JP5756227B2 - ノノムラエ種からの環状ペプチド、その生産プロセス、およびそれを含むマイコバクテリア関連疾病の治療または予防のための薬学的組成物 - Google Patents
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Description
MDR−TB保菌者30万名およびHIV保菌者のうちの100万件のケースを含んで2009年に940万件の新しい結核事例があった(非特許文献1:WHO Actions For Life - Towards a world free of tuberculosis; World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2006)。MDR−TB(multi−drug resistant tuberculosis、多剤耐性結核)は、少なくとも6ヶ月以上、2年間にわたる治療期間が必要である。XDR−TB(extensively drug resistant tuberculosis)の世界的な出現はMDR M.結核菌株(milti−drug resistant M.tuberculosis strains)の6.6%であると推定される(非特許文献1:WHO Actions For Life - Towards a world free of tuberculosis; World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2006)。
したがって、できる限り新しい作用メカニズムを有する新規な抗結核薬物(anti−TB drugs)の開発が至急求められる。
本発明の他の目的は、抗結核ペプチドの生産プロセスおよび各種マイコバクテリア感染(mycobacterial infection)の予防および/または治療のための薬学組成物における抗結核ペプチドの用途を提供することにある。
本発明は、マイコバクテリア菌種(Mycobacterium spp.)、好ましくはノノムラエ種MJM5123菌株から分離された環状ペプチドを提供する。本発明の好適な実施例において、本発明の環状ペプチドは化学式1または化学式2を有する。好ましくは、本発明の環状ペプチドはノノムラエ種(Nonomuraea sp.)MJM5123菌株から次の手続きによって分離できる。
放線菌は、非常に多様な2次代謝産物を生産すると知られている、何処にでもある土壌生物である。多様な細菌性感染の治療に用いられる幾つかの抗生剤は、ストレプトマイシン(streptomycin)、セファロスポリン(cephalosporins)、テトラサイクリン(tetracycline)、エリスロマシン(erythromycin)、リファンピン(rifampin)およびダプトマイシン(daptomycin)を含む放線菌に由来する。今日の結核治療に用いられる3種の薬物(リファンピン(rifampin)、ストレプトマイシン(streptomycin)、サイクロセリン(cycloserine)は、寒天拡散分析(agar diffusion assays)を用いて放線菌から発見されたが、このようなスクリーン(screens)は最初に結核(M.tuberculosis)を用いて行われたのではない。これは結核(TB)の伝染性、およびたまに(当時の)致命的な結果に起因した。今、M.結核抗生剤が種々の抗菌剤に特異的に影響を受けやすい(susceptible)と理解するため、直接このような病原体に対抗して発酵培養液(fermentation broths)をスクリーニングすることについての過去の失敗は多くの潜在的に有用な化合物群が検出されない結果をもたらしたと仮定しなければならない。よって、M.結核の悪性菌株に対抗して直接スクリーニングすることにより、このようなTB薬物発見プログラムを開始した。
純粋な化合物または抽出物のハイスループットスクリーニングについての技術は、ITR(the Institute for Tuberculosis Research)で確立された。韓国明知大学校におけるECUM(Extract Collection of Useful Microorganisms)は、韓国、中国、ネパル、フィリピン、ベトナム、南国大陸および北極圏からの7000以上の放線菌分離菌(isolates)の菌株保存(culture collection)を維持する。より異国的な地域を含ませることは希少で新規な種を分離しようとする試みであった。
各分離菌(isolate)は、最初に3つの相異なる培養培地−G.S.S(富栄養培地(rich medium))、Bennett’sおよびGYC(最少培地(minimal medium))で20mLの培養液で発酵され、菌株別に3つの抽出物がMABA(Microplate Alamar Blue Assay)でテストされ、より優先的に処理された。
韓国の明知大学校のECUMに貯蔵された6万5千以上の抽出物をスクリーニングした後、新規な放線菌種、菌株MJM5123からの菌糸体(mycelium)のメタノール抽出物が強い抗結核活動(anti−TB activity)を有することが発見された。菌株MJM5123は多相分類学的接近法(polyphasic toxonomic approach)によってノノムラエ種(Nonomuraea sp.)として識別された。
菌株MJM5123が、真空液体クロマトグラフィー(VLC、vacuum−liquid chromatography)で初期分画(initial fractionation)した後、幾つかの高速向流クロマトグラフィー(CCC:high−speed counter current chromatograpy)段階で選別浄化(targeted purification)することに基づくバイオアッセイによる分離手続きのために選択された。
H−14とH−16の完全な構造解明は、最高の品質と最先端の1D/2DNMR−およびペプチドのX線結晶学(X−ray crystallography)によって増加した高解像度MS基盤構造情報を用いて行われる。定量的NMR(qNMR)は、全ての分離段階の同時選択認識および定量決定(simultaneous selective recognition and quantitative determination)のために使用された。QNMRは、活性分離菌(active isolates)の純度および/または量(quantity)の決定のためにだけでなく、生物学的に活性であるが、依然として複雑な化合物の混合物/画分(compound fractions)をプロファイリングする目的のためにも最適の道具である。H−14およびそのアミノ酸残基(amino acid residues)の全般的な3D構造はX線結晶学(X−ray crystallography)によって決定された。
抗結核ペプチド(anti−TB peptides)の生産性向上のために、最適の発酵プロセスと費用効率的な培地(media)が開発された。主要発酵は6日間600rpmの攪拌速度(agitation speed)と0.3vvmのエアレーション(aeration)によって34℃で行われた。 最終充填された菌糸体容積(final packed mycelium volume)はpH8.20で80%であり、総糖(totla sugar)は1.8%未満であった。発酵プロセスは373mg/LのH−14を産出した。
本発明の薬学的組成物は、ノノムラエ種(Nonomuraea sp.)MJM5123菌株から分離された本発明の新規な抗結核ペプチドを含む。好ましくは、本発明の薬学的組成物は薬学的に許容される担体(carrier)、賦形剤(excipient)および希釈剤(diluent)をさらに含むことができる。
経口投与のための液状製剤は懸濁液、溶液、エマルジョンおよびシロップであり、前記言及された製剤は水や流動パラフィンなどのように一般に用いられる単純希釈剤に加えて、湿潤剤(wetting agents)、甘味剤(sweeteners)、芳香剤(aromatics)、保存剤(preservatives)などの多様な賦形剤を含むことができる。
筋肉内投与、非経口投与または静脈内投与の準備のために、抗結核ペプチドの殺菌製剤または前記化合物の適切な水溶性塩の形態、例えば塩酸塩(hydrochloride salt)が注射用水(WFI、Water−for−Injection)、生理食塩水或いは5%ブドウ糖などの薬学的希釈剤に溶解して投与できる。
直腸投与に適用するために、本発明のペプチドはココアバター、ワックスまたはその他のグリセリド等の既存の担体と混合される坐薬として製剤化できる。
また、本発明の抗結核ペプチドは、測定された定量吸入器(metered dose inhalers)および噴霧器(nebulizers)などの吸入器に使用することもできる。
本発明の一実施例において、前記抗結核環状ペプチドを分離するための段階は、次の段階を含むことができる:溶離液としてメタノールとクロロホルムを用いてノノムラエ種MJM5123菌糸体のメタノール抽出物の真空液体クロマトグラフィー(VLC)を行う段階、溶離液としてメタノールを用いてセファデックスLH−20オーブンカラムクロマトグラフィー(Sephadex LH−20 open column chromatography)を行う段階、および溶媒としてHEMWat+2を用いて高速向流クロマトグラフィー(HSCCC:High Speed Countercurrent Chromatography)を行う段階。
ところが、当業者は本発明の開示を考慮することにより本発明の思想と範囲内で修正および改善を加え得ることが理解できるであろう。
約7,000の放線菌分離菌は、高山地域、熱帯地域、極地方、砂漠、火山などの独特な気候条件および生態系を有する地域から収集された土壌試料から分離され、韓国明知大学校のECUM(Extract Collection of Useful Microorganisms)によって維持されている。9種の相異なる抽出物が、各抗結核候補をスクリーニングするために各分離菌から製造された。第一、それぞれの分離菌はG.S.S、Bennett’sおよびGYCの30mLで培養された。菌糸体および培養液が遠心分離によって分離された後、前記菌糸体はメタノールで抽出され、前記培養上清液はそれぞれ酢酸エチルと水で分割された。最後に、3種の培地で培養された各微生物分離菌から9つの有機および水溶性抽出物が真空蒸発によって濃縮乾燥し、−70℃で急速冷凍機に保存された(図1、図2および表1)。
ECUMの各放線菌分離菌は、最初3つの相異なる培養培地、すなわちG.S.S(富栄養培地)、Bennett’sおよびGYC(最少培地)で20mLの培養液で発酵された。前記菌糸体はメタノールで抽出され、培養上清液は酢酸エチルで抽出されたが、これは水で分割されて分離菌当たり9個の抽出物を生成した。100μLの分取量(aliquot)が96ウェルプレートで乾燥し、明知大学校からUICへ発送されたが、100μLのDMSOで可溶性とし、試験培養液で1:100に希釈した。〜63,000抽出物のHTSは、マイクロアラマーブルー分析(MABA、micro Alamar Blue Assay)の蛍光測定値によって決定される7H12培地で結核菌(M.tuberculosis)=90%抑制(Cソースとしてのパルミチン酸)で349抽出物(0.55%)を産出した。次いで、初期ヒット(hits)の90はECUMで1リットルの規模で再発酵され、その後、抽出物当たり6個の画分(fraction)を産出するために、前記抽出物が、メタノール−水濃度勾配20〜100%(MeOH−water gradient 20〜100%)の後にクロロホルム(CHCl3)100%で固体相反転シリカゲル抽出(solid phase reversed−silica gel extraction)でUICから分画された。画分は次の項目で生物学的にプロファイリングされた:1)哺乳類細胞毒性(ベロ細胞IC50)、2)非複製結核菌(M.tuberculosis)に対抗する活性(LORA)、3)リファンピン、イソニアジド(INH)、ストレプトマイシン(SM)、カナマイシン(KM)、カプレオマイシン(CAP)、シクロセリン(CS)(また、単にこのような放線菌由来抗生剤のみを見つけるのではないことを明らかにするために)またはモキシフロキサシン(MOX)に耐性を有する結核菌株(M.tuberculosis strains)に対抗する活性、4)スメグマ菌(M.smegmatis)、黄色ブドウ球菌(S.aureus)、大腸菌(E.coli)およびC.アルビカンス(C.albicans)に対抗する活性。これらの結果に基づいて、20個の放線菌株は追加調査のために優先順位が与えられた。
形態学的および培養特性の決定
MJM5123は、韓国の漢拏山から収集された土壌試料から分離された。前記菌株の属(genus)は細胞壁構成要素の特性形態と化学的分析によって識別された。形態学的および培養特性を決定するために、前記菌株を酵母エキス麦芽エキス寒天(yeast extract malt extrat agar)(ISP2)、オートミール寒天(ISP3)、無機塩澱粉寒天(ISP4)、グリセロールアスパラギン寒天(ISP5)のように国際ストレプトミセスプロジェクト(ISP;International Streptomyces Project)培地を用いて28℃で2週間成長させた[Shirling, E. B. and D. Gottlieb, Methods for characterization of Streptomyces species. Int J Syst Evol Microbiol. 1966 16(Pt 3): 313-330]。前記コロニー色相(colony colors)が色相ハモニー説明書[Jacobson, E., W. C. Grauville, et al., Color Harmony Manual. 1958. Chicago, Container Corporation of America]を用いて決定された。胞子(spores)と菌糸体は電子顕微鏡(日立、S−3500N、日本)をスキャンして観察された(図3)。
細胞壁構成要素の化学分類学的特性について、凍結乾燥した菌糸体が28℃で7日間回転振動機上のTSB培地(TSB、tripticase soy broth)で成長させて製造された。グリシンとジアミノピメリン酸(DAP、diaminopimelic acid)の立体異性体(stereoisomers)がTLCによって決定された[Becker, B.; Lechevalier, M. P.; Gordon, R. E.; Lechevalier, H.A. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole-cell hydrolysates. Appl Microbiol 1964, 12, 421-423]。ドライセル(dry cells)5mgを1mLの6N塩酸と共に小さいアンプル内にシールした。アンプルは100℃のオーブンで一晩保管された。空冷した加水分解物がWattman1番の濾紙で濾過された。濾過液は濃縮乾燥し、蒸留水0.3mLに溶解した。前記溶液の2μLをTLCプレート上に滴下し(Merck、TLCセルロースFガラスプレート番号105,718)、メタノール:蒸留水:6N塩酸:ピリジン(80:26:4:10、vol/vol)の溶媒系で4時間成長させた。空気乾燥の後、0.2%のニンヒドリン溶液(アセトン)で噴霧し、100℃で3分間加熱してスポットを現した。0.1MD、L−DAP(Sigma Aldrich、番号D−1377)1μmと0.1Mグリシン(Sigma Aldrich、番号50046)1μLが定格標準(authentic standards)として使用された。グリシンとD,L−DAPスポットは灰色−緑色で視覚化された。
16S rDNAが27f(5’−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3’、配列番号1)と1492r(5’−GGTTACCTTGTTACGACTT−3’、配列番号2)のプライマー対を持つMJM5123ゲノムDNAから増幅された。増幅されたDNAはABI 3730XL毛細管DNAシーケンサー上に上述のプライマーを用いてシーケンスされた(Applied Biosystems、USA)。コンピュータを用いた16S rDNAの比較はhttp://www.ncbi-nlm-nih.govで利用可能なNCBI BLASTを用いて行われた。
系統樹(phylogenetic tree)がMEGA4.0ソフトウェアを用いて近隣結合法(neighbor−joining method)によって構成された。系統樹のための分岐支持(branch support)が1000個のブートストラプト(bootstrap)複製によって生成された。
ソフトウェアパッケージMEGA、version4.0を用いて近隣結合方法によって、距離が得られ(Kimura−2モデルによって距離オプションを用いて)、クラスタリング(clustering)が行われた。1000個の複製に基づくブートストラプト値は分岐点で百分率にて記載される。バーはヌクレオチド当たり0.002置換(substitutions)を示す(図6)。
密接に関連した菌株とのDNA−DNAの連関性がマイクロプレートハイブリッド化方法を用いて蛍光分析によって評価された。DNA−DNAの連関性値はMJM5123が別のゲノム種を示したことを表示する34%〜65%であった(表7)。
抗結核ペプチドの生産性を改善するために、最適の発酵プロセスと費用効率的な培地が開発された。菌株MJM5123は、多様な炭素および窒素供給源、例えばブドウ糖、フルクトース、マルトース、ガラクトース、キシロース、スクロース、グリセリン、大豆油、澱粉、デキストリン、アミノ酸、酵母エキス、膵臓消化カゼイン、牛肉エキス、ペプトン、麦芽エキス、オートミール、大豆粉、酵素分解された大豆粉、綿実粕、コーンスティープリカー、無機塩類などを用いることができる。MJM5123は広範囲の温度とpH(20〜40℃、pH5.0〜9.0)で成長した。ところが、接種前に初期培地pHを〜7.2に調整することが有利である。発酵温度を34℃に維持したとき、最も効率的な成長と力価(titer)が達成された。各段階に対する3段階発酵手続きおよび培地が、費用効率的な生産および後続処理の容易性のために、次のとおり開発された。
分離例1:
20個の優先順位化された放線菌株の一つである菌株MJM5123が大規模発酵され、その有効な画分(fractions)が後述の方法によって実施例1で分離された。
活性と選択性指数(activity and selectivity index)をモニタリングするために、MABA、LORAおよびベロ細胞毒性を用いて生物学的特性化と併用して、菌株E5123の大規模菌糸体メタノール抽出物が化学的分画プロセス(chemical fractionation process)を経た。活性成分の分画および分離(isolation)はクロマトグラフィー分離の3つの段階を関連させた。20%での水/メタノール濃度勾配段階を用いて、逆相シリカゲル(reversed phase silica gel)上に、前記抽出物(128.7g)の真空液体クロマトグラフィー(VLC)は7個の化学的に異なる画分VC−1〜7を産出した。それぞれ100%メタノールと100%エタノールで溶出した画分VC−6とVC−7に対して、MIC<0.76、0.74μg/mLが観察された。VC−6およびVC−7は、再結合し(8.47g)、溶離液としての100%エタノールによってセファデックスLH−20オーブンカラム上に81個の画分にさらに分離され、S−1からS−11まで11個の再結合した画分のパネルを産出した(TLCによって)。副画分(subfactions)S−2とS−3に対して、MICは<0.21μg/mLであった。S−3(374mg)は、GUESS方法によって最も適した溶媒系として選択されたHEMWat+2で高速向流クロマトグラフィー(HSCCC)によって110個の画分(fraction)に分離された[Kubo, I. Recent applications of counter-current chromatography to the isolation of bioactive natural products. J Chrom 1991, 538, 187-191]。これらの画分はH’−1からH’−11まで11個の画分のパネルに再結合した。副画分H−4、H−6、H−8およびH−9に対して、MICは<0.391μg/mLであった。S−2(177mg)がHEMWat+2でHSCCCによって140個の画分にさらに分離され、H−1からH−26まで26個の画分のパネルに再結合した。H−3、H−5、H−7、H−9〜H−23に対して、MICは<0.5μg/mLであった。活性ペプチド画分のうち、H−14とH−16(8mg、収率=0.4mg/L)が、qHNMR分析によれば最も純粋であったので、構造的解明(structural elucidation)のために選択された。1HNMRスペクトルの類似性に応じて、H−11はH−15、H’−6はH’−8とそれぞれ再結合した後、H−14(約80%純度)189mgが得られた(収率=9.45mg/L)、活性ペプチドの全量は約369mgであり、収率は18mg/Lである。
MJM5123の発酵によって生成された抗結核化合物は、主に細胞内部で維持された。抗結核化合物は菌糸ケーキ(mycelial cake)から抽出された。上述したように、後者は全体発酵液の濾過によって発酵過程から収穫された。菌糸ケーキの抽出はメタノールを用いることが最も効果的であったが、エタノール、n−プロパノール、イソプロパノール、アセトニトリル、アセトン、ジクロロメタン、酢酸エチル、クロロホルムなどのその他の有機溶媒を用いてもよい。未加工の抗結核活性化合物は適量で抽出物の蒸発および溶媒−溶媒分割(solvent−solvent partitioning)を含むルーチンプロセスによって抽出溶液から回復された。
H−14は菌糸体のMeOH抽出によって得られたノノムラエ種MJM5123の代謝産物である。H−14に対する分子式は高解像度質量分析(high resolution mass spectrometry)と1H、13C NMRによって決定されたようにC83H134O17N14である。
H−14は光活性淡黄色粉末(optically active light yellow powder)として分離された。高解像度質量スペクトルは1600.0189m/zで陽イオンピーク[M+H]+を示し、1621.9982m/zで陽イオンピーク[M+Na]+を示し、1599.0111の正確な質量を示す。IRスペクトルはマルチプルアミド部分(multiple amide moities)(1632.16cm−1)の存在を暗示する。UVスペクトルは、H−14が211nm(=54209M−1Mcm−1,48、25℃、メタノールで)、219nm(=55266M−1cm−1、48、25℃、メタノールで)、263nm(=7925M−1cm−1、48、25℃、メタノールで)、281nm(=6465M−1cm−1、48、25℃、メタノールで)、および291nm(=5839M−1cm−1、48、25℃、メタノールで)における吸収帯域であり、芳香族残基を有するペプチドであることを示唆した。CDスペクトルは、H−14が220nm(25℃、アセトニトリルで)でモル楕円率(molar ellipticity)が1918530degcm2mol−1であり、196nm(25℃、アセトニトリルで)で616094degcm2mol−1であり、H−14は逆平行−βシート構造(antiparallel β−sheet structure)であるペプチドであることを示唆する。
また、N−Me−4−OMe−L−Trpのメトキシ基の位置はHMBC相関を分析して決定された。HMBC相関がN−Me−4−OMe−L−Trp H12/N−Me−4−OMe−L−Trp C10、N−Me−4−OMe−L−Trp H8/N−Me−4−OMe−L−Trp C6、N−Me−4−OMe−L−Trp H7/N−Me−4−OMe−L−Trp C11、N−Me−4−OMe−L−Trp H9/N−Me−4−OMe−L−Trp C11について観察された。
高解像度質量スペクトル分析によって決定された1599.0111の分子量と共に、このデータは分子式C83H134N14O17と一致する。
ところが、N,N−Me2−ValとL−Val1間の連結性は、m/z354.32で断片イオン(fragment ion)[N,N−Me2−Val+L−Val1+N−Me−L−allo−Ile]+を示すH−14のダンデム質量スペクトル(tandem mass spectrum)の分析によって確認された。
bメタノール−d3で1H NMR実験から得られたデータ
57日にわたる遅い蒸発方法を用いてMeOH:MeCN:水=(1:1:0.5)からH−14の針状の結晶が得られた。結晶サイズは約0.1×0.15×0.5mmであった。X線データはBruker D8ディスカバーX線システム(Bruker D8 Discover x−ray system)上から室温で収集され、結晶(crystal)はX線を0.83に回折させた。前記結晶はユニットセル媒介変数、a=71.64、b=11.43、c=12.70を有する斜方晶系空間(orthorhombic space)P2(1)2(1)2に属した。非対称ユニットに一つの分子がある(図8および表12)。
H−16はノノムラエ菌糸体のメタノール抽出物から得たノノムラエ種(Nonomuraea sp.)M5123の別の代謝産物である。H−16に対する分子式は1H、13CNMRおよび高解像度質量データによって決定されたようにC83H134O16N14である。
図12は環状H−14ペプチドの構造的配列を示す。
結核菌(M.tuberculosis)に対抗してH−14とH−16の抑制活性はマイクロアラマーブルー分析を用いて測定した[Collins, L. and S.G. Franzblau, Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother, 1997. 41(5): p. 1004-9; Hurdle, J.G., et al., A microbiological assessment of novel nitrofuranylamides as anti-tuberculosis agents. J Antimicrob Chemother, 2008. 62(5): p. 1037-45]。参照菌株M.tuberculosis H37Rvを用いて好気性条件の下で測定したH−14とH−16に対するMIC(90%に成長を抑制するのに必要な最小抑制濃度)とMBC99(有機体の99%を死なせる最小濃度)値を表14で示す。
各化合物のMBC99がそのMICより約2倍高く、よって、H−14とH−16は殺菌的なものと分類されるべきである。
表15は、参照としてH37Rv実験室菌株と共に、地理/遺伝的多様性を代表する6種のマイコバクテリア結核菌株に対抗するH−14とH−16のMIC値を提供する。この6種の菌株に対抗するH−14とH−16のMICは野生型H37Rvに対抗するMICと比較でき、それが広く効能を持つことを示唆する。
低酸素の下で非複製M.結核菌に対抗するH−14とH−16の殺菌活性は、低酸素回復分析(LORA:low oxygen recovery assay)を用いて決定された。複製されていない条件の下で10日間培養した後、結核菌の生存能力99%減少に影響した濃度はH−14とH−16の両方とも約1.5μMであった。この低いMBCはH−14とH−16が非複製パーシスタ(non−replicating persistors)の部分母集団(subpopulation)を抑制することにより、結核治療期間を減らすことが可能な潜在性を持つことを示唆する。
H−14とH−16の選択性は、大腸菌、グラム陰性菌、黄色ブドウ球菌、グラム陽性菌、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、酵母、および6種のマイコバクテリア種(表16)に対抗してそれらをスクリーニングすることにより決定された。その化合物のいずれも大腸菌、黄色ブドウ球菌、およびC・アルビカンスに対する抗菌活性を示さなかった。2つの化合物はMIC 0.4μM以下でM.Kansasiiに対抗し、MIC 1.0μM以下でM.aviumに対抗し、MIC 2.0μM以下でM.chelonaeおよびM.mariumに対抗し、MIC 4.0μM以下でM.smegmatisに対抗する活性であるが、M.abscessusに対抗しては相当少なく活性化された。それらの結果はH−14とH−16が選択的抗マイコバクテリア化合物であることを示唆する。
タンパク結合(protein binding)は、化合物の薬物動態学(pharmacokinetics)に影響を与え、究極的に活性非結合化合物の量を減少させることにより、その効率性に影響を及ぼすおそれがある。M.結核に対抗するH−14およびH−16のMICは、表17に示すように、10%ウシ胎仔血清(FBS)、4%ウシ血清アルブミン(BSA)の存在下に追加補充タンパク質(0.4% BSA)なしで決定された。10%FBSまたは4%BSAの存在下でMICが2倍(2−fold)増加し、タンパク結合が自分の効能に悪影響を与えないことを示唆する。
H−14とH−16がリファンピン(RMP)、イソニアジド(INH)、モキシフロキサシン(Mox)、ストレプトマイシン(SM)、カナマイシン(KM)、サイクロセリン(CS)またはカプレオマイシン(CAP)にそれぞれ耐性があるH37Rv−isogenic M.結核菌株のパネルに対してテストされた(表19)。2つの化合物はいずれもモノ薬剤耐性結核菌の菌株に対抗してそれらの活性水準を維持し、現在抗結核薬物と交差耐性(cross−resistance)がないことを示唆し、よって、薬物敏感および薬剤耐性結核菌感染に対抗する利用に同等に適する新しい行動モード(novel mode of action)を示唆する。
Claims (10)
- ノノムラエ種(Nonomuraea sp.)MJM5123菌株(ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号:KCTC 12178BP)から分離された化学式1または化学式2の環状ペプチド:
- 有効成分として化学式1および/または化学式2の化合物を含む、マイコバクテリア関連疾患の予防または治療のための薬学組成物:
- 前記マイコバクテリア関連疾患が結核である、請求項2に記載の薬学組成物。
- 前記結核がMDR結核またはXDR結核である、請求項3に記載の薬学組成物。
- 薬学組成物における前記組成物が1種以上の抗マイコバクテリア剤をさらに含む、請求項2〜4のいずれか1項に記載の薬学組成物。
- 前記抗マイコバクテリア剤は、第1線経口抗結核剤、注射用抗結核剤、フルオロキノロン、第2線経口抗結核剤、その他の抗結核剤、および結核に対する現在臨床試験中の化合物よりなる群から選ばれ、前記第1線経口抗結核剤はイソニアジド、リファンピシン、エタンブトールおよびピラジンアミドを含む群から選ばれ、前記注射用抗結核剤はストレプトマイシン、アミカシン、カプレオマイシンおよびカナマイシンを含む群から選ばれ、前記フルオロキノロンはシプロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシンおよびモキシフロキサシンを含む群から選ばれ、前記第2線経口抗結核剤はリファブチン、プロチオンアミド、エチオナミド、サイクロセリン、PASおよびチオアセタゾンを含む群から選ばれ、前記その他の抗結核剤はリネゾリド、クロファジミン、アモキシリン/クラブラン酸、クラリスロマイシン、およびジアミノジフェニルスルホンの誘導体を含む群から選ばれ、前記結核に対する現在臨床試験中の化合物はベダキリン、PA−824、ダラマニド、SQ−109、ステゾリド、リファペンチンおよび臨床前開発中の化合物、特にAZD5847、BTZ043、TBA−354、CPZEN−45、SQ−641、SQ−609、DC−159a、Q201、THPP、クロファジミンのリミノフェナジン類似体およびホウ素含有LeuRS抑制剤を含む群から選ばれる、請求項4に記載の薬学組成物。
- 前記一般化学式1または2の化合物と少なくとも1種の追加の化合物が同時、順次または別途の投与のために調整される、請求項5または6に記載の薬学組成物。
- 請求項1に記載の化学式1または化学式2の抗結核環状ペプチドの製造のためのプロセスにおいて、液体培養培地で好気的条件の下に抗マイコバクテリアペプチドを生産する前記ノノムラエ種(Nonomuraea sp.)MJM5123菌株(ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号:KCTC 12178BP)の微生物を培養する段階と、菌糸から請求項1に記載の抗結核環状ペプチドを分離する段階とを含む、抗結核環状ペプチドの製造プロセス。
- 前記抗結核環状ペプチドを分離する段階が、溶離液としてクロロホルムとメタノールを用いてノノムラエ種(Nonomuraea sp.)MJM5123菌(ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号:KCTC 12178BP)糸のメタノール抽出物の真空液体クロマトグラフィー(VLC、Vacuum liquid chromatography)を行う段階と、溶離液からメタノールを用いてセファデックス(Sephadex)LH−20オープンカラムクロマトグラフィーを行う段階と、溶媒としてHEMWat+2を用いて高速向流クロマトグラフィー(HSCCC:High Speed Coutercurrent Chromatography)を行う段階とを含む、請求項8に記載の抗結核環状ペプチドの製造プロセス。
- 前記抗結核環状ペプチドを分離する段階が、溶媒としてメタノールを用いてノノムラエ種(Nonomuraea sp.)MJM5123菌(ブダペスト条約に基づく国際寄託である受託番号:KCTC 12178BP)糸を抽出する段階と、液体メタノールを作るために前記メタノールの30%まで水を添加する段階と、ヘキサンを用いて前記メタノール抽出物を脱脂する段階と、液体層を分離し、65%まで液体メタノールを調整する段階と、クロロホルムを用いて液体層を抽出する段階と、メタノールを用いて前記クロロホルム抽出物を濃縮し、溶解する段階と、溶離液としてメタノールを用いてセファデックスLH−20カラムクロマトグラフィーを行う段階と、逆相ゲル(reverse phase gel)(RP−18)で充填されたカラムを備えた 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を行う段階とを含む、請求項8に記載の抗結核環状ペプチドの製造プロセス。
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