JPH03173892A - Ｌ―６８３，５９０の微生物変換生成物 - Google Patents

Ｌ―６８３，５９０の微生物変換生成物

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JPH03173892A
JPH03173892A JP2003665A JP366590A JPH03173892A JP H03173892 A JPH03173892 A JP H03173892A JP 2003665 A JP2003665 A JP 2003665A JP 366590 A JP366590 A JP 366590A JP H03173892 A JPH03173892 A JP H03173892A
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JP2003665A
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Byron H Arison
バイロン　エツチ．アリソン
Edward S Inamine
エドワード　エス．イナミネ
Shieh-Shung T Chen
シエー‐シユング　テー．チエン
Linda S Wicker
リンダ　エス．ウイツカー
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Original Assignee
Merck and Co Inc
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は新規な免疫抑制剤＞６８５，４８７と微生物
の未同定の放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ）　（Ｍ
Ａ６４７４）、ＡＴＣＣＮα５３８２８を使用するその
生産のための発酵法に関する。この方法はＬ−６８３，
５９０の構造を転位し、モノデメチル化する条件下で微
生物とＬ−６８３，５９０を培養することを含む。また
、自己免疫疾患、感染性疾患の治療および／または臓器
移植拒絶反応の予防のためヒトに対する使用方法が開示
されている。
１９８３年、米国ＦＤＡは臓器移植外科領域に革命を起
こした極めて有効な抗拒絶反応薬であるサイクロスポリ
ン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）を認可した。この薬品は
体の免疫系についてその移植物の外来タンパク質を拒絶
する天然保護剤の広大な蓄積物を動員するのを阻害する
ことにより作用する。
この薬品は移植拒絶反応との戦いに有効である一方、腎
不全、肝臓障害および潰瘍を起こす決定があり、それら
は多くの場合極めて重篤になる可能性がある。
Ｆｕｊｉｓａｗａに対する欧州特許出願公開第０１８４
１６２号は、参考のためにここに組み入れるものである
が、新規なマクロライド免疫抑制剤ＦＫ−５０６を記述
しており、それはサイクロスポリンより１００倍有効と
いわれている。このマクロライドはストレプトマイセス
・ツクバエンシス（ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ　ｔｓｕ
ｋｕｂａｅｎｓｉｓ）の特別な株の発酵により生産され
る。また、ニス・ハイグロスコピクス・サブスブ・ヤク
シマエンシス（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｓｕｂ
ｓｐ、　ｙａｋｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ）により生産され
る近縁のマクロライド免疫抑制剤ＦＫ−５２０について
も記述している。
Ｔ、八ｒａｉに対する米国特許第３，２４４，５９２号
は抗カビ剤「アスコマイシン（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）　
Ｊを産生ずるストレプトマイセス・ハイグロスコピクス
・バール・アスコマイセティクス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏ
ｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ、　ａ
ｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）の培養について記述してい
る。
しかしながら、サイクロスポリンの副作用が実質的にな
いいかなる免疫抑制剤の生産についても文献の記述がな
い。
副作用の少ないより新しくより安全な薬品がこの分野に
おいてつねに探し求められている。
微生物放線菌（ＭＡ　　６４７４）、ＡＴＣＣＮｏ、５
３８２８をマクロライド免疫抑制剤Ｌ−６８３゜５９０
の存在下、窒素栄養原を含む水性炭水化物培地中液中好
気的条件下であって、前記条件をρ１１約７でＬ−６８
３，５９０を選択的にモノデメチル化（すなわちＣ−１
３メトキシ基を除去すること）し、６員ビラン環の５員
フラン環への転位を起こす（ここでヒドロキシル基はＣ
−１４にある）のに十分な時間実行することにより新規
な免疫抑制剤Ｌ−６８５，４８７を得ることができるこ
とを発見した。
生成するＬ−６８５，４８７は免疫抑制活性ずなわらカ
ルシウムイオノフオア（イオノマイシン（ｉｏｎｏｍｙ
ｃｉｎ））とフォルボールミリステートアセテ−１−（
ＰＭＡ）により講導されるＴ細胞刺激試験によって示さ
れるようなＴ細胞活性化の正の阻害を示し、前記試験を
ここでは「′Ｆ細胞増殖試験」と称する。この試験法の
原理はイオノマイシンとＰＭＡの組合せにより刺激され
るマウス下リンパ球の増殖を測定することである。この
試験で陽性の試料はＴ細胞の増殖を阻害し、これは減少
したトリチウム化チξジンの取込みによって示される。
この発明により、未同定の放線菌（ＡＴＣＣＮｏ、　５
３８２８　）の株をＬ−６８３，５９０と共に窒素栄養
原を含む水性炭水化物培地中で生成物Ｌ６８５．４８７
を生産するに十分な時間液内好気的醗酵条件下で培養す
ることにより生産されるＬ−６８５，４８７と称する免
疫抑制剤が提（Ｊ（される。
新規な免疫抑制剤Ｌ−６８５，４８７はＴ細胞増殖試験
でＴ細胞活性化の正の阻害と第１図に示すようなプロト
ン核磁気共鳴スペクトルとを示し、ＦＡＢ質量スペクト
ル分析により得られる７７７の分子量を持つ。
さらに、放線菌、Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、５３８２８の株を
Ｌ−６８３，５９０の存在下で窒素栄養原を含む水性炭
水化物培地中で８．０以下のｐＨでＬ−６８５４８７を
生成させるに十分な時間液内好気的発酔条件下で培養す
る工程を含むＬ−６０５，４８７と確認される免疫抑制
剤の製造法が提供される。
さらに、Ｔ細胞増殖試験によりＴ細胞活性化の正の阻害
を示すＬ−６８５，４ｆ３７を含む上述の方法により製
造されるブイヨンが提供される。
さらに、上述の方法により製造される免疫抑制剤生成物
が提供される。
また、医薬的に受容可能な実質的に無毒な担体または賦
形剤を配合したＩ、−６８５，４８７の治療的有効量を
含む医薬組成物が提（」（される。
さらに、Ｌ−６８５，４８７の治療的有効量をヒトに投
与することからなる移植拒絶反応を予防し、もしくは自
己免疫疾患または感染性疾患を治療するためにヒトを治
療するための使用方法が提（共される。
本発明はり、−６８３，５９０と共に放線菌ＭＡ６４７
４、ＡＴＣＣＮｏ、５３８２８を酩酊させてＬ−６８５
，４８７を生産することを含む。微生物は現在ブダペス
ト条約により、メリーランＩ′（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、
ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌ　Ｉｅ）、パークローン・
ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　１２３０
１に所在するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣＮｏ、５３８２８
として、およびニュー・シャーシー（Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓ
ｅｙ）　、’ローウェー　（Ｒａｈｗａｙ）に所在する
メルク・カルチャー・コレクション（Ｍｅｒｃｋ　Ｃｕ
１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＭＡ　　６４７
４として制限寄託されている。物理学的性質および形態
学的、培養的、生物学的および生理学的性質を含む分類
は以下に簡単に記述する。
これまでになされた分類学的分析に基づいて、この培養
は仮に未同定の放線菌と分類された。この微生物の族と
種を最終的に決定するため、さらに分類学的性質を研究
した。
この培養物は（２８°Ｃ及び３７°Ｃ）酵母麦芽エキス
寒天、グリセロールアスパラギン寒天、無機塩澱粉寒天
、オートミール寒天、ツアペック・ドックス（Ｃｚａｐ
ｅｋ　Ｄｏｘ）、ツアペック溶液寒天およびペアトン寒
天、ならびにベネント（Ｂｅｎｎｅｔｔ）寒天を含む通
常の培地上ですべて２８°Ｃでよく増殖する。
悪−悪 この培養は分岐した糸状菌糸として増殖し、菌糸の直径
は０．７６ミクロンである。コロニーは不透明でもりあ
がり、でこぼこしている。コロニのＭｉ織は酵母麦芽エ
キス寒天ではゴム状であるが、他の培地ではバター状に
なる傾向があり、この場合菌糸の著しい分断が認められ
る。コロニーの表面は外観がマット状になる傾向がある
。拡散性色素は認められなかった。
胞子嚢 大部分は短鎖状で大きさは直径が４〜２５ミクロンの範
囲にある。胞子嚢はグリセロールアスパラギン寒天上で
一般に２１日までに観察され、合体する傾向がある。胞
子は棒状で鈍端を持ち（０，７６Ｘ　１．Ｏξミクロン
、非運動性であり、長さ１５０ミクロンまでの長い分岐
しない鎖で存在する。
ＭＡ　　６４７４の培養的性質 栄養増殖：裏面は黄褐色、表面は黄褐色でもりあがった
増殖。
気菌糸（八ｅｒｉａｌ　Ｍｙｃｅｌｉｕｍ）：まばらで
白色粉状。
可溶性色素：ない。
ツアペックドックス基　（スクロース蛸酸塩寒天）栄養
増殖：淡黄色マット状平坦で、−平板は増殖周辺に透明
部分を示す。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
典ヱ古工まＺ寒天 栄養増殖：黄色平坦マット状。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
グリセロールアスパラギン寒天 栄養増殖：裏面はクリーム黄色平坦マット状で、表面も
同様。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
月出■鰻魁彰４天 栄養増殖：黄色平坦マット状。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
象粂工旦之２寒天 栄養増殖：裏面は黄褐色。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
チロシンの分解：重厚な増殖域に認められる。
恩胆五阜天 栄養増殖：黄色〜黄褐色、平坦マツ１へ状。
気菌糸：ない。
可溶性色素：淡褐色。
カゼインの加水分解：顕著。
酵、エキス麦芽エキス系− 栄養増殖：裏面は黄褐色〜褐色、表面は黄褐色〜褐色、
もりあがりしわがある。
気菌糸：灰白色粉状。
可溶性色素：ない。
逮」Ｑ１天 栄養増殖：黄褐色〜褐色、もりあがりしわがありマット
状。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
栄養寒天 栄養増殖：黄褐色〜褐色、もりあがりしわがありマット
状。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
澱粉の加水分解：良好。
トマトペーストオートご−ル寒 栄養増殖ニー平板はしわがあり、芥子色〜黄色の塊状に
ちりあがった栄養増殖を示し、 第二の平板は合体した褐色〜黄色のし わのある増殖のほかに孤立した芥子色 〜黄色の塊状にもりあがったコロニ も認められる。
気菌糸二上記第二の平板上にまばらで白色の気菌糸を認
める。
可溶性色素：ない。
亙旦±ｚｚ剋 栄養増殖：ない。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
ゼラチンの液化：ない。
ペプトン鉄酵母エキス寒− 栄養増殖：オレンジル褐色でもりあがり、しわがあり、
縁辺はでこぼこしている。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
メラニン：陰性。
１１□Ｓ　：陰性。
′ンアベ・ンクドンクス９！≧２り５α＋　［ｉｊ。
栄養増殖：無色。
気菌糸：ない。
可溶性色素：ない。
トリプトン酵母エキスブロス 可溶性色素：ない。
生理学的および生化学・ 酸素要求（酵母エキス−デキストロース＋無塩類寒天の
穿刺培養）は好気的である。
送通□１」塁 「メソッズ・フォー・キャラクタライゼーション・オブ
・ストレプトマイセス・スピシース（Ｍｅｔｈｏｄｓｆ
ｏｒ　Ｃｂａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔ
ｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ　５ｐｅｃｉｅｓ）　Ｊ（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　（１９６６
年７月）、１ｎ（３号）、３１３〜３４０ページ）に記
載の標準により、ブリダム・ゴツトリーブ基礎培地（Ｐ
ｒｉｄｈａｍ−ＧｏＬＬｌｉｅｂＢａｓａｌ　Ｍｅｄｉ
ｕｍ）十炭素原１％で評価した。
ＮＳ（炭素原なし）　　　　　　　軽微な発育α−Ｄ−
グルコース（正対照）　　　ＵＪｔ著な発育Ｄ−アラビ
ノース　　　　　　　　　　＋Ｌ−アラビノース　　　
　　　　　　　＋Ｄ−フラクトース　　　　　　　　　
　　−ト＋Ｌ−グルコース イノシトール α−Ｄ−ラクトース β−Ｄ−ラクトース Ｄ−マルトース　　　　　　　　　　　　〜ト＋Ｄ−マ
ンニトール　　　　　　　　　　＋Ｄ−マンノース　　
　　　　　　　　　　−＋−＋Ｌ−マンノース Ｄ−ラフィノース Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　　　　＋スクロース Ｄ−キシロース　　　　　　　　　　　＋１−Ｌ−キシ
ロース 別記しない限り、すべての記録は２８°Ｃ３週間のイン
キュベート後とった。すべての培地のｐＨはほぼ中性（
６，８〜７．２）である。
本発明は放線菌の任意のｒＬ−６８５，４８７産生性」
株により実施することができるが、特にＡＴＣＣＮα５
３８２８株が好ましい。
一般に、Ｌ−６８５，４８７は上述の「Ｌ６８５．４８
７産生性株」を１、−６８３，５９０の存在下、同化性
炭素原と窒素原を含む永住栄養培地中で、好ましくは液
内好気的条件下（たとえば振盪培養、液内培養など）で
培養（醗酵）することにより生産することができる。水
性培地は醗酵過程の始発期および柊１す１（収穫期）に
おいてｐｌ＋を約７に維持するのが好ましい。より高い
ｐＨでは生成物の実質的なおよび／または全部の喪失に
つながる。所望のｐＨはモルフォリノエタンスルフォン
酸（ＭＥＳ）、モルフォリノプロパンスルフォン酸（Ｍ
ＯＰＳ）などのような緩衝剤の使用、または以下に記述
する生産培地のような本来緩衝能力を持つ栄養原材料の
選択により維持することができる。
栄養培地の好ましい炭素原はグルコース、キシロース、
ガラクトース、グリセリン、澱粉、デキストリンなどの
ような炭水化物である。マルトース、ラムノース、ラフ
ィノース、アラビノース、マンノース、サリシン、コハ
ク酸ナトリウムなどのような他の炭素原も含めることが
できる。
好ましい窒素原は酵母エキス、肉エキス、ペプトン、グ
ルテンミール、綿実ミール、大豆ミールおよび他の植物
稟−ル（部分脱脂または全脱脂）、カゼイン加水分解物
、大豆加水分解物および酵母加水分解物、コーン・ステ
イープ・リカー、乾燥酵母、小麦胚芽、フェザ−・ミー
ル（ｆｅａｔｈｅｒ　ｍｅａｌ）、落花生粉末、ディス
ティラース・ソリューブルスなど、並びにアンモニウム
塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウムなど）、尿素、アごノ酸などのような無
機および有機窒素化合物である。
炭素原と窒素原は好便に組み合わせて使用されるがそれ
らの純粋な形態で使用する必要はなく、何となれば痕跡
量の成長因子および相当量の鉱物質栄養原を含むところ
のより純粋でない材料も使用に適しているからである。
所望ならば炭酸ナトリウムまたはカルシウム、リン酸ナ
トリウムまたはカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウ
ム、ヨウ化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩
、銅塩、コバルト塩などのような鉱物質塩を培地に添加
することができる。必要により、特に培養中、培地が著
しく泡立つ場合、流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱
物油またはシリコンのような消泡剤を添加することがで
きる。
Ｌ−６８３，５９０出発物質は米国特許第３．２４４，
５９２号に記述されたニス・ハイグロスコピクス・バー
ル・アスコマイセテイクス、ＡＴＣＣｋ１４８９１の醗
酵により、およびＦｕｊ　ｉｓａｗａの欧州特許出願公
開第０１８４１６２号に記述されたニス・ハイグロスコ
ピクス・サプスプ・ヤクシマエンシスＮα７２７８の醗
酵（Ｌ−６８３，５９０と同一のＦＲ−９００５２０ま
たはｒＦＫ−５２０Ｊの産生のため）により得ることが
でき、前記文献はこの特別な目的のため参考のためにこ
こに組み入れる。
Ｌ−６８３，７５６を大量に産生ずる条件については液
内好気的培養条件が好ましい。少量の産生のためにはフ
ラスコまたは瓶による振盪または表面培養が使用される
。更に増殖を大型槽で実施する場合、Ｌ−６８３，７５
６の産生の過程における増殖遅滞を避けるため増殖型の
生物を生産槽への接種に使用するのが好ましい。従って
、最初に「斜面」に作られた微生物の胞子または菌糸を
比較的少量の培地に接種し、前記接種した培地（これを
「種菌培地」と称することもある）を培養することによ
り微生物の増殖型接種原を作り、次いで培養した増殖型
接種原を無菌的に大型槽に移すのが望ましい。接種原が
産生される醗酵培地はＩ、−６８３，７５６の産生に使
用される培地と実質的に同一かまたは相違し、一般に接
種前に培地、をオートクレーブに入れて殺菌する。培地
のｐＨは一般にオートクレーブ殺菌工程前、酸または塩
基を好ましくは緩衝溶液の形態で適当に添加することに
よりｐＨ８，ｏ以下たとえば約７．０に３ＪＸ１節する
。
培養混合物の撹拌と通気は種々な方法で達成することが
できる。撹拌はプロペラまたはｔ’ｉ’ｆ似の機械的撹
拌設備により、醗酵槽を回転または振盪することにより
、種々なポンプ設備により、または培地に無菌空気を通
過させることにより実現することができる。通気は無菌
空気を醗酵混合物に通過させることにより実現すること
ができる。
醗酵は通常約２０°Ｃと４０°Ｃの間の温度好ましくは
２５〜３５°Ｃで約１０時間ないし２０時間の間行うが
、醗酵条件とスケールにより変更することができる。好
ましくは、生産培養は２２０ｒｐｍで稼働する回転振盪
機上２７°Ｃで約２４時間定温保持し、この場合醗酵培
地のρ１１は収穫期まで７．０に維持する。
醗酵を実行するための好ましい培養／生産培地は次の培
地を含む。
種　　　　声　地　Ａ　　　　　　　　　ヱｌ□Ｌデキ
ストロース（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ）　　　　　　１．０デ
キストリン　（Ｄｅｘｔｒｉｎ）　　　　　　１０．０
Ｍｇ５Ｏ４７１’１２０ に２１１ＰＯ４ ｐＨを７．１に調節 ＣａＣ０１ｏ、ｓ　ｇ　／　’添加 稟−共一」Ｌ」４−圧 グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ） ０．０５ ０．３７ １１□４ ０ Ｍ　ＯＰ　Ｓ １１．６ ｐＨ７，２に調節 生成したＬ−６８５，４８７は他の公知の生物学的活性
物質の回収に一般に使用される通常の方法により培養液
から回収することができる。生成したＬ−６８５，４８
７物質は培養した菌糸体と濾液に見出され、したがって
培養液の濾過または遠心分離により得られる菌糸体と濾
液から減圧下の濃縮、凍結乾燥、メタノールなどのよう
な通常の溶媒による抽出、ｐｔ＋調節、通常の樹脂（た
とえばアニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸
着樹脂など）による処理、通常の吸着剤（たとえば活性
炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルξすなと）
による処理、結晶化、再結晶化などのような通常の方法
により単離し精製することができる。好ましい方法は溶
媒抽出、特にメタノールを使用するものである。
醗酵からの生成物Ｌ−６８５，４８７は「Ｔ細胞増殖ア
ッセイ」により正の免疫抑制活性を示し、これに基、づ
く用途を持ち、次の物理的特性を示す。
１、　白色無定形粉末 ２、　メタノールに可溶 ３、ＦＡＢ質景スペクトル分析により求められる７７７
の分子量を持ち、第１図において与えられた分子構造と
一致 上述の醗酵法により得られるＬ−６８５，４８７は通常
の方法たとえば抽出、沈殿、分画結晶化、再結晶化、ク
ロマトグラフなどにより単離し精製することができる。
この物質の適当な処方物はアセテートのような分子のヒ
ドロキシ基を介して形成されるし−６８５，４８７の通
常の医薬的に受容可能な生物学的不安定性エステルも含
むことができる。
上述の醗酵反応とその醗酵混合物の後処理にはＬ−６８
５，４８７のへミケタール環系の転位によるＬ−６８５
，４８７の互変異性体も本発明の範囲に含まれることに
注意すべきである。
本発明のＬ−６８５，４８７は免疫抑制活性、抗菌活性
などのような薬理活性を持ち、したがって心臓、腎臓、
肝臓、骨髄、皮膚などのような臓器または組織の移植拒
絶反応、骨髄移植による移植片対宿主病、リウマチ様関
節炎、全身性狼疹紅斑、橋本氏甲状腺炎、多発性硬化症
、重症性筋無力症、■型糖尿病、＠萄膜炎などの自己免
疫疾患の予防と治療に有用である。
本発明の医薬組成物は医薬製剤たとえば固体、半固体ま
たは液体の形であって、外部、腸内または非経口用に適
当な無機または有機の担体または賦形剤と混合して活性
成分として本発明のし６８５．４８７を含む形で使用す
ることができる。
活性成分は、たとえば錠剤、ペレット、カプセル、生薬
、溶液、エマルジョン、懸濁液、および任意の他の使用
に適当な形体用の通常の無毒の医薬的に受容可能な担体
と配合することができる。使用することができる担体は
、水、ブドウ糖、乳糖、アカシアゴム、ゼラチン、マン
ニ１−−ル、澱粉糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、
コーンスターチ、ケラチン、コロイド性シリカ、ポテト
スターチ、尿素および固体、半固体または液体形体の製
剤の製造に適当な他の担体であり、さらに補助剤、安定
剤、増粘剤、着色剤および香料も使用することができる
。活性の目的化合物は病気の治療または調整に望ましい
効果を与えるに十分な量が医薬組成物中に含まれている
。
このｍ酸物をヒトに用いる場合、非経口または腸内投与
で用いるのが好ましい。Ｌ−６８５゜４８７の治療的有
効量は変動し、治療を受ける個々の患者の年齢と状態に
基づくものであるが、−般に毎日の用ｆｆｉ　（７０ｋ
ｇの男子を基準として計算）としては活性成分の約０．
０１〜１０００■、好ましくは０．１〜５００　ｍｇお
よびより好ましくは０．５〜１００ｍｇを病気を治療す
るために与え、また−般に平均単一用量としては約０．
５　ｍｇ、１　ｍｇ、５　ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、
１００ｍｇ、２５０■および５００■が投与される。
次の実施例は本発明を例証する目的で示すものであり、
本発明の範囲または思想を限定するものと解釈すべきで
はない。
一矢韮例１ 重重」昼ｌ勤１先使 （ＭＡ　　６４７４）ＡＴＣＣＮｏ、５３８２８の凍結
乾燥培養をデキストリン１０．０％、デキストロース１
．０％、牛肉エキス３．０％、アルダミン（八ｒｄａｍ
ｉｎｅ）　　Ｐ　　Ｈ（Ｙｅａｓｔ　　Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ、　　Ｉｎｃ、＋）５．０％、Ｎ−Ｚ　　アミン　タ
イプ　Ｅ　５．０％、ＭｇＳＯ４・７１１□００．０５
％、ＫＩＩＺＰＯ４０，３７％、およびＣａＣＯ３０，
５％（単位ニゲラム／リッター）からなるオートクレー
ブ処理した種菌培地の５０雌を含む２５０ｍ１邪魔板付
き振盪フラスコに接種するのに使用した。種菌培地のｐ
Ｈをオートクレーブ処理前７．１に調節した。接種を種
菌培地中で２２ｏｒρｍで稼働する回転振盪機上で２７
“Ｃ７２時間インキユヘートした。もしくは凍結栄養菌
糸体または斜面培養源を使用する場合、培養は種菌培地
中で　２２０　ｒｐｍで２７°Ｃ７２時間インキュヘー
トする。得られる種菌培地の５．　Ｏｍ１分を次のあら
かしめオートクレーブ処理した変換培地Ｂの５０ｄを含
む２５０　ｍｌの邪魔板のない振盪フラスコに接種する
のに使用した。Ｌ−６８３，５９０をジメチルスルホキ
シド溶液としてＯ，１■／ｌｌｌ１の最終濃度となるよ
うに添加した。次いで振盪フラスコの内容を２２０　ｒ
ｐｍで稼働する回転振盪機上で２７°Ｃ７２時間インキ
ュベートした。
１、変換培地Ｂはグルコース１０．０、酵母エキス１．
０、牛肉エキス１．０、ＭＯＰＳ　　１１．６　（グラ
ム／リンター）からなり、ｐＨを圧熱殺菌前７．２に調
節した。
ブイヨンの単離と精製　法 変換培地Ｂの全培養液（１００＋１）を塩化メチレン（
３ｘ２００ｍ）で抽出した。塩化メチレン抽出液を合併
し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で’ａ４１ＭＩ
、て油状残留物を得た。残留物をアセトニトリルに溶解
し、高速液体クロマトグラフ（ＩＩＩ”ＬＣ）による精
製を行った。
ＩＩ　Ｐ　Ｌ　ＣはＷｈａｔｍａｎ　Ｐａｒｔｉｓｉｌ
　　１００ＤＳ−３を使用する９、４ｍｎ＋Ｘ２５ｃｍ
のカラムチ実行し、６ｏ″Ｃで２０５ｎ１ＩＩと２２５
ｎｍで監視した。カラムを０．１％水性＋＋３ＰＯ，−
ＣＨ３ＣＮ　、５５　：　４５から０．１％水性１ｔ、
ＰＯ。
Ｃ１ｈＣＮ　、２０　：　８０に至る直線勾配で３ｄ／
分で４０分間展開した。上記抽出液を繰り返し注入する
間に化合物を集めた。保持時間１２分の画分を集めてｐ
ｌ＋６．５に調節し、蒸発してアセトニトリルを除いた
。化合物はＣ＋ａ　５ｅｐ−Ｐａｋ　（ＷａＬｅｒｓ八
５ｓｏｃへａｔｅｓ）　とアセトニトリル−水の溶離溶
媒を使用してさらに精製して２．４　ｍｇのＬ−６８５
゜４８７と称する生成物を得た。
旦−一辺 Ｌ−６８５，４８７はＮＭＲスペクトル分析により与え
られた分子構造を含む第１図のプロトンＮＭＲスペクト
ルを得ることにより確認された。
１、　試料の３粍製 上記ＨＰＬにより調製した精製Ｌ−６８５゜４８７を無
水エタノールに１■／ｄの濃度に溶解した。
２、　アッセイ Ｃ５７Ｂ　１　／　６マウスの肝臓を無菌条件下で取り
出し、氷冷した１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣ
Ｏ）添加ＲＰＭＩ　　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ。
Ｇｒａｎｄ　１ｓｌａｎｄ、Ｎ、Ｙ、）中でおだやかに
分離した。
細胞を１５０Ｏｒｐｍ８分間の遠心分離によりペレット
化した。混在する赤血球をペレットを塩化アンモニウム
溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ）で４°Ｃ２分間処理すること
により除いた。冷培地を添加し、細胞を１５００ｒｐｍ
で８分間再遠心した。次いで細胞懸濁液を次のようにナ
イロンウールカラム上で分離することによりＴリンパ球
を分離した。すなわちナイロンウールカラムを２０１ｄ
のプラスチック注射器中に約４グラムの洗浄し乾燥した
ナイロンウールを充填して作った。カラムを２５０°Ｆ
で３０分間オートクレーブ処理した。ナイロンウールカ
ラムを温培地（３７’Ｃ）で湿らせ、同一培地で洗浄し
た。温培地に再懸濁した洗浄したＩＩｌ！！臓細胞をナ
イロンウールにゆっくり加えた。次いでカラムを直立位
置で３７°Ｃ１時間インキュベートした。
非付着性Ｔリンパ球を温培地でカラムから？′８離し、
細胞懸濁液を上のようにスピンさせた。
精製したＴリンパ球を１０％熱不活化ウシ胎児血清、１
００ｍＭグルタミン、１＋Ｍピルビン酸ナトリウム、２
Ｘ１０−’Ｍ２−メルカプトエタノールおよび５ｅｐｇ
／ｒｒｔｆｌゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ　　１
６４０培地からなる完全培地に２．５×１０５細胞／ｄ
の割合に再懸濁した。イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｍ
ｅおよびＰＭＡを１０ｎｇ／ｌｄの濃度に添加した。細
胞懸濁液をただちに９６ウエル平底【クロ培養板（（ｏ
ｓ　ｔａｒ）中に２００１１ｊ２／ウエルづつ分注した
。被験薬品を添加しない培地である対照と試験すべき試
料（上記精ＷＬ−６８３，７５６）の種々な下記希釈液
を繰返し３つの槽に２０μｌ／ウエル添加した。Ｌ−６
７９゜９３４を標準として使用した０次いで培養板を５
％ｃｏｔ−９５％空気からなる加湿した大気中で３７°
Ｃ４４時間インキュベートした。Ｔ細胞の増殖はトリチ
ウム化チξジンの取込みを測定することにより評価した
。４４時間インキュベート後、細胞２μＣｉ／ウエルの
トリチウム化チξジン（ＮＵＮ。
Ｃａｎ＋ｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）で瞬間標識した。さらに
４時間インキュベート後、培養物を多重試料収穫器を用
いてガラス繊維濾過器上に収穫した。個々のウェルに対
応する濾過器ディスクの放射能を標準液体シンチレーシ
ョン計数法（Ｂｅｔａｃｏｕｎ　ｔｅｒ）で測定した。
反復ウェルの１針当たり平均計数を計算し、結果を次の
ようにトリチウム化チミジン取込み（増殖）の阻害パー
セントとして表した。
Ｌ−６８５，４８７の種々な濃度における阻害％の結果
を次表に示す。
−１２」−二に− ５０，０ ３３，０ ２２，０ １５，０ ９，９ ６，６ ４，４ ２，９ １，９ １，３ ０，８７ ０，５８ ９ ９ ８ ２ ８ １ ９ Ｏ ０ 注意： １６　　マウスＴ細胞培養は４８時間目に収穫する前４
時間にわたって３Ｈ−チくジンで瞬間標識した。
２、標準Ｌ　　６７９．９３４　（１０Ｈｇ／ｄ）は９
９％阻害を示した。
３、　　Ｌ−６８５，４８７についてはＩＣ５゜＝４．
９Ｈｇ／ｍｌ　＝　６．３　ｎＭであり、一般に６．０
〜１２．０ＸＩＯ−９モルの範囲である。
４、　増殖阻害は一５０単位／　ｍＱの組換えヒ１−Ｉ
Ｌ２の添加により逆転した。
【図面の簡単な説明】
第１図はＣＤＣｌ　３中Ｌ−６８５，４８７の４００Ｍ
１ｌｚにおける’Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル、
第２図はＬ−６８５，４８７の与えられた化学構造であ
る。 ＦＩＧ、　２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ細胞増殖アッセイによりＴ細胞活性化の正の阻害
    と第１図に示すようなプロトン核磁気共鳴スペクトルと
    ＦＡＢ質量スペクトル分析により求められる７７７の分
    子量とを示すＬ−６８５，４８７と称する免疫抑制剤。 ２、第１図に示すような分子構造を持つ免疫抑制剤Ｌ−
    ６８５，４８７。 ３、医薬的に許容可能な実質的に無毒の担体または賦形
    剤を配合したＬ−６８５，４８７の治療的有効量を含む
    医薬組成物。 ４、放線菌、ＡＴＣＣＮｏ．５３８２８株、をＬ−６８
    ３，５９０の存在下、窒素栄養原を含む水性炭水化物培
    地中で８．０以下のｐＨでＬ−６８５，４８７を生成さ
    せるに十分な時間液内好気的発酵条件下で培養する工程
    を含むＬ−６８５，４８７と同定される免疫抑制剤の製
    造法。 ５、Ｔ細胞増殖アッセイによりＴ細胞活性化の正の阻害
    を示すＬ−６８５，４８７を含む請求項４記載の方法に
    より製造されるブイヨン。 ６、上述の請求項４記載の方法により製造される免疫抑
    制剤生成物。 ７、Ｌ−６８５，４８７の治療的有効量をヒトに投与す
    ることを含む移植拒絶反応を予防するか、もしくは自己
    免疫疾患または感染性疾患を治療するためにヒトを治療
    するための使用方法。
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