KR101599982B1

KR101599982B1 - 노노무라에아 종으로부터의 고리형 펩티드, 그에 대한 생산 프로세스 및 이를 포함하는 마이코박테리아 관련 질병의 치료 혹은 예방을 위한 약학적 조성물

Info

Publication number: KR101599982B1
Application number: KR1020137030572A
Authority: KR
Inventors: 김종우; 이상욱; 박상진; 서주원; 이인애; 윤태미; 최종근; 이지언; 김진용; 잉 유 진; 스콧 프란츠블라우; 조상현; 웨이 가오; 구이도 파울리; 제임스 맥알파인; 호세 나폴리타노; 비르기트 자키; 브렌트 프리젠; 마리아 플로렌시아 로드리게스 브라스코; 데이비드 랜킨
Original assignee: 명지대학교 산학협력단; 더 보드 오브 트러스티즈 오브 더 유니버시티 오브 일리노이
Priority date: 2011-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2016-03-09
Also published as: CN104144940B; EP2699584A1; CN104144940A; JP5756227B2; KR20140004774A; WO2012144790A1; KR101663234B1; EP2699584B1; KR20150144812A; US9090667B2; JP2014512380A; EP2699584A4; ES2575981T3; US20140142031A1

Abstract

본 발명은 노노무라에아 종 MJM5123(Nonomuraea sp. MJM5123)으로부터 새로운 항결핵 고리형 펩티드(anti-TB cyclic peptides), 항결핵 펩티드 생산을 위한 프로세스 및 이를 포함하는 마이코박테리아 감염의 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 MDR 및 XDR을 포함하는 복제/비복제 M. 결핵에 대항하여 매우 활동적이므로, 결핵 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

노노무라에아 종으로부터의 고리형 펩티드, 그에 대한 생산 프로세스 및 이를 포함하는 마이코박테리아 관련 질병의 치료 혹은 예방을 위한 약학적 조성물{CYCLIC PEPTIDE FROM NONOMURAEA SP., PROCESS FOR THE PRODUCTION THEREOF, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF MYCOBACTERIA RELATED DISEASE COMPRISING THE SAME}

본 출원은 2011.4.18자에 출원된 미국 임시 출원번호 US61/476,473, 2011.7.29자 출원된 US61/513,403, 2011.11.3자 출원된 US61/555,257, 및 2012.3.7자 출원된 US61/607,934 의 이익을 주장하고, 그 내용들은 참조에 의해 여기에 포함된다.

본 발명은 복제/비복제 결핵균, 및 다중 약물 내성 (MDR, multi-drug resistant) 및 광범위한 약제 내성(XDR,extensively drug resistant) 결핵을 포함하는 다양한 약물 내성 결핵균 균주(M. tuberculosis strains)에 대항하여 높은 활성을 갖는 새로운 안티 마이코박테리아 펩티드 (anti-mycobacterial peptides)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 결핵의 예방 및/또는 치료를 위해, 상기 안티 마이코박테리아 펩티드와 그것의 생산 프로세스 및 본 발명의 안티 마이코박테리아 펩티드를 포함하는 그들의 제약 조성물과 준비하기 위한 MJM5123 노노무라에아 종의 균주 배양을 위한 발효 프로세스(furmentation process)에 관한 것이다

결핵균은 인간과 다른 포유 동물에 결핵(TB) 질병을 일으키는 크고 복잡한 박테리아이다. 결핵은 사람의 호흡 경로에 의해 사람에게 전파되는 매우 전염성이 높은 질병이다. MDR-TB보균자 30만명과 HIV보균자들 중 110만 가지 경우를 포함하여 2009년에 940만건의 새로운 결핵 사례가 있었다[WHO 생명을 위한 행동- 결핵 없는 세상을 향해; 세계 보건기구 ; 제네바, 스위스, 2006]. MDR-TB(multi-drug resistant tuberculosis, 다중 약물 내성 결핵)는 최소한 6 개월 이상 2 년까지 연장된 치료 기간이 필요하다. XDR-TB(extensively drug resistant tuberculosis)의 세계적인 출현은 MDR M.결핵 균주(multi-drug resistant M.tuberculosis strains)중 6.6 %로 추정된다[WHO 생명을 위한 행동- 결핵 없는 세상을 향해; 세계 보건기구 ; 제네바, 스위스, 2006].

본 전염병에 대한 예리한 인식에도 불구하고, MDR- 뿐만 아니라 XDR-TB 유행은 계속 증가 추세이다[WHO 세계 보고서 # 4 WHO 항결핵 약제 내성, 2008]. MDR 및 XDR 결핵 균주(tuberculosis strains)의 급속한 출현은 현재의 화학 요법으로는 치료가 어렵거나 사실상 치료 불가능하다. 이러한 균주들은 특히 HIV/AID의 출현이 증가하는 국가 및 개발도상국들에서 주요 세계 보건 위협을 초래한다[Koenig, R. 약물 내성 결핵균. 남아프리카에서 XDR TB와 HIV의 조합은 죽음의 조합임을 증명. Science 2008 319, 894-897].

LTBI(latent TB infection, 잠복 결핵 감염)에 감염된 사람들의 대부분은 증상을 일으키는 원인균들(bacilli)을 포함할 수도 있고, 다른 사람을 감염시킬 위험을 갖고 있지 않을 수도 있다. 명백한 약물이나 질병-매개 면역 억제(obvious drug or disease-mediated immune suppression)를 제외하고, LTBI가 활성 TB 질환(active TB disease)으로 진행하도록 촉발시키는 것이 무엇인지 거의 알려진 바가 없으나, TB가 면역 억제(immunological containment)를 피해갈 수 있으면, 그것은 활성 TB 질환으로 진행한 것으로 간주된다. 영양 실조 및/혹은 면역저하된(immune-compromised) 아동 및 성인들에게 질병 진행의 위험이 증가한다. 2008년에, TB로 희생된 182만명 중 50만명은 HIV 감염자중에서 발생하였고, HIV감염자의 주된 사망요인이 되었다[WHO Global tuberculosis control: a short update to the 2009 report. Geneva, Switzerland:WHO,2009].

따라서, 가급적 새로운 작용 메커니즘을 갖는 새로운 항결핵 약물(anti-TB drugs)의 개발이 긴급하게 요구된다.

복제 / 비복제 M. 결핵(replicating/non-replicating M. tuberculosis ) 및 많은 약물 내성 M. 결핵 균주들에 대항하여 작용하는 새로운 항결핵 펩티드(anti-TB peptides)를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.

항결핵 펩티드의 생산 프로세스 및 각종 마이코박테리아 감염(mycobacterial infections)의 예방 및/혹은 치료를 위한 약학 조성물에서 항결핵 펩티드의 사용을 제공하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.

이러한 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 노노무라에아 종 MJM5123 균주(Nonomuraea sp.　MJM5123 strain)에서 분리된 고리형 펩티드(cyclic peptides)를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서, 본 발명의 고리형 펩티드는 하기 화학식 1 또는 화학식 2를 가질 수 있다.

[화학식 1: H-14]

[화학식 2: H-16]

또한, 본 발명은 마이코박테리아 균종들(mycobacterium spp.) 관련 질환의 예방 및/혹은 치료에 효과적인 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 노노무라에아 종 MJM5123 균주(Nonomuraea sp. MJM5123 strain)에서 분리된 새로운 항결핵 고리형 펩티드(anti-TB cyclic peptides)와 마이코박테리아(Mycobacteria)에 의한 감염을 치료하기 위해 약학적으로 허용되는 담체(a pharmaceutically acceptable carrier)를 포함한다. 본 발명자들은 노노무라에아 종 MJM5123 균주(Nonomuraea sp. MJM5123 strain)를 2012년 4월 3일에서 생명 공학 및 생명 과학 연구원 (KRIBB)의 유형 배양 한국 컬렉션(KCTC)에 기탁하였다(접근번호: KCTC 12178BP).

이하에서 본 발명이 상세하게 기술된다.

본 발명은 마이코박테리아 균종(Mycobacterium spp.), 바람직하게는 노노무라에아종 MJM5123 균종으로부터 분리된 고리형 펩티드를 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서, 본 발명의 고리형 펩티드는 화학식 1 또는 화학식 2를 갖는다. 바람직하게, 본 발명의 고리형 펩티드들은 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123 균주로부터 다음의 절차들을 통해서 분리될 수 있다.

방선균( Actinomycetes ) - 새로운 항결핵 항생제( Anti - TB Antibiotics )에 대한 소스( source )

방선균은 매우 다양한 2차 대사 산물을 생산하는 것으로 알려진 어디에나 있는 토양 생물이다. 다양한 세균성 감염의 치료에 사용되는 몇 가지 항생제들은 스트렙토마이신(streptomycin), 세팔로스포린(cephalosporins), 테트라사이클린(tetracycline), 에리스로마이신(erythromycin), 리팜핀(rifampin), 및 뎁토마이신(daptomycin)을 포함하는 방선균으로부터 유래된다. 오늘날 결핵 치료에 사용되는 세 가지 약물(리팜핀(rifampin), 스트렙토마이신(streptomycin), 사이클로세린(cycloserine))들은 한천 확산 분석(agar diffusion assays)을 사용하여 방선균으로부터 발견되었지만, 이러한 스크린들(screens)은 처음에 결핵(M. tuberculosis)을 사용하여 수행되지 않았다. 이것은 결핵(TB)의 전염성과 때로는 (당시의) 치명적인 결과에 기인하였다. 우리는 지금 M. 결핵 항생제가 몇 클래스들의 항생제들(several classes of antimicrobial agents)에 독특하게 영향받을 수 있다는(susceptible) 이해하기 때문에, 우리는 직접적으로 이러한 병원체에 대항하여 발효 배양액들(fermentation broths)을 스크리닝(screening)하는 것에 대한 과거의 실패는 많은 잠재적으로 유용한 화합물 클래스들이 검출되지 않는 결과를 가져왔다고 가정해야만 한다. 따라서 우리는 M. 결핵의 악성 균주에 대항하여 직접적으로 스크리닝함으로써 이러한 TB 약물 발견 프로그램을 시작했다.

높은 처리량 스크리닝( High - throughput Screening )

순수한 화합물 또는 추출물 하나의 높은 처리량 스크리닝(High-throughput Screening)에 대한 기술은 결핵 연구원(ITR, the Institute for Tuberculosis Research)에서 확립되었다. 한국 명지대학교에서의 유용한 미생물의 추출물 컬렉션 (ECUM)은 한국, 중국, 네팔, 필리핀, 베트남, 남극대륙, 및 북극권으로부터의 7000여 방선균 분리균들(isolates)의 배양 콜렉션(culture collection)을 유지한다. 보다 이국적인 지역들을 포함시키는 것은 희귀하고 새로운 종들의 분리하려는 시도였다.

각 분리균(isolate)은 처음에 세 개의 다른 배양 배지-G.S.S(풍부한 배지(rich medium)), Bennett’s 및 GYC(최소 배지(minimal midium)) 에서 20 ㎖ 배양액에서 발효되었고, 균주 별로 세 개의 추출물이 마이크로플레이트 알마르 블루 분석(MABA, Microplate Alamar Blue Assay)에서 테스트되었고, 보다 우선적으로 처리되었다(prioritized).

MJM5123 의 식별

한국 명지대학교의 유용 미생물 추출물 컬렉션(ECUM)에 저장된 6만5천 이상의 추출물들을 스크리닝한 후, 새로운 방선균 종, 균주 MJM5123으로부터의 균사체(mycelium)의 메탄올 추출물(methanol extract)이 강한 항결핵 활동(anti-TB activity)을 갖는 것이 발견되었다. 균주 MJM5123는 다상 분류학적 접근법(polyphasic taxonomic approach)에 의하여 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.)으로 식별되었다.

생물학적 분석에 의한 분리( Bioassay - guided isolation )

균주 MJM5123가, 진공 액체 크로마토그래피 (VLC, vacuum-liguid chromatography)로 초기 부분 분리(initial fractionation)한 다음 몇 개의 고속 역류 크로마토그래피(CCC: high-speed counter current chromatography) 단계들로 선별정화(targeted purification)하는 것에 기초하는 생물학적 분석에 의한 분리 절차를 위하여 선택되었다.

자연 산물들(natural products)의 바이오활성 원리들(bioactive privciples)에 대한 생물학적 분석 검색은 복잡한 혼합물을 효율적으로 분석(분해)할 수 있는 예비 분석 기법들(preparative analytical techniques)을 필요로 한다[Hostettmann, K.; Marston, A. 고등식물로부터의 새로운 약물 검색. Chimia 2007, 61, 322-326; Hostettmann, K.; Marston, A. 새로운 약물의 아직 미개발 소스로서의 식물들. Nat Prod Com 2008, 3, 1307-1315; Hostettmann, K.; Marston, A.;Wolfender, J.-L. 식물들로부터의 새로운 리드 화합물(lead compounds) 및 약물들에 대한 검색 전략. Chimia 2005, 59, 291-294]. 이 분야에서 현재의 표준 방법들은 칼럼/플래시(column/flash), 진공 및 고성능 액체 크로마토그래피(CC , VLC , HPLC)처럼, 고체 고정상(solid stationary phase)을 사용하는 다양한 형태들의 고체-액체 크로마토그래피이다. 그러나 고체 고정상들(흡착제들)의 사용과 관련된 몇 가지 단점이 있는데, 이것은 생물학적 분석 부분 분리(bioassay-guided fractionation)의 맥락에서 그들의 기능을 상당히 제한한다: 비가역 흡수(irreversible absorption)는 이러한 제한들 중 하나이고, 널리 인식된다[Lindblom, T. 정상 및 역상 HPLC-컬럼(a straight phase and a reverse phase HPLC-column) 상에 디페닐아민(diphenylamine)의 비가역 흡수. 폭발물의 안정성에 연관된 화학 문제들에 대한 심포지엄, [논문집] 1993, 9판, 205-213; Kubo, I. 바이오 활성 자연 산물들의 분리에 역류 크로마토그래피의 최근 응용. J Chrom 1991, 538, 187-191;Sadek, P. C.; Carr, P. W.; Bowers, L. D.; Haddad, L. C. 역상(reversed phase) 크로마토그래피의 팩킹 재료들 상에서 단백질의 비가역 흡수에 대한 방사화학적 연구. Anal Biochem 1986, 153, 359-371]. 따라서, LC 방법들은 재료의 손실(제한된 회복)과 자주 연관되고, 더 중요하게는, 부분 분리 경로(fractionation pathway)에 따라 바이오활성의 감쇠와 연관된다. 이러한 제한들은 역류 크로마토그래피(CCC, counter-current chromatography)에서는 존재하지 않는데, 이는 분리를 달성하기 위해 두 섞이지 않는 용매들 사이의 시료의 파티션(partition)에 전적으로 의존하는 액체-액체 기술(liquid-liquid technique)로서, 그것은 시료 재료(sample material)의 완전한 회복(full recovery)을 허용하고, 따라서 복잡한 자연 산물 혼합물들의 시너지 효과들을 평가할 수 있는 가능성을 제공하기 때문이다. 또한, 그것은 특정 화합물 클래스들의 선별 분리를 위한 이상적인 방법이다. 이와 같이, 우리의 분리 절차는 주로 역류 크로마토그래피(CCC)에 기초한다.

균주 MJM5123가, 순수한 화합물 H-14와 H-16, 두 개의 높은 항결핵 활성 고리형 펩티드의 분리(isolation), 구조 설명(structure elucidation), 및 생물학적 프로파일링(biological profiling)을 위한 충분한 바이오매스(biomass)를 생성하기 위하여, ECUM에서 20 L 발효조들(fermentators)에서 배양, 수확 및 추출되었다.

바이오 활성 성분들의 구조 설명( structure elucidation of bioactive constituents )

H-14와 H-16의 완전한 구조 설명은, 최고의 품질과 최첨단의 1D/2DNMR- 및 펩티드의 X-선 결정학(X-ray crystallography)에 의해 증가된 고해상도 MS-기반 구조 정보를 사용하여 수행된다. 정량적 NMR (qNMR)는 모든 분리 단계의 동시 선택 인식 및 정량 결정(simultaneous selective recognition and quantitative determination)을 위해 사용되었다. QNMR은 활성 분리균들(active isolates)의 순도(purity) 및/혹은 양(quantity)의 결정을 위해서뿐만 아니라, 생물학적으로 활성이지만 여전히 복잡한 화합물의 혼합물들/부분들(compound fractions)을 프로파일링할 목적을 위한 것으로도 최적의 도구이다. H-14 및 그것의 아미노산 잔기들(amino acid residues)의 전반적인 3D 구조는 X-선 결정학(X-ray crystallography)에 의해 결정되었다.

발효 프로세스의 최적화

항결핵 펩티드(anti-TB peptides)의 생산성 향상을 위해, 최적의 발효 프로세스와 비용 효율적인 배지(media)가 개발되었다. 주요 발효는 6일 동안 600 rpm의 교반속도(agitation speed)와 0.3 vvm의 에어레이션(aeration)으로 34 ℃에서 수행되었다. 최종 패킹된 균사체 부피(final packed mycelium volume)는 pH 8.20에서 80 %이었고, 총 당(total sugar)는 1.8 % 미만이었다. 발효 프로세스는 373 ㎎/L의 H-14 를 산출했다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화학식 1 및/혹은 화학식 2의 화합물을 활성성분으로써 포함하는 마이코박테리아 종 관련 질환의 예방 및/혹은 치료에 효과적인 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 실시 예에서, 마이코박테리아 종 관련 질환은 결핵이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시 예에서, 결핵은 MDR 결핵 또는 XDR 결핵일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123 균주로부터 분리된 본 발명의 신규 항결핵 펩티드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(excipient) 및 희석제(diluent)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시 예에서, 본 발명의 고리형 펩티드(cyclic peptides)는 결핵 치료제로 단독으로 처치되거나(treated), 혹은 다른 항 마이코 박테리아제(anti-mycobacterial agent) 중 하나 혹은 적어도 두 종류의 혼합된 조성물과 결합하여 처치될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서, 상기 안티 마이코박테리아제는 이소니아지드(isoniazid), 리팜피신(rifampicin), 에탐부톨(ethambutol) 및 피라지나마이드(pyrazinamide)와 같은 제1선 경구 항결핵제들(a 1st line oral antituberculosis agent)이 될 수 있고; 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin), 카프레오마이신(capreomycin) 및 카나마이신(kanamycin)과 같은 주사용 항결핵제(injectable anti-TB agent)가 될 수 있고; 시프로플록사신(ciprofloxacin), 오플록사신(ofloxacin) 및 목시플록사신(moxifloxacin)과 같은 플루오로퀴놀론(fluoroquinolone)이 될 수 있고; 리파부틴(rifabutin), 프로티오나마이드(protionamide), 에티오나마이드(ethionamide), 사이클로세린(cycloserine), PAS 및 티오아세타존(thioacetazone)과 같은 제2선 경구 항결핵제(a 2nd line oral antituberculosis agent)가 될 수 있고; 리네졸리드(linezolid), 클로파지마인(clofazimine), 아목실린/클라불라네이트(amoxicillin/clavulanate), 및 다이아미노다이페닐설폰의 유도체(derivative of dianomidiphenylsulphone)와 같은 기타 항결핵제가 될 수 있고; 베다퀼린(Bedaquiline), PA-824, 달라마니드(Dalamanid), SQ-109,수테졸리드(Sutezolid), 리파펜타인(rifapentine)과 같이 결핵에 대해 현재 임상시험중인 화합물 및 임상전 개발(pre-clinical development) 중인 화합물, 특히 AZD5847, BTZ043, TBA-354, CPZEN-45, SQ-641, SQ-609, DC-159a, Q201, THPP, 클로파지민(clofazimine)의 리미노페나진 유사체(riminophenazine analogs) 및 붕소(boron)을 포함하는 LeuRS 억제제들(inhibitors)과 같은 화합물(compound)이 될 수 있지만, 항상 그것에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항결핵 고리형 펩티드(anti-TB cyclic peptides)는 경구 투여를 위해서, 예를 들면, 분말, 과립, 정제, 알약, 캡슐, 용액, 현탁액, 에멀젼, 및 시럽들로 제제될(formulated) 수 있다. 담체(carriers), 부형제 및 희석제는 유당(lactose), 덱스트로오스(dextros), 자당(sucrose), 소르비톨(sorbitol), 마니톨(mannitol), 자일리톨(xylitol), 에리스리톨(erythritol), 말티톨( maltitol), 전분(starch), 아라비아 고무(acacia gum), 알지네이트(alginate), 젤라틴(gelatin), 인산칼슘(calcium phosphate), 규산칼슘(calcium silicate), 셀룰로오스(cellulose), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 마이크로크리스탈린셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 물(water), 메틸 하이드록시벤조에이트(methyl hydroxybenzoate), 프로필 하이드록시벤조에이트(propyl hydroxybenzoate), 탈크(talc), 스테아린산마그네슘(Magnesium stearate) 및 미네랄 오일(mineral oil)에 의해 예시된다.

경구 투여를 위한 고형 제제(solid formulations)에는 정제, 알약, 분말, 과립 및 캡슐이 있다. 이러한 고형 제제는, 예를 들어 전분, 탄산 칼슘(calcium carbonate), 자당(sucrose) 또는 유당(lactose), 젤라틴 등과 같은 하나 이상의 적절한 부형제들와 혼합하여 준비될 수 있다. 간단한 부형제들을 제외하고, 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크 등의 윤활제(lubricants)가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 액상 제제는 현탁액(suspensions), 용액(solution), 에멀젼, 및 시럽들이고, 상기 언급된 제제들은 물, 액체 파라핀과 같이 일반적으로 사용되는 단순 희석제에 더하여 습윤제(wetting agents), 감미제(sweeteners), 방향제(aromatics), 보존제(preservatives)와 같은 다양한 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 신규 항결핵 펩티드는 정맥 주사(intravenous injection)를 위해 제제될 수 있다. 정맥(IV)내의 사용을 위하여, 본 발명의 화합물의 수용성 형태는 일반적으로 사용되는 어떠한 정맥 유체 내에서도 용해될 수 있고 주입에 의해 투여될 수 있다. 정맥용 제제들은 담체(carriers), 부형제, 또는 칼슘, 인혈청 알부민(human serum albumin), 구연산(citrate), 초산(acetate), 염화 칼슘(calcium chloride), 탄산(carbonate) 및 기타 소금을 제한 없이 포함하는 안정제(stabilizers)를 포함할 수도 있다, 정맥용 유체는 제한 없이, 생리 식염수 또는 링거액을 포함할 수 있다. 본 발명의 항결핵 펩티드는 또한 주사기들, 캐뉼라(cannulae), 카테터(catheters) 및 선(lines)에 배치될 수도 있다.

비경구 투여(parenteral administration)를 위한 제제들은 수성 또는 비수성 등장성 멸균 주사 용액 또는 현탁액(aqueous or nonaqueous isotonic sterile injection solutions or suspensions)의 형태일 수 있다. 이들 용액 또는 현탁액이 경구 투여를 위한 제제에 사용하기 위해 언급된 담체들 중 하나 이상을 갖는 멸균 분말 또는 과립으로부터 준비될 수 있다. 본 발명의 신규 항결핵 펩티드(anti-TB peptides)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 에탄올, 옥수수 기름, 벤질 알코올(benzyl alcohol), 염화 나트륨(sodium chloride) 및/혹은 다양한 버퍼들(buffers)에서 용해될 수 있다.

근육내, 비경구, 혹은 정맥내 투여 준비를 위하여, 항결핵 펩티드의 살균 제제 혹은 상기 화합물의 적절한 수용성 염 형태, 예를 들어 염산염 소금(hydrochloride salt)이, 주사용 물(Water-forInjection(WFI), 생리 식염수 혹은 5% 포도당(glucose)과 같은 약학적 희석제에 용해되어 투여될 수 있다.

항결핵 펩티드의 적절한 불용성 형태가 또한 수성 염기(aqueous base) 또는 약학적으로 받아들일 수 있는 오일 염기(oil base), 예를 들어, 에틸 올레이트(ethyl oleate)와 같은 긴 사슬 지방산의 에스테르(ester of a long chain fatty acid)인 염기에서 현탁액으로서 준비되고 투여될 수도 있다. 주사가능한 데포 형태(injectable depot forms)가 폴리락타이드-폴리글리콜라이드 (polylactide-polyglycolide)와 같은 생분해성 폴리머(biodegradable polymers)에서 항결핵 펩티드의 미소캡슐화된 매트릭스들(microencapsulated matrices)을 형성함으로써 만들어질 수 있다. 약물 대 폴리머의 비율과 채용된 특정한 폴리머의 성질에 의존하여, 약물 방출 속도(rate of drug release)가 제어될 수 있다. 생분해성 폴리머들은 폴리-오르소에스테르들(poly-orthoesters)과 폴리-무수물(poly-anhydrides)들을 포함한다. 데포 주사 제제들(depot injectable formulations)은 또한 신체조직과 양립 가능한 호환될 수 있는 마이크로에멀젼(microemulsions)에 약물을 인트랩(entrap)함으로써 준비될 수 있다.

눈이나 귀에 적용하기 위하여, 본 발명의 펩티드는 연고, 크림, 로션, 페인트 혹은 분말과 같이 소수성 또는 친수성 염기(hydrophobic or hydrophilic base)로 제제될 수 있다.

직장 투여에 적용하기 위해서, 본 발명의 펩티드는 코코아 버터, 왁스 또는 기타 글리세라이드(glyceride)와 같은 기존의 담체들과 혼합되는 좌약의 형태로 제제될 수 있다.

본 발명의 항결핵 펩티드는 또한 측정된 정량 흡입기(metered dose inhalers) 및 분무기(nebulizers) 등의 흡입기에 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 화학식 1 또는 화학식 2의 항결핵 고리형 펩티드의 제조를 위한 프로세스를 제공한다. 본 발명의 프로세스는 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 액체 배양 배지에서 호기적 조건하에서 안티 마이코박테리아 펩티드(anti-mycobacterial peptide)를 생산하는 노노무라에아 종. (Nonomuraea sp.) MJM5123 균주의 미생물을 배양하는 단계; 발효된 균사체로부터 본 발명의 항결핵 고리형 펩티드를 분리하는 단계.

본 발명의 일 실시 예에서, 상기 항결핵 고리형 펩티드를 분리하는 위한 단계는 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 용리액으로 메탄올(methanol)과 클로로포름(chloroform)을 사용하여 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123 균사체의 메탄올 추출물의 진공 액체 크로마토그래피 (VLC)를 수행하는 단계; 용리액으로 메탄올을 사용하여 세파덱스 LH-20 오픈 칼럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 open column chromatography)를 수행하는 단계; 및 용매로서 HEMWat +2를 사용하여 고속 역류 크로마토그래피 (HSCCC: High Speed Countercurrent Chromatography)을 수행하는 단계.

본 발명의 또 다른 실시 예에서, 상기 항결핵 고리형 펩티드를 분리하기 위한 단계는 다음의 단계들을 포함할 수 있다: 용매로 메탄올을 사용하여 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123 균사체를 추출하는 단계; 액체 메탄올을 만들기 위하여 메탄올 추출액의 30 %까지 물을 첨가하는 단계; 헥산(hexane)을 사용하여 메탄올 추출물을 탈지하는 단계; 액체층을 분리하고 65 %까지 액체 메탄올을 조정하는 단계; 클로로포름을 사용하여 상기 액체층을 추출하는 단계; 메탄올을 사용하여 상기 클로로포름 추출물을 농축 및 용해하는 단계; 용리액으로 메탄올을 사용하여 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column Chromatography)를 수행하는 단계; 및 역상 겔(RP-18)로 채워진 칼럼이 갖추어진 HPLC수행하는 단계.

새로운 항결핵 고리형 펩티드는 결핵에 대한 치료제로써 효과적으로 사용될 수 있도록, 단일 약물 내성 결핵 균주, MDR(multi-drug resistant) 및 XDR-TB(extensively drug resistant tuberculosis)를 포함하는 복제/비복제 M. 결핵에 대항하여 강한 활성과 포유 동물 세포에 대해서는 매우 낮은 사이토 독성(cyto-toxicity)을 갖는다.

도 1은 미생물 추출물 라이브러리 구축(establishment of microbial extract libraries)을 위한 프로세스를 보여준다.
도 2는 본 펩티드의 추출 프로세스의 개요를 보여준다.
도 3은 28 ℃에서 2주 동안 ISP3 배지(ISP3 medium)에서 성장된 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.)의 주사 전자 현미경 사진을 보여준다.
도 4는 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123의 전체 세포 가수분해(hydrolysate) 분석의 결과를 보여준다.
도 5는 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123의 극성 지질 프로파일(polar lipid profile)을 보여준다. 플레이트들(plates)은 전체 지질들을 검출하기 위한 몰리브다토포스포릭 산(molybdatophosphoric acid)(a), 아미노지질(aminolipids)을 검출하기 위한 닌히드린(ninhydrin)(b), 인지질(phospholipids)를 검출하기 위한 몰리브덴 블루(molybdenum blue)(c), 및 글루코지질(glucolipids)을 검출하기 위한 알파-나프톨설퍼릭 산(α-naphtholsulfuric acid)(d)가 살포되었다.
도 6은 클러스탈-엑스(CLUSTAL-X)에 의한 데이터의 다중 정렬 뒤에 구축되고, NCBI 데이터베이스로부터 이용가능한 16S rDNA 시퀀스들(sequences)에 기초한 계통발생(phylogenic) 분석을 보여준다. [Thompson, J. D.; Gibson T. J.; Plewniak, F.; Jeanmougin, F.; Higgins, D. G., The CLUSTAL_X windows interface: 품질 분석 툴의 도움으로 다중 시퀀스 정렬을 위한 유연한 전략. 핵산연구학회지(Nucleic Acids Res )　1997,　25, 4876-4882].
도 7은 주요 발효에서 항결핵 화합물들의 활성과 바이오매스(biomass)의 그래프 를 보여준다(DCW;건조세포무게(dry cell weight), PMV; 포장 균사체 볼륨, 활성(packed mycelium volume, activity); 종이 디스크 확산 분석(paper disk diffusion assay)에 의해 마이코박테리아 스메그마균(Mycobacterium smegmatis) mc2155에 대항하는 성장 억제 존(zone of growth inhibition).
도 8은 느린 증발 방법을 사용하여 성장된 H-14의 결정들(crystals)을 보여준다. 가장 긴 치수는 약 0.5 mm이었다.
도 9는 H-14의 3D 구조를 보여준다.
도 10은 0.83 해상도에서 선택된 잔류물들, 트립토판(tryptophan)(W10), 페닐알라닌(phenylalanine)(F12), 트레오닌(threonine)(T5) 및 이소류신(isoleucine) (I3)의 전자 밀도 맵(electron density map)를 보여준다.
도 11은 본 발명의 고리형 H-14 펩티드의 구조적 배열을 보여준다.
도 12는 본 발명의 고리형 H-16 펩티드의 구조적 배열을 보여준다.
도 13은 도 15와 도 16에 있는 특별한 아미노산 잔기(amino acid residues)를 보여준다.

본 발명의 실용적이고 현재 선호되는 실시 예들이 다음의 예에서 나타나듯이 예시된다.

그러나, 당업자는 본 발명의 개시된 바를 고려함으로써, 본 발명의 사상과 범위 내에서 수정 및 개선할 수도 있다는 것이 이해될 것이다.

<예 1> : 높은 처리량 스크리닝( high - throughput screening )을 위한 미생물 추출물 라이브러리( microbial extract libraries )의 준비

약 7,000 방선균 분리균(actinomycetes isolats)은 고산지역, 열대지역, 극지방, 사막, 화산 등과 같은 독특한 기후 조건 및 생태계들을 갖는 지역에서 수집 된 토양 시료에서 분리되었고, 한국 명지대학교 유용 미생물 추출물 컬렉션 (ECUM)에 의해 유지되고 있다. 9가지의 서로 다른 추출물들이 각 항결핵 후보들을 스크리닝하기 위해 각 분리균(isolate)으로부터 준비되었다. 첫째, 각각의 분리균은 G.S.S, 베넷( Bennett’s), 그리고 GYC의 30 ㎖로 배양되었다. 균사체 및 배양액이 원심분리에 의해 분리된 후, 상기 균사체는 메탄올로 추출되었고 상기 배양 상청액(culture supernatant)은 각각 에틸 아세테이트와 물로 분할되었다. 마지막으로, 세 가지 배지에서 배양된 각 미생물 분리균으로부터 아홉개의 유기 및 수용성 추출물들이 진공 증발에 의해 농축 건조되었고, -70 ℃에서 급속냉동기에 보존되었다. (도 1, 도 2, 표 1)

[표 1]

<예 2> 대규모 스크리닝

ECUM의 각 방선균 분리균은 처음 세 개의 서로 다른 배양 배지- G.S.S (풍부한 배지), 베넷 과 GYC (최소 배지)-에서 20 ㎖ 배양액에서 발효되었다. 상기 균사체는 메탄올로 추출되고 배양 상청액은 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 추출되었는데, 이것은 이어서 물로 분할되어 분리균당 9개의 추출물들을 생성했다.

100 ㎕의 분취량(aliquot)이 96-웰 플레이트들(96-wel plates)에서 건조되고 명지대학교에서 UIC로 발송되었는데, 100 ㎕ DMSO에서 가용성으로 하고, 시험 배양액에서 1:100 희석되었다.

~ 63,000 추출물의 HTS는 마이크로 알마르 블루 분석(MABA, Micro Alamar Blue Assay)의 형광 측정 값(fluorometric readings)에 의해 결정되는 7H12 배지에서 결핵균(M.tuberculosis) = 90 % 억제(inhibition)(C 소스로서의 팔미트 산(palmitic acid))으로 349 추출물들(0.55 %)을 산출하였다. 그 다음 초기 히트들(hits)의 90은 ECUM에서 1 리터 규모로 재발효되었고, 그 뒤에 추출물당 6개의 프랙션들(fractions)들을 산출하기 위해, 상기 추출물들이, 메탄올 - 물 변화 20-100%(MeOH-water gradient 20-100%) 다음에 클로로포름(CHCl3 )100 % 로 고체상 반전 실리카 겔 추출(solid phase reversed-silica gel extraction)로 UIC에서 분류되었다(fractionated). 프랙션들은 다음의 항목들로 생물학적으로 프로파일링되었다: 1) 포유류 세포 독성 ( VERO 세포 IC50 ); 2) 비복제 결핵균(M. tuberculosis)에 대항하는 활성 (LORA ); 3) 리팜핀(rifampin), 이소니아지드(isoniazid)(INH ), 스트렙토마이신(streptomycin)(SM ), 카나마이신(kanamycin)( KM ), 카프레오마이신(capreomycin)(CAP), 싸이클로세린 (CS), (또 우리가 단지 이러한 방선균-유래 항생제를 찾는 것이 아니라는 것을 분명히 하기 위하여) 또는 목시플록사신(moxifloxacin)(MOX )에 내성을 갖는 결핵균 균주들(M. tuberculosis strains)에 대항하는 활성; 4) 스메그마균(M. smegmatis), 황색 포도상 구균(S. aureus), 대장균(E. coli) 및 씨. 알비칸스(C. albicans)에 대항하는 활성. 이러한 결과들에 기초하여, 20 방선균 균주들은 추가 조사를 위해 우선 순위가 부여되었다

<예 3> MJM5123 의 식별

형태학적 및 배양 특성들의 결정( Determination of morphological and cultural characteristics )

MJM5123는 한국, 한라산에서 수집된 토양 시료로부터 분리되었다. 상기 균주의 속(genus)은 세포 벽 구성 요소의 특성 형태와 화학적 분석에 의해 식별되었다. 형태학적 및 배양 특성들을 결정하기 위하여, 상기 균주를 효모 추출물 맥아 추출물 한천(yeast extract malt extract agar) (ISP2), 오트밀 한천(ISP3), 무기 염 전분 한천(ISP4), 글리세롤 아스파라긴 한천(ISP5)과 같이 국제 스트렙토마이시스 프로젝트 (ISP;International Streptomyces Project) 배지에서 28 ℃에서 2주 동안 성장시켰다(Shirling, E.B. 와 D. Gottlieb, 스트렙토마이시스 종들의 특성화 방법. Int J Evol Microbiol. 1966 16(Pt3):313-330 ). 상기 집락 색상들(colony colors)이 색상 하모니 설명서(Jacobson, E., W.C. Grauville, 외, Color Harmony Manual. 1958. 시카고, Container Corporation of America)를 사용하여 결정되었다. 포자들(spores)과 균사체는 전자 현미경 (히타치, S-3500N, 일본)을 스캔하여 관찰되었다(도 3).

[표 2]

기균사체(aerial mycelium) 의 성장과 포자형성은: ++, 우수(good); +,보통(moderate); ±, 불량(poor); -, 성장없음 또는 포자형성 없음으로써 스코어링된다.

상기 균주는 ISP2 배지에서 잘 성장하고, 다른 배지에서 보통의 성장을 보여 주었다. 영양 균사체(vegetative mycelium) 및 기균사체의 색상은 확산성 색소가 없는 베이지 색이었다. 흰색 포자들은 오트밀 배지(ISP3)에서만 형성되었고, 주사 전자 현미경은 기균사체 상에 주름진 포자들의 나선형 사슬을 보여주었다.

멜라노이드(melanoid) 색소에 대해 테스트하기 위해, 펩톤 효모 추출물 철 한천(peptone yeast extract iron agar) (ISP6)과 티로신 한천 (ISP7, 티로신(tyrosine)을 가지고, 또는 티로신 없이)이 사용되었다. 성장을 위한 온도 범위, 염화나트륨(NaCl) 내성과 pH 범위가 ISP3 배지에서 결정되었고 항생제 내성 시험은 28℃에서 2주간 ISP2 배지에서 수행되었다.

[표 3]

특성들은 (++), 긍정적(positive); (+), 보통(moderate); (-), 부정적(negative)으로 스코어링된다.

MJM5123은 멜라닌을 생산하지 않고 영양 공급원으로서 티로신을 흡수하고(assimilate), 상기 균주는 pH 5.0~ 9.0 , 0 ~ 3.0%의 NaCl에서 성장할 수 있었고, 20℃ ~ 37℃에서 좋은 성장을 보였다. MJM5123은 아프라마이신(apramycin), 카나마이신(kanamycin), 반코마이신(vancomycin) 및 티오스트렙톤(thiostrepton)에 대해서는 취약하였지만(susceptible) 암피실린(ampicillin)에는 내성을 갖는다. [표 4]

특성들은 (+)긍정적;(-)부정적으로 스코어링된다.

ISP9 한천 배지가 유일한 탄소 소스로서 탄수화물의 이용을 시험하는 기초 배지(basal medium)으로 사용되었다. 탄수화물 (Sigma-Aldrich, CAR10)의 원액(stock solution)(10 % W / V)는 여과에 의해 멸균되었고 1.0 %의 최종 농도에서 ISP9 배지를 오토클레이브(autoclave)하기 위해 첨가되었다. MJM5123은 헥소오스(hexoses), 펜토오스(pentose), 알코올 당(alchol sugars) 및 이당류(disaccharide)를 사용하였다 (표 5).

[표 5]

특성들은 (+ +) 긍정적; (+) 보통; (-) 부정적으로 스코어링된다.

화학분류학적 특성의 결정( Determination of chemotaxonomic characters )

세포벽 구성 요소들의 화학분류학적 특성에 대해서, 동결 건조된 균사체들이 28℃에서 7일 동안 회전 진동기상의 TSB 배지(TSB, tripticase soy broth)에서 성장시켜 준비되었다. 글리신과 디아미노피멜산(DAP, diaminopimelic acid)의 입체 이성체들(seteroisomers)이 TLC에 의하여 결정되었다[Becker, B.; Lechevalier, M. P.; Gordon, R. E.; Lechevalier, H.A. 전체-셀 가수분해물들의 종이 크로마토그래피에 의한 스트렙토마이시스와 노카르디아 사이의 신속한 분화(rapid differentiation). Appl Microbiol 1964, 12, 421-423]. 드라이 셀(dry cell) 5 ㎎을 1 ㎖ 6N 염산과 함께 작은 앰플 안에 봉인하였다. 앰플은 오븐에서 100℃에서 하룻밤 동안 보관되었다. 공랭된 가수 분해물이 워트맨(Wattman) 1번 여과지로 여과도되었다. 여과액은 농축 건조되고 증류수 0.3㎖ 에 용해하였다. 상기 용액의 2 ㎕ 를 TLC 플레이트상에 떨어뜨리고(Merck, TLC 셀룰로오스 F 유리 플레이트 번호 105,718), 메탄올: 증류수 : 6N 염산 : 피리딘(80:26:4:10, vol/vol)의 용매계(solvent system)로 4시간 동안 성장시켰다. 공기 건조 후, 0.2 % 닌히드린 용액(아세톤에서) 분무하고 100 ℃에서 3분간 가열하여 스팟들(spots)을 드러냈다. 0.1MD , L - DAP (시그마 올드리치, 번호 D-1377) 1 ㎕ 와 0.1M 글리신 (시그마 올드리치, 번호 50046) 1 ㎕가 정격 표준(authentic standards)으로 사용되었다. 글리신과 D, L - DAP 스팟들은 회색-녹색(gray-green)으로 시각화되었다.

당류 분석(saccharide analysis)이 Lechevalier의 약간 수정된 방법으로 수행되었다. 드라이 셀(dry cell) 50 ㎎이 1N 황산 2.0 ㎖를 가진 밀봉된 앰플에서 2 시간 동안 끓였다. 냉각된 가수 분해물이 50 ㎖ 원추형 원심 튜브로 옮기고 pH가 포화 수산화 바륨에 의해 5.4로 조정되었다. 원심 분리 후 ,상층액은 0.3 ㎖까지 농축되고 불용입자들은 원심 분리에 의해 제거하였다. 용액 1 ㎕를 플레이트(Merk , TLC 셀룰로오스 F 유리 플레이트 번호 105718 (Merck, TLC Cellulose F glass plate no. 105718))TLC 상에 로딩(loading)하였다. 크실로오스(xylose), 아라비노스(arabinose), 갈락토오스(galactose)를 포함하는 제1 당류 (시그마 올드리치 , car10 )표준과, 람노스(rhamnose), 리보오스(ribose), 마노스(mannos), 포도당(glucose)을 포함하는 제2 (시그마 올드리치 , CAR10 ) 당류 표준이 n-부탄올(n-butanol):증류수:피리딘(pyridine):톨루엔(toluene)(10:6:6:1, vol/vol) 용매계로 1% 농도로 각각 4시간 동안 적용되었다. 아닐린 프탈에이트 용액(aniline phthalate solution)(물 포화된 부탄올 100 ㎖ 에 용해된, 3.25 g의 아닐린 수소 프탈에이트(TCI-GR, No. P0284))을 분무한 후에, TLC 플레이트를 100℃에서 4분간 가열하였다. 글리신(glycine)과 D, L-DAP는 MJM5123 의 펩티도글리칸(peptidoglycan )의 구성 성분들이고, 주요 당들은 전체 세포 가수분해물들에서 크실로오스, 갈락토오스, 마노스, 포도당이었다(도 4).

극성 지질들(polar lipids)과 메나퀴논(menaquinones)들이 Minnikin et al. 등의 방법에 의해 추출되었다. [Minnikin, D. E.; O'Donnella, A. G.; Goodfellowb, M.; Aldersonb, G.; Athalyeb, M.; Schaala, A.; Parlett, J. H. 세균 아이소프레노이드 퀴논 및 극성 지질의 추출을 위한 통합된 절차. J Microbiol Methods 1984, 2, 233-241)]. 메탄올: 증류수 ( 100:10, vol/vol) 2 ㎖ 와 석유 에테르 2 ㎖ 를 드라이 셀(dry cell) 50㎎에 첨가하고 15분 동안 혼합하였다. 상부 층은 새 유리병에 옮겨졌다. 석유 에테르 1 ㎖를 하부 층에 첨가하여 혼합하였다. 조합된 상부 층들은 상온에서 질소 가스 하에서 증발되었고, 잔류물이 메나퀴논들(menaquinones)의 분석에 사용되었다. 극성 지질들이 하부 층으로부터 추출되었다. 하부 층은 5 분 동안 끓는 물 용기 내에서 가열되었다. 37℃로 냉각 후에, 클로로포름 : 메탄올 : 물 (90:100:30, vol/vol) 용액 2.3 ㎖을 첨가하여 60분 동안 혼합되었다. 원심 분리 다음에 상청액이 새 튜브로 옮겨졌다. 클로로포름:메탄올:물(50:100:40, vol/vol) 용액 0.75ml를 5분 동안 혼합하여 하부 층이 추출되고, 상청액은 상기 튜브와 조합되었다. 이 단계를 한번 더 반복하였다. 수집된 상청액은 클로로포름 1.3 ㎖와 0.3 % 염화나트륨 용액 1.3 ㎖와 함께 완전히 혼합되었다. 원심분리하여 분할한 후에, 상부 층은 버리고 하부 층을 실온에서 질소 가스 하에서 건조하였다. 극성 지질 추출물을 클로로포름: 메탄올 (2:1, vol/vol) 60㎕에 용해시키고, 용액 10㎕를 TLC 플레이트(Merk, TLC 실리카 겔 60 F254 유리 플레이트 번호 105729 )상에 떨어뜨리고(spot), 클로로포름 : 메탄올 : 증류수 ( 65:25:4, vol/vol)를 이용하는 2차원 TLC 방법으로 식별하였고, 현상 용제(developing solvent)로서 클로로포름 : 메탄올 : 증류수 (40:7.5:6:2, vol/vol)를 이용하였다. 극성 지질들(polar lipids)이 4개의 시약들(reagents), 에탄올 내의 5 % 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid) 용액(시그마 올드리치, P4869) , 물 포화 N- 부탄올에서 0.2 % 닌히드린 용액(시그마 올드리치, N4876 ), a-나프톨 황산과 몰리브덴 블루(시그마 올드리치, M1942)를 가지고 분무함으로써 시각화되었다.

극성 지질 분석 결과로 MJM5123의 극성 지질은 포스파티딜에탄올아민(PE;phosphatidylethanolamine), 디포스파티딜글리세롤 (DPG;diphosphatidylglycerol), 포스파티딜모노메틸에탄올라민 (PME;phosphatidylmonomethylethanolamine), 포스파티딜이노시톨 만노사이드 (PIM;phosphatidylinositol mannoside), 알 수 없는 인지질(PL;phospholioid) 및 알 수 없는 극성 지질(L)로 구성됨이 밝혀졌다(도 5).

세포 지방산들(cellular fatty acids)이 기체 크로마토그래피와 결합된 미생물 식별 시스템(MIDI; Microbial Identification System 버전 4.5)를 사용하여 분석되었고, ACTIN6 데이터베이스로 식별되었다. 주요 세포 지방산은 iso-C16:0(25.5 %)이었고, 각종 다른 지방산들도 검출되었다(표 6).

[표 6]

값들은 전체 세포 지방산의 비율이다. 1.0 % 이하의 극소량은 표시되지 않는다.

계통 발생 분석( Phylogenetic analysis )

16S rDNA가 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, SEQ. ID. NO : 1)과 1492r (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3', SEQ. ID. NO : 2)의 프라이머 쌍(primer pair)을 가진MJM5123 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 증폭된 DNA는 ABI 3730XL 모세관 DNA 시퀀서 상에 위에서와 같은 프라이머들을 사용하여 시퀀싱되었다(sequenced)(Applied Biosystems, USA). 컴퓨터를 이용한 16S rDNA의 비교가 http://www.ncbi-nlm-nih.gov에서 이용가능한 NCBI BLAST를 사용하여 수행되었다.

계통수(phylogenetic tree)가 MEGA4.0 소프트웨어를 이용하여 이웃 접합 방법(neighbor-joining method)에 의해 구성되었다. 계통수를 위한 분기 지지(branch support)가 1000개의 부트 스트랩(bootstrap) 복제에 의해 생성되었다.

BLAST 검색에 따르면, 16S rDNA 시퀀스는 노노무라에아 루브라(Nonomuraea rubra) DSM 43768T, 노노무라에아 로제올라(Nonomuraea roseola) DSM 43767T와 98% 유사성을, 및 노노무라에아 디에트지아에(Nonomuraea dietziae) DSM 44320T와 97% 유사성을 보였다. 계통 발생 분석으로 MJM5123이 Nonomuraea 패밀리에 속하였지만, 밀접한 관련이 있는 균주들(strains)로부터 서로 다른 하위 계통분기(subclade)에 위치해 있다.

소프트웨어 패키지 MEGA, 버전 4.0을 사용하여, 이웃 접합 방법을 사용하면서, 거리들이 얻어지고(Kimura-2 모델에 따라 거리 옵션들을 사용하여), 클러스터링(clustering)이 수행되었다. 1000개의 복제들에 기초한 부트 스트랩 값들은 분기점에서 백분율로 리스트된다(listed). 막대(bar)는 뉴클레오티드(nucleotide) 당 0.002 치환들(substitutions)를 나타낸다(도 6).

밀접하게 관련된 균주( strain )와의 DNA 연관성( DNA relatedness )

밀접하게 관련된 균주들과 DNA-DNA 관계성이 마이크로플레이트 하이브리드화 방법(microplate hybridization method)을 사용하여 형광 분석에 의해 평가되었다. DNA-DNA의 관계성 값들은 MJM5123가 별도의 게놈 종(genomic species)을 나타냈다는 것을 표시하는 34%~65% 였다(표 7).

[표 7]

본 발명자들은 2012년 4월 3일에 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123 을 한국 생명 공학 및 생명 과학 연구원 (KRIBB)의 한국 기준 배양 켈렉션 (KCTC;Korea Collection for Type Cultures)에 기탁했다(기탁번호: KCTC 12178BP).

<예 4> 발효 프로세스의 최적화

항결핵 펩티드의 생산성 개선을 위해서, 최적의 발효 프로세스와 비용 효율적인 배지가 개발되었다. 균주 MJM5123는 포도당, 과당, 맥아당, 갈락토오스, 크실로오스, 수크로오스, 글리세린, 콩 기름, 전분, 덱스트린, 아미노산, 효모 추출물, 췌장 소화된 카제인, 쇠고기 추출물, 펩톤, 맥아 추출물, 오트밀, 대두분(콩가루), 효소 분해된 대두분, 목화씨 가루, 옥수수 침지액, 무기염류 등등과 같은 다양한 탄소 및 질소 공급원들을 이용할 수 있다. MJM5123 는 넓은 범위의 온도와 pH(20℃ ~ 40℃ 사이, pH 5.0 ~ 9.0)에서 성장하였다. 그러나 접종(inoculation) 전에 초기 배지 pH를 ~ 7.2로 조정하는 것이 유리하다. 발효 온도를 34 ℃로 유지했을 때, 가장 효율적인 성장과 역가(titer)가 달성되었다. 각 단계에 대한 3 단계 발효 절차 및 배지가 비용 효율적인 생산과 후속 처리의 용이성을 위해 다음과 같이 개발되었다.

[표 8]

[표 9]

[표 10]

기계적이고 재생산 가능한 처리를 위해서, 냉동 영양 균사체(FVM: frozen vegetative mycelia)가 다음과 같이 준비되었다; 28℃에서 7일 동안 ISP 3 배지에서 성장된 단일 균사가 SC 배양액 70ml를 포함하는 500ml 배플 플라스크에 접종되고(inoculated), 3일간 200rpm의 진동 속도로 34℃에서 배양하였다(incubation). 전체 배양액은 50 % 글리세롤과 완전히 혼합하고 영양 균사체-글리세롤 혼합물을 사용하기까지 -80℃에서 보관하였다.

상기 냉동영양균사체(FVM)는 10 % v/v로 상기 활성화 배양을 개시하는 데 사용되었다. 활성화 단계는 54시간 동안 200 rpm의 진동 속도로 34℃에서 수행되었다. 이 활성화 단계를 통해, 패킹된 균사체 볼륨(PMV)은 15 %이었고 pH는 7.58이었다. 상기 어린 활성 영양 배양액이 10 % v/v에서 종 배양(seed culture)을 위해 사용되었다. 두 번째 종 배양은 60시간 동안 200 rpm의 진동 속도로 34℃에서 유지되었다. 상기PMV와 pH는 각각 43 %, 7.48이었다. 상기 종 배양액은 10 % v/v에서 주 발효 배지로 옮겨졌다. 주 발효는 144시간 동안 34℃에서 교반속도(agitation speed) 800rpm, 통기(aeration) 0.3 vvm에서 수행되었다. 최종 PMV는 pH 8.20에서 80%이었고, 총 당은 1.8% 미만이었다. 발효 과정은 373mg/L의 H-14를 산출하였다(도 7).

<예 5> 노노무라에아 종( Nonomuraea sp .) MJM5123 균주로부터 새로운 항결핵 펩티드들인 H-14와 H-16의 분리.

분리( Isolation ) 예 1:

20개의 우선순위화된 방선균 균주들 중 하나인 균주 MJM5123이 대규모 발효되었고, 그것의 유효한 프랙션들(fractions)이 아래에서 설명된 방법에 의해서 예 1에서 분리되었다.

활성과 선택성 지수(activity and selectivity index)를 모니터링하기 위하여 MABA, LORA 및 베로 세포(Vero cell) 독성(toxicity)을 이용하여 생물학적 특성화와 병행하여, 균종 E5123의 대규모 균사체 메탄올 추출물이 화학적 부분분리 프로세스(chemical fractionation process)를 겪었다. 활성 성분의 부분 분리 및 분리(iolation)는 크로마토그래피 분리의 세 단계들을 관련시켰다. 20%에서의 물/메탄올 변화량(gradient) 단계들을 사용하여 역상 실리카 겔(reversed phase silica gel)상에 상기 추출물(128.7g)의 진공 액체 크로마토그래피(VLC)는 7개의 화학적으로 별개의 프랙션들, VC-1 내지 7을 산출했다. 각각 100% 메탄올과 100% 에탄올로 용출된 프랙션들, VC-6 과7 에 대해서, MIC < 0.76, 0.74μg/ml가 관찰되었다. VC-6 및 7 이 재결합되고(8.47g), 용리액(eluent)으로서 100% 에탄올을 세파덱스(Sephadex) LH-20 오픈 칼럼 상에 81프랙션들로 더 분리 되어(separated), S-1에서 11까지11개의 재결합된 프랙션들의 패널(panel)을 산출하였다(TLC에 의해). 섭브프랙션들(subfractions), S-2와 S-3에 대해서 MIC들은 <0.21μg/ml이었다. S-3(374mg)는 GUESS 방법에 의하여 가장 적합한 용매계(solvent system)로서 선택된 HEMWat+2로 고속 역류 크로마토그래피(HSCCC)에 의하여 110 프랙션들로 분리되었다[Kubo, I. 생리 활성 자연 산물들(bioactive natural products)에 역류 크로마토그래피의 최근의 적용들. J Chrom 1991, 538, 187-191]. 이들 프랙션들은 H'-1 에서 H'-11까지 11 프랙션들의 패널에 재결합되었다. 서브프랙션들 H-4, H-6, H-8, 및 H-9에 대해서 MIC는 <0.391μg/ml이었다. S-2(177mg)이 HEMWat+2로 HSCCC에 의해서 140 프랙션들로 더 분리되었고, H-1에서 H-26 까지 26 프랙션들의 패널에 재결합되었다. H-3, H-5, H-7, H-9 내지 H-23까지에 대해서 MIC는 <0.5μg/ml이었다. 활성 펩티드 프랙션들 중에서, H-14 와 H-16 (8mg, 수득률(yield)=0.4mg/L)가 qHNMR 분석에 의하여 가장 순수하였고, 따라서 구조적 설명(structural elucidation)을 위해 선택되었다. ¹HNMR 스펙트럼들의 유사성에 따라서, H-11 는 H-15로 그리고 H'-6 는 H'-8로 재결합한 후, H-14 (약 80% 순도) 189mg이 얻어졌다(수득률= 9.45mg/L). 활성 펩티드들의 전체 양은 약 369mg이고 수득률은 18mg/L 이다.

분리 예 2 :

MJM5123의 발효에 의해 생성된 항결핵 화합물들은 주로 세포 내부에서 유지되었다. 항결핵 화합물들은 균사 케이크(mycelial cake)에서 추출되었다; 위에서 언급된 바와 같이, 후자는 전체 발효액의 여과에 의하여 발효과정으로부터 수확되었다. 균사 케이크의 추출은 메탄올로 가장 효과적이었지만, 에탄올, n-프로판올(n-propanol), 이소프로판올(isopropanol), 아세토 니트릴(acetonitrile), 아세톤(acetone), 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 클로로포름 등의 기타 유기 용매들도 사용될 수 있다. 미가공의 항결핵 활성 화합물은 적당한 용량으로 추출물의 증발 및 용매-용매 분할(solvent-solvent partitioning)을 포함하는 루틴 프로세스에 의해 추출 용액으로부터 회복되었다(recovered).

메탄올 추출물은 37℃ 진공(vacuo)에서 농축되었고, 70 % 메탄올을 얻기 위해 상기 농축된 용액에 탈이온수(deionized water)가 첨가되었다. 물 혼합물은 n-헥산과 탈이온수수의 한 용량(one volume)으로 희석된 탈지된 용액으로 분할함으로써 탈지되었다. 이것은 한 용량의 클로로포름으로 추출되었고, 항결핵 활성 화합물을 포함하는 클로로포름 층은 탈 이온수로 흔들어 세척되었다. 상기 클로로포름 층의 건조는, 100 % 메탄올에 용해되었고, 100 % 메탄올과 평형을 이루는 세파덱스 LH- 20에 적용된 노란색 고체를 산출하였다. 항결핵 활성 화합물은 100 % 메탄올 용리로 입체 배제 크로마토그래피(steric exclusion chromatography)로 풀링되었다(pooled). 강력한 항결핵 활성을 보이는 H -14 와 H -16는 이동상(mobile phase)으로서 20μM 인산나트륨(pH 8.0)으로 완충된 35% 수성 아세토니트릴 용액과 역상 C-18 칼럼을 이용하는 고성능 액체 크로마토그래피로 완전히 정제되었다. 정제된 프랙션들은 아세토 니트릴을 제거하기 위하여 기화되었고 클로로포름으로 추출되었다. 마지막으로,클로로포름 층들은 건조 농축되었고, 높은 수준으로 정제된 H-14와 H-16은 구조 결정 및 체외 항결핵 활성을 포함한 추가 연구대상이었다.

<예 6> 항결핵 고리형 펩티드 H-14의 구조 설명

H-14 는 균사체의 MeOH 추출에 의하여 얻어진 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123의 대사산물(metabolite)이다. H-14에 대한 분자식은 고해상도 질량 분석(high resolution mass spectrometry)과 ¹H, ¹³CNMR에 의하여 결정된 바와 같이 C₈₃ H₁₃₄ O₁₇ N₁₄ 이다.

H-14은 광 활성 밝은 노란색 분말(optically active light yellow powder)로서 분리되었다. 고해상도 질량 스펙트럼은 1600.0189 m/ z 에서 양이온 피크 [M+H]⁺ 를, 1621.9982 m/z에서 양이온 피크 [M+Na]⁺ 를 보여주었고, 1599.0111의 정확한 질량을 나타낸다. IR 스펙트럼은 멀티플 아미드 모이어티스(multiple amide moities) (1632.16cm^-1)의 존재를 암시한다. UV 스펙트럼은, H-14가, 211nm (= 54209 M^-1cm^-1, 48, 25℃, methanol에서), 219nm (= 55266 M^-1cm^-1, 48, 25℃, 메탄올에서), 263nm (= 7925 M^-1cm^-1, 48, 25℃, 메탄올에서), 281nm (= 6465M^-1cm^-1, 48, 25℃, 메탄올에서), 및 291nm (= 5839M^-1cm^-1, 48, 25℃, 메탄올에서)에서의 흡수대역들로, 아로마 잔류물을 갖는 펩티드임을 시사하였다. CD 스펙트럼은 H-14가, 220nm (25℃, 아세토니트릴에서)에서 몰 타원률(molar ellipticity)이 1918530 degcm² mol^-1이고, 196nm (25℃, 아세토니트릴에서)에서 616094degcm² mol^-1인, H-14 는 역평행-β시트 구조(antiparallel β-sheet structure)인 펩티드임을 시사하였다.

이 분자의 상대적으로 큰 크기에도 불구하고, NMR 스펙트럼들은 허용가능한 신호 분산을 보였고, 따라서 구조 정보의 가치있는 소스가 되었다. 메탄올-d3에서 ¹HNMR 스펙트럼은 교환 시 완전히 중수소화된 메탄올로 사라지는 9.20 ppm 및 7.72 ppm의 사이의 8 교환가능한 양성자 신호들을 디스플레이했다. 또한, 신호들이 하나의 페닐 그룹과 다른 아로마 시스템에 대하여 는 아로마 영역 코딩(coding)에서 나타났고, 더블릿들(doublets)이 20 지방족 메틸 그룹들(aliphatic methyl groups)에 대응하는 해당하는 0.73 내지 1.33 ppm에서 발견되었다. 펩티드의 경우에 대해서는 놀랍게도, 2.16, 2.31, 3.14, 3.23, 3.26, 3.33, 및 3.82 ppm에서 일곱 개의 싱글릿들(singlet)들이 나타났고, 2.31ppm에서의 싱글릿이 두 개의 메틸 그룹들에 대해 통합함에 따라, 이는 8 N-메틸 및/또는 메톡시 그룹들을 나타낸다. 아미드 양성영역에서 더블릿들을 가진 신호들 및 5.4 및 0.7ppm 사이의 완전한 범위를 커버하는 신호들의 분포는, 상기 조사된 화합물이 정말로 펩티드임을 명백하게 보여주었다.

펩티드로써 상기 화합물의 분류(classification)를 지지하는 추가 분광 증거는 13 카르보닐 탄소들에 해당하는, 170.92 와 175.14 ppm사이의 범위 내에 있는 총 12 (아미드-) 카르보닐 신호들을 나타내는 ¹³C NMR 스펙트럼으로부터 파생되었다. DEPT135 및 HSQC 실험들을 이용함으로써, 34개 메틴, 3개 메틸렌, 및 28개 메틸 신호들이 식별되었다. 이 신호들은 155.23, 142.68, 140.04, 118.36, 및 12.47 ppm 에서 5개의 4차 탄소 신호들(quaternary carbon signals)과 함께 H-14에 존재하는 총 83개 탄소들을 나타냈다.

특히 COSY, TOCSY, HSQC, HMBC 및 반선택적인(semi-selective) HMBC 실험들에 기초한, H-14의 2D NMR 스펙트럼들의 광범위한 분석의 결과로, 15개의 이산 ¹H, ¹H 스핀 시스템들; N,N-Me₂-Val,Val¹,N-Me-L- allo-Ile, L-Thr, N-Me-L-Thr, L-Val²,N-Me-L-Leu, L-Val³,N-Me-L-Val, N-Me-4-OMe-L-Trp a, N-Me-4-OMe-L-Trp b, L-Val⁴, R-β-OH-L-Phe a, R-β-OH-L-Phe b 및 L-Val⁵의 설명이 이루어졌다. ¹H 과 ¹³C에 대한 상세한 할당(assignment)이 표 11에서 주어졌다. 터미널 메틸 그룹들의 ¹³C 과 ¹H 신호들은 매우 혼잡한 지역들 내에 존재한다. ¹³C NMR 스펙트럼은 19.10ppm 내지 20.04ppm까지 0.94ppm 윈도우 내에 14 탄소들을 나타내는 14 탄소 신호들을 디스플레이했고, ¹H NMR 스펙트럼들은 0.85ppm 내지 1.09ppm 까지 0.14ppm 윈도우 내에 47 양성자들을 나타내는 17 양성자자 신호들을 디스플레이했다. HSQC 및 HMBC 실험들 해상도는 이러한 신호들에 대한 연결성(conectivity)을 확립하기에 충분히 높지 않아서, 우리는 반선택(semi-selective) HMBC실험을 도입하였는데, 이는 동핵 양자결합변조(homonuclear proton coupling modulation)들을 억제함으로써 간접적 ¹³C 차원에서 고해상도(high-resolution)을 얻는다. 직접적인 H-C 연결성은 반선택(semi-selective) HMBC 실험에서 추출된 ¹³C-¹H 단일 결합 상관들(single bond correlations)을 사용하여 구축되었다. 이러한 상관들은 F2 방향을 따라 126 Hz의 주위에 커플링 상수(coupling constant)로 관찰되었다. 메틸 그룹은 반선택 HMBC실험에서 추출된 메틸 양성자 신호들과 일반적으로 β-탄소 신호들, 및 메틸 탄소 신호들과 일반적으로 β-양성자 신호들 사이의 상기 ¹H, ¹³C 긴 범위 상관들 (long-range relations)을 각각 그들의 스핀 시스템들에 연결되었다.

N-Me-4-OMe-L-Trp 과 R--OH-L-Phe 유닛들(units) 내부의 연결성은 HMBC 실험에서 추출된 ¹H,¹³C 긴 범위 상관들을 이용하여 확립되었다. 이러한 HMBC 상관들이 N-Me-4-OMe-L-Trp H⁴ /N-Me-4-OMe-L-Trp C, R--OH-L-Phe H^2'/ R--OH-L-Phe C,and R--OH-L-Phe H^5'/ R--OH-L-Phe C.에 대해서 관찰되었다.

N-Me-4-OMe-L-Trp의 메톡시 그룹의 위치는 HMBC의 상관들을 분석하여 또한 결정되었다. HMBC 상관들이 N-Me-4-OMe-L-Trp H¹²/N-Me-4-OMe-L-Trp C¹⁰,N-Me-4-OMe-L-Trp H⁸/N-Me-4-OMe-L-Trp C⁶,N-Me-4-OMe-L-Trp H⁷/N-Me-4-OMe-L-Trp C¹¹,N-Me-4-OMe-L-Trp H⁹/N-Me-4-OMe-L-Trp C¹¹에 대하여 관찰되었다.

N-메틸 그룹의 위치들은 HMBC 상관들을 분석하여 결정되었다. (i, i) H^NMe, Cα 및/또는 (i, i-1) H^NMe, C^C ⁼ ^OHMBC 상관들이 N,N-Me₂-ValH⁶ ⁽⁷⁾/N,N-Me₂-ValC,N-Me-L-allo-Ile H⁷/Val¹ C^C ^=O,N-Me-L- allo-Ile H⁷/N-Me-L- allo-Ile C,N-Me-L-Thr H⁵/ L-Thr C^C=O,N-Me-L-Thr H⁵/N-Me-L-Thr C,N-Me-L-Leu H⁷/ L-Val² C^C ^=O,N-Me-L-Leu H⁷/N-Me-L-Leu C,N-Me-L-Val H⁶/ L-Val³ C^C ^=O,N-Me-L-Val H⁶/N-Me-L-Val C,N-Me-4-OMe-L-Trp H¹³/N-Me-L-Val C^C ^=O,N-Me-4-OMe-L-Trp H¹³/N-Me-4-OMe-L-Trp C 에 대해서 관찰되었다.

각각의 아미노산 잔기들의 대부분은 이후에 N,N-Me₂-Val 및 N-Me-L-Leu 유닛들을 제외하고, ¹H, ¹³C-긴 범위 상관들을 통해 순차적으로 연결(link)되었다. 각 아미노산 잔기에 대해서 Hα, C^C ^=O사이에 두 개의 상관들, (i, i) Hα,C^C ^=O 및 (i, i-1) Hα,C^C ^=O이 관찰되었다, 이것은 함께 펩티드 결합 연결성을 결정한다; 반면에 Hα,C^C ^=O사이에 단지 하나의 상관이 관찰된다 이것은 상기 잔류물의 카르보닐 그룹을 결정한다. HMBC 실험이 170.91 ppm ~175.14 ppm인 4.23 ppm 윈도우에 제공되는 13 ¹³C 신호들로 상기 혼잡한 카르보닐 영역을 해결할 수 없으므로, 다시 반선택 HMBC 실험이 채용되었다. N,N-Me₂-Val H^α/N,N-Me₂-Val C^C ^=O, N,N-Me₂ _-Val H^β/N,N-Me₂-Val C^C ^=O, Val¹H^α/Val¹C^C ^=O, Val¹H^β/ Val¹C^C ^=O, N-Me-L-allo-Ile H^α/N-Me-L-allo-Ile C^C ^=O, N-Me-L-allo-Ile H^α/Val¹C^C ^=O, N-Me-L-allo-IleH^β/N-Me-L-allo-Ile C^C ^=O, L-Thr H^α/L-Thr C^C=O, L-Thr H^α/N-Me-L-allo-Ile C^C ^=O, L-Thr H^β/L-Thr C^C ^=O, N-Me-L-Thr H^α/ N-Me-L-Thr C^C ^=O, N-Me-L-Thr H^α/ L-Thr C^C ^=O, N-Me-L-Thr H^β/ N-Me-L-Thr C^C ^=O, L-Val² H^α/ L-Val²C^C=O, L-Val² H^α/ N-Me-L-Thr C^C ^=O, L-Val² H^β/ L-Val² C^C ^=O, N-Me-L-Leu H^α/N-Me-L-Leu C^C ^=O, N-Me-L-Leu H^α/ L-Val2 C^C ^=O, N-Me-L-Leu H^β/ N-Me-L-Leu C^C ^=O, L-Val³ H^α/ L-Val³ C^C ^=O, L-Val³ H^β/ L-Val³ C^C ^=O, N-Me-L-Val H^α/N-Me-L-Val C^C ^=O, N-Me-L-Val H^α/L-Val³ C^C ^=O, N-Me-L-Val H^β/ N-Me-L-Val C^C ^=O, N-Me-4-OMe-L-Trp H^α/N-Me-4-OMe-L-Trp C^C ^=O, N-Me-4-OMe-L-Trp H^α/ N-Me-L-Val C^C ^=O, N-Me-4-OMe-L-Trp H^β/ N-Me-4-OMe-L-Trp C^C ^=O, L-Val⁴ H^α/ L-Val⁴ C^C ^=O, L-Val⁴ H^α/ N-Me-4-OMe-L-Trp C^C ^=O, L-Val⁴ H^β/ L-Val⁴ C^C ^=O, R-β-OH-L-Phe H^α/R-β-OH-L-Phe C^C ^=O, R-β-OH-L-Phe H^α/ L-Val⁴ C^C=O, R-β-OH-L-Phe H^β/R-β-OH-L-Phe C^C ^=O, L-Val⁵ H^α/ L-Val⁵ C^C ^=O, L-Val⁵ H^α/ R-β-OH-L-Phe C^C ^=O, L-Val⁵ H^β/ L-Val⁵ C^C ^=O 에 대하여 상관이 관찰되었다.

NMe₂-Val과 NMe-L-Leu로부터 카르보닐 그룹의 ¹³C 신호들은 173.29 ppm에서 오버래핑하였고,카르보닐 그룹들과의 Val¹ Hα 와 L-Val³ Hα의 연결성이 미정인 채로 남겨두어, 이와 같이 H -14 에 대한 두 가지 가능한 구조들을 남겨두었다.

또한, L-Thr Hβ 및 L-Val⁵ C^C ^=O 사이의 HMBC 상관이 관찰되었고, H-14가 C-말단(terminal) 카르복실기와 L- THR 잔기의 사이드 체인(side chain) 사이에서 고리화된(cyclized) 고리형 뎁시펩티드(cyclic depsipeptide)임을 시사한다.

고해상도 질량 스펙트럼 분석에 의해 결정된 1599.011의 분자량과 함께 이 데이터는 분자식 C₈₃H₁₃₄N₁₄O₁₇와 일치한다 .

그러나, N,N-Me₂-Val과 L-Val¹ 사이의 연결성은 m/z 354.32에서 프래그먼트 이온(fragment ion)[N,N-Me₂-Val+ L-Val¹ +N-Me-L- allo-Ile]⁺을 보여주는 H-14 의 탠덤 질량 스펙트럼(tandem mass spectrum)의 분석으로 확인되었다.

분자의 시퀀스를 확립하는 것을 돕는 다음의 프래그먼트들이 탠덤 질량 스펙트럼에서 검출되었다:m/z(rel.int.) 1600.23 [M+H]⁺(8), 1246.95[M-N,N-Me₂-Val- L-Val¹ -N-Me-L- allo-Ile + 2H]⁺(48), 990.86[M-N,N-Me₂-Val- L-Val¹ -N-Me-L-allo-Ile - L-Thr - L-Val⁵ +2H]⁺(7), 800.60[M+2H]²⁺(50), 610.41[N,N-Me₂-Val+ L-Val¹ +N-Me-L-allo-Ile + L-Thr+L-Val⁵]⁺(36), 354.32[N,N-Me₂-Val+ L-Val¹ +N-Me-L- allo-Ile]⁺ (87).

[표 11]

^a오버래핑 때문에 상기 신호들의 다중성(multiplicity)은 불확실하다.

^b 메탄올-d₃에서 ¹H NMR실험에서 얻어진 데이터

MJM5123 (Nonomuraea sp.)에서 분리되고 정제된 H-14의 구조는 화학식 1로 표시된다. 도 11은 고리형 H-14 펩티드의 구조적 배열을 보여준다.

[화학식 1]

결정화 및 구조 결정

57일에 걸친 느린 증발 방법을 사용하여 MeOH: MeCN: 물 = (1:1:0.5)로부터 H-14의 바늘 모양의 결정이 얻어졌다. 결정 크기는 약 0.1 X 0.15 X 0.5 mm이었다. X-선 데이터는 브루커 D8 디스커버 엑스레이 시스템(Bruker D8 discover x-ray system )상에서 실온에서 수집되었고, 결정(crystal)은 엑스선을 0.83로 회절시켰다. 상기 결정은 유닛 셀 매개변수들, a=71.64, b=11.43, c=12.70 을 갖는 사방정계 공간(orthorhombic space)공간 P2(1)2(1)2에 속하였다. 비대칭 유닛에 하나의 분자가 있다(도 8 및 표 12).

[표 12]

상(phase)의 문제는 ShelxD 소프트웨어를 사용하여 원자들의 임의의 분포로 시작하는 반복 이중 공간 직접 방법(ierative dual-space direct methods)에 의하여 해결되었다. ShelxD로부터 생성된 초기 모델은 H -14 의 2차원 구조에 따라서 수정되었고, 물 분자들이 그래픽 프로그램 WinCoot로 생성된 초기 전자 밀도 맵(initial electron density map)에 의해 안내되어 첨가되었다. 마지막으로, 정제 프로그램 (refinement program) ShelxL 또는 Refmac으로 R 인자를 0.1723 줄임으로써 정제된 모델(refined model)을 얻었다. 도 9 에서 보는 바와 같이, H -14 의 전체 구조는 트위스트 머리핀 같은 역 병렬 구조(anti-parallel structure)와 유사하다. 주 체인의 C=O 와 N-H 그룹들 사이의 5개의 H-결합들이 전체 구조를 안정화한다. 또한 둘러싸는 물 분자들이 H-결합 형성에 참여한다. X-ray 구조 및 Marfey 방법의 결과과로부터(도시되지 않은 데이터), 우리는 H-14가 모든 L 아미노산 또는 그들의 유사체들(analogs)로 구성되었다고 결론지었다. NMR 분석에 의해 시사된 비표준 아미노산도 모두, 전자 밀도 맵을 사용하여 각 원자의 위치를 검사함으로써 확인되었다(도 9 및 도 10).

<예 7> 항결핵 고리형 펩티드 H-16의 구조 설명

H-16은 노노무라에아 균사체의 메탄올 추출물에서 얻은 Nonomuraea sp. M5123의 또 다른 대사산물이다. H-16에 대한 분자식은 ¹ H,¹³ CNMR및 고해상도 질량 데이터에 의해 결정된 바와 같이 C₈₃ H₁₃₄ O₁₆ N₁₄ 이다.

H -16 는 밝은 노란색 비정질 분말로서 얻어졌다. [고해상도 질량 스펙트럼은 1584.0227 m/ z 에서 양이온 피크[ M + H] +를 보이고, 1606.0035 m/ z 에서 양이온 피크[M+Na]⁺ 를 보이는데, 1583.0149의 정확한 질량을 나타낸다. 고해상도 질량 스펙트럼 및 ¹³C NMR 데이터는 분자식 C₈₃H₁₃₄N₁₄O₁₆와 일치했다. ¹H NMR 데이터 또한 H -16이 펩티드임을 나타내었다. 상세한 ¹H 및 ¹³C 할당이 표 13에서 주어진다. H-16의 NMR 분광 식별은 H -14의 분광 식별과 유사하게 수행되었다. 이 과정에서 아미노산 잔기의 스핀 시스템들은 다시 COSY , TOCSY , HSQC 및 HMBC 스펙트럼을 포함하는, 2D NMR 스펙트럼의 해석에 의해 식별되었다 . 각각의 아미노산 잔기들이 명확하게 HMBC 및 반선택 HMBC 상관들을 통해 순차적으로 링크되었다 . 이러한 상관 관계는 N,N-Me₂-ValH/N,N-Me₂-ValC^C ^=O,N,N-Me₂-ValH/N,N-Me₂-ValC^C ^=O,Val¹ H/Val¹ C^C ^=O,Val¹ H/N,N-Me₂-ValC^C ^=O,Val¹ H/Val¹ C^C ^=O,N-Me-IleH/N-Me-IleC^C ^=O,N-Me-IleH/Val¹ C^C ^=O,N-Me-IleH/N-Me-IleC^C=O,ThrH/ThrC^C=O,ThrH/N-Me-IleC^C ^=O,ThrH/ThrC^C ^=O,N-Me-ThrH/N-Me-ThrC^C ^=O,N-Me-ThrH/ThrC^C ^=O,N-Me-ThrH/N-Me-ThrC^C=O,Val² H/Val² C^C ^=O,Val² H/N-Me-ThrC^C ^=O,Val² H/Val² C^C ^=O,N-Me-LeuH/N-Me-LeuC^C=O,N-Me-LeuH/Val² C^C ^=O,N-Me-LeuH/N-Me-LeuC^C ^=O,Val³ H/Val³ C^C ^=O,Val³ H/N-Me-LeuC^C=O,Val³ H/Val³ C^C ^=O,N-Me-ValH/N-Me-ValC^C ^=O,N-Me-ValH/Val³ C^C=O,N-Me-ValH/N-Me-ValC^C ^=O,N-Me-4-OMe-TrpH/N-Me-4-OMe-TrpC^C ^=O,N-Me-4-OMe-TrpH/N-Me-ValC^C ^=O,N-Me-4-OMe-TrpH/N-Me-4-OMe-TrpC^C=O,Val⁴ H/Val⁴C^C ^=O,Val⁴ H/N-Me-4-OMe-TrpC^C ^=O,Val⁴ H/Val⁴ C^C=O,PheH/PheC^C=O,PheH/Val⁴ C^C ^=O,PheH/PheC^C ^=O,Val⁵H/Val⁵ C^C ^=O,Val⁵ H/PheC^C ^=O,Val⁵ H/Val⁵ C^C ^=O에 대하여 관찰되었다.

[표 13]

MJM5123로부터 분리 및 정제된 H -16의 구조는 화학식 2 로 표시된다.

도12는 고리형 H -14 펩티드 의 구조적 배열을 보여준다

[화학식 2: H-16]

실험 예 1 : 호기성 조건들 하에서 결핵에 대항하는 H- 14 와 H - 16 의 MIC 및 MBC

결핵균(M. tuberculosis)에 대항하여 H -14 와 H -16 의 억제 활성은 마이크로 알마르 블루 분석을 사용하여 측정하였다[Collins, L. 및 S.G. Franzblau, Microplate almar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Anticrob Agents Chemother, 1997. 41(5):p. 1004-9; Hurdle, J.G., et al., A microbiological assessment of novel nitrofuranylamides as anti-tuberculosis agents. J Antimicrob Chemother, 2008. 62(5):p.1037-45]. 참조 균주 M. tuberculosis H37Rv로 호기성 조건 하에서 측정한 H -14 와 H-16에 대한 MIC (90 % 로 성장을 억제하는데 필요한 최소 억제 농도)와 MBC99 (유기체들의 99 %를 죽이는 최소 농도) 값들이 표 14에서 나타낸다.

각 화합물의 MBC99 가 그들의 MIC보다 약 2배 높고, 따라서 H -14 와 H- 16는 살균적인 것으로 분류되어야 한다.

[표 14]

결핵균은 세포에서 세포로 유전 정보를 교환하지 않는 클론 유기체(clonal organism)이다. 인간들과 공동진화의 과정 중에, 많은 별개의 혈통들(lineages), 또는 계통군들(clodes)들이 생성되어왔고 지구의 많은 부븐들에서 두드러진다[Filliol, I., et al., Global phylogeny of Mycobacterium tuberculosis based on single nucleotide polymorphism(SNP) anaysis:insights into tuberculosis evolution, phylogenetic accuracy of other DNA fingerprinting systems, and recommendations for a minimal standard SNP set. J Bacteriol, 2006. 188(2): p. 759-72; Gagneux, S. and P.M. Small, Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development. Lancet Infect Dis, 2007.7(5):p.328-37].

표 15는 참조로 H37Rv 실험실 균주와 함께, 지리/유전적 다양성을 대표하는 여섯 마이코박테리아 결핵 균주들에 대항하는 H -14 와 H -16 의 MIC 값들을 제공한다. 이 여섯 균주들에 대항하는 H-14 와 H-16 의 MIC는 야생 형 H37Rv에 대항하는 MIC들과 비교될 수 있고, 그들이 널리 효능이 있을 것임을 시사한다.

[표 15]

실험 예 2 : 저산소하에서 M.결핵균에 대항하는 H-14 와 H-16의 MBC

저산소하에서 비복제 M.결핵균에 대항하는 H-14와 H-16의 살균 활성은 저산소 회복 분석(LORA: low oxygen recovery assay)를 사용하여 결정되었다. 복제되지 않는 조건하에서 10 일 배양 후 결핵균의 생존 능력 99 % 감소를 영향을 준 농도는 H-14와 H-16 모두 약 1.5μM이었다. 이 낮은 MBC는 H-14와 H-16이 비 복제 퍼시스터들(non-replicating persistors)의 부분모집단(subpopulation)을 억제함으로써 결핵 치료 기간을 줄일 수 있는 잠재성을 가진다는 것을 시사한다.

실험 예3 : H-14와 H-16 항균 선택성

H-14와 H-16의 선택성은 대장균, 그람-음성 박테리아, 황색 포도상 구균, 그람-양성 세균, 칸디다 균(Candida albicans), 효모, 및 6 마이코 박테리아 종 (표 16)에 대항하여 그들을 스크리닝함으로써 결정되었다. 그 화합물의 어느것도 대장균, 황색 포도상 구균, 그리고 C. albicans에 대한 항균 활성을 나타내지 않았다. 두 화합물은 MIC 4.0μM 이하에서 M. Kansasii에 대항하고, MIC 0.1μM 이하에서 M. avium 에 대항하고, MIC 2.0μM 이하에서 M. chelonae 및 M. marium에 대항하고, MIC 4.0μM 이하에서 M. smegmatis에 대항하는 활성이지만, M. abscessus에 대항해서는 상당히 덜 활성화되었다. 그 결과들은 H-14와 H-16이 선택적 안티 마이코박테리아 화합물이라는 것을 시사한다.

[표 16]

실험 예 4 : 포유 동물 세포에 대항하는 단백질 바인딩 및 독성

단백질 바인딩(protein binding)은 화합물의 약물 동력학(pharmacokinetics)에 영향을 주고 궁극적으로 활성 언바운드 화합물의 양을 감소시킴으로써 그의 효율성에 영향을 미칠 수 있다. M.결핵에 대항하는 H-14 및 H-16의 MIC는 표17에서처럼 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 4 % 소 혈청 알부민 (BSA)의 존재에서 추가 보충 단백질 (0.4 % BSA)없이 결정되었다. 10 % FBS 또는 4 % BSA 존재에서 MIC가 2배(2-fold) 증가되었고, 단백질 바인딩이 자신의 효능에 역으로 영향을 주지 않는다는 것을 시사한다.

[표 17]

포유류 세포에 대항하는 H-14 및 H-16 싸이톡시티들( Cytoxicities)을 베로 세포(Vero cells), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 라인에 대해 테스트하여 평가하였다(표 18). 싸이톡시티(cytoxicity)는 최고 시험 농도 (32μM)에서조차 두 화합물에 대해 발견되지않았다.

[표 18]

실험 예 5 : 실험실 생성된 모노 약물 내성( mono - drug - resistant ) M.결핵 균주의 패널에 대항하는 H-14와 H-16의 MIC

H-14와 H-16가 리팜핀 RMP), 이소니아지드(INH), 목시플록사신(Mox), 스트렙토 마이신(SM), 카나마이신(KM), 사이클로세린(CS) 또는 카프레오마이신(CAP)에 각각 내성있는 H37Rv-isogenic M. 결핵 균주의 패널에 대하여 테스트되었다(표 19). 두 화합물은 모든 이들 모노 약물 내성 결핵균의 균주들(strains)에 대항하여 그들의 활성 수준을 유지하여, 현재 항결핵 약물과 교차 내성(cross-resistance)이 없음을 시사하고, 따라서 약물-민감 및 약물 내성 결핵균 감염들에 대항하는 이용에 동등하게 적합할 새로운 행동 모드(novel mode of action)를 시사한다.

[표 19]

결론적으로 H-14 및 H-16 모두 현재의 제1선 항결핵 약제에 비교할 만한 생체외 항결핵 활성 프로파일을 가지고, MBC 100-fold에서 생체외 포유동물 세포 독성을 갖지 않는다. 복제하는 마이코박테리아 결핵에 대항하는 MIC들은 H14, H16, 리팜핀 및 이소니아지드에 대해서 각각 0.16μM,0.16μM, 0.09μM 및 0.47μM 이다. H-14와 H-16의 선택 인덱스들(베로 셀(VERO cell) IC50/M결핵 MIC)은 모두 620보다 크다. 활성 레벨은 지구의 계통군을 대표하는 임상적 분리균에 대해서 뿐만 아니라 고리형 펩티드, 카프레오마이신에 대항하고, 리팜핀, 이소니아지드, 스트렙토마이신, 카나마이신, 사이클로세린에 내성을 갖는 M.결핵의 동종 균주들에 대항하도록 유지된다. 복제 M.결핵균에 대항하는 MBC들은 강한 살균제들을 나타내는 H-14 및 H-16에 대해서 각각 0.34μM, 0.19μM이다. 화합물들 모두는 LORA에서 대략 1.5μM에서 log10만큼 비복제 M.결핵균의 생존능력을 감소시켜, M.결핵 퍼시스터들의 부분 모집단을 억제함으로써 TB 치료 기간을 단축할 수 있는 잠재성을 시사한다. 대조적으로, 31μM에서 황색 포도상 구균(S. aureus), 대장균(E. coli), C. 알비칸(C. albicans)에 대항하는 활성이 관찰되지 않았고, M.스메그마티스에 대항하는 활성은 더 낮았으며, 이는 양 펩티드 모두의 항결핵 활성이 매우 선택적임을 의미한다. 이것은 또한 이러한 펩티드들이 대리 박테리아(surrogate bacteria)에 대항하여 스크리닝함으로써 본래 검출되지 않았을 것임을 시사한다. 4% BSA 혹은 10% FBS의 존재에서 MICs가 단지 두 배만큼 증가하므로, 단백질 바인딩은 그것들의 효능에 역으로 영향을 미치지 않아야 한다.

<110> B&C BIOPHARM CO., LTD. <120> CYCLIC PEPTIDE FROM NONOMURAEA SP., PROCESS FOR THE PRODUCTION THEREOF, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF MYCOBACTERIA RELATED DISEASE COMPRISING THE SAME <150> US 61/476473 <151> 2011-04-18 <150> US 61/513403 <151> 2011-07-29 <150> US 61/555257 <151> 2011-11-03 <150> US 61/607934 <151> 2012-03-07 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer, 27f, for the amplification of 16S rDNA from MJM5123 genomic DNA <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer, 1492r, for the amplification of 16S rDNA from MJM5123 genomic DNA <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123 균주(기탁 번호 : KCTC 12178BP)로부터 분리된 화학식 1 또는 화학식 2의 고리형 펩티드 :
[화학식 1: H-14]

[화학식 2: H-16]
유효성분으로서 화학식 1 및/또는 화학식 2의 화합물을 포함하는 결핵의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물:
[화학식 1: H-14]

[화학식 2: H-16]
삭제
제 2항에 있어서,
상기 결핵은 MDR 결핵 혹은 XDR 결핵인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 2항에 있어서,
하나 이상의 항결핵제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 항결핵제는 제1선 경구 항결핵제 소그룹, 주사용 항결핵제 소그룹, 플루오로퀴놀론 소그룹, 제2선 경구 항결 핵제 소그룹, 기타 항결핵제 소그룹, 결핵에 대한 현재 임상시험중인 화합물 소그룹, 및 임상 전 개발중인 화합물 소그룹으로 구성된 그룹에서 선택되며,
상기 제1선 경구 항결핵제 소그룹은 이소니아지드, 리팜 피신, 에탐부톨 및 피라지나마이드를 포함하는 소그룹이고;
상기 주사용 항결핵제 소그룹은 스트렙토마이신, 아미카신, 카프레오마이신 및 카나마이신을 포함하는 소그룹이고;
상기 플루오로퀴놀론 소그룹은 키프로플록사신, 오프록사신, 가티프록사신 및 목시플로사신을 포함하는 소그룹이고;
상기 제2선 경구 항결핵제 소그룹은 리파부틴, 프로티오나마이드, 에티오나마이드, 시클로세린, PAS 및 티오아세타손을 포함하는 소그룹이고;
상기 기타 항결핵제 소그룹은 리네졸리드, 클로파지마인, 아목실린/클라불라네이트, 클라리트로마이신 및 디아미노디페닐설폰의 파생물을 포함하는 소그룹이고;
상기 결핵에 대한 현재 임상 시험중인 화합물 소그룹은 베다퀼린(Bedaquiline), PA-824, 달라마니드(Dalamanid), SQ-109, 수테졸리드(Su tezolid) 및 리파펜틴(rifapentine)을 포함하는 소그룹이고;
상기 임상 전 개발중인 화합물 소그룹은 A ZD5847, BTZ043, TBA-354, CPZEN-45, SQ-641, SQ-609, DC-159a, Q201, THPP, 클로파지마인의 리미노페나진 유사체들 및 붕소 함유 LeuRS 억제제를 포함하는 소그룹인 것을 특징으로 하는 약학 조성물 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 항결핵제는 상기 화학식 1 및/또는 화학식 2의 화합물과 함께(simultaneous), 순차적으로(sequential) 또는 별도로(separate) 투여되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
액체 배양 배지에서 호기적 조건하에서 안티 마이코박테리아 펩티드를 생산하는 노노무라에아종(Nonomuraea sp.) MJM5123 균주(기탁 번호 : KCTC 12178BP)를 배양하는 단계; 및 노노무라에아종(Nonomuraea sp.) MJM51 23 균주(기탁 번호 : KCTC 12178BP)의 균사로부터 청구항 제 1항의 화학식 1 또는 화학식 2의 고리형 펩티드를 분리하는 단계;를 포함하는 고리형 펩티드의 제조 방법.
제 8항에 있어서,
상기 고리형 펩티드를 분리하는 단계는,
클로로포름과 메탄올을 용리액(eluent)으로 사용하여 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM5123 균주 균사의 메탄올 추출물에 대한 진공 액체 크로마토그래피(VLC, Vacuum liquid chromatogr ahpy)를 수행하는 단계; 메탄올을 용리액으로 사용하여 세파덱스(Sephadex) LH-20 오픈 칼럼 크로마토그래피 를 수행하는 단계; 및 HEMWat+2를 용매(solvent)로 사용하여 고속 역류 크로마토그래피(HSCCC; High Speed Countercurrent Chromatography)를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드의 제조 방법.
제 8항에 있어서,
상기 고리형 펩티드 분리하는 단계는,
메탄올을 용매로 사용하여 노노무라에아 종(Nonomuraea sp.) MJM 5123 균주 균사에서 추출물을 추출하는 단계; 상기 추출물 용액에 메탄올 중량의 30%의 물을 첨가하여 메탄 올 수용액으로 만드는 단계; 헥산을 이용하여 상기 메탄올 수용액을 탈지하는 단계; 물층을 분리하여 65% 메 탄올 수용액으로 조정하여 만드는 단계; 클로로포름을 이용하여 물층에서 클로로포름 추출물을 추출하는 단 계; 농축하고나서 메탄올을 이용하여 상기 클로로포름 추출물을 용해하는 단계; 메탄올을 용리액(eluent)로 사용하여 세파덱스 LH-20 칼럼 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및 역상 겔(reverse phase gel)(RP-18)로 채워진 칼럼으로 HPLC를 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고리형 펩티드의 제조 방법.