KR20120093192A - 항생제 화합물 - Google Patents

항생제 화합물 Download PDF

Info

Publication number
KR20120093192A
KR20120093192A KR1020127008552A KR20127008552A KR20120093192A KR 20120093192 A KR20120093192 A KR 20120093192A KR 1020127008552 A KR1020127008552 A KR 1020127008552A KR 20127008552 A KR20127008552 A KR 20127008552A KR 20120093192 A KR20120093192 A KR 20120093192A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
formula
compound
compounds
bacteria
species
Prior art date
Application number
KR1020127008552A
Other languages
English (en)
Inventor
프랍후 두트 미스라
기리쉬 바드리나쓰 마하잔
Original Assignee
피라말 라이프 사이언시스 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 피라말 라이프 사이언시스 리미티드 filed Critical 피라말 라이프 사이언시스 리미티드
Publication of KR20120093192A publication Critical patent/KR20120093192A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D277/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings
    • C07D277/02—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings
    • C07D277/20—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D277/22—Heterocyclic compounds containing 1,3-thiazole or hydrogenated 1,3-thiazole rings not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D277/28—Radicals substituted by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D513/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D513/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00
    • C07D513/12—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for in groups C07D463/00, C07D477/00 or C07D499/00 - C07D507/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D513/18—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 화학식 (I)의 신규의 순수 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체이성체 형태 또는 모든 호변이성체 형태 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 유도체를 포함한다. 본 발명은 추가로 트렙스마이세스 종에 속하는 미생물(PM0626271/MTCC 5447)의 발효에 의한 신규 항균제 화합물의 제조방법 또는 상기 신규 화합물의 하나 또는 그 이상을 활성성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 박테리아 감염에 의해 원인이 된 질환의 치료 및 예방용 약제에서의 그의 용도에 관한 것이다.

Description

항생제 화합물{Antibiotic Compounds}
본 발명은 항균 활성을 갖는 화학식 (I)의 신규의 화합물에 관한 것이다. 본 화합물은 트렙스마이세스 종에 속하는 미생물(PM0626271/MTCC 5447)의 발효에 의해 얻을 수 있다. 본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체이성체 형태 또는 모든 호변이성체 형태 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 유도체를 포함한다. 본 발명은 추가로 신규 항균제 화합물의 제조방법 및 상기 신규 화합물의 하나 또는 그 이상을 활성성분으로 함유하는 약학적 조성물 및 박테리아 감염에 의해 원인이 된 질환의 치료 및 예방용 약제에서의 그의 용도에 관한 것이다.
박테리아 중에서 항균 내성의 널리 퍼짐의 급격한 상승이 최근에 세계적인 공중 보건에 심각한 위협을 주고 있다. 메티실린 내성균 스타필로코커스 아우레우스(MRSA), 페니실렌 내성균 스트렙토코커스 뉴모니에(PRSP), 반코마이신 내성의 엔테로코커스 (VRE) (Clin. Microbiol. Infect., 2005, 11, Supplement 3: 22-28) 및 다약제 내성균(MDR) 마이코박테리아 투베르쿠로시스(Mycobacterium tuberculosis ) (Eur. Respir. J., 2002, Supplement 36, 66S-77S)에 의해 원인이 되는 감염이 특히 관심이 있다.
티오스트렙톤(Thiostrepton) 즉 스트렙토마이세스 아주레우스(Streptomyces azureus)로부터 분리된 항생제는 페니실린과 동일한 항생 스펙트럼을 갖는 효과적인 항-감염 약제인 것으로 보고되었으며 또한 그람 양성 구균 감염증에 대하여 사용된다 (미국 특허 제2,982,689호).
시오마이신(Siomycin) 즉 스트렙토마이세스 시오야엔시스(Streptomyces sioyaensis)로부터 분리된 황-함유 펩타이드 항생제는 그람 양성 박테리아에 대하여 활성이 있거나 또는 그람 음성 박테리아에 대하여 활성이 적거나 없는 마이코박테리아인 것으로 보고되었다 (The Journal Of Antibiotics, 1969, 364-368).
박테리아, 특히 MRSA, VRE 및 마이코박테리아 투베르쿠로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 다약제 내성 박테리아에 감염 위험이 있거나 감염되는 환자들을 치료하기 위한 약제로서 사용할 수 있는 새로운 화합물을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 화학식(I)의 신규한 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 트렙스마이세스 종에 속하는 미생물(PM0626271/MTCC 5447)의 발효액체 배지로부터 분리된 화학식(I)의 신규의 정제 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체이성체 형태와 모든 호변이성체 형태 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 유도체에 관한 것이다.
화학식(I)의 화합물, 및 이의 이성체, 약학적으로 허용되는 염 및 유도체는 항균활성을 가지며 또한 박테리아 특히 MRSA, VRE 및 마이코박테리아 투베르쿠로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 다약제 내성 박테리아에 의해 원인이 되는 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명은 추가로 박테리아 특히 MRSA, VRE 및 마이코박테리아 투베르쿠로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 다약제 내성 박테리아에 의해 원인이 되는 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 화학식(I)의 신규 화합물, 이의 이성체, 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를 활성성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 트렙스마이세스 종에 속하는 미생물(PM0626271/MTCC 5447)로부터 화학식(I)의 화합물 및/또는 이의 이성체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명을 상세하게 설명하기 전에, 본 발명이 특별한 실시양태로 제한되지 않는 것으로 이해하여야 한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특별한 실시양태를 설명하는 목적이지 제한하려는 의도가 아닌 것으로 이해하여야 한다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 단수 형태 "하나"(a, an) 및 "상기"(the)는 문맥이 달리 명확하게 지시되지 않는 한 복수개의 인용을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도체"는 하나의 원자가 또 다른 원자 또는 원자 그룹으로 대체되는 경우 또 다른 화합물로부터 발생하는 것으로 상상할 수 있는 유사한 화합물 또는 화합물로부터 유도되는 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "입체이성체"(stereoisomer)는 공간에서 그의 원자의 배열만 다른 개개 화합물들의 모든 이성체를 의미한다. 상기 입체이성체는 거울상 이성체(에난티오머), 거울상 이성체의 혼합물 (라세미체, 라세미체 혼합물), 기하(시스/트랜스 또는 신/안티 또는 E/Z) 이성체, 및 서로의 거울상이 아닌 하나 이상의 키랄 중심을 갖는 화합물의 이성체 (디아스테레오 이성체)를 포함한다. 본 발명이 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있으며 또한 라세미체, 라세미체 혼합물, 개개 디아스테레오 이성체, 또는 에난티오머로 일어날 수 있거나 또는 기하 이성체로 존재할 수 있으며, 이때 상기 화합물의 모든 이성체는 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "호변이성체"는 하나 (또는 그 이상)의 이동원자(mobile atoms)의 위치에서 및 전자 분포에서만 서로 다른 두 개 (또는 그 이상)의 화합물 예를 들면 케토-에놀 및 이민-엔아민 호변이성체들의 공존을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발효 액체배지" (fermented broth)은 그의 성장 중에 미생물에 의해 생산된 화합물을 함유하며 또한 미사용의 영양분을 갖는 영영 배지에서 미생물 배양의 현탁액을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "돌연변이체"(mutant)는 대체 표현형 내지 야생형인 돌연변이를 갖는 유기체 또는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "변이체"는 그 종에서 임의의 표준으로부터 인식할 수 있을 정도로 상이한 개개 유기체를 의미한다.
화학식(I)의 신규 화합물은 구조적으로 다음 식으로 표시된다.
[화학식 1]
Figure pct00001
화학식 I(a): R =
Figure pct00002
화학식 I(b): R=
Figure pct00003
화학식 I(a)의 신규 화합물은 분자식 C71H83N19O18S5 (분자량 1649.5)을 갖는다. 화학식 I(b)의 신규 화합물은 분자식 C71H85N19O18S5 (분자량 1651.5)을 갖는다. 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 신규 화합물은 본 명세서에서 이후에 논의되는 바와 같은 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 질량 스펙트럼(MS), 적외선(IR) 및 핵자기공명 (NMR) 분광분석 데이터와 같은 이들의 물리화학적 및 스펙트럼적 성질의 어느 하나 또는 그 이상을 특징으로 할 수 있다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 신규 화합물의 구조가 설명되었으며 또한 그의완전한 특징화는 HPLC, 고해상 MS (HRMS), IR 및 NMR 분광분석 데이터에 의해 행한다. 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물은 박테리아, 특히 MRSA, VRE 및 마이코박테리아 투베르쿠로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같은 다약제 내성의 박테리아에 대하여 활성인 신규 항생제이다. 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물은 지금까지 보고되지 않은 구조를 갖는다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물의 제조에 사용될 수 있는 미생물은 남극지역에서 Schirmacher 오아시스에서 수집된 토양 샘프로부터 분리된 트렙스마이세스 종의 균주(PM0626271/MTCC 5447)이며, 본 명세서에서 이후에 배양번호 PM0626271로 언급된다.
본 발명은 추가로 하나 또는 그 이상의 탄소원 및 하나 또는 그 이상의 질소원 및 임의로 영양 무기염 및/또는 미량원소를 함유하는 영양 배지에서 수중 호기성 조건 하에 배양번호 PM0626271를 배양하는 단계; 발효액으로부터 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물을 분리하는 단계; 및 관련분야에서 일반적으로 사용되는 정제 절차를 사용하여 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물을 정제하는 단계를 포함하는, 배양번호 PM0626271로부터 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물의 생산자인 배양번호 PM0626271의 예비적 동정(preliminary identification)은 클로니 형태의 검사, 웨트 마운트(wet mount) 관찰 및 그람 균 반응에 의해 행한다. 분리된 배양번호 PM0626271의 균주에 대한 현미경적 연구는 1.5% 한천을 함유하는 악티노마이세스 분리한천(AS-AIA; 자세한 사항은 실시예 부분에 제공)에서 수행하였고 관찰은 25℃에서 배양 1일, 2일 및 3일에 하였다.
1.5% 한천을 함유하는 AS-AIA에 대한 성장은 백색 포자형성, 소량 황색 기질 균사체, 약간 상승된 외관(slightly raised appearance), 비확산성 색소 및 이면 암색 버프(buff)를 갖는 1mm 직경 콜로니로 발전한다. 위상차 광학현미경 하에, 포자형성 선단을 갖는 얇은 균사체의 파상 매듭이 400배 확대에서 관찰되었다. 이들이 그람 양성이다. 자유 포자는 비운동성이다. 관찰된 형태는 이 유기체를 스트렙토마이세스 패미리의 일원으로 분류한다.
배양번호 PM0626271은 미생물주 보존기관 (MTCC), 미생물 기술연구소, Sector 39-A, Chandigarh-160 036, 인도, 세계지적소유권기관(WIPO) 승인된 국제기탁기관 (IDA)에 기탁되었으며 수탁번호 MTCC 5447가 부여되었다.
본 명세서에 기술된 구체적인 미생물 외에도, 돌연변이체, 예를 들어 X-선, 자외선 등을 포함하는 화학적 또는 물리적 돌연변이원의 사용에 의해 생산된 것들, 및 유전자구조가 분자 생물학 기술에 의해 변형된 유기체들이 또한 배양되어 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물을 생산할 수 있는 것으로 이해하여야 한다.
본 발명에 따른 화합물을 제조할 수 있는 적절한 돌연변이체 및 변이체의 스크리닝은, 예를 들면 화합물의 생물학적 활성을 시험함으로써, 발효액체 배지에 축적된 활성화합물의 생물학적 활성의 측정 및/또는 HPLC에 의해 확인할 수 있다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물을 생산하는 배양번호 PM0626271의 분리 및 배양에 사용되는 배지 및/또는 영양 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원 및 영양 무기염을 함유한다. 상기 탄소원은 예를 들면 전분, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 프럭토오스, 당밀, 글리세롤, 락토오스 또는 갈락토오스 중의 하나 또는 그 이상이다. 바람직한 탄소원은 가용성 전분 및 글루코오스이다. 질소원은 예를 들면 대두 곡물, 피이넛 미일(peanut meal), 효모 추출물, 고기즙 추출물(beef extract), 펩톤, 맥아 추출물, 옥수수 침출액(corn steep liquor), 젤라틴, 또는 카사미오 산중의 하나 또는 그 이상이다. 바람직한 질소원은 펩톤 및 효모 추출물이다. 영양 무기 염은 예를 들면 염화 나트륨, 염화 칼륨, 염화 칼슘, 염화 마그네슘, 염화 제2철, 염화 스트론튬, 염화 코발트, 취화 칼륨, 불화 나트륨, 인산 수소 나트륨, 인산 수소 칼륨, 인산 수소 이칼륨, 인산 마그네슘, 탄산 칼슘, 중탄산 나트륨, 규산 나트륨, 질산 암모늄, 질산 칼륨, 황산 제1철, 황산 나트륨, 황산 암모늄, 황산 마그네슘, 구연산 제2철, 붕산 또는 미량 염 용액 중의 하나 또는 그 이상이다. 탄산칼슘, 염화 나트륨 및 염화 마그네슘이 바람직하다.
배양번호 PM0626271의 유지는 22℃ 내지 36℃ 범위의 온도 및 약 7.5 내지 8.0의 pH에서 수행할 수 있다. 전형적으로, 배양번호 PM0626271는 25℃ 내지 27℃ 의 온도 및 약 7.4 내지 7.8의 pH에서 유지된다. 잘 성장된 배양액은 냉장고에 4℃ 내지 8℃로 보존할 수 있다.
배양번호 PM0626271의 종배양(seed culture cultivation)은 25℃ 내지 36℃ 의 온도 및 약 7.5 내지 8.0의 pH에서 66 시간 내지 75 시간 동안 200 rpm (분당 회전수) 내지 280 rpm으로 수행할 있다. 전형적으로, 배양번호 PM0626271 종은 29℃ 내지 31℃의 온도 및 약 7.4 내지 7.8의 pH에서 72 시간 동안 230 rpm 내지 250 rpm으로 배양할 수 있다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물의 생산은 26℃ 내지 36℃ 범위의 온도 및 약 6.5 내지 8.5의 pH에서 24 시간 내지 96 시간 동안 60 rpm 내지 140 rpm 및 100 lpm (분당 리터) 내지 200 lpm 통기(aeration) 하에 발효에 의해 배양번호 PM0626271을 배양함으로써 수행할 있다. 전형적으로, 배양번호 PM0626271은 30℃ 내지 32℃의 온도 및 약 7.4 내지 7.8의 pH에서 40 시간 내지 90 시간 동안 90 rpm 및 110 lpm 통기하에 배양한다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물의 생산은 본 명세서에 기술된 조건 하에, 바람직하게는 수중 호기성 조건하에, 예를 들면 진탕 플라스크에서 뿐만 아니라 실험실 발효기에서, 적절한 영양 배지 중에 배양번호 PM0626271를 배양함으로써 수행할 수 있다. 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물의 발효 및 생산의 진행은 공지된 미생물 한천 플레이트 확산 어세이 방법에 의해 스타필로코커스 및/또는 엔테로코커스 종에 대하여 배양 액체 배지의 생체 활성을 측정함으로써 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 검지할 수 있다. 바람직한 배양물은 메타실린에 대한 내성이 있는 균주 즉 문헌에 보고된 αβ-락탐 항생제인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) E710, 및 반코마이신에 내성이 있는 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium ) R2 (VRE)이다. 수득된 발효 액체 배지에서, 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물은 배양 여과물은 물론 세포 덩이에 존재하며, 또한 용매추출 및 칼럼 크로마토그래피와 같은 공지 분리 기술을 사용하여 분리할 수 있다. 따라서, 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물은 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸 아세테이트 또는 부탄올과 같은 수불혼화성 용매로 약 5 내지 9의 pH에서 추출에 의해, 또는 "Diaion HP-20®" (Mitsubishi Chemical Industries Limited, 일본), "Amberlite XAD®" (Rohm and Haas Industries, 미국), 활성탄과 같은 고분자 수지를 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해, 또는 pH 5 내지 9에서 이온교환 크로마토그래피에 의해, 배양 여과액으로부터 회수할 수 있다. 활성물질은 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올 또는 이소-프로판올과 같은 수혼화성 용매를 사용하거나, 또는 석유 에테르, 디클로로포름, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 디에틸 에테르 또는 부탄올과 같은 수불혼화성 용매를 사용하여 추출에 의해 세포 덩이로부터 회수할 수 있다. 하나의 다른 방법은 석유 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올, 이소-프로판올, 또는 부탄올로부터 선택된 용매로 전체 액체배지를 추출하는 것이다. 전형적으로, 활성물질은 전체 액체 배지로부터 에틸 아세테이트로 추출한다. 추출물의 농축 및 동결건조는 활성 조 물질을 제공한다.
본 발명의 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물은 다음 기술들: 정상상 크로마토그래피(정지상으로서 알루미나 또는 실리카 겔: 석유 에테르, 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 아세톤, 클로로포름, 메탄올, 또는 이의 결합물 등의 추출물을 사용); 역상 크로마토그래피 (정지상으로서 디메틸옥타세실실릴 실리카 겔, (RP-18) 또는 디메틸옥틸실릴 실리카 겔 (RP-8)과 같은 역상 실리카 겔을 사용); 및 용출물 예들 들어 물, 완충액 [예를 들면, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트 (pH 2 내지 8)], 및 유기 용매 (예를 들면, 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라하이드로푸란, 또는 이들 용매의 결합물); 겔 침투 크로마토그래피 (메탄올, 클로로포름, 아세톤, 에틸 아세테이트, 또는 이의 결합물 등의 용매 중에 Sephadex LH-20® (Pharmacia Chemical Industries, 스웨덴), TSKgel® Toyopearl HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, 일본) 등의 수지; 또는 물 중에 Sephadex® G-10 및 G-25등의 수지를 사용)의 어느 하나를 사용하여 분획화에 의해 조 물질로부터 회수하거나; 또는 향류 크로마코그래피 (물, 메탄올, 에탄올, 이소-프로판올, n-프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세톤, 아세토니트릴, 염화 메틸렌, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 석유 에테르, 벤젠 및 톨루엔과 같은 용매 두 개 또는 그 이상으로 이루어진 이상 용출 시스템을 사용)에 의해 조 물질로부터 회수할 수 있다. 이들 기술은 반복적으로, 단독으로 또는 결합하여 사용할 수 있다. 대표적인 방법은 실리카 겔을 사용하는 정상 상에 대한 크로마토그래피이다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 및 이의 입체이성체는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 유도체로 전환될 수 있으며, 이들은 모두 본 발명에 의해 고려된다.
상기 화합물의 염은 당해 분야의 기술자에게 알려진 표준 절차에 의해 제조할 수 있으며; 예를 들면, 하이드로클로라이드 및 설페이트 염과 같은 염은 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 및 이의 이성체를 적절한 산, 예를 들면 염산, 황산으로 처리하여 제조할 수 있다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물은 광범위한 박테리아 균에 대하여 항균활성을 갖는다. 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물은 또한 MDR Mycobacterium tuberculosis 균 예를 들어 M. tuberculosis H37Rv; M. tuberculosis 임상 분리균 -S(스트렙토마이신), H(이소니아지드 또는 이소니코티닐히드라진), R(리팜피신) 및 E(에탐부톨)-내성균; 및 M. tuberculosis 임상 분리균- S, H, R 및 E 민감 균주에 대하여 항미코박테리아 활성을 갖는다.
화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물, 이의 입체이성체 및 약학적으로 허용되는 염 중의 하나 또는 그 이상은, 단독으로 또는 함께, 인간을 포함한 포유류 등의 동물에게 약물로서 및 약학적 조성물 형태로 투여할 수 있다. 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물, 이의 입체이성체 및 약학적으로 허용되는 염 중의 하나 또는 그 이상은, 단독으로 또는 함께, 박테리아 감염에 의해 감염 위험이 있는 환자에게 예방적으로 투여할 수 있다. 환자는 의료 현장에서, 예를 들면 병원에서, 또는 박테리아가 존재할 수 있는 다른 현장에서 박테리아에 노출될 수 있는 누군가일 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 약물로서 사용하기 위한 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물, 이의 입체이성체 및 이의 약학적으로 허용되는 염, 및 항균활성을 갖는 약제의 제조를 위한 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물, 이의 입체이성체 및 이의 약학적으로 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 박테리아 감염증을 예방 또는 치료하는데 유용한, 하나 또는 그 이상의 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 및/또는 입체이성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는 유도체의 유효량을, 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체와 함께, 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 약학적 조성물에서 활성성분으로서 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 또는 이의 입체이성체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 유도체의 유효량은 정상적으로 약 0.01 mg 내지 1000 mg이다.
본 발명은 또한 하나 또는 그 이상의 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 및/또는 입체이성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 필요한 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 박테리아 감염증의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 박테리아 감염증에 의해 원인이 되는 질환의 치료 또는 예방을 위한, 하나 또는 그 이상의 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 및/또는 입체이성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 이의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 함유하는 약물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 화합물은 항균제로서 특히 유용하다. 따라서 본 발명은 박테리아 감염에 의해 원인이 되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에서, 하나 또는 그 이상의 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 및/또는 입체이성체 및/또는 하나 또는 그 이상의 이의 약학적으로 허용되는 염 및/또는 유도체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 화합물이 사용되는 치료용 박테리아 감염증은 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus),엔테로코커스(Enterococcus), 바실루스(Bacillus) 또는 마이코박테리아(Mycobacterium) 종에 속하는 박테리아에 의해 원인이 될 수 있다. 스타필로코커스 종에 속하는 박테리아는 메티실린 내성균(methicillin-resistant) 또는 반코마이신 내성균(vancomycin-resistant)일 수 있다. 엔테로코커스 종에 속하는 박테리아는 반코마이신 내성균일 수 있다. 마이코박테리아 종에 속하는 박테리아는 다약제 내성균(multi drug-resistant)일 수 있다.
용어 "스타필로코커스 종"은 현미경을 통해 보았을 때 포도상 균주군으로 보이며 또한 혈액 한천 플레이트 상에서 성장하였을 때, 흔히 β-용혈 현상을 갖는 큰 둥근 황금색 콜로니로서 나타나는 그람 양성 박테이아를 의미한다. 스타필로코커스의 종은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 포함한다.
용어 "스트렙토코커스 종"은 구형의 그람 양성 박테리아의 속, 및 피르미쿠테스 문(phylum Firmicutes)의 일원을 의미한다. 스트렙토코커스는 락트산 박테리아이다. 스트렙토코커스 종은 S. hemolyticus, S. mitis , S. salivarius , S. pneumoniae 등의 박테리아를 포함한다. 스트렙토코커스 종은 수막염, 세균성 폐렴, 심장내막염, 얕은 연조직염 및 괴사 근막염('육식성' 박테리아 감염증)과 같은 감염성 질환에 관여한다.
용어 "엔테로코커스 종"은 피르미쿠테스 문의 락트산 박테리아의 속을 의미한다. 이들은 흔히 쌍으로 발생하는 그람 양성 구균이다 (쌍구균 예를 들면 Diplococcus pneumoniae). 엔테로코커스는 조건 무산소 균이다.
용어 "바실루스" 종은 주모성 편모증(peritrichous flagellarefers)에 의해 운동성이며 또한 B. anthracis , B. subtilis과 같이 호기성이거나 또는 Clostridium spp. 예를 들면 C. difficile과 같이 혐기성인 다수 개의 다양한 로드상 양성균을 의미한다. 이들 바실루스는 피르미쿠테스 과에 속한다.
용어 "마이코박테리아 종"은 악티노마이세스(actinomyces)에 관련된 그람 양성, 비운동성, 다형 로드를 의미한다. 인간의 결핵은 마이코박테리아 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)에 의해 원인이 된다. MDR-TB (다약제 내성 결핵)은 적어도 두 개의 제1선 TB 약물, 이소니아지드(isoniazid) 및 리팜피신(rifamipicin)에 내성이 있는 결핵의 균을 설명한다.
본 발명의 화합물은 경구로, 코로, 국소로, 비경구로 예를 들면 피하로, 근육내로, 정맥내로, 또는 다른 투여 경로에 의해 투여할 수 있다.
하나 또는 그 이상의 화학식 I(a) 및 화학식I(b)의 화합물 또는 이의 입체이성체 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 유도체를, 임의로 다른 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체와 함께, 함유하는 약학적 조성물은, 상기 활성 화합물을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제 및/또는 담체 예를 들어 습윤제, 가용화제 예를 들어 계면활성제, 매개체, 등장화제, 충전제, 착색제, 향미 차폐제(masking flavor), 윤활제, 붕괴제, 희석제, 결합제, 가소제, 유화제, 연고기제, 피부연화제, 증점제, 고분자제, 지질, 유제, 공용매, 착화제, 또는 완충물질과 혼합한 다음, 상기 혼합물을 적절한 약학적 형태 예를 들어 정제, 피복 정제, 캅셀제, 과립제, 분말제, 크림제, 연고제, 겔제, 시럽제, 유화제, 현탁제, 또는 비경구 투여에 사용되는 주사에 적합한 용액으로 전환시킴으로써 제조할 수 있다.
언급될 수 있는 부형제 및/또는 담체의 예는 크레모포르(cremophor), 폴록사머, 염화 벤잘코늄, 라우릴 황산 나트륨, 덱스트로오스, 글리세린, 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜, 전분, 덱스트린, 락토오스, 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 활석, 한천 배지, 광물유, 동물유, 식물성유, 유기 및 광물성 왁스, 파라핀, 겔, 프로필렌 글리콜, 벤질 알코올, 디메틸아세트아미드, 에탄올, 폴리글리콜, 트윈 80, 솔루톨 HS 15, 물 및 염수이다. 또한 이러한 활성 물질들을 부형제 또는 희석제 없이 적절한 형태로 예를 들면 캡슐 중에 투여할 수 있다.
습관적으로, 생약 제형 및 투여방법은 물론, 특정한 경우에 적합한 투여량 범위는 치료하고자 하는 종에 따라 또한 각각의 증상 또는 질환의 상태에 따라 달라지며 또한 당해 분야에 알려진 방법들을 사용하여 최적화할 수 있다. 평균적으로, 환자에서 활성 화합물의 일일 투여량은 0.0005 mg/kg 내지 50 mg/kg, 전형적으로 0.001 mg/kg 내지 20 mg/kg이다.
도 1은 CDCl3: CD3OD (4:1)에서 화학식 I(a)의 화합물의 1H NMR 스펙트럼 (500 MHz; Instrument Bruker)을 예시한다.
도 2는 CDCl3: CD3OD (4:1)에서 화학식 I(a)의 화합물의 13C NMR 스펙트럼 (75 MHz; Instrument Bruker)을 예시한다.
도 3은 CDCl3: CD3OD (4:1)에서 화학식 I(b)의 화합물의 1H NMR 스펙트럼 (500 MHz; Instrument Bruker)을 예시한다.
다음은 본 발명의 예시적인 실시예들이 제공되며 그의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1
남극 지역에서 수집된 토양으로부터 배양번호 PM0626271의 분리
a) 분리 배지의 조성
변형된 인공해수 한천 : 펩톤 1.5 g, 효모 추출물 0.5 g, 염화 제2철 0.007 g, 1.0 L 물 (750 mL 인공해수 + 250 mL 광물 제거수), 한천 분말 15.0 g, 최종 pH (25℃에서) 7.4 내지 7.8.
인공해수의 조성: 염화 나트륨 24.6 g, 염화 칼륨 0.67 g, 염화 칼슘.2H2O 1.36 g, 황산 마그네슘.7H2O 6.29 g, 염화 마그네슘.6H2O 4.66 g, 중탄산 나트륨 0.18 g, 광물 제거수 1.0 L, 최종 pH (25℃에서) 7.8 내지 8.2.
b) 절차
남극 지역의 Schirmacher 오아시스 지역으로부터, 표면 레벨 토양을 수집하고 인도, 뭄바이, 고레가온의 Piramal Life Sciences Limited에 여행 내내 -20℃에서 저장하였다. 샘플은 -20℃ 내지 -22℃에서 저장하고 나중에 미생물의 분리를 위해 실온 (25±2℃)로 녹였다. 토양 샘플 (~1 g)은 100 mL 멸균 플라스크 중에 25ml의 멸균성 1% 펩톤 수에 현탁시켰다. 플라스크는 30초 동안 소용돌이 시켰다. 10-5까지의 단계적 희석액은 멸균성 1% 펩톤 수에서 준비하였다. 100㎕의 10-5 희석액은 변형 인공 해수 한천에 표면 확산시켰다. 플레이트는 콜로니가 관찰될 때까지 실온(25℃±2℃)에서 배양하였다. 1달 반 동안 배양 후에, 이 배지 상에 나타나는 콜로니는 75% 인공 해수 [AccumixTm] 중에서 제조된 (AS-AIA) 악티노마이세스 분리 한천[Hi 배지]를 함유하는 페트리 플레이트(petri plates) 상에서 스트리킹(streak)하였다. 분리주을 정제하고 배양 ID 번호 PM0626271를 부여하였다. 따라서 배양 번호 PM0626271은 성장하는 미생물 중에서 단일 분리균으로 분리하였다.
실시예 2
배양 번호 PM0626271의 정제
a) 정제 배지의 조성 (악티노마이세스 분리 한천, 1.5% 한천 배지로 한천화(agarified)함):
글리세롤 5.0 mL, 카제인산 나트륨 2.0 g, L-아스파라긴 0.1 g, 프로피온산 나트륨 4.0 g, 인산 이칼륨 0.5 g, 황산 마그네슘 0.1 g, 황산 제1철 0.001 g, 1.0 L 물 (750 mL 인공 해수 + 250 mL 광물 제거수), 한천 분말 15.0 g, 최종 pH (25℃에서) 7.4 내지 7.8.
인공 해수의 조성: 염화 나트륨 24.6 g, 염화 칼륨 0.67 g, 염화 칼슘.2H2O, 1.36 g, 황산 마그네슘.7H2O 6.29 g, 염화 나트륨.6H2O 4.66 g, 중탄산 나트륨 0.18 g, 광물제거수 1.0 L, 최종 pH (25℃에서) 7.8 내지 8.2.
b) 절차:
배양번호 PM0626271는 악티노마이세스 분리 한천(75% 인공 해수염을 함유) 페트리플레이트 상에서 스트리킹하였다. 페트리플레이트를 25℃에서 10일 동안 배양하였다. 페트리플레이트로부터 분리된 콜로니의 하나를 75% 인공해수에서 제조된 악티노마이세스 분리 한천의 신선한 경사배지(slant)에 옮겼다. 경사 배지를 25℃에서 10일 동안 배양하였다.
실시예 3
생산주 - 배양번호 PM0626271의 유지
a) 배지의 조성 (악티노마이세스 분리 한천):
글리세롤 5.0 mL, 카제인산 나트륨 2.0 g, L-아스파라긴 0.1 g, 프로피온산 나트륨 4.0 g, 인산 이칼륨 0.5 g, 황산 마그네슘 0.1 g, 황산 제1철 0.001 g, 1.0 L 물 (750 mL 인공 해수 + 250 mL 광물 제거수), 한천 분말 15.0 g, 최종 pH (25℃에서) 7.4 내지 7.8.
인공해수의 조성: 염화 나트륨 24.6 g, 염화 칼륨 0.67 g, 염화 칼슘.2H2O 1.36 g, 황산 마그네슘.7H2O 6.29 g, 염화 마그네슘.6H2O 4.66 g, 중탄산 나트륨 0.18 g, 광물 제거수 1.0 L, 최종 pH (25℃에서) 7.8 내지 8.2.
b) 가열에 의해 성분들을 철저하게 용해한 후, 수득된 용액을 시험관에 분배하고 121℃에서 30분 동안 멸균시켰다. 시험관을 냉각하고 경사 배지 위치에서 고화시켰다. 한천 경사배지는 와이어 루프(wire loop)에 의해 배양번호 PM0626271의 성장으로 스트리킹하고 양호한 성장이 관찰될 때까지 27℃ 내지 29℃에서 배양하였다. 잘 성장된 배양물은 냉장고에 4℃ 내지 8℃에서 저장하였다.
실시예 4
진탕 플라스크에서 배양번호 PM0626271의 발효
a) 종 배지의 조성 [AS-274 (1)]:
글루코오스 15 g, 옥수수 침출액 5 g, 펩톤 7.5 g, 효모 추출물 7.5 g, 탄산 칼슘 2.0 g, 염화 나트륨 5.0 g, 750 mL 인공해수 및 250 mL 광물 제거수로 만든 용적.
b) 상기 배지는 500 mL 용적 에를렌마이어 플라스크 속에 40mL의 량으로 분배하고 121℃에서 30분 동안 고압 멸균시켰다. 플라스크를 실온(25±2℃)로 냉각하고 각각의 플라스크를 경사 배지 상에 잘 성장된 생산 균(배양번호 PM0626271)의 고리(loopful)로 배양하고 30℃(±1℃)에서 230 rpm 내지 250 rpm으로 72 시간 동안 회전식 진탕기에서 진탕하여 종배양물을 얻었다.
c) 생산 배지의 조성 [AS 36P (1)]:
가용성 전분 20 g, 글루코오스 15 g, 효모 추출물 2 g, 펩톤 3 g, 탄산 칼슘 2 g, 황산 암모늄 0.5 g, 옥수수 침출액 2 g, 염화 나트륨 2 g, 인산 마그네슘 5 g, 1 g/L의 군체로부터 염화 코발트 1mL/L, 미량 염 용액 1 mL/L, 75% 인공해수 및 25% 광물 제거수를 사용하여 1 L로 만든 용적.
d) 500 mL 용적 에를렌마이어 플라스크 속에 40 mL의 생산 배지를 121℃에에서 30분 동안 고압 멸균하고, 29℃ 내지 30℃로 냉각하고, 실시예 4b에 언급된 종배양액의 5%(v/v)로 종자 배양하였다.
e) 발효 인자:
생산 플라스크를 29℃ 및 220 rpm에서 96시간 동안 진탕기에서 배양하였다. 생산 플라스크를 회수하고 각각의 배지 플라스크로부터 전체 액체 배지는 29℃에서 1 시간 동안 진탕 조건 하에 동일 용적의 메탄올로 추출하고 3500 rpm에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상청액은 활성 모니터링용 항균성 한천 웰 확산 어세이를 위해 사용하였다.
발효액체 배지에서 화학식I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 생산은 한천 웰 확산 법을 사용하여 S. aureus E710 (MRSA 균) 및/또는 Enterococcus faecium R2 (VRE)에 대한 생체 활성을 시험하여 결정하였다. 발효된 액체배지의 회수 pH는 7.0 내지 8.0이었다. 발효된 액체 배지를 회수하고 전체 액체 배지는 화학식I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 분리 및 정제를 위해 사용하였다.
실시예 5
발효용 진탕 플라스크에서 종 배양액의 제조
a) 배지의 조성[AS-274 (1)]:
글루코오스 15 g, 옥수수 침출액 5 g, 펩톤 7.5 g, 효모 추출물 7.5 g, 탄산 칼슘 2.0 g, 염화 나트륨 5.0 g, 750 mL 인공 해수 및 250 mL 광물 제거수로 만든 용적
b) 상기 배지는 1000 mL 용적 에를렌마이어 플라스크 속에 200mL의 량으로 분배하고 121℃에서 30분 동안 고압 멸균시켰다. 플라스크를 실온 (25±2℃)으로 냉각하고 각각의 플라스크를 경사 배지 상에 잘 성장된 생산 균(배양번호 PM0626271)의 고리(loopful)로 배양하고 29℃ 내지 30℃ 및 230 rpm 내지 250 rpm에서 70 내지 74 시간 동안 회전식 진탕기에서 진탕하여 종배양액을 얻었다.
실시예 6
발효기에서 배양 번호 PM0626271의 배양
a) 생산 배지의 조성:
인공해수 (인공해수 염 28.32 g) (75%), 가용성 전분 20 g, 글루코오스 15 g, 효모 추출물 2 g, 펩톤 3 g, 탄산 칼슘 2 g, 황산 암모늄 0.05 g, 옥수수 침출액 2 g, 염화 나트륨 2 g, 인산 마그네슘 5 g, 염화 코발트 (염화 코발트 1 g, 광물 제거수 1.0 L) 1 mL/L, 미량 염 용액 (황산구리 7 g, 황산 제1철 1 g, 염화 마그네슘 8 g, 황산 아연 2 g, 광물 제거수 1.0 L) 1 mL/L, 광물 제거수 1.0 L, pH 6.5 내지 7.5 (멸균 전).
b) 소포제로서 30 mL의 데스모펜과 함께 150 L의 발효기속에 100 L의 생산 배지를 121℃에서 30분 동안 멸균하고 29℃ 내지 30℃로 냉각하고 상기(실시예5)에서 얻어진 2.5 L 내지 3.5 L의 종 배양액으로 종자 배양하였다.
c) 발효 인자: 발효는 온도 29℃ 내지 30℃, 교반 100 rpm, 통기 60 lpm에서 수행하고 70 시간 내지 74 시간에서 회수하였다. 발효액체 배지에서 화학식I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 생산은 한천 웰 확산 법을 사용하여 S. aureus E710 (MRSA 균) 및/또는 Enterococcus faecium R2 (VRE)에 대한 생체 활성을 시험하여 정성적으로 탐지하였다. 발효된 액체 배지의 회수 pH는 7.5 내지 8.0이었다. 회수 후에, 전체 액체 배지는 용매 추출 처리하였다.
실시예 7
화학식I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 분리 및 정제
전체 액체 배지(10 L 배치)는 에틸 아세테이트(1:1)를 사용하여 추출하였다. 유기 및 수성 층을 분리하였다. 유기 층을 처리하여 용매를 증발시켜 조 에틸 아세테이트 추출물(1.5 g)을 얻었다. 조 추출물을 플래시 크로마토그래피 (실리카 겔, 30 g, 용매 : 메탄올/클로로포름 단계 구배, 유속: 15 mL/분)으로 처리하였다. 활성 화합물은 클로로포름 중에 1% 메탄올 내지 5% 메탄올로 용출하고, 농축시켜 반순수 (semipure) 화합물(250 mg)을 얻었다. 추가의 정제는 반복적인 정상상 분취 HPLC로 수행하였다.
분취 HPLC 조건:
칼럼 : Eurospher 실리카 (10μ, 20x250 mm)
용출물 : 메탄올: 클로로포름 (5:95)
유속 : 20 mL/분
검출(UV): 245 nm
보유시간 : 화학식 I(a)의 화합물 (5 내지 6 분),
화학식 I(b)의 화합물 (8 내지 10 분)
분획의 순도는 E. faecium R2 및/또는 S. aureus 3066에 대한 생물 검정 및/또는 분석 HPLC에 의해 조사하였다. 화학식I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물을 함유하는 용출물을 혼주(pooled)하고 감압하에 농축시켜 용매를 제거하여 화학식I(a)의 화합물 (40 mg), 및 화학식 I(b)의 화합물 (3 mg)을 얻었다.
분석 HPLC 조건:
칼럼: Eurospher RP-18, (3μ, 4.6 x125 mm)
용매 시스템 : 구배 (물에 대해 15분 내 0% 아세토니트릴 100%, 다음에 5분 동안 100% 아세토니트릴)
유속 : 1 mL/분
검출 (UV) : 245 nm
보유 시간 : 화학식 I(a)의 화합물(12 내지 13 분), 및 화학식 I(b)의 화합물 (11 내지 12 분)으로 구성
A. 화학식 I(a)의 화합물의 물리적 및 스펙트럼적 특성:
외관 : 백색 분말
융점 : 240℃ (분해)
용해도: 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올에 가용성 및 물에 불용성
MS [HR-ESI(+) MS)] m/z : 1650.4858 (M+H)
분자량 : 1649.5
분자식: C71H83N19O18S5
IR (KBr): 3386, 2927, 1648, 1507, 1206, 756, 666 cm-1
1H NMR : 표 1 및 도 1을 참조한다
13C NMR: 표 2 및 도 2를 참조한다.
B. 화학식 I(b)의 화합물의 물리적 및 스펙트럼적 특성:
외관: 백색 분말
용해도: 클로로포름, 에틸 아세테이트, 메탄올에 가용성 및 물에 불용성
MS [HR-ESI(+) MS)] m/z : 1674.4787 (M+Na)
분자량: 1651.50
분자식: C71H85 N19O18S5
1H NMR : 표 3 및 3을 참조한다.
500 MHz에서 CDCl3: CD3OD (4:1)중의 화학식I(a)의 화합물의 1H NMR
피크 δ 피크 δ 피크 δ
1 0.7(d, 3H) 18 3.67(d, 1H) 35 6.91(s, 1H)
2 0.74(d, 3H) 19 3.7 (q, 1H) 36 6.94(s, 1H)
3 0.95(d, 3H) 20 4.33(d, 1H) 37 7.2(s, 1H)
4 1.04(s, 3H) 21 4.33(d, 1H) 38 7.43(s, 1H)
5 1.08(d, 3H) 22 4.62((q, 1H) 39 7.45(s, 1H)
6 1.2(d, 3H) 23 4.86(dd, 1H) 40 7.65(s, 1H)
7 1.28(d, 3H) 24 5.19 (s, 1H) 41 7.87(s, 1H)
8 1.34(d, 3H) 25 5.19(s, 1H),
5.67 (s, 1H)		 42 8.05(s, 1H)
9 1.37(m, 1H) 26 5.2(t, 1H) 43 8.17(s, 1H)
10 1.5(d, 3H) 27 5.6(d, 1H) 44 8.2 (s, 1H)
11 1.6(d, 3H) 28 5.62(s, 1H), 6.44(s, 1H) 45 8.5 (s, 1H)
12 2.1(m, 1H) 29 5.65(d, 2H) 46 8.67 (s, 1H)
13 2.2 (m, 1H) 30 5.72(s, 1H), 6.61(s, 1H) 47 8.99 (s, 2H)
14 2.2(m, 1H)
3.99(m, 1H)		 31 6.1(q, 1H) 48 9.72 (s, 1H)
15 2.8(d, 1H) 32 6.25(m, 1H) 49 9.8 (s, 1H)
16 3.05(t, 1H) 3.5(t, 1H) 33 6.28(d, 2H)
17 3.49(d, 2H) 34 6.8(d, 1H)
Figure pct00004
500 MHz에서 CDCl3: CD3OD (4:1)중의 화학식I(b)의 화합물의 1H NMR
피크 δ 피크 δ 피크 δ
1 0.88(d, 3H) 23 4.59(t, 1H) 45 7.80(s, 1H)
2 0.95(d, 3H) 24 4.61(dd, 1H) 46 8.05(s, 1H)
3 0.99(d, 3H) 25 4.74 (t, 1H) 47 8.11(s, 1H)
4 1.0 (m, 1H) 26 4.95(t, 1H) 48 8.14 (s, 1H)
5 1.16(s, 3H) 27 5.19(s, 1H), 5.78 (s, 1H) 49 8.26 (s, 1H)
6 1.18(d, 3H) 28 5.19(s, 1H) 50 8.52(t, 1H)
7 1.32(d, 3H) 29 5.3(d, 1H) 51 8.65(d, 1H)
8 1.35(d, 3H) 30 5.52(s, 1H), 6.65(s, 1H) 52 9.2 (s, 1H)
9 1.43(d, 3H) 31 5.65(s, 1H) 53 9.87 (s, 1H)
10 1.5(d, 3H) 32 5.72(d, 1H) 54 9.92 (s, 1H)
11 1.61(d, 3H) 33 5. 8(d, 1H)
12 1.72(d, 3H) 34 6.1(q, 1H)
13 2.02 (m, 1H) 35 6.34(m, 1H)
14 2.28(m, 1H) 36 6.36(d, 1H)
15 2.8(d, 1H) 37 6.73(d, 1H)
16 3.17(t, 1H) 3.69(t, 1H) 38 6.91(d, 1H)
17 3.43 (d, 1H) 39 6.94(s, 1H)
18 3.46(d, 1H) 40 7.14(s, 1H)
19 3.58 (d, 1H) 41 7. 3(s, 1H)
20 3.8(q, 2H) 42 7.46(s, 1H)
21 4.06(m, 1H) 43 7.54(d 1H)
22 4.45((d, 1H) 44 7.65(d, 1H)
시험관내 시험에서 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 생물학적 평가
실시예 8
시험관내 효력은 미국 임상연구소 규격 위원회 (2000) 가이드라인 (Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically-Fifth Edition: Approved Standard M7-A5. NCCLS, Wayne, PA, 미국)에 따라 마크로 액체 희석법을 사용하여 박테리아 균에 대한 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 최소 억제 농도(MIC) 측정에 의해 입증되었다. 뮐러-힌톤 액체 배지는 달리 언급이 없는 한 시험을 위한 영양 배지로 사용하였다. PM181104 (PCT 국제공개공보 WO2007119201)는 모든 시험관내 시험에서 공지된 표준으로 사용하였다. 화학식I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 저장용액의 제조를 위하여 클로로포름(총 필요 용적이 5%) 중에 용해하고 메탄올(총 필요 용적의 95%)를 사용하여 희석하였다.
결과:
얻어진 결과는 표 4 및 표 5에 나타내며, 화학식I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물이 박테리아 감염증의 치료에 유용성을 가지고 있음을 입증한다.
Figure pct00005
박테리아균에 대한 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 MIC
시험배양물 최소억제농도 (㎍/ml)
화학식I(a)의 화합물 화학식I(b)의 화합물
E.faecium, R-2 (VRE) 0.125 2
S.aureus E710, (MRSA) 0.125 2
S.aureus 209P (MSSA) 0.064-0.125 0.25-0.5
표 4 및 표 5에서 사용된 약자는 다음과 같다:
S : Staphylococcus
E : Enterococci
실시예9
항결핵균 활성의 시험
본 시험은 J. Clin. Microbiol., 1999, 37, 1144에 보고된 바와 같이 수행하였다. MacFarlands 번호 2 표준 (>5 x 107 CFU/ml에 상응함) (Remel, Lenexa, Kan.)에 동등한, 50㎕의 박테리아 (표 6에 언급됨) 현탁액은 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 존재하에 또는 부재하에 400㎕의 G7H9에 첨가하고 (0.5 ㎍/mL, 5 ㎍/mL 및 10 ㎍/mL에서 시험함), 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 50 ㎕의 높은 티터 루시퍼라제 리포터 페이지(titer Luciferase reporter phage; phAE 129) 및 40㎕의 0.1M 염화칼슘 (CaCl2)을 모든 바이얼에 첨가하고 이 셋업을 37℃에서 4 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 100㎕의 혼합물은 루미노미터 큐베트(luminometer cuvette)내의 각각의 바이얼로부터 취하고 동량의 작업 D-루시페린 (0.05 M 구연산 나트륨 완충액 중 0.3 mM, pH 4.5)용액을 첨가하였다. 상대 발광 단위(RLU)는 루미노미터(Monolight 2010)에서 조정 10초 후에 측정하였다.
중복 해독은 각각의 샘플에 대해 기록하고 평균을 계산하였다. RLU에서 감소율%는 각각의 시험 샘플에 대해 계산하고 대조군과 비교하였다. 시험은 대조군의 평균 URL이 1000 미만이었을 때 반복하였다. 활성 기준은 화합물 자유 대조군과 비교하여 화합물의 존재 하에 RLU의 50% 감소율로 표시되는 항결핵균 활성이다.
화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 항결핵균 활성
균 화합물 RLU에서 %감소
0.5 ㎍/mL 5 ㎍/mL 10 ㎍/mL
M. tuberculosis
H37Rv		 화학식I(a)의 화합물 36.36 77.17 83.76
화학식I(b)의 화합물 28.87 54.83 76.73
임상분리균:
S, H, R 및 E 내성균		 화학식I(a)의 화합물 20.88 78.11 88.42
화학식I(b)의 화합물 5.67 70.9 83.74
결론: 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물
화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물은 TB의 표준균주(H37 RV) 및 MDR Mycobacterium tuberculosis 균 [4 표준 항생제에 대한 내성균: S (스트렙토마이신), H (이소니아지드 또는 이소니코티닐 히드라진), R (리팜피신) 및 E (에탐부톨)]에 대해 활성이 있다.
Microbial Type Culture Collection MTCC5447 20080915

Claims (19)

  1. 하기 화학식 I(a) 또는 I(b)의 화합물 또는 이의 입체이성체, 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용되는 염:
    [화학식 1]
    Figure pct00006

    화학식 I(a): R =
    Figure pct00007

    화학식 I(b): R=
    Figure pct00008

  2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물이 스트렙스마이세스 종에 속하는 미생물(PM0626271/MTCC 5447)의 발효액체 배지로부터 분리된 화합물.
  3. (i) 상기 화학식I(a)의 화합물이 (a) 분자량 1649.5, (b) 분자식 C71H83N19O18S5, (c) 도 1에 도시된 바와 같은 1H NMR 스펙트럼, 및 (d) 도 2에 도시된 바와 같은 13C NMR 스펙트럼을 특징으로 하며, 또한 (ii) 상기 화학식I(b)의 화합물이 (a) 분자량 1651.5, (b) 분자식 C71H85N19O18S5, 및 (c) 도 3에 도시된 바와 같은 1H NMR 스펙트럼을 특징으로 하는, 화학식 I(a)의 화합물 또는 화학식 I(b)의 화합물 또는 이의 입체이성체 또는 호변이성체 또는 약학적으로 허용되는 염.
  4. 탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 배지에서 수중 호기성 조건 하에 스트렙스마이세스 종의 미생물(PM0626271/MTCC 5447) 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체의 하나를 배양하여 발효액체 배지 중에 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물을 제조하는 단계를 포함하는 제 1항 또는 제 3항에 정의된 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물을 제조하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, (a) 트렙스마이세스 종의 미생물(PM0626271/MTCC 5447) 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체의 하나를 배양한 후에 얻어진 발효 액체 배지로부터 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물을 분리하고, (b) 상기 화학식 I(a) 및 화학식 I(b)의 화합물의 하나 또는 그 이상을 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 화학식 I(a) 또는 화학식 I(b)의 화합물 또는 이들 둘 다 중의 하나 또는 그 이상을 이의 약학적으로 허용되는 염으로 전환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 1항, 제2항 또는 제3항에 정의된 화합물의 하나 또는 그 이상의 유효량을 적어도 하나의 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체와 함께 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 약학적 화합물이 정제, 피복 정제, 캡슐제, 과립제, 분말제, 크림제, 연고제, 겔제, 유제, 현탁제, 또는 주사용액제의 형태인 약학적 조성물.
  9. 제 7항 또는 제8항에 있어서, 박테리아 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 박테리아 감염증이 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 바실루스(Bacillus) 또는 마이코박테리아(Mycobacterium) 종에 속하는 박테리아에 의해 원인이 되는 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 스타필로코커스 종에 속하는 박테리아가 메티실린 내성균, 반코마이신 내성균 또는 이들 둘 다인 약학적 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 엔테로코커스 종에 속하는 박테리아가 반코마이신 내성균인 약학적 조성물.
  13. 제 10항에 있어서, 마이코박테리아 종에 속하는 박테리아가 다약제 내성균인 약학적 조성물.
  14. 박테리아 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 제1항, 제2항 또는 제3항에 정의된 화합물 중의 어느 하나 또는 그 이상의 용도.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 박테리아 감염증이 스타필로코커스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 바실루스 또는 마이코박테리아 종에 속하는 박테리아에 의해 원인이 되는 용도.
  16. 제 15항에 있어서, 스타필로코커스 종에 속하는 박테리아가 메티실린 내성균, 반코마이신 내성균 또는 이들 둘 다인 용도.
  17. 제 15항에 있어서, 엔테로코커스 종에 속하는 박테리아가 반코마이신 내성균인 용도.
  18. 제 15항에 있어서, 마이코박테리아 종에 속하는 박테리아가 다약제 내성균인 용도.
  19. 박테리아 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 제1항, 제2항 또는 제3항에 정의된 화합물 중의 어느 하나 또는 그 이상의 용도.

KR1020127008552A 2009-09-02 2010-08-31 항생제 화합물 KR20120093192A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23918609P 2009-09-02 2009-09-02
US61/239,186 2009-09-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20120093192A true KR20120093192A (ko) 2012-08-22

Family

ID=42990204

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127008552A KR20120093192A (ko) 2009-09-02 2010-08-31 항생제 화합물

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10501492B2 (ko)
EP (1) EP2473516A1 (ko)
JP (1) JP2013503624A (ko)
KR (1) KR20120093192A (ko)
CN (1) CN102574892B (ko)
AU (1) AU2010290872B2 (ko)
BR (1) BR112012004643A2 (ko)
CA (1) CA2772742A1 (ko)
IL (1) IL218478A0 (ko)
MX (1) MX2012002619A (ko)
NZ (1) NZ599175A (ko)
RU (1) RU2536587C2 (ko)
WO (1) WO2011027290A1 (ko)
ZA (1) ZA201202350B (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8697653B2 (en) 2010-08-05 2014-04-15 Priamal Enterprises Limited Microparticle formulation for pulmonary drug delivery of anti infective molecule for treatment of infectious diseases
JP5975000B2 (ja) * 2013-08-30 2016-08-23 株式会社ツムラ 微生物検出方法
WO2015107482A1 (en) * 2014-01-17 2015-07-23 Piramal Enterprises Limited Pharmaceutical combination for treatment of tuberculosis
JP6465299B2 (ja) * 2015-05-29 2019-02-06 株式会社山田養蜂場本社 蜂蜜画分
EP3906251A4 (en) * 2019-01-05 2022-10-05 Foundation For Neglected Disease Research THIAZOLYL PEPTIDES FOR THE TREATMENT OF NON-TUBERCULAR MYCOBACTERIAL INFECTIONS

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2982689A (en) 1955-03-01 1961-05-02 Olin Mathieson Thiostrepton, its salts, and production
IL84819A (en) * 1986-12-15 1993-07-08 Lilly Co Eli Antibiotic a10255 complex and factors, process, microorganisms, and production therefor
AUPR320701A0 (en) * 2001-02-20 2001-03-15 Kim, Jonghee The new cancer therapeutic agent with a thiopeptides
JP5391373B2 (ja) * 2006-04-18 2014-01-15 ピラマル エンタープライジーズ リミテッド 新規抗菌化合物
WO2009115288A1 (de) * 2008-03-17 2009-09-24 Technische Universität Dortmund Thiostrepton-sonde
UA91725C2 (ru) * 2008-05-12 2010-08-25 Львовский Национальный Университет Им. Ивана Франка Способ обнаружения антибиотиков тиострептонового ряда

Also Published As

Publication number Publication date
RU2536587C2 (ru) 2014-12-27
ZA201202350B (en) 2015-05-27
WO2011027290A1 (en) 2011-03-10
AU2010290872B2 (en) 2015-06-11
CA2772742A1 (en) 2011-03-10
MX2012002619A (es) 2012-06-25
RU2012112366A (ru) 2013-11-10
US20120156295A1 (en) 2012-06-21
JP2013503624A (ja) 2013-02-04
BR112012004643A2 (pt) 2019-09-24
CN102574892A (zh) 2012-07-11
IL218478A0 (en) 2012-04-30
AU2010290872A1 (en) 2012-04-26
EP2473516A1 (en) 2012-07-11
NZ599175A (en) 2013-05-31
US10501492B2 (en) 2019-12-10
US20140348919A1 (en) 2014-11-27
CN102574892B (zh) 2014-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5907931B2 (ja) チアクマイシン生産
US20140348919A1 (en) Antibiotic compounds
NZ509306A (en) Nocathiacin antibiotics
CN101563353B (zh) 氨基噻唑大环类、它们作为抗菌化合物的用途以及制备它们的方法
US8003602B2 (en) Antibacterial compounds
US7271147B2 (en) Antibiotics, tripropeptins and process for producing the same
RU2228337C2 (ru) Ванкорезмицин (варианты), его использование, штамм amycolatopsis вида hil-006734 для его получения
KR102342719B1 (ko) 마이크로모노스포라 속 균주를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물
CN112899199B (zh) 一种小单孢菌tmd166及其应用
US8318684B2 (en) Antibiotics, bispolides A1, A2, and A3 as well as bispolides B1, B2a, B2b and B3 and processes for producing said antibiotics
WO2013080167A1 (en) Compounds for the treatment of tuberculosis
NZ571636A (en) Novel antibacterial compounds comprising multiple thiazole rings isolated from Kocuria
US20080132565A1 (en) Polycyclic Macrolactones
ZA200006693B (en) Nocathiacin antibiotics.

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid