙주병을 유발한 Balb/c 마우스에 프로디지오신을 투여하여 급성 이식편대숙주병에 대한 치료효과 여부를 확인하기 위하여 마우스의 생존율(도 1) 및 마우스의 몸무게(도 2)를 관찰한 도이며,

도 3은 프로디지오신의 T 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 4는 사이클로스포린에이의 T세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 5는 프로디지오신 및 사이클로스포린에이의 T세포의 IL-2의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 6은 프로디지오신 및 사이클로스포린에이의 T세포의 IL-2 수용체(IL-2R alpha)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 7은 프로디지오신의 면역억제효과와 IL-2와의 관련성을 나타낸 도이며,

도 8은 사이클로스포린에이의 면역억제효과와 IL-2와의 관련성을 나타낸 도이며,

도 9는 프로디지오신의 IL-2 의존성 T세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 10은 사이클로스포린에이의 IL-2 의존성 T세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescense) B-1231 KCTC 0386BP에서 분리한 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease) 예방 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.

급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease)은 골수이식 시에 나타나는 복합질환으로서, 면역기능이 있는 골수세포 중의 T 세포가 이식받는 인체의 장기를 공격하여 나타나는 질환이다. 주요증상은 피부, 간, 소화기계에 나타난다고 알려져 있다.

급성 이식편대숙주병은 3단계로 발생한다. 1단계에서는 골수를 이식하기 이전에 발생하는 것으로 환자의 조직이 손상되고 경우에 따라서는 박테리아 감염 등에 의해 항원제시세포(antigen presenting cell)가 활성화되는 단계이다. 2단계에서는 이식되는 골수세포 중의 T 세포가 활성화되는 단계이다. 이미 활성화된 환자의 항원제시세포가 T 세포를 Th1 세포로 분화시키며, 궁극적으로 IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인 분비를 증가시킨다. 3단계에서는 환자의 장기가 파괴된다. 활성화된 Th1 세포에서 분비되는 사이토카인에 의해 사이토톡식 T 세포 (cytotoxic T cell) 및 자연살해세포 (naturall killer cell)등이 활성화되면 이들 세포는 환자의 장기를 공격하게 되어 이식편대숙주병이 발생하게 된다.

급성 이식편대숙주병을 치료하기 위해서 여러 가지 방법이 제안되고 있다. 이식되는 골수세포 중에서 T 세포를 제거하는 방법, T 세포와 항원제시세포의 반응을 억제하기 위해 CD80, CD86 등에 대한 항체를 투여하는 방법, IL-2, IFN-gamma 등의 사이토카인에 대한 항체를 투여하는 방법 등이 제시되고 있다. 이와 더불어 사이클로스포린 에이, 라파마이신, FK-506 스테로이드제제 등의 화합물 면역억제제를 투여하는 방법도 사용되고 있다. 이들 방법 중에서 T 세포의 활성화를 억제하는 화합물 면역억제제 투여법이 가장 널리 사용되고 있다.

현재까지 많은 화합물 면역억제제가 개발되어 있으나 사이클로스포린에이가 가장 우수한 임상효과를 나타내고 있으며 급성 이식편대숙주병을 포함하여 자가면역질환, 장기이식거부반응, 다양한 염증질환에 널리 쓰이고 있다. 사이클로스포린에이는 고용량으로 사용할 경우 T 세포의 활성화를 완벽하게 억제하여 질병을 치료할 수 있으나 신장독성을 포함하여 상당한 부작용을 나타내는 단점을 가지고 있어, 저용량으로 사용하는 것을 권장하고 있다. 이때 나타나는 약효의 감소를 보충하기 위하여 2-3종의 다른 면역억제제와 병용투여를 실시하고 있다. 사이클로스포린에이와 기타 면역억제제를 병용투여에 사용하기 위해서는 두 물질의 작용기전과 독성 부위가 상이해야 한다는 선행조건이 있다. 현재에도 이와 같은 조건을 충족시켜 사이클로스포린에이와 병용투여법에 사용하기 위한 면역억제제 개발연구가 계속되어 지고 있다.

스트렙토마이세스(Streptomyces) 및 세라시아(Serratia) 속의 미생물들은 피롤릴피로메텐골격의 붉은색 물질들을 생산하는데 이들 중에는 프로디지오신, 메타사이클로프로디지오신, 프로디지오센, 데스메톡시프로디지오신, 프로디지오신 25-C등이 포함되어 있다. 이들 물질들은 항균제, 항말라리아, 항암 등의 효과가 있다고 알려져 있다.

프로디지오신의 질병치료효과에 대해서는 본 발병자들에 의해 이미 보고되었다(한국특허등록 제150106848호, 제190392225호; International Journal of Immunopharmacology 20, pp1-13, 1997; Journal of Pharmacoloy and Experimental Therapeutics 299(2), pp415-425, 2001).

그러나 상기 문헌 어디에도 프로디지오신을 이용한 급성 이식편대숙주병에 대한 치료효과에 대해서는 교시 또는 개시되어 있지 않다.

이에 따라, 본 발명자들은 세라시아 마르세센스 B-1231 KCTC 0386BP로 부터 분리된 프로디지오신의 단독투여 뿐만 아니라 사이클로스포린에이와 병용투여할 경우 급성 이식편대숙주병에 대한 탁월한 면역억제효과를 가짐을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescense) B-1231 KCTC 0386BP에서 분리한 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease) 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescense) B-1231 KCTC 0386BP에서 분리한 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease) 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 프로디지오신은 일반적인 면역억제제인 사이클로스포린에이와 그 작용기전이 상이하여 병용투여가 가능함을 특징으로 하는 급성 이식편대숙주병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 프로디지오신은 본 발명자들이 발명한 한국특허 제252197호에 공지된 방법에 따라 세라시아 마르세센스 B-1231 KCTC 0386BP로 부터 분리하여 사용할 수 있으며, 그 방법은 하기와 같다.

면역억제물질을 생산하기 위하여 세라시아 마르세센스 B-1231 KCTC 0386BP을 1ℓ 용량 삼각 플라스크에 생산배지(가용성 전분1%, 파마메이드 0.5%, 포도당 0.2%, 황산암모늄 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7배 결정수 0.05%, 염화칼슘0.1%, 염화나트륨 0.3%, 초기 pH 7.0) 20-100 ㎖를 가하고 20-30℃에서 50-70시간동안 배양하였다.

활성물질을 추출하기 위하여 발효액과 동량의 에틸아세테이트를 가하여 20-60분동안 교반한 후 유기용매층을 모아 감압하에서 농축하여 유상의 적색물질을 얻 었으며, 그 후 실리카겔 컬럼에서 클로로포름:메탄올용액을 용매구배방법을 이용하여 활성물질을 분리 정제하고, 실리카겔 박층 크로마토그라피를 이용하여 프로디지오신을 순수 분리 정제할 수 있다.

상기의 방법에 의해 분리, 정제된 프로디지오신의 구조는 하기 화학식 1에서 보는 바와 같다.

따라서 본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescense) B-1231 KCTC 0386BP에서 분리한 상기 화학식 1의 구조를 갖는 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease) 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

또한 상기 프로디지오신은 일반적인 면역억제제인 사이클로스포린에이와 그 작용기전이 상이하여 병용투여가 가능함을 특징으로 하는 급성 이식편대숙주병의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 급성 이식편대숙주병의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적 으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존 제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명이 이에 의해 한정되지는 않는다.

실시예 1. 프로디지오신의 분리 및 정제

면역억제물질을 생산하기 위하여 세라시아 마르세센스 B-1231 KCTC 0386BP를 1ℓ 용량 삼각 플라스크에 생산배지 (가용성 전분1%, 파마메이드 0.5%, 포도당 0.2%, 황산암모늄 0.1%, 인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘 7배 결정수 0.05%, 염화칼슘0.1%, 염화나트륨 0.3%, 초기 pH 7.0) 100 ㎖를 가하고 28℃에서 62시간 배양하였다.

활성물질을 추출하기 위하여 발효액과 동량의 에틸아세테이트를 가하여 30분간 교반한 후 유기용매층을 모아 감압농축하여 유상의 적색물질을 얻었으며, 그 후 실리카겔 컬럼에서 클로로포름:메탄올용액을 용매구배방법을 이용하여 활성물질을 분리 정제하였으며, 실리카겔 박층 크로마토그라피를 이용하여 프로디지오신을 순수 분리 정제하였다.

실험예 1. 급성 이식편대숙주병에 대한 프로디지오신의 치료효과

1-1. 마우스의 생존여부 실험

골수이식시험계를 이용하여 급성 이식편대숙주병에 대한 본 발명의 프로디지오신의 치료효과를 관찰하였다.

C57BL/6 마우스의 골수세포(5×10⁷ cells)와 비장세포(1×10⁷ cells)를 방사선을 조사하여 면역기능을 제거한 Balb/c 마우스에 이식하여 급성 이식편대숙주병 을 유발하였다. 세포를 이식한 후 14일 동안 마우스의 생존율을 조사하였다(Blood, 97(4), pp1123-1130, 2001).

대조군 마우스에는 0.5% 트윈(tween) 80을 격일 간격으로 복강 투여하였다. 상기 실시예 1에서 분리, 정제한 프로디지오신 또는 사이클로스포린에이(Sigma Co.)는 0.5% 트윈 80에 녹인 후 1 mg/kg의 농도에서 격일간격으로 복강 투여하였다. 병용투여 군에서는 프로디지오신과 사이클로스포린에이를 동시에 투여하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 대조군(○)의 경우, 세포이식 후 6일경에 50%의 Balb/c 마우스가 사망하였으며, 10일경에 모든 Balb/c 마우스가 급성 이식편대숙주병으로 사망하였다. 그러나 프로디지오신 투여군(●)에서는 세포이식 후 6일경에 35%의 Balb/c 마우스가 사망하였으나, 65%의 마우스는 실험종료일까지 살아있었다. 또한 사이클로스포린에이 투여군(□)의 경우 50%의 마우스가 실험종료일까지 생존하여 있었다. 한편 프로디지오신 및 사이클로스포린에이의 병용투여 군(■)에서는 모든 동물이 생존함을 확인할 수 있었다.

1-2. 마우스의 체중변화 실험

실험예 1-1과 동일한 방법을 수행하여 마우스의 몸무게 변화를 조사하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 2에서 보는 바와 같이 대조군(○)의 경우, 세포이식 후 2일경부터 마우스의 몸무게가 급격히 감소한 증상을 나타내었다. 9일까지 몸무게가 지속적으로 감소한 후 모든 마우스가 사망하였다. 이는 이식된 골수세포중의 T 세포가 숙주의 장기를 공격하여 나타나는 급성 이식편대숙주병의 대표적인 증상이다. 반면 프로디지오신(●)과 사이클로스포린에이(□)의 단독투여 및 병용투여군(■)의 Balb/c 마우스도 2일 경부터 뭄무게가 감소하기 시작하여, 6일까지 지속적으로 감소하였으나 7일 경부터 몸무게가 증가하기 시작하였으며 14일에는 정상적인 몸무게를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 상기 실험예 1-1 및 1-2의 결과를 종합하여 볼 때 프로디지오신 및 사이클로스포린에이는 단독 투여의 경우 1 mg/kg에서 50~60%의 급성 이식편대숙주병 치료효과가 있었으며, 이들의 병용투여 시에는 100%의 강력한 치료효과가 있음을 알 수 있다.

실험예 2. T 세포 및 B 세포의 증식에 대한 영향

2-1. 프로디지오신이 T 세포 및 B 세포의 증식에 미치는 영향

C57BL/6 마우스의 비장에서 T 세포를 분리하여 사용하였다. 1 ug/ml의 콘카나발린에이를 사용하여 T 세포의 증식을 유발하였으며, 1 ug/ml의 리포폴리사카라이드를 이용하여 B 세포의 증식을 유도하였다. 상기 실시예 1에서 분리한 프로디지오신은 디메틸술폭시화물(dimethyl sulfoxide)에 녹인 후 최종농도가 3, 10, 30 ng/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 60시간 동안 배양한 후 [3H]-티미딘(thymidine)을 1 uCi/well의 농도로 배양용기에 첨가하였으며, 12시간 후에 세포를 수거하여 DNA내로 유입된 방사능의 양을 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 프로디지오신은 T 세포의 증식을 선택적으로 억제하였으며, B 세포의 증식은 억제하지 못함을 확인할 수 있 었다.

2-2. 사이클로스포린에이가 T 세포 및 B 세포의 증식에 미치는 영향

상기 실험예 2-1과 동일한 방법을 수행하여 사이크로스포린에이(Sigma Co.)의 T세포 및 B세포의 증식에 미치는 영향을 관찰하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 사이클로스포린에이는 T 세포의 증식을 선택적으로 억제하였으며, B 세포의 증식은 억제하지 못함을 확인할 수 있었다.

따라서 상기 실험예 2-1 및 실험예 2-2의 결과를 종합하여 보면 본 발명의 프로디지오신 및 사이클로스포린에이는 T세포의 증식을 선택적으로 억제하는 면역억제제임을 알 수 있으며, 프로디지오신은 2.03 ng/ml의 IC₅₀(50% 억제농도)를 보였으며, 사이클로스포린에이는 1.29 ng/ml의 IC₅₀를 보여 두 물질의 약효는 거의 유사함을 알 수 있었다.

실험예 3. 프로디지오신 및 사이클로스포린에이가 IL-2 및 IL-2 수용체의 발현에 미치는 영향

T 세포의 활성화를 위해서는 3종류의 신호전달계가 필요하다. 항원제시세포(antigen presenting cell)와 MHC-TCR 상호작용(Signal 1)과 CD80-CD28 상호작용(Signal 2)을 통해 T 세포가 활성화된다. 이때 T 세포는 IL-2를 생성하게 되며 자 체적으로 IL-2 수용체 발현을 증가시키게 된다. 이 후에 T 세포 내부에서 IL-2-IL-2 수용체 신호전달(Signal 3)이 발생하게 된다. T 세포가 완전히 활성화되어 면역기능을 수행하기 위해서는 이와 같은 세 종류의 신호가 모두 필요하게 된다. IL-2 수용체는 알파, 베타, 감마의 세 종류의 단백질로 구성되어 있으며, 베타와 감마는 항상 발현하고 있는 반면에, 알파는 T 세포 활성화에 따라서 발현양이 조절된다.

대표적인 면역억제제인 사이클로스포린에이는 IL-2의 생성을 억제하는 물질이다. 시그날 1과 시그날 2에 관여하는 칼시네우린(calcineurin) 이라는 단백질의 기능을 억제하고, 궁극적으로 전사조절물질인 NF-AT의 기능을 억제하여 IL-2 생성을 억제하는 물질이다. NF-AT는 IL-2 수용체의 생성에도 관여하기 때문에, 사이클로스포린에이는 IL-2 수용체의 생성도 억제한다.

3-1. IL-2 발현에 미치는 영향

C57BL/6 마우스의 비장에서 T 세포를 분리하여 사용하였다. 1 ug/ml의 콘카나발린에이를 사용하여 T 세포를 활성화시켰다. 프로디지오신 및 사이클로스포린에이는 디메틸 술폭시화물(DMSO)에 녹인 후 최종농도가 3, 10, 30 ng/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 4시간 동안 배양한 후 세포를 수거하였으며, RNA를 분리한 후 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 IL-2 mRNA 발현도를 측정했다.

상기 실험 수행의 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 활성화되지 않은 T 세포는 IL-2 mRNA를 발현하지 못하였다(untreated-시험군, U). 그러나 콘카나발린에이를 처리할 경우 IL-2 mRNA이 발현이 강하게 증가하였으며(Naive control, N), 용매로 사용된 0.1% DMSO는 IL-2 mRNA 발현에 영향을 주지 않았다(vehicle control, V).

프로디지오신을 3, 10, 30 ng/ml의 농도로 처리할 경우 IL-2 mRNA 발현에 영향을 주지 않았으나, 사이클로스포린에이는 IL-2 mRNA 발현을 강하게 억제했다. 베타-액틴(beta-actin)에 대한 RT-PCR을 수행하여 동일한 양의 RNA를 실험에 사용하였으므 그래프는 베타-액틴에 대한 상대적인 양을 나타내고 있다.

3-2. IL-2 수용체의 발현에 미치는 영향

C57BL/6 마우스의 비장에서 T 세포를 분리하여 사용하였다. 1 ug/ml의 콘카나발린에이를 사용하여 T 세포를 활성화시켰다. 프로디지오신 및 사이클로스포린에이는 디메틸 술폭시화물(DMSO)에 녹인 후 최종농도가 3, 10, 30 ng/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 4시간 동안 배양한 후 세포를 수거하였으며, RNA를 분리한 후 RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하여 IL-2 수용체(IL-2R alpha) mRNA 발현도를 측정했다.

상기 실험 수행의 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 활성화되지 않은 T 세포는 IL-2 수용체 mRNA를 발현하지 못하였다(untreated-시험군, U). 그러나 콘카나발린에이를 처리할 경우 IL-2 수용체 mRNA의 발현이 강하게 증가하였으며(Naive control, N), 용매로 사용된 0.1% DMSO는 IL-2 수용체 mRNA 발현에 영향을 주지 않았다(vehicle control, V). 프로디지오신을 3, 10, 30 ng/ml의 농도로 처리할 경우 IL-2 수용체 mRNA 발현을 강하게 억제하였으며, 사이클로스포린에이도 IL-2 수용체 mRNA 발현을 강하게 억제했다. 베타-액틴에 대한 RT-PCR을 수행하여 동일한 양의 RNA를 실험에 사용했으며, 그래프는 베타-액틴에 대한 상대적인 양을 나타내고 있다.

상기 실험예 3-1 및 3-2의 결과를 종합하여 보면, 프로디지오신은 IL-2 수용체 발현을 선택적으로 억제하는 면역억제제임을 알 수 있다. 반면에, 사이클로스포린에이는 IL-2 및 IL-2 수용체의 발현을 모두 억제하였다. 이와 같은 결과로부터, 프로디지오신 및 사이클로스포린에이는 상이한 작용기전을 소유한 물질임을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 프로디지오신 및 사이클로스포린에이의 면역억제효과와 IL-2와의 관련성

4-1. 프로디지오신의 면역억제효과와 IL-2와의 관련성

C57BL/6 마우스의 비장에서 T 세포를 분리하여 사용하였으며, 1 ug/ml의 콘카나발린에이와 10 unit/ml의 IL-2를 이용하여 T 세포의 증식을 유도하였다. 대조군으로는 1 ug/ml의 콘카나발린에이를 사용하여 T 세포의 증식을 유발하였다. 프로디지오신은 DMSO에 녹인 후 최종농도가 3, 10, 30 ng/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 60시간 동안 배양한 후 [3H]-티미딘을 1 uCi/well의 농도로 배양용기에 첨가하였으며, 12시간 후에 세포를 수거하여 DNA내로 유입된 방사능의 양을 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 프로디지오신은 콘카나발 린에이에 의한 T 세포의 증식을 억제하였으며, 외부에서 첨가한 과량의 IL-2는 영향을 주지 못하였다.

4-2. 사이클로스포린에이의 면역억제효과와 IL-2와의 관련성

C57BL/6 마우스의 비장에서 T 세포를 분리하여 사용하였으며, 1 ug/ml의 콘카나발린에이와 10 unit/ml의 IL-2를 이용하여 T 세포의 증식을 유도하였다. 대조군으로는 1 ug/ml의 콘카나발린에이를 사용하여 T 세포의 증식을 유발하였다. 사이클로스포린에이는 DMSO에 녹인 후 최종농도가 3, 10, 30 ng/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 60시간 동안 배양한 후 [3H]-티미딘을 1 uCi/well의 농도로 배양용기에 첨가하였으며, 12시간 후에 세포를 수거하여 DNA내로 유입된 방사능의 양을 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 사이클로스포린에이는 콘카나발린에이에 의한 T 세포의 증식을 억제하였으며, 외부에서 첨가한 과량의 IL-2에 의해 복구되었다.

따라서, 실험예 4-1 및 4-2의 결과를 종합해 보면, 프로디지오신의 면역억제효과는 IL-2와 관련성이 없고, 사이클로스포린에이의 면역억제효과는 IL-2에 의해 복구됨을 알 수 있다. 이와 같은 결과로부터, 프로디지오신 및 사이클로스포린에이의 작용기전은 상이함을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 프로디지오신 및 사이클로스포린에이의 IL-2 의존성 T세포의 증식 에 미치는 영향

5-1. 프로디지오신의 IL-2 의존성 T세포의 증식에 미치는 영향

C57BL/6 마우스의 비장에서 T 세포를 분리하여 사용하였으며, 1 ug/ml의 콘카나발린에이를 이용하여 T 세포증식을 유도하였다(콘카나발린에이 의존성 T 세포 증식, ConA-dependent T cell proliferation).

IL-2 의존성 T 세포증식을 측정하기 위하여, 마우스의 비장에서 분리한 T 세포에 1 ug/ml 콘카나발린에이를 48시간 동안 처리하였다. 3번 세척하여 모든 콘카나발린에이를 제거한 후 실험에 사용하였다. 이와 같이 전처리된 세포는 과량의 IL-2 수용체를 가지고 있어 외부에서 가해주는 IL-2에 반응하지만, 전처리하지 않은 세포는 IL-2 수용체가 없어 외부에서 첨가하는 IL-2에 반응하지 않는다. 전처리된 세포에 10 unit/ml의 IL-2를 첨가하여 T 세포증식을 유도하였다(IL-2-dependent T cell proliferation).

프로디지오신은 DMSO에 녹인 후 최종농도가 3, 10, 30 ng/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 60시간 동안 배양한 후 [3H]-thymidine을 1 uCi/well의 농도로 배양용기에 첨가하였으며, 12시간 후에 세포를 수거하여 DNA내로 유입된 방사능의 양을 측정하였다.

도 9에 나타난 결과와 같이 프로디지오신은 콘카나발린에이에 의한 T 세포의 증식을 억제하였으나, IL-2에 의한 T 세포증식은 억제하지 못했다.

5-2. 사이클로스포린에이의 IL-2 의존성 T세포의 증식에 미치는 영향

사이클로스포린에이는 dimethyl sulfoxide에 녹인 후 최종농도가 3, 10, 30 ng/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 60시간 동안 배양한 후 [3H]-thymidine을 1 uCi/well의 농도로 배양용기에 첨가하였으며, 12시간 후에 세포를 수거하여 DNA내로 유입된 방사능의 양을 측정하였다.

상기 실험 수행의 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 사이클로스포린에이는 콘카나발린에이에 의한 T 세포의 증식을 억제하였으나, IL-2에 의한 T 세포증식은 억제하지 못했다.

따라서, 상기 실험예 5-1 및 5-2의 결과를 종합하여 보면, 프로디지오신 및 사이클로스포린에이는 IL-2-의존성 T 세포증식, 다시 설명하면 IL-2가 그의 수용체에 결합한 이후의 신호전달에는 영향을 주지 않음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 세라시아 마르세센스(Serratia marcescense) B-1231 KCTC 0386BP에서 분리한 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease) 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 프로디지오신은 IL-2 발현에는 영향을 미치지 아니하지만 T세포의 활성화에 필요한 IL-2의 수용체의 발현을 억제함으로서 T세포의 증식을 선택적으로 억제하며, IL-2 수용체가 T세포에 결합한 이후의 신호전달에는 영향을 미치지않는 면역억제 활성을 가지는 것으로 단독투여의 경우뿐만 아니라 일반적인 면역억제제인 사이클로스포린에이와 그 작용기전이 상이하여 이와 함께 병용투여할 경우에는 면역억제 효과가 현저히 증대하는 효과를 가지고 있으므로 본 발명의 프로디지오신은 급성 이식편대숙주병의 예방 및 치료에 효과적인 조성물이다.

Claims

세라시아 마르세센스(Serratia marcescense) B-1231 KCTC 0386BP에서 분리한 프로디지오신(prodigiosin)을 유효성분으로 포함한 급성 이식편대숙주병(acute graft-versus-host disease)의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 프로디지오신과, 그와 작용기전이 상이한 면역억제제인 사이클로스포린에이의 조합인 것을 특징으로 하는 급성 이식편대숙주병의 예방 또는 치료용 조성물.