CN104144940A - 来自野野村菌的环肽、其制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物 - Google Patents

来自野野村菌的环肽、其制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104144940A
CN104144940A CN201280028784.8A CN201280028784A CN104144940A CN 104144940 A CN104144940 A CN 104144940A CN 201280028784 A CN201280028784 A CN 201280028784A CN 104144940 A CN104144940 A CN 104144940A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tuberculosis
val
chemical formula
agent
mjm5123
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201280028784.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104144940B (zh
Inventor
金钟宇
李常旭
朴相珍
徐胄源
李仁爱
尹泰美
崔钟根
李知彦
金晋龙
金英宇
斯科特·弗兰兹伯劳
曺尚铉
高薇
吉多·保利
詹姆斯·麦克阿尔潘
约瑟·纳波利塔诺
波吉特·杰希
布伦特·弗里森
玛利亚·弗洛伦西亚·罗德里格斯·布拉斯科
大卫·兰金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industry Academy Cooperation Foundation of Myongji University
University of Illinois
Original Assignee
Industry Academy Cooperation Foundation of Myongji University
University of Illinois
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Industry Academy Cooperation Foundation of Myongji University, University of Illinois filed Critical Industry Academy Cooperation Foundation of Myongji University
Publication of CN104144940A publication Critical patent/CN104144940A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104144940B publication Critical patent/CN104144940B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
    • C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及来自野野村菌MJM5123的新型抗TB环肽，一种生产该抗结核病肽的方法以及用于预防和治疗分支杆菌感染的包含该环肽的药物组合物。本发明的组合物对复制/非复制结核分支杆菌包括MDR和XDR菌株有很高的活性，因此其能有效地用作结核病的治疗剂。

Description

来自野野村菌的环肽、其制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物
技术领域
本申请要求于2011年4月18日提交的申请号为US61/476,473和2011年7月29日提交的申请号为US61/513,403和2011年11月3日提交的申请号为US61/555,257以及2012年3月7日提交的申请号为US61/607,934的美国临时专利申请的权益，其全部公开内容通过引用并入到本文中。
本发明涉及新的抗分支杆菌肽，其对复制/非复制结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和包括多重耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）结核病的耐药结核分支杆菌(M.tuberculosis)在内的各种耐药结核分支杆菌菌株具有高活性。本发明还涉及一种培养野野村菌(Nonomuraea sp.)MJM5123菌株以制备抗分支杆菌肽的发酵方法，以及生产抗分支杆菌肽的方法和用于预防和/或治疗结核病的含有本发明的抗分支杆菌肽的药物组合物。
背景技术
结核分支杆菌是一种大的复杂的引起人类和其他哺乳动物结核病（TB）病的细菌。TB是一种通过呼吸途径在人与人之间传播的高传染性疾病。
在2009年，有940万新的TB病例，包括110万携带HIV的病例和30万MDR-TB[WHO Actions For Life-Towards a world free oftuberculosis;World Health Organization:Geneva,Switzerland,2006（世界卫生组织呼吁为生命的行动—迈向无结核病世界）]。MDR-TB需要的治疗时间从6个月延长到至少2年。世界各地的MDR结核分支杆菌菌株中的广泛耐药TB(XDR-TB)的流行率估计有6.6%[WHOActions For Life-Towards a world free of tuberculosis;World HealthOrganization:Geneva,Switzerland,2006（世界卫生组织呼吁为生命的行动—迈向无结核病世界）]。
尽管对该传染病已有深刻的认识，但MDR-TB以及XDR-TB的流行率继续增长[WHO Anti-tuberculosis drug resistance in the world-Report#4.2008（世界卫生组织全球抗结核病药耐药性报道）]。现有的化学疗法很难或者几乎不能医治快速出现的MDR和XDR结核病菌株。这些菌株对全球造成重大的健康威胁，特别是在发展中国家和HIV/AIDS流行率日渐增长的国家[Koenig,R.Drug-resistanttuberculosis.In South Africa,XDR TB and HIV prove a deadlycombination.Science2008,319,894-897（耐药结核病）]。
感染有潜伏TB感染（LTBI）的大部分人能够遏制该杆菌引发症状，并且没有感染其他人的风险。除了明显的药物或疾病介导的免疫抑制以外，对于什么引发LTBI发展成活跃的TB疾病知之甚少，而一旦TB能避开免疫防护，则认为已发展成活跃的TB疾病。营养不良和/或有营养缺陷的孩子和成年人有更高的疾病进展风险。2008年，TB夺去了182万人的生命，其中50万发生在感染HIV的人中间，这成为感染HIV人群的主要死因[World Health Organization.Globaltuberculosis control:a short update to the2009report.Geneva,Switzerland:World Health Organization,2009（全球结核病控制）]。
因此，迫切需要研发新的抗TB药物，优选具有新的作用机制的抗TB药物。
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是，提供对复制/非复制结核分支杆菌和许多耐药结核分支杆菌具有活性的新型抗TB肽。
本发明的另一个目的是，提供一种生产该抗结核病肽的方法和该抗TB肽在预防和/或治疗各种分支杆菌感染的药物组合物中的用途。技术方案
为了实现以上目的，本发明提供了从野野村菌MJM5123菌株分离的环肽。在本发明的优选实施方案中，本发明的环肽具有以下化学式1或者化学式2：
化学式1：H-14
化学式2：H-16
此外，本发明提供了能有效预防和/或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物。在本发明的优选实施方案中，本发明的药物组合物包含用于治疗分支杆菌引起的感染且从野野村菌MJM5123菌株分离的新型抗TB环肽和药学上可接受的载体。发明人已于2012年4月3日将野野村菌MJM5123(Nonomuraea sp.MJM5123)保藏在韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国典型菌种保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC12178BP)。
在下文中，对本发明进行了详细阐述。
本发明提供了从分支杆菌(Mycobacterium spp.)、优选野野村菌MJM5123菌株分离的环肽。在本发明的优选实施方案中，本发明的环肽具有化学式1或化学式2。优选地，本发明的环肽可以通过以下步骤从野野村菌MJM5123菌株分离出来：
放线菌—新抗TB抗生素来源
放线菌是已知用来生产各种次生代谢物的无所不在的土壤生物。几种用于治疗各种细菌感染的抗生素来源于放线菌，其包括链霉素、头孢菌素、四环素、红霉素、利福平和达托霉素。尽管现今用于治疗结核病的三种不同的药物（利福平、链霉素和环丝氨酸）是通过使用琼脂扩散试验从放线菌中发现的，但是最初并未使用结核分支杆菌进行这些筛选。这是由于TB的感染性和（在那时）时常致命的后果。因为我们现在知道结核分支杆菌特别容易受几种抗菌药物的影响，所以必须假设过去针对这种病原体直接筛选发酵液的失败导致许多潜在有用的化合物种类没有被发现。因此，我们通过对结核分支杆菌的强毒株进行直接筛选启动了这一TB药物研发计划。
高通量筛选
由结核病研究所(ITR)建立高通量筛选纯化合物或提取物的技术。南韩明知大学有用微生物提取物中心(The Extract Collection ofUseful Microorganisms,ECUM)保存7000份以上来自韩国、中国、尼泊尔、菲律宾、越南、南极洲和北极圈的放线菌分离物。在更合适的外来地点尝试分离稀有且新的种类。
首先在3种不同的培养基即G.S.S.（丰富培养基）、Bennett's和GYC（基本培养基）中以20ml培养物发酵每一分离物，并且用微孔板Alamar蓝分析法(MABA)测定每一菌株的三份提取物并进一步划定优先级。
MJM5123的鉴定
在筛选了韩国明知大学有用微生物提取物中心(ECUM)保存的65000份以上的提取物后，发现来自新放线菌种类即MJM5123的菌丝的甲醇提取物有强的抗TB活性。通过多相分类方法将菌株MJM5123鉴定为野野村菌(Nonomuraea sp.)。
生物测定指导的分离
选择菌株MJM5123来进行基于用真空液相色谱(VLC)进行的初始分级的生物测定指导的分离步骤，之后通过数个高速逆流色谱分析(CCC)步骤进行定向纯化。
用于天然产品生物活性原理的生物测定指导的研究需要能够有效地解析复杂混合物的制备分析技术[Hostettmann,K.;Marston,A.The search for new drugs from higher plants.Chimia2007,61,322-326;Hostettmann,K.（对来自高等植物的新药的研究）；Marston,A.Plants asa still unexploited source of new drugs.Nat Prod Com2008,3,1307-1315;Hostettmann,K.（作为新药的还未开发的来源的植物）；Marston,A.;Wolfender,J.-L.Strategy in the search for new leadcompounds and drugs from plants.Chimia2005,59,291-294（对来自植物的新先导化合物和药的研究中的战略）]。本领域目前的标准方法是利用固体静止相的各种形式的固液色谱分析法，如柱层析法/快速柱层析法(CC)、真空液相色谱(VLC)和高效液相色谱(HPLC)。然而，存在数种与固体静止相（吸附剂）的使用有关的缺点，这极大地限制了在生物测定指导的分级情况下它们的功能：不可逆吸附是公认的这些限制中的其中一种[Lindblom,T.Irreversible absorption ofdiphenylamine onto a straight phase and a reverse phase HPLC-column.Symposium on Chemical Problems Connected with the Stability ofExplosives,[Proceedings]1993,9th,205-213（二苯胺映射到正相和反相HPLC柱上的不可逆吸附）；Kubo,I.Recent applications ofcounter-current chromatography to the isolation of bioactive naturalproducts.J Chrom1991,538,187-191（逆流色谱层析生物活性天然产物的新应用）；Sadek,P.C.;Carr,P.W.;Bowers,L.D.;Haddad,L.C.Aradiochemical study of irreversible adsorption of proteins onreversed-phase chromatographic packing materials.Anal Biochem1986,153,359-371（对反相色谱填充材料上蛋白的不可逆吸附的放射性研究）]。相应地，LC方法经常与材料的损失（有限回收）有关，并且更重要地是，与沿分级途径的生物活性的衰减有关。这些限制在逆流色谱层析(CCC)中不存在，因为作为液液技术，其完全依靠两种不能混合的溶剂之间的样品分开来实现分离，这允许样品材料的完全回收，并且因此具有评价复杂天然产物混合物的协同效应的潜力。而且，它是一种对特定化合物种类定向分离的理想方法。因此，我们的分离步骤主要基于CCC。
为了生产用于纯化合物H-14和H-16这两种高抗TB活性环肽的分离、结构鉴定和生物分析足够的生物质，在ECUM在20L的发酵罐中对菌株MJM5123进行大量培养、收集并提取。
生物活性成分的结构鉴定
利用基于最高质量和最先进的1D/2D NMR和高分辨率MS(highresolution MS-based)且通过肽的X射线晶体学放大的结构信息对H-14和H-16进行完整的结构鉴定。定量NMR(qNMR)用于对每个分离步骤同时进行选择性识别和定量分析。qNMR不仅是用于确定活性分离株的纯度和/或质量的最佳工具，还是用于分析具有生物活性但仍复杂的化合物混合物/级分的最佳工具。通过X射线晶体学确定H-14的整体3D结构和它的氨基酸残基。
发酵工艺的优化
为了改进抗TB肽的生产率，研发了最佳发酵工艺和成本效益好的培养基。在34℃、搅拌速度600rpm和0.3vvm曝气条件下进行6天主发酵。最终的湿菌丝浓度(packed mycelium volume)在pH为8.20时是80%，并且总糖量少于1.8%。该发酵工艺的H-14的产量为373mg/L。
此外，本发明提供了有效预防和/或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的本发明的化学式1和/或化学式2的化合物。在优选实施方案中，分支杆菌相关疾病是结核病。在本发明的另一个优选实施方案中，结核病可以是MDR结核病或者XDR结核病。
本发明的药物组合物包含本发明的从野野村菌MJM5123菌株分离的新抗TB肽。优选地，本发明的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂。
在本发明的一个实施方案中，本发明的环肽可以作为结核病治疗剂单独治疗，或者可以与一种或至少两种其它抗分支杆菌剂的混合组合物结合治疗。在本发明的优选实施方案中，该抗分支杆菌剂可以是一线口服抗结核病剂，例如异烟肼、利福平、乙胺丁醇片和吡嗪酰胺；可注射抗TB剂，如链霉素、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素；氟喹诺酮如环丙沙星、氧氟沙星和莫西沙星；二线口服抗TB剂，如利福布汀、丙硫异烟胺、乙硫异烟胺、环丝氨酸、PAS和胺苯硫脲；其它抗TB剂，如利奈唑胺、氯苯吩嗪(clofazimine)、阿莫西林/克拉维酸和二氨基二苯砜的衍生物；以及目前用于结核病临床试验中的化合物，如贝达喹啉、PA-824、Dalamanid（大冢制药）、SQ-109、Sutezolid、利福喷汀和临床前研发的化合物，具体是AZD5847、BTZ043、TBA-354、CPZEN-45、SQ-641、SQ-609、DC-159a、Q201、THPP、氯苯吩嗪的氯法齐明(riminophenazine)类似物和含硼LeuRS抑制剂，但并不限于这些。
本发明的抗TB环肽经配制就可以口服给药，例如粉剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊、溶液剂、悬浮剂、乳剂和糖浆。载体、赋形剂和稀释剂的例子有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟苯甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
用于口服的固体制剂是片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂和胶囊。通过与一种或多种合适的赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖或者乳糖、明胶等混合来制备这些固体制剂。除了这些简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂例如硬脂酸镁、滑石等。
用于口服的液体制剂是悬浮剂、溶液剂、乳剂和糖浆，且上述制剂可以含有除通常使用的简单稀释剂如水和液体石蜡外的多种赋形剂如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。
本发明的新型抗TB肽经配制可以用于静脉内注射。对于静脉内(IV)使用，可以将本发明的水溶性形式的化合物溶解在任何常用的静脉注射液中，并且通过注入施用。静脉注射剂型可以包括载体、赋形剂或者稳定剂，其包括但不限于，钙、人血清白蛋白、柠檬酸盐、醋酸盐、氯化钙、碳酸盐以及其它盐。静脉注射液包括但不限于生理盐水或者林格氏溶液。本发明的抗TB肽还可以置于注射器、插管、导尿管和线中。
用于肠胃外给药的制剂可以是含水的或者无水的等渗无菌注射液或者悬浮剂的形式。这些注射液或者悬浮剂可以由具有一种或者多种提到的用在口服的剂型中的载体的无菌粉剂或者颗粒剂制得。本发明的新型抗TB肽可以溶解在聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苯甲醇、氯化钠和/或各种缓冲剂中。
对于肌肉内、肠胃外或者静脉内制剂，可以将抗TB肽的无菌制剂或者该化合物的合适的可溶盐形式例如盐酸盐溶解在制药稀释剂如注射用水(WFI)、生理盐水或者5%葡萄糖中施用。
也可以制得该抗结核病肽的合适的不可溶形式，并且其作为水基或者药学上可接受的油基中的悬浮剂施用，例如，长链脂肪酸的酯如油酸乙酯。可以通过在生物可降解聚合物如聚乳酸-聚乙交酯中形成该抗TB肽的微胶囊化基质来制得可注射的长效形式(depot form)。根据药物与聚合物的比例和使用的具体聚合物的性质，可以控制药物释放速度。生物可降解聚合物包括聚原酸酯和聚酸酐。还可以通过将药物裹入与体组织相容的微乳液中制得长效可注射剂型。
为了应用于眼睛和耳朵，本发明的肽可以在疏水或亲水基质(bases)中配制为膏剂、霜剂、洗剂、涂抹剂(paints)或者粉剂。
为了应用于直肠给药，本发明的肽可以以与常用的载体如可可油、蜡或者其它甘油酯混合的栓剂形式配制。
本发明的抗TB肽还可以在吸入器如定量雾化吸入器和雾化器中使用。
本发明还提供了一种制备本发明的化学式1或者化学式2的抗结核病环肽的方法。本发明的方法可以包括以下步骤：在好氧条件(aerobic conditions)下，在含水培养基中培养野野村菌MJM5123菌株的生产抗分支杆菌肽的微生物；并且从发酵的菌丝中分离本发明的抗结核病环肽。
在本发明一个实施方案中，分离抗结核病环肽的步骤可以包括以下步骤：使用甲醇和氯仿作为洗脱液对野野村菌MJM5123菌丝的甲醇提取物进行真空液相色谱分析(VLC)；使用甲醇作为洗脱液进行Sephadex LH-20开口柱层析法；以及使用HEMWat+2作为溶剂进行高速逆流色谱法(HSCCC)。
在本发明的另一个实施方案中，分离抗结核病环肽的步骤可以包括以下步骤：用甲醇作为溶剂提取野野村菌MJM5123菌丝；加水直至达到30%的甲醇提取物，以制得含水甲醇；用己烷对甲醇提取物进行脱脂；分离水层，并且调节至65%含水甲醇；用氯仿提取该水层；浓缩，并且用甲醇解析氯仿提取物；使用甲醇作为洗脱液进行Sephadex LH-20开口柱层析法；以及进行HPLC(高效液相色谱)，其配置了填有反相凝胶(RP-18)的柱。
发明的有益效果
新型抗TB环肽对哺乳动物细胞有非常低的细胞毒性，对复制/非复制结核分支杆菌有强活性，该复制/非复制结核分支杆菌包括单耐药结核分支杆菌菌株、MDR和XDR-TB，因此，它们可以有效地用作结核病的治疗剂。
附图简要说明
图l示出建立微生物提取物库的方法。
图2示出本发明的肽的提取过程概观。
图3示出于28℃、ISP3培养基上生长2周的野野村菌MJM5123的扫描电子显微照片。
图4示出野野村菌MJM5123全细胞水解产物的分析结果。
图5示出野野村菌MJM5123极性脂质检查。在板上喷钼磷酸以检测总脂质(a)，喷茚三酮以检测氨脂质(b)，喷钼蓝以检测磷脂质(c)，以及喷α-萘酚硫酸以检测糖脂(d)。
图6示出系统发育分析，其以从NCBI数据库获得的16S rDNA序列为基础，用CLUSTAL-X对数据进行多重对比后构建[Thompson,J.D.;Gibson,T.J.;Plewniak,F.;Jeanmougin,F.;Higgins,D.G.TheCLUSTAL_X windows interface:flexible strategies for multiplesequence alignment aided by quality analysis tools.Nucleic Acids Res1997,25,4876-4882（CLUSTAL-X视窗界面：用于质量分析工具辅助的多重序列对比的柔性策略）]。
图7示出主发酵中抗TB化合物的生物质和活性的图表（DCW；干细胞重，PMV；湿菌丝浓度，活性；通过纸片扩散试验的对耻垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)mc2155的生长抑制区域）。
图8示出用慢蒸方法生长的H-14晶体。最长尺寸大约是0.5mm。
图9示出H-14的3D结构。
图10示出0.83分辨率下所选择的残基色氨酸(W10)、苯基丙氨酸(F12)、苏氨酸(T5)和异亮氨酸(I3)的电子密度图。
图11示出本发明的环H-14肽的结构布置。
图12示出本发明的环H-16肽的结构布置。
图13示出图15和16的具体氨基酸残基。
最佳实施方式
目前本发明实际的且优选的实施方案在以下实施例中说明。
然而，应该认识到，本领域技术人员根据本公开可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1：用于高通量筛选的微生物提取物库的制备
从具有独特的气候条件和生态的地区如高山区、热带区、极地区、沙漠、火山等中收集的土壤样品分离出大约7000份放线菌分离物，并且其已保藏在韩国明知大学的有用微生物提取物中心(ECUM)。从每一分离物制备9种不同种类的提取物，用于筛选抗TB候选物。首先，用30ml G.S.S、Bennett’s和GYC培养每一分离物。离心分离菌丝和培养液后，用甲醇提取该菌丝并分别用乙酸乙酯和水分开培养上清液。最后，通过真空蒸发器将来自三种培养基中培养的每一微生物分离物的9种有机含水提取物浓缩至干燥，并且于-70℃保藏在冷藏器中（图1、图2和表1）
表1用于放线菌的三种主要培养基
<1>G.S.S.培养基
可溶性淀粉10g
葡萄糖20g
大豆粉25g
牛肉膏1g
酵母膏4g
NaCl2g
K2HPO40.25g
CaCO32g
D.W.1L
pH7.2
<2>Bennett氏培养基(Bennett's medium)
葡萄糖10g
酵母膏1g
Bacto蛋白胨2g
牛肉膏1g
<3>DYC培养基
糊精25g
干酵母12g
CSL20g
NaBr1g
CoCl21g
pH7.0
D.W.1L
实施例2：大规模筛选
ECUM的每一放射菌分离物首先在3种不同的培养基即G.S.S.(丰富培养基)、Bennett’s and GYC（基本培养基）中以20ml培养物发酵。用甲醇提取该菌丝，用乙酸乙酯萃取该培养上清液，随后用水萃取，每一分离物产生9种提取物。干燥100μl等份试样(Aliquots)，并将其从明知大学运到96孔板中的UIC，溶解在100μlDMSO中，并按1:100稀释为测试培养物。通过微孔板Alamar蓝试验(MABA)中的荧光读数确定，约63000份提取物的HTS产生对7H12培养基(棕榈酸作为C源)中结核分支杆菌具有=90%的抑制的349份提取物(0.55%)。然后在ECUM重新发酵1升规模的90份原始采样，且该提取物随后在具有固相反相硅胶萃取的UIC中用20-100%MeOH-水梯度进行分级，接着用100%CHCl3进行分级，以使每份提取物产生6个级分。从以下方面对级分进行生物学分析：1)哺乳细胞毒性(VERO细胞IC50)；2)对非复制结核分支杆菌(LORA)的活性；3)对耐利福平(RMP)、异烟肼(INH)、链霉素(SM)、卡那霉素(KM)、卷曲霉素(CAP)、环丝氨酸(CS)、(当然我们不仅仅发现这些放线菌衍生的抗生素)或者莫西沙星(Mox)的结核分支杆菌菌株的活性；以及4)对耻垢分支杆菌(M.smegmatis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和白色念珠菌(C.albicans)的活性。基于这些结果，对20种放射菌菌株划定用于进一步研究的优先级。
实施例3：MJM5123的鉴定
形态和培养特征的确定
从在韩国汉拿山收集的土壤样品中分离MJM5123。通过特征形态和细胞壁成分的化学分析鉴别菌株的属。为确定形态和培养特征，将该菌株在28℃于国际链霉菌计划（ISP）培养基(Shirling,E.B.and D.Gottlieb,Methods for characterization of Streptomyces species.Int J SystEvol Microbiol.196616(Pt3):313-330（用于鉴定链霉菌属种类的方法）)例如酵母膏-麦芽膏琼脂（ISP2）、燕麦琼脂（ISP3）、无机盐淀粉琼脂（ISP4）和甘油天冬酰胺琼脂（ISP5）上生长2周。通过使用颜色调和手册(Jacobson,E.,W.C.Grauville,et al.,Color HarmonyManual.1958.Chicago,Container Corporation of America)来确定菌落颜色。通过扫描电镜观察孢子和菌丝（Hitachi,S-3500N,Japan）（图3）。
表2MJM5123的培养特征
气生菌丝上的生长和孢子形成评级如下：++，好；+，中等；±，差；-，不生长和无孢子形成。
菌株在ISP2培养基上生长良好，而在其它培养基上显示生长中等。营养菌丝体和气生菌丝体的颜色是无扩散性色素的米黄色。白色孢子仅在燕麦培养基（ISP3）上形成，并且扫描电子显微镜显示气生菌丝上不规则的孢子的螺旋链。
使用蛋白胨酵母膏铁琼脂（ISP6）和酪氨酸琼脂（ISP7，含或者不含酪氨酸）来测试黑色素。确定ISP3培养基上用于生长的温度范围、NaCl耐受性和pH范围，以及28℃在ISP2培养基上进行2周抗生素抗性测试。
表3野野村菌MJM5123的生理特征
特征评级如下：(++)，好；(+)，一般；(-)，差
MJM5123吸收作为营养来源的酪氨酸但不产生黑色素，并且该菌株能在pH5.0-9.0以及0-3.0%NaCl下生长，并且在20℃-37℃表现良好的生长。MJM5123对阿泊拉霉素、卡那霉素、万古霉素和硫链丝菌素敏感，但对氨苄青霉素有抗性。
表4.存在抗生素(50μg/ml)时的生长
特征评级如下：(+)，有；(-)，无
使用ISP9琼脂培养基作为基础培养基来检验作为唯一碳源的碳水化合物的利用。通过过滤对碳水化合物的原液(10%w/v)(SigmaAldrich,CAR10)灭菌，并以1.0%的最终浓度将其加入到高压蒸汽处理的ISP9培养基中。MJM5123利用了己糖、戊糖、醇糖(alcohol sugars)和二糖（表5）。
表5碳水化合物的利用
利用： MJM5123
葡萄糖 ++
阿拉伯糖 ++
蔗糖 ++
木糖 ++
肌糖 +
甘露醇 ++
果糖 ++
鼠李糖 ++
棉子糖 +
特征评级如下：（++），好；（+），一般；（-），差
化学分类学特征的确定
为了对细胞壁成分进行化学分类表征，通过于28℃在旋转振动器上在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中生长7天来制得冻干的菌丝。通过TLC确定二氨基庚二酸（DAP）和甘氨酸的立体异构体[Becker,B.;Lechevalier,M.P.;Gordon,R.E.;Lechevalier,H.A.Rapid differentiationbetween Nocardia and Streptomyces by paper chromatography ofwhole-cell hydrolysates.Appl Microbiol1964,12,421-423（通过全细胞水解物的纸色谱分析快速区分诺卡氏菌和链霉菌）]。将5mg干细胞和1ml6N盐酸一起密封在小安瓿中。将该安瓿在烘箱中于100℃储存过夜。用Whatman1号滤纸过滤该空气冷却的水解物。将过滤液浓缩至干，并溶解在0.3ml蒸馏水中。将2μl该溶液点在TLC板上（Merck，TLC纤维素F玻璃板编号105718），并用溶剂体系甲醇：蒸馏水：6NHCl：吡啶(80:26:4:10，vol/vol)展开（develop）4小时。风干后，喷0.2%茚三酮溶液（丙酮中），并且在100℃加热3分钟以显示这些斑点。用1μl0.1M D,L-DAP(Sigma Aldrich，编号D-1377)和1μl0.1M甘氨酸(Sigma Aldrich，编号50046)作为正品标准。甘氨酸和D,L-DAP斑点显示为灰绿色。
用稍微改进的Lechevalier方法进行糖类分析。在密封的安瓿中，用2.0ml1N硫酸煮50mg干细胞2小时。将冷却的水解物转移到50ml尖底离心管中，用饱和氢氧化钡将pH调节到5.4。离心后，将上清液浓缩至0.3ml，并通过离心除去未溶解颗粒。在TLC板上加载1μl该溶液(Merck，TLC纤维素F玻璃板编号105718)。用溶剂体系正丁醇：蒸馏水：吡啶：甲苯(10:6:6:1，vol/vol)涂敷浓度为1%的包含木糖、阿拉伯糖和半乳糖的第一糖类(Sigma Aldrich，CAR10)标准和包含鼠李糖、核糖、甘露糖和葡萄糖的第二糖类标准的每一种4小时。喷涂邻苯二甲酸苯胺盐溶液（3.25g苯胺邻苯二甲酸氢盐(TCI-GR，编号P0284)，溶于100ml水饱和丁醇中）后，在100℃将该TLC板加热4分钟。甘氨酸和D,L-DAP是MJM5123肽聚糖的成分，并且全细胞水解物中的主要糖类是木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖（图4）。
用Minnikin等的方法(Minnikin,D.E.;O'Donnella,A.G.;Goodfellowb,M.;Aldersonb,G.;Athalyeb,M.;Schaala,A.;Parlett,J.H.An integrated procedure for the extraction of bacterial isoprenoidquinones and polar lipids.J Microbiol Methods1984,2,233-241（用于提取细菌类异戊二烯醌类和极性脂质类的完整步骤）)提取极性脂质和甲基萘醌。将2ml甲醇：蒸馏水(100:10，vol/vol)和2ml石油醚加入50mg干细胞中，并混合15分钟。将上层转移到新的小瓶中。将1ml石油醚加入下层中并混合。在氮气条件下于室温蒸发合并的上层，并且残余物用于分析甲基萘醌。从下层提取极性脂质。在沸水浴中将该下层加热5分钟。在37℃冷却后，加入2.3ml氯仿：甲醇：水(90:100:30，vol/vol)溶液，并混合60分钟。离心后，将上清液转移至新的试管中。通过与0.75ml氯仿：甲醇：水(50:100:40，vol/vol)溶液混合5分钟提取该下层，并且将分离的上清液与上述试管中的溶液混合。再重复一次该步骤。将收集的上清液与1.3ml氯仿和1.3ml0.3%氯化钠溶液充分混合。在离心分离后，弃去上层，并在氮气下于室温干燥下层。将极性脂质提取物溶解在60μl氯仿：甲醇(2:1，vol/vol)中，并且在TLC板上点10μl该溶液（Merck，TLC硅胶60F254玻璃板编号105729），并使用氯仿：甲醇：蒸馏水(65:25:4，vol/vol)和氯仿：乙酸：甲醇：蒸馏水(40:7.5:6:2，vol/vol)作为展开溶剂通过二维TCL方法鉴定。通过喷四种试剂，5%乙醇中磷钼酸溶液(Sigma Aldrich，P4869)、0.2%水饱和正丁醇中茚三酮溶液(Sigma Aldrich，N4876)、α-萘酚硫酸和钼蓝(Sigma Aldrich，M1942)来显示极性脂质。
极性脂质分析揭示，MJM5123的极性脂质由磷脂酰乙醇胺(PE)、双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰单甲基乙醇胺(PME)、磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)、未知磷脂(PL)和未知极性脂质(L)构成（图5）。
用与气相色谱组合的微生物鉴定系统(MIDI，4.5版)分析细胞脂肪酸，并用ACTIN6数据库鉴定。主要细胞脂肪酸是异C16:0；还检测了各种其它脂肪酸（表6）。
表6MJM5123的脂肪酸组成
脂肪酸 MJM5123(%)
16:0ISO 25.5
17:1CIS9 10.5
15:00 10.1
16:00 9.6
15:0ISO 9.3
16:1CIS9 4.3
17:010甲基 3.9
17:00 3.0
16:0ISO2OH 2.9
16:1ISOG 2.6
14:00 2.4
14:0ISO 2.2
16:010甲基 1.6
17:0ANTEISO 1.6
17:0ISO 1.4
15:0ANTEISO 1.2
数值是总细胞脂肪酸的百分比。未示出少于1.0%的微量。
进化分析
用引物对27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，SEQ.ID.NO:1)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3',SEQ.ID.NO:2)从MJM5123基因组DNA扩增16S rDNA。使用如上相同的引物对在ABI3730XL毛细管DNA测序仪（应用系统公司(Applied Biosystems)，美国）上对扩增的DNA测序。用http://www.ncbi-nlm-nih.gov/提供的NCBI BLAST进行16S rDNA的计算机辅助比较。
使用MEGA4.0软件通过邻接法构建系统树。通过1000次引导复制生成系统树的分支支持。
根据BLAST研究，16S rDNA序列显示出与红色野野村菌(Nonomuraea rubra)DSM43768T和玫瑰色野野村菌(Nonomuraearoseola)DSM43767T有98%的相似性，以及与迪氏野野村菌(Nonomuraea dietziae)DSM44320T有97%的相似性。该系统发育分析表明MJM5123属于野野村菌科(Nonomuraea)，但其与密切相关的菌株位于不同的亚枝上。
用邻接方法通过用版本4.0的软件包MEGA（根据Kimura-2模型用距离选择）获得距离，并且进行归类。将以1000次复制为基础的引导值(Bootstrap value)按百分比在分支点列出。柱表示每个核苷酸有0.002的取代（图6）。
与密切相关菌株的DNA关联性
使用微孔板杂交法通过荧光分析评价与密切相关菌株的DNA-DNA关联性。DNA-DNA关联性值是34-65%，这表明MJM5123代表单独的基因组种类（表7）。
表7DNA-DNA杂交
分类群 MJM5123(%)
MJM5123 100
迪氏野野村菌DSM44320T 65
玫瑰色野野村菌DSM43767T 65
红色野野村菌DSM43768T 34
发明人已于2012年4月3日将野野村菌MJM5123保藏在韩国生命工学研究院(KRIBB)韩国典型菌种保藏中心(KCTC)(保藏号：KCTC12178BP）。
实施例4：发酵工艺的优化
为了提高抗TB肽的生产率，研发了最佳发酵工艺和成本效益好的培养基。菌株MJM5123可以利用各种碳源和氮源，如葡萄糖、果糖、麦芽糖、半乳糖、木糖、蔗糖、甘油、大豆油、淀粉、糊精、氨基酸、酵母膏、酪蛋白胰酶消化物、牛肉膏、蛋白胨、麦芽膏、燕麦、大豆粉、酶消化的大豆粉、棉籽粉、玉米浆、无机盐等。MJM5123能在大范围的温度和pH下(20-40℃，pH5.0-9.0)生长。然而，在接种前将初始培养基pH调节到约7.2是有利的。当发酵温度维持在34℃时，实现最有效率的生长和效价。为了有成本效益的生产和轻松的下游加工，研发了三步发酵法和用于每一步的培养基，如下所述：
表8活化培养基(AM)
成分 量(%)
可溶性淀粉 2.000
酵母膏 0.500
牛肉膏 0.300
胰蛋白胨 0.500
CaCO3 0.200
CoCl2 0.0001
MgSO47H2O 0.050
NE-302 0.05
表9种子培养基(SC)
成分 量(%)
葡萄糖 1.000%
糊精 3.000%
大豆胨 1.000%
玉米种子粉 0.500%
酵母膏 0.500%
K2HPO4 0.100%
CaCO3 0.400%
MgSO47H2O 0.086%
CaCl2 0.010%
(NH4)2SO4 0.100%
大豆油 0.080%
NE-302 0.050%
表10主发酵培养基(MF)
成分 量(%)
葡萄糖 2.000%
可溶性淀粉 6.000%
玉米浆 1.600%
玉米种子粉 0.600%
酵母膏 0.800%
大豆胨 1.250%
CaCO3 0.300%
K2HPO4 0.100%
MgSO47H2O 0.086%
CaCl2 0.010%
FeSO47H2O 0.001%
L-缬氨酸 0.050%
NE-302 0.050%
对于常规和可再生加工，按以下步骤制备冷冻的营养菌丝(FVM)：将在28℃于ISP3培养基上生长7天的单一菌丝接种到含70ml SC培养基的500ml的三角烧瓶中，并且于34℃以200rpm的摇动速度培养3天。该全部培养肉汤与50%甘油充分混合，并且在-80℃保藏该营养菌丝-甘油混合物至使用。
10%v/v的FVM用来引发菌株活化。以200rpm的摇晃速度在34℃进行活化阶段54小时。通过该活化阶段，湿菌丝浓度(PMV)是15%，且pH是7.58。10%v/v的初期的活性营养培养肉汤用于种子培养物。第二种子培养物在34℃和200rpm的摇晃速度下保持60小时。PMV和pH分别是43%和7.48。将该10%v/v的种子培养肉汤转移至主发酵培养基中。在34℃，600rpm搅拌速度和0.3vvm曝气下进行144小时主发酵。最终PMV在pH8.20时是80%，并且总糖少于1.8%。该发酵工艺产生373mg/L的H-14（图7）。
实施例5：从野野村菌MJM5123分离新型抗TB肽H-14和H-16 分离实施例1：
大规模地发酵菌株MJM5123，其是20种优先的放射菌菌株中的一种，并且通过以下描述的方法在实施例1中分离出它的活性级分。
菌株E5123的大规模的菌丝甲醇提取物经历了化学分级过程，与此同时使用MABA、LORA和Vero细胞毒性监控活性指标和选择性指标进行生物学表征。活性成分的分级和分离包括3个色谱分离步骤。反相硅胶上提取物(128.7g)的真空液相色谱在20%步骤中使用水/甲醇梯度，产生了7种化学上不同的级分，VC-1至VC-7。用100%甲醇和100%氯仿洗脱级分VC-6和VC-7，其MICs分别是<0.76μg/ml和<0.74μg/ml。VC-6和VC-7重新混合(8.47g)，并且在SephadexLH-20开口柱上用100%甲醇作为洗脱液将其进一步分离为81种级分，产生了一组11个重新组合的级分S-1-S-11（通过TLC）。对于子级分S-2和S-3，MICs＜0.21μg/ml。通过高速逆流色谱(HSCCC)与通过GUESS方法选作最合适的溶剂体系的HEMWat+2，将S-3(374mg)分离为110种级分[Kubo,I.Recent applications of counter-currentchromatography to the isolation of bioactive natural products.J Chrom1991,538,187-191（逆流色谱在分离生物活性天然产品中的最新应用）)]。这些级分重新组合为一组从H’-1到H’-11的11种级分。对于子级分H-4、H-6、H-8和H-9，其MICs＜0.391μg/ml。通过HSCCC与HEMWat+2将S-2(177mg)进一步分离为140种级分，并且重新组合为一组26个级分，H-1到H-26。对于H-3、H-5、H-7以及H-9到H-23，其MICs＜0.5μg/ml。通过qHNMR分析，在这些活性肽级分中H-14和H-16(8mg，产量=0.4mg/L)是最纯的，因此被选来用于结构分析。根据H-11到H-15和H’-6-到H’-8的1HNMR光谱的相似性将它们重新组合后，得到189mg H-14（大约80%纯度，产量=9.45mg/L）。活性肽的总量大约是369mg，产量=18mg/L。
分离实施例2：
通过MJM5123的发酵产生的抗TB化合物大部分保留在细胞内。该抗TB化合物从菌丝饼(mycelial cake)中提取而来；如上描述，发酵过程中通过过滤全部的发酵液得到后者。用甲醇提取菌丝饼是最有效的，但也可以使用其它有机溶剂，例如乙醇、正丙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿等。通过常规工艺从提取溶液中回收粗抗TB活性化合物，该常规工艺包括蒸发提取物至合适的体积和溶剂-溶剂分区。
于37℃真空浓缩该甲醇提取物，并且将去离子水加到浓缩的溶液中以得到70%甲醇。通过用正己烷分区使水混合物脱脂，并用一体积的去离子水稀释脱脂溶液。用一体积的氯仿提取，并且通过摇晃用去离子水清洗该含有抗TB活性化合物的氯仿层。干燥氯仿层生成一种淡黄色固体，然后将其溶于100%甲醇中，应用到用100%甲醇平衡的SephadexTMLH-20。通过使用100%甲醇洗脱的空间排阻色谱法合并抗TB活性化合物。通过高效液相色谱完全纯化显示强抗TB活性的H-14和H-16，其中使用反相C18柱并用20mM磷酸钠(pH8.0)缓冲的35%含水乙腈溶液作为流动相。蒸发纯化的级分以除去乙腈，并用氯仿提取。最后，浓缩氯仿层至干，并且进一步研究高度纯化的H-14和H-16，包括结构测定和体外抗TB活性。
实施例6：抗TB环肽H-14的结构分析
H-14是通过菌丝的MeOH提取获得的野野村菌MJM5123的代谢物。H-14的分子式是C83H134O17N14，通过1H、13C NMR和高分辨质谱法测定。
H-14作为一种光学活性淡黄色粉末被分离。该高分辨质谱图示出一个在1600.0189m/z的阳离子峰[M+H]+和一个在1621.9982m/z的阳离子峰[M+Na]+，显示准确的质量为1599.0111。该IR谱图表明存在多种氨化物组成(1632.16cm-1)该UV谱图表明H-14是具有芳香族残基的肽，其吸收谱带在211nm(=54209M-1cm-1，48，25℃，在甲醇中）、219nm(=55266M-1cm-1，48，25℃，在甲醇中)、263nm(=7925M-1cm-1，48，25℃，在甲醇中)、281nm(=6465M-1cm-1，48，25℃，在甲醇中)以及291nm(=5839M-1cm-1，48，25℃，在甲醇中)。CD谱图表明H-14是有反平行β-折叠结构的肽，摩尔椭圆率在220nm(25℃，在乙腈中)是1918530deg cm2mol-1和在196nm(25℃，在乙腈中)是616094deg cm2mol-1。
尽管这个分子相对尺寸较大，但NMR谱图显示可接受的信号散射，因此是有价值的结构信息来源。甲醇-d3中的1H NMR谱图显示在7.72ppm到9.20ppm之间的8种可交换质子信号，一旦交换为完全氘化的甲醇，质子信号便会消失。另外，在为一个苯基和另一芳香族编码的芳香族区域中出现信号，并且在0.73-1.33ppm发现对应于20个脂肪族甲基的双峰。出人意料的是该肽在2.16ppm、2.31ppm、3.14ppm、3.23ppm、3.26ppm、3.33ppm和3.82ppm出现7个单峰，表明作为在2.31ppm的单峰的8个N-甲基和/或甲氧基结合为2个甲基。氨化物质子区域中双峰的信号和覆盖0.7-5.4ppm之间整个范围的信号的分布清楚地表明所研究的化合物确实是肽。
支持该化合物的分类是肽的进一步光谱证据源于13C NMR谱图，其显示了与13个羰基碳对应的在170.92ppm和175.14ppm的范围间的总共12个（酰胺-）羰基信号。通过使用DEPT135和HSQC实验，识别了34个次甲基、3个亚甲基和28个甲基信号。这些信号，与在155.23ppm、142.68ppm、140.04ppm、118.36ppm和112.47ppm的5个季碳原子信号一起表明H-14中存在总共83个碳。
H-14的2D NMR谱图的全面分析尤其是基于COSY、TOCSY、HSQC、HMBC和半选择HMBC实验阐明了15个离散的1H,1H自旋系统：N,N-Me2-Val、Val1、N-Me-L-allo-Ile、L-Thr、N-Me-L-Thr、L-Val2、N-Me-L-Leu、L-Val3、N-Me-L-Val、N-Me-4-OMe-L-Trp a、N-Me-4-OMe-L-Trp b、L-Val4、R-β-OH-L-Phe a、R-β-OH-L-Phe b和L-Val5。表11中给出详细的1H和13C分配。末端甲基的13C和1H信号位于很密集的区域内。该13C NMR谱图显示了在从19.10ppm和20.04ppm的0.94ppm窗内代表14个碳的14个碳信号，并且该1HNMR谱图显示了在从0.85ppm和1.09ppm的0.14ppm窗内代表47个质子的17个质子信号。HSQC和HMBC实验的分辨率不够高以至于不能建立这些信号的连通性，因此我们引入了半选择HMBC实验，其通过抑制同核质子结合调制在间接13C尺寸中产生高分辨率。通过用从半选择HMBC实验中得到的13C-1H单键相关性来建立直接的H-C连通性。可通过沿F2方向的大约126Hz的耦合常数观察到这种关联性。分别通过使用从半选择HMBC实验提取的甲基质子信号和通常的β-碳信号以及甲基碳信号和通常的β-质子信号之间的1H,13C长期(long-range)相关性将甲基连接至其自旋系统。
通过使用从HMBC实验提取的1H,13C长期相关性建立了N-Me-4-OMe-L-Trp单元和R-β-OH-L-Phe单元内的连通性。对于N-Me-4-OMe-L-Trp H4/N-Me-4-OMe-L-Trp Cβ、R-β-OH-L-PheH2'/R-β-OH-L-Phe Cβ和R-β-OH-L-Phe H5'/R-β-OH-L-Phe Cβ，观察到这种HMBC相关性。
还通过分析HMBC相关性确定了N-Me-4-OMe-L-Trp的甲氧基的位置。对于N-Me-4-OMe-L-Trp H12/N-Me-4-OMe-L-Trp C10、N-Me-4-OMe-L-Trp H8/N-Me-4-OMe-L-Trp C6、N-Me-4-OMe-L-TrpH7/N-Me-4-OMe-L-Trp C11和N-Me-4-OMe-L-TrpH9/N-Me-4-OMe-L-Trp C11，观察到HMBC相关性。
通过分析HMBC相关性确定N-甲基的位置。对于N,N-Me2-ValH6(7)/N,N-Me2-Val Cα、N-Me-L-allo-Ile H7/Val1CC=O、N-Me-L-allo-IleH7/N-Me-L-allo-Ile Cα、N-Me-L-Thr H5/L-Thr CC=O、N-Me-L-ThrH5/N-Me-L-Thr Cα、N-Me-L-Leu H7/L-Val2CC=O、N-Me-L-LeuH7/N-Me-L-Leu Cα、N-Me-L-Val H6/L-Val3CC=O、N-Me-L-ValH6/N-Me-L-Val Cα、N-Me-4-OMe-L-Trp H13/N-Me-L-Val CC=O和N-Me-4-OMe-L-Trp H13/N-Me-4-OMe-L-Trp Cα，观察到(i,i)HNMe，Cα和/或(i,i-1)HNMe，CC=O HMBC相关性。
大部分单体氨基酸残基，除了N,N-Me2-Val和N-Me-L-Leu单元之外，随后顺序地通过1H,13C长期相关性连接。对于每一个氨基酸残基，Hα,CC=O间观察到两种相关性：(i,i)Hα,CC=O和(i,i-1)Hα,CC=O，其一起确定肽键连通性；而Hβ,CC=O间只观察到一种相关性，其确定残基的羰基。再次使用半选择HMBC实验，因为HMBC实验不能解析密集的羰基区域，其在从170.91ppm到175.14ppmr的4.23ppm窗中存在13个13C信号。对于N,N-Me2-Val Hα/N,N-Me2-Val CC=O、N,N-Me2-Val Hβ/N,N-Me2-Val CC=O、Val1Hα/Val1CC=O、Val1Hβ/Val1CC=O、N-Me-L-allo-Ile Hα/N-Me-L-allo-Ile CC=O、N-Me-L-allo-Ile Hα/Val1CC=O、N-Me-L-allo-Ile Hβ/N-Me-L-allo-Ile CC=O、L-Thr Hα/L-ThrCC=O、L-Thr Hα/N-Me-L-allo-Ile CC=O、L-Thr Hβ/L-Thr CC=O、N-Me-L-ThrHα/N-Me-L-Thr CC=O、N-Me-L-Thr Hα/L-Thr CC=O、N-Me-L-ThrHβ/N-Me-L-Thr CC=O、L-Val2Hα/L-Val2CC=O、L-Val2Hα/N-Me-L-ThrCC=O、L-Val2Hβ/L-Val2CC=O、N-Me-L-Leu Hα/N-Me-L-Leu CC=O、N-Me-L-Leu Hα/L-Val2CC=O、N-Me-L-Leu Hβ/N-Me-L-Leu CC=O、L-Val3Hα/L-Val3CC=O、L-Val3Hβ/L-Val3CC=O、N-Me-L-Val Hα/N-Me-L-ValCC=O、N-Me-L-Val Hα/L-Val3CC=O、N-Me-L-Val Hβ/N-Me-L-Val CC=O、N-Me-4-OMe-L-Trp Hα/N-Me-4-OMe-L-Trp CC=O、N-Me-4-OMe-L-TrpHα/N-Me-L-Val CC=O、N-Me-4-OMe-L-Trp Hβ/N-Me-4-OMe-L-TrpCC=O、L-Val4Hα/L-Val4CC=O、L-Val4Hα/N-Me-4-OMe-L-Trp CC=O、L-Val4Hβ/L-Val4CC=O、R-β-OH-L-Phe Hα/R-β-OH-L-Phe CC=O、R-β-OH-L-PheHα/L-Val4CC=O、R-β-OH-L-Phe Hβ/R-β-OH-L-Phe CC=O、L-Val5Hα/L-Val5CC=O、L-Val5Hα/R-β-OH-L-Phe CC=O和L-Val5Hβ/L-Val5CC=O，观察到相关性。来自NMe2-Val和NMe-L-Leu的羰基的13C信号在173.29ppm重叠，使得带羰基的Val1Hα和L-Val3Hα的连通性待确定，因此为H-14留有两个可能的结构。
另外，观察L-Thr Hβ和L-Val5CC=O之间的相关性，表明H-14是在C-端羧基和L-Thr残基的侧链之间环化的环缩肽。
这些数据与通过高分辨率质谱测定的分子量1599.0111与分子式C83H134N14O17一致。
然而，N,N-Me2-Val和L-Val1间的连接通过H-14的串联质谱分析确认，显示在354.32m/z的碎片离子[N,N-Me2-Val+L-Val1+N-Me-L-allo-Ile]+。
在串联质谱中检测到以下有助于建立分子序列的片段：m/z(rel.int.)1600.23[M+H]+(8)、1246.95[M-N,N-Me2-Val-L-Val1-N-Me-L-allo-Ile+2H]+(48)、990.86[M-N,N-Me2-Val-L-Val1-N-Me-L-allo-Ile-L-Thr-L-Val5+2H]+(7)、800.60[M+2H]2+(50),、610.41[N,N-Me2-Val+L-Val1+N-Me-L-allo-Ile+L-Thr+L-Val5]+(36)和354.32[N,N-Me2-Val+L-Val1+_N-Me-L-allo-Ile]+(87)。
表11CD3OD中H-14的1H和13C NMR数据
a由于重叠，信号的多重性不清楚。
b从甲醇-d3中1H NMR实验获得的数据
从MJM5123（野野村菌属）分离和纯化的H-14的结构如化学式1所示。图11示出环H-14肽的结构布置。
化学式1
用57天以上缓慢蒸发方法从MeOH:MeCN:水=(1:1:0.5)中得到H-14的针状结晶。晶体尺寸大约为0.1×0.15×0.5mm。于室温在BrukerD8discover X射线系统上收集X射线数据，并且该晶体衍射X射线至0.83。该晶体属于斜方晶系空间群P2(1)2(1)2，晶胞参数a=71.64，b=11.43和c=12.70。不对称单元中有一个分子（图8和表12）。
表12数据收集统计
用ShelxD软件通过从原子随机分配开始的迭代对偶空间直接法解决相位问题。根据H-142D结构校正由ShelxD生成的原始模型，并且通过图形程序WinCoot产生的原始电子密度图的指导，加入水分子。最后，通过用细化程序ShelxL或者Refmac将R-因子降低到0.1723获得细化的模型。如图9所示，H-14的整体结构与扭夹型(twisthairpin-like)反平行结构相似。主链的C=O和N-H基团之间的5个H键使整体结构稳定。另外，周围的水分子也参与了H键的形成。从这个X射线结构和Marfey方法的结果（数据未示出）中，我们得出结论，H-14由所有L氨基酸或它们的类似物组成。NMR分析提出的所有的非标准氨基酸也通过使用电子密度图检查每个原子的位置来确认（图9和图10）。
实施例7：抗TB环肽H-16的结构鉴定
H-16是从菌丝的MeOH提取物获得的野野村菌MJM5123的另一种代谢产物。H-16的分子式是C83H134O16N14，其由1H,13C NMR和高分辨率质谱数据测定。
得到的H-16是淡黄色无定形粉末。高分辨度质谱显示一个在1584.0227m/z的阳离子峰[M+H]+和一个在1606.0035m/z的阳离子峰[M+Na]+，表明准确质量为1583.0149。该高分辨率质谱和13C NMR数据与分子式C83H134N14O16一致。该1H NMR数据表明H-16也是一种肽。表13中给出详细的1H和13C分配。H-16的NMR光谱鉴定的进行与H-14的光谱鉴定进行相似。在该过程中，氨基酸残基的自旋系统通过2D NMR谱图包括COSY、TOCSY、HSQC和HMBC谱图的说明再次鉴定。单体氨基酸残基顺序地通过HMBC和半选择HMBC相关性清楚地关联。对于N,N-Me2-Val Hα/N,N-Me2-Val CC=O、N,N-Me2-Val Hβ/N,N-Me2-Val CC=O、Val1Hα/Val1CC=O、Val1Hα/N,N-Me2-Val CC=O、Val1Hβ/Val1CC=O、N-Me-Ile Hα/N-Me-Ile CC=O、N-Me-Ile Hα/Val1CC=O、N-Me-Ile Hβ/N-Me-Ile CC=O、Thr Hα/Thr CC=O、Thr Hα/N-Me-Ile CC=O、Thr Hβ/Thr CC=O、N-Me-Thr Hα/N-Me-Thr CC=O、N-Me-Thr Hα/Thr CC=O、N-Me-Thr Hβ/N-Me-Thr CC=O、Val2Hα/Val2CC=O、Val2Hα/N-Me-Thr CC=O、Val2Hβ/Val2CC=O、N-Me-LeuHα/N-Me-Leu CC=O、N-Me-Leu Hα/Val2CC=O、N-Me-Leu Hβ/N-Me-LeuCC=O、Val3Hα/Val3CC=O、Val3Hα/N-Me-Leu CC=O、Val3Hβ/Val3CC=O、N-Me-Val Hα/N-Me-Val CC=O、N-Me-Val Hα/Val3CC=O、N-Me-ValHβ/N-Me-Val CC=O、N-Me-4-OMe-Trp Hα/N-Me-4-OMe-Trp CC=O、N-Me-4-OMe-Trp Hα/N-Me-Val CC=O、N-Me-4-OMe-TrpHβ/N-Me-4-OMe-Trp CC=O、Val4Hα/Val4CC=O、Val4Hα/N-Me-4-OMe-TrpCC=O、Val4Hβ/Val4CC=O、Phe Hα/Phe CC=O、Phe Hα/Val4CC=O、Phe Hβ/PheCC=O、Val5Hα/Val5CC=O、Val5Hα/Phe CC=O和Val5Hβ/Val5CC=O，观察到这种相关性。
表13CD3OD中H-16的1H和13C NMR数据
从MJM5123分离和纯化的H-16的结构如化学式2所示。图12示出环H-14肽的结构布置。
化学式2
实验实施例1：在好氧条件下H-14和H-16对结核分支杆菌的 MIC和MBC
用微孔板Alamar蓝分析法测定H-14和H-16对结核分支杆菌的抑制活性[Collins,L.and S.G.Franzblau,Microplate alamar blue assayversus BACTEC460system for high-throughput screening ofcompounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacteriumavium.Antimicrob Agents Chemother,1997.41(5):p.1004-9（用于高通量筛分针对结核杆菌和鸟型结核分支杆菌的化合物的微孔板Alamar蓝分析法和BACTEC460系统）;Hurdle,J.G.,et al.,A microbiologicalassessment of novel nitrofuranylamides as anti-tuberculosis agents.JAntimicrob Chemother,2008.62(5):p.1037-45（抗结核病新试剂硝基呋喃铵类化合物的微生物学评价）)]。表14示出在好氧条件下用对照菌株结核分支杆菌H37Rv测得的H-14和H-16的MIC值（抑制90%的生长需要的最小抑制浓度）和MBC99值（杀死99%的生物的最小浓度）。
每一种化合物的MBC99大约仅比其MIC高2倍，因此H-14和H-16应当归为杀菌类。
表14针对结核分支杆菌H37Rv的好氧MIC和MBC
H-14 H-16
MIC(μM) 0.16 0.16
MBC99(μM) 0.34 0.19
结核分支杆菌是无性繁殖生物，其不在细胞间交换遗传信息。在同人类的共同进化过程中，已形成许多不同的谱系或分支，且在全球各地都很显著(Filliol,I.,et al.,Global phylogeny of Mycobacteriumtuberculosis based on single nucleotide polymorphism(SNP)analysis:insights into tuberculosis evolution,phylogenetic accuracy of other DNAfingerprinting systems,and recommendations for a minimal standardSNP set.J Bacteriol,2006.188(2):p.759-72（基于单核苷酸多态分析的结核杆菌全球系统进化：了解结核病进展、其它DNA指纹分析系统的系统进化精确度以及对最低标准SNP设定的建议）；Gagneux,S.和P.M.Small,Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis andimplications for tuberculosis product development.Lancet Infect Dis,2007.7(5):p.328-37（结核杆菌的全球系统地理学和对结核病产品发展的启示）]。
表15列举了H-14和H-16对代表地理/遗传多样性的6种结核分支杆菌的MICs，用H37Rv实验室菌株作对照。将H-14和H-16对这6种菌株的MICs与它们对野生H37Rv的MICs比较，显示它们将广泛有效。
表15针对结核分支杆菌分支的遗传/地理多样性的临床分离株的MICs
实验实施例2：低氧下H-14和H-16对结核分支杆菌的MBC
通过使用低氧恢复试验(LORA)测定用cfu读出低氧下H-14和H-16对非复制结核分支杆菌的杀菌活性[Cho,S.H.,et al.,Low-oxygen-recovery assay for high-throughput screening of compoundsagainst nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.Antimicrob AgentsChemother,2007.51(4):p.1380-5（用于高通量筛分针对非复制结核分支杆菌的化合物的低氧恢复试验）]。在非复制条件下培养10天后，H-14和H-16的影响结核分支杆菌生存能力下降99%的浓度都大约是1.5μM。该低MBC表明H-14和H-16通过抑制非复制顽固菌(non-replicating persistors)的亚种群(subpopulation)具有缩短TB治疗时间的潜力。
实验实施例3：H-14和H-16的抗菌选择性
通过针对大肠杆菌、革兰氏阴性菌、金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性菌、白色念珠菌、酵母菌(yeast)和6种分支杆菌筛选H-14和H-16以确定其选择性（表16）。两种化合物都没有显示出对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抗菌活性。两种化合物都对MICs低于0.4μM的堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、MICs低于1.0μM的鸟型结核分支杆菌(M.avium)、MICs低于2.0μM的龟分支杆菌(M.chelonae)和海分支杆菌(M.marinum)以及MICs低于4.0μM的耻垢分支杆菌(M.smegmatis)有活性，但对脓肿分枝杆菌(M.abscessus)有显著较低的活性。结果表明H-14和H-16是选择性的抗分支杆菌化合物。表16对其它分支杆菌、典型的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及酵母菌的MICs
（数据来自UIC）
实验实施例4：对哺乳动物细胞的蛋白结合和毒性
蛋白结合可以影响化合物的药代动力学并且通过降低活性未结合化合物的量最终影响其效率。在存在10%胎牛血清(FBS)和4%牛血清蛋白(BSA)以及未将另外补充的蛋白(0.4%BSA)作为对照的情况下测定H-14和H-16对结核分支杆菌的MICs（表17）。10%FBS或者4%BSA存在时，MICs只增加2倍，表明蛋白结合不应该对它们的效力有不利影响。
表17用结核分支杆菌H37Rv测量的蛋白结合对MICs的影响（数据来自UIC）
通过针对Vero细胞和非洲绿猴肾脏细胞系测试来评价H-14和H-16对哺乳细胞的细胞毒性（表18）。发现两者中任一化合物甚至在最高测试浓度(32μM)时都未显示细胞毒性。
表18对哺乳细胞的毒性
Vero细胞IC50(μM) 选择性指标(SI)
H-14 >32 >620
H-16 >32 >620
实验实施例5：H-14和H-16对实验室生成的单耐药结核分支杆 菌菌株小组的MIC
分别针对耐利福平(RMP)、异烟肼(INH)、莫西沙星(Mox)、链霉素(SM)、卡那霉素(KM)、环比氨酸(CS)或者卷曲霉素(CAP)的H37Rv-同基因结核分支杆菌菌株小组测试H-14和H-16。有抗性（表19）。两种化合物都保持了它们对所有这些单耐药结核分支杆菌菌株的活性水平，表明与现有的抗TB药无交互抗性，并且因此得到一种将同样适合用于抗药物敏感和抗药物结核分支杆菌感染的新的作用方式。
表19对实验室生成的单耐药结核分支杆菌菌株小组的MIC
（数据来自UIC）
总之，H-14和H-16都有体外抗TB活性谱，即使不比现在的一线抗TB药更好，至少可以相媲美，在100倍于一线抗TB药的MBC时，其没有体外哺乳细胞毒性。H-14、H-16、利福平和异烟肼对复制结核分支杆菌的MICs分别是0.16μM、0.16μM、0.09μM和0.47μM。H-14和H-16的选择性指标（VERO细胞IC50/结核分支杆菌MIC）都是＞620。对耐利福平、异烟肼、链霉素、卡那霉素、环丝氨酸的结核分支杆菌的同基因菌株及对环肽和卷曲霉素，还有代表全球分支的临床分离物保持了该活性水平。H-14和H-16对复制结核分支杆菌的MBCs分别是0.34μM和0.19μM，表明它们都是强杀菌剂。两种化合物在LORA中在大约1.5μM时都降低了非复制结核分支杆菌一个log10的生存能力，表示具有通过抑制结核分支杆菌顽固菌的亚种群来缩短TB治疗时间的潜力。相反，在31μM时没有观察到对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌的活性，以及对耻垢分支杆菌的活性更低，表示两种肽类的抗TB活性有高的选择性。这也表明通过对替代细胞筛选最初将不能检测到这些肽。蛋白结合不应该对其效力有不利影响，因为MICs在4%BAS或者10%FBS存在时只增加2倍。
国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约国际表
保藏证明
按照第七条第1款发布
至：徐胄源(SUH JOO-WON)
韩国京畿道449-728龙仁市处仁区明知路116号明知大学生物科学和生物信息学部生物科学系
表格BP/4:KCTC表171          单页

Claims (10)

1.从野野村菌MJM5123菌株（保藏号：KCTC12178BP）分离的具有化学式1或化学式2的环肽：
化学式1：H-14
化学式2：H-16
。
2.用于预防或治疗分支杆菌(Mycobacterium spp.)相关疾病的药物组合物，包含作为活性成分的具有化学式1和/或化学式2的化合物，
化学式1：H-14
化学式2：H-16
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述分支杆菌相关疾病是结核病。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述结核病是MDR结核病或者XDR结核病。
5.如权利要求2-4中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含一种或多种抗分支杆菌剂。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述抗分支杆菌剂选自由以下各项组成的组：一线口服抗结核病剂、可注射抗结核病剂、氟喹诺酮、二线口服抗结核病剂、其他抗TB剂和目前用于结核病临床试验中的化合物；
其中，所述一线口服抗结核病剂选自由以下各项组成的组：异烟肼、利福平、乙胺丁醇片和吡嗪酰胺；可注射抗TB剂选自由以下各项组成的组：链霉素、阿米卡星、卷曲霉素和卡那霉素；所述氟喹诺酮选自由以下各项组成的组：环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星和莫西沙星；二线口服抗TB剂选自由以下各项组成的组：利福布汀、丙硫异烟胺、乙硫异烟胺、环丝氨酸、PAS和胺苯硫脲；所述其他抗TB剂选自由以下各项组成的组：利奈唑胺、氯苯吩嗪、阿莫西林/克拉维酸、克拉霉素和二氨基二苯砜的衍生物；以及目前用于结核病临床试验中的所述化合物选自由以下各项组成的组：贝达喹啉(Bedaquiline)、PA-824、Dalamanid、SQ-109、Sutezolid、利福喷汀和临床前研发的化合物，具体是AZD5847、BTZ043、TBA-354、CPZEN-45、SQ-641、SQ-609、DC-159a、Q201、THPP、氯苯吩嗪的氯法齐明类似物和含硼LeuRS抑制剂。
7.如权利要求5或6所述的药物组合物，其中具有通式1或者2的所述化合物和至少一个另外的化合物适于同时、顺序或者单独施用。
8.一种制造权利要求1所述的化学式1或者化学式2的抗TB环肽的方法，包括：在好氧条件下，在含水培养基中培养野野村菌MJM5123菌株的产抗分支杆菌肽的微生物；以及从菌丝中分离权利要求1所述的抗TB环肽。
9.如权利要求8所述的方法，其中分离抗结核病环肽的步骤包括使用甲醇和氯仿作为洗脱液对野野村菌MJM5123菌丝的甲醇提取物进行真空液相色谱(VLC)；使用甲醇作为洗脱液进行Sephadex LH-20开口柱色谱法；以及使用HEMWat+2作为溶剂进行高速逆流色谱(HSCCC)。
10.如权利要求8所述的方法，其中分离抗结核病环肽的步骤包括用甲醇作为溶剂提取野野村菌MJM5123菌丝；加水直至甲醇的30%，以制得含水甲醇；用己烷对甲醇提取物进行脱脂；分离水层，并且调节至65%含水甲醇；用氯仿提取所述水层；浓缩，并且用甲醇溶解氯仿提取物；使用甲醇作为洗脱液进行Sephadex LH-20开口柱色谱法；以及进行高效液相色谱（HPLC），其配置了填有反相凝胶（RP-18）的柱。
CN201280028784.8A 2011-04-18 2012-04-18 来自野野村菌的环肽、其制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物 Active CN104144940B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161476473P 2011-04-18 2011-04-18
US201161513403P 2011-07-29 2011-07-29
US201161555257P 2011-11-03 2011-11-03
US201261607934P 2012-03-07 2012-03-07
PCT/KR2012/002933 WO2012144790A1 (en) 2011-04-18 2012-04-18 Cyclic peptide from nonomuraea sp., process for the production thereof, and pharmaceutical composition for the prevention or treatment of mycobacteria related disease comprising the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104144940A true CN104144940A (zh) 2014-11-12
CN104144940B CN104144940B (zh) 2018-06-26

Family

ID=47041798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280028784.8A Active CN104144940B (zh) 2011-04-18 2012-04-18 来自野野村菌的环肽、其制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9090667B2 (zh)
EP (1) EP2699584B1 (zh)
JP (1) JP5756227B2 (zh)
KR (2) KR101599982B1 (zh)
CN (1) CN104144940B (zh)
ES (1) ES2575981T3 (zh)
WO (1) WO2012144790A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107243008A (zh) * 2017-04-13 2017-10-13 中国科学院广州生物医药与健康研究院 吡唑并[1,5‑a]吡啶类化合物的新应用及一种治疗脓肿分枝杆菌感染的组合物
CN111378014A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 中国海洋大学 一种环七肽类化合物及其制备方法与作为抗结核杆菌药物的应用

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103913533B (zh) * 2013-01-09 2016-08-24 丽珠集团利民制药厂 用于评价参芪扶正注射液化学成分的方法及其应用
US10647746B2 (en) 2016-04-08 2020-05-12 Versitech Limited Antibacterial cyclic lipopeptides
US11667674B2 (en) 2016-04-08 2023-06-06 Versitech Limited Antibacterial cyclic lipopeptides
KR20180090113A (ko) 2017-02-02 2018-08-10 서울대학교산학협력단 사이클릭 펩티드 화합물을 포함한 마이코박테리움 속 세균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 방법
KR102570075B1 (ko) * 2017-02-02 2023-08-23 서울대학교산학협력단 사이클릭 펩티드 화합물을 포함한 마이코박테리움 속 세균 감염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 방법
US20200246268A1 (en) * 2017-06-08 2020-08-06 Pai Life Sciences Inc. Cpzen compositions and uses
JPWO2019189331A1 (ja) * 2018-03-28 2021-04-15 学校法人北里研究所 新規ｋ９５−５９０１−１物質およびその製造方法
KR20210036661A (ko) * 2019-09-26 2021-04-05 경상국립대학교산학협력단 Mmagnu2 화합물을 유효성분으로 함유하는 결핵균, 비결핵 항산균 또는 그람 양성균 감염 질환 예방 또는 치료용 조성물
KR102349458B1 (ko) * 2019-12-16 2022-01-11 이화여자대학교 산학협력단 신규한 오명사마이신 유도체 및 이의 이용
KR102308831B1 (ko) 2020-02-14 2021-10-06 서울대학교산학협력단 매크로라이드 화합물을 포함한 약학적 조성물, 이의 생산 방법, 및 이를 이용한 방법
CA3224989A1 (en) * 2021-06-23 2022-12-29 Northeastern University A novel compound acting against a select group of bacteria

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009119710A1 (ja) * 2008-03-26 2009-10-01 明治製菓株式会社 新規抗生物質sf2876物質、その製造法および医薬組成物
US20100093615A1 (en) * 2006-12-20 2010-04-15 Lamarche Matthew J Antibacterial compounds and processes for its production

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992021376A1 (en) * 1991-06-06 1992-12-10 Med Immune, Inc. Induction of ctl responses to foreign antigens expressed in mycobacteria
WO1997000067A1 (en) * 1995-06-15 1997-01-03 University Of Victoria Innovation And Development Mycobacterium tuberculosis dna sequences encoding immunostimulatory peptides

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100093615A1 (en) * 2006-12-20 2010-04-15 Lamarche Matthew J Antibacterial compounds and processes for its production
WO2009119710A1 (ja) * 2008-03-26 2009-10-01 明治製菓株式会社 新規抗生物質sf2876物質、その製造法および医薬組成物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TERUI Y ET AL.: "New cyclictetrapeptides from Nonomuraea sp. TA-0426 that inhibit glycine transporter type 1 (GlyT1)", 《BIOORG MED CHEM LETT.》, vol. 18, no. 24, 15 December 2008 (2008-12-15), pages 6321 - 6323, XP025679019, DOI: doi:10.1016/j.bmcl.2008.10.104 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107243008A (zh) * 2017-04-13 2017-10-13 中国科学院广州生物医药与健康研究院 吡唑并[1,5‑a]吡啶类化合物的新应用及一种治疗脓肿分枝杆菌感染的组合物
CN107243008B (zh) * 2017-04-13 2021-03-30 中国科学院广州生物医药与健康研究院 吡唑并[1,5-a]吡啶类化合物的新应用及一种治疗脓肿分枝杆菌感染的组合物
CN111378014A (zh) * 2018-12-27 2020-07-07 中国海洋大学 一种环七肽类化合物及其制备方法与作为抗结核杆菌药物的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2699584A1 (en) 2014-02-26
KR101599982B1 (ko) 2016-03-09
JP5756227B2 (ja) 2015-07-29
US9090667B2 (en) 2015-07-28
ES2575981T3 (es) 2016-07-04
EP2699584B1 (en) 2016-04-13
CN104144940B (zh) 2018-06-26
KR20140004774A (ko) 2014-01-13
WO2012144790A1 (en) 2012-10-26
KR20150144812A (ko) 2015-12-28
KR101663234B1 (ko) 2016-10-07
US20140142031A1 (en) 2014-05-22
JP2014512380A (ja) 2014-05-22
EP2699584A4 (en) 2014-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104144940A (zh) 来自野野村菌的环肽、其制备方法以及含有该环肽的用于预防或治疗分支杆菌相关疾病的药物组合物
CA2799572C (en) Novel cyclic peptide compound, method for producing same, anti-infective agent, antibiotic-containing fraction, antibiotic, method for producing antibiotic, antibiotic-producing microorganism, and antibiotic produced by same
FI81117C (fi) Foerfarande foer framstaellning av antibiotikum a 40926 komplex och dess rena faktorer pa, pb, a, b och bo.
Charousová et al. Antimicrobial activity of actinomycetes and characterization of actinomycin-producing strain KRG-1 isolated from Karoo, South Africa
JPH0320279A (ja) 新規免疫抑制剤
Bjerketorp et al. Selective isolation of Multidrug-Resistant Pedobacter spp., producers of novel antibacterial peptides
GB2220657A (en) Antifungal fermentation product
CN101563353B (zh) 氨基噻唑大环类、它们作为抗菌化合物的用途以及制备它们的方法
KR20120093192A (ko) 항생제 화합물
CN108102933B (zh) 一株白黄黑链霉菌菌株及其应用
US6750047B2 (en) Fermentation and purification of migrastatin and analog
CN109280034A (zh) 一种具有抑菌活性的苯并氮氧杂卓类化合物及其制备方法与应用
WO2009141786A2 (en) Anti-inflammatory compounds
EP2010202A2 (en) Novel antibacterial compounds
CN111588717A (zh) 两个四重内酯类抗生素作为抗mrsa药物的应用及其提取分离方法
Messaoudi et al. Diversity of Isolated from Date Palms Rhizosphere and Saline Environments: Isolation, Identification and Biological Activity Evaluation.
AU2004283722A1 (en) Method for the production of bioactive substances from the novel actinomycete taxon MAR2 (&#34;marinophilus&#34;)
Gao Discovery of Anti-tuberculosis lead compounds from actinomycetes
Alqahtani Antibacterial Compounds from Bacteria Isolated from Hot Springs Water in Saudi Arabia
JP4755248B2 (ja) 新規な抗生物質、ビスポライドＡ１、Ａ２およびＡ３ならびにビスポライドＢ１、Ｂ２ａ、Ｂ２ｂおよびＢ３と、それら抗生物質の製造方法
CN115894307A (zh) 一类异腈基化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
JP2856379B2 (ja) 蛋白質脱リン酸化酵素阻害剤及び抗腫瘍剤
JPH03209384A (ja) 新規な微生物変換生成物
JPH03240495A (ja) 新規生理活性物質サイクロオクタチン、その製造法およびその用途
JPH02231074A (ja) 免疫抑制剤を生産する新規な培養菌株

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant