FI81117C - Foerfarande foer framstaellning av antibiotikum a 40926 komplex och dess rena faktorer pa, pb, a, b och bo. - Google Patents

Description

1 81117

MENETELMÄ ANTIBIOOTIN A 40926 KOMPLEKSIN JA SEN PUHTAIDEN TEKIJÖIDEN PA, PB, A, B JA BQ VALMISTAMISEKSI

Tämä keksintö koskee menetelmää uuden antibiootin valmistamiseksi, joka on antibiootti A 40926 kompleksi tai sen teki-5 jät antibiootti A 40926 tekijä A, antibiootti A 40926 tekijä B, antibiootti A 40926 tekijä Bq, antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A 40926 tekijä PB, viljelemällä uutta kantaa Actinomadura sp. ATCC 39727.

Keksinnön mukaiset antibiootit ovat glykopeptidisiä a i -10 neita kuuluen antibioottien vankomysiini1uokkaan, niillä on kyky sitoutua asyyli-D-alanyyli-D-alaniiniin.

Antibiootti A 40926 kompleksi ja sen tekijät antibiootit A 40926 tekijä A, tekijä B, tekijä Bq, tekijä PA ja tekijä PB voivat muodostaa suoloja sinänsä tunnettujen mene-15 telmien mukaisesti.

Tässä selityksessä ja vaatimuksissa määritelmällä "antibiootti A 40926" tarkoitetaan sellaista yhdistettä, joka on antibiootti A 40926 kompleksi, antibiootti A 40926 tekijä A, antibiootti A 40926 tekijä B, antibiootti A 40926 20 tekijä Bq, antibiootti A 40926 tekijä PA, antibiootti A 40926 tekijä PB, näiden suola tai mikä tahansa seos. Määritelmä "antibiootti A 40926 kompleksi", "antibiootti A 40926 tekijä PA", "antibiootti A 40926 tekijä PB", "antibiootti A 40926 tekijä A", "antibiootti A 40926 tekijä 25 B", "antibiootti A 40926 tekijä Bq" käsiteltäessä biolo gisia ominaisuuksia, käsittää vastaavat, farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

2 81117

Antibioottia A 40926 tuotetaan viljelemällä Actinomadu-ra-kantaa, joka on eristetty maanäytteestä ja joka on talletettu 8. kesäkuuta 1984 kansainvälisesti tunnettuun kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC) 5 - 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20582, USA,

Budapestin sopimuksen ehtojen mukaisesti. Kannalle on annettu tai 1etusnumero ATCC 39727 .

Tuottavan kannan luultiin alunperin kuuluvan Streptomyces-sukuun ja aluksi sitä merkittiin Streptomyces nov. sp.

10 A 40926 ja sellaisenaan se tallennettiin ATCC:hen, jossa se sai tai 1etusnumeron ATCC 39727 . Lisätutkimukset, erityisesti soiuseinäkoostumuksesta suoritetut tutkimukset, saivat meidät kuitenkin päättelemään, että uusi kanta kuuluu Actinomadura-sukuun. Näin kanta, joka alunperin tal-15 lennettiin Streptomyces sp. ATCC 39727, on uudestaan nimitetty Actinomadura sp. ATCC 39727.

Antibiootin A 40926 kompleksin, antibioottien A 40926 tekijän A, tekijän B, tekijän Bq, tekijän PA tai tekijän PB tuottaminen tapahtuu viljelemällä kantaa Actinomadura sp., 20 joka kykenee tuottamaan kyseistä antibioottia, t.s. viljelemällä kantaa Actinomadura sp. ATCC 39727 aerobisissa oloissa vesipitoisessa ravintoalustassa, joka sisältää assimiloituvat hiili- ja typpilähteet sekä epäorgaanisia suoloja. Voidaan käyttää monia niistä ravintoalustoista, 25 joita tavallisesti käytetään käymisessä, kuitenkin tietyt alustat ovat edullisia. Edullisia hii1i1ähteitä ovat glukoosi, mannoosi, galaktoosi, tärkkelys, maissijauho ja vastaavat. Edullisia typpi 1ähteitä ovat ammoniakki, nitraatit, soijapapujauho, peptoni, lihauute, hiivauute, 30 tryptoni , aminohapot ja vastaavat, Epäorgaanisia suoloja, joita voidaan lisätä vi1jelyalustoihin , ovat tavallisesti liukenevat suolat, jotka kykenevät tuottamaan natrium-, kalium-, rauta-, sinkki-, koboltti-, magnesium-, kalsium-, ammonium-, kloridi-, karbonaatti-, sulfaatti-, fosfaatti-, 35 nitraatti-ioneja ja vastaavia.

3 81117

Tavallisesti antibioottia tuottavaa kantaa esivi1 jell ään ravistelupul1ossa , sen jälkeen viljelmää käytetään käy-misastioiden ymppäämiseen huomattavien määrien antibioottia tuottamiseksi. Esiviljelmään käytetty kasvualusta voi 5 olla sama kuin mitä käytetään suuremmissa käymisastioissa, mutta myös muita alustoja voidaan käyttää. Antibioottia A 40926 tuottava kanta voi kasvaa lämpötiloissa, jotka ovat 20 - 40°C, mieluimmin 24 - 35°C.

Käymisen aikana antibiootti tuotantoa voidaan seurata tes -10 taamalla kasvuliemestä tai myseelistä otettujen uuttonäyt-teiden antibioottinen aktiivisuus esimerkiksi kasvukokeil-la tai ohutkerroskromatografisesti (TLC) tai korkeapaine-nestekromatografisesti (HPLC).

Testiorganismeina voidaan käyttää antibiooteille A 40926 15 herkkiä organismeja, kuten Bacillus subtilis'ta ja S. au-reus'ta. Kasvukoe suoritetaan mieluimmin agardiffuusiome-netelmällä agarlevyi11ä. Antibioottisen a tiivisuuden mak-simituotanto tapahtuu tavallisesti käymisen toisen ja viidennen päivän välisenä aikana.

20 Antibioottia A 40926 tuotetaan viljelmällä kantaa Acti-nomadura sp. ATCC 39727 ja antibiootti löytyy pääasiassa vi1jelyli emi stä.

Seuraavissa kappaleissa on esitetty kannan Actinomadura 25 sp. A 40926 ATCC 39727 tunnusmerkit:

MAKROSKOOPPINEN JA MIKROSKOOPPINEN TUTKIMUS

Kasvumyseeli muodostuu taipuisasta ja haarautuneesta hyyfistä (halkaisija noin 0,8 /jm), jolla eräillä kasvualustoilla, merkitty tähdellä taulukossa I, jossain mää-30 rin on taipumusta pilkkoutua sauvama isiksi kappaleiksi usean päivän kasvun jälkeen, kun taas glukoosi-asparagii-ni-kasvualustal1 a se pilkkoutuu kokkimaisiksi kappaleiksi.

4 81117

Tyypillistä tälle kannalle on kasvumyseelin Burgundy-väri eräillä kasvualustoilla.

Ilmamyseeliä esiintyy ainoastaan muutamilla kasvualustoilla; erityisesti taulukossa I esitetyissä alustoissa, sitä 5 esiintyy ainoastaan kaurajauhoagari11 a ja maa-agari11 a. Näillä kasvualustoilla ilmamyseeli on vai koisen-harmaata ja muodostaa itiöalustoja, jotka ovat järjestäytyneet koukuiksi ja lyhyiksi, noin 10-20 itiön spiraaleiksi.

Itiöt ovat sy1interimäisiä ja niiden keskimääräinen koko 10 on 0,8 x 1,2 p.

VILJELYTUNNUSMERKKIEN MÄÄRITTÄMINEN

Vi1jelytunnusmerkkien määrittämiseksi viljeltiin kantaa Actinomadura sp. ATCC 39727 erilaisilla standardi-kasvualustoilla, joita ovat Shirling ja Gottlieb esittäneet 15 (Shirling E.B. and Gottlieb D., 1966 - Method for characterization of Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacteriol., 313-340), lisäksi käytettiin useita Waksman'in suosittelemia kasvualustoja (Waksman, S.A.

1961 - The Actinomycetes - The Williams and Wilkins Co.

20 Baltimore; Voi. 2, 328-334).

Värin määrittäminen suoritettiin tarvittaessa Maerz'in ja Paul'in menetelmällä (Maerz A. and M. Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2rd Edition McGraw-Hill Book Company Inc. New York).

25 Organismin kykyä käyttää hyväkseen erilaisia hiili!äh te i-tä tutkittiin menetelmällä, jonka ovat esittäneet Shirling ja Gottlieb.

Viljely- ja fysiologiset tunnusmerkit ja hii1i1ähteiden hyväksikäyttö on esitetty taulukoissa I, II ja III.

30 Taulukossa I esitetyt tulokset on saatu aikaan kahden viikon inkuboinnin jälkeen 28°C:ssa.

5 81117

TAULUKKO I

KANNAN ACTINOMADURA sp. ATCC 39727 VILJELYTUNNUSMERKIT

Kasvualusta Tunnusmerkit

Kasvualusta No 2 runsasta kasvua, kovakuori- (hiivauute-mallasagar) nen pinta, 8/L/8, jälkiä ku1 - lanruskeasta-vaaleanpunaises-ta, liukenevasta pigmentistä

Kasvualusta No 3 runsasta kasvua, pehmeä pinta, (kaurajauhoagar) violetti, 55/E/4, ilmamysee- liä hyvin niukasti, harmaa, liukeneva pigmentti violetti 55/H/4

Kasvualusta No 4 kohtuullista kasvua, pehmeä (epäorgaanisia suoloja- ja ohut pinta, kermanvärinen tärkkelysagar) 10/D/2

Kasvualusta No 5 kohtuullista kasvua, pehmeä (glyseroli-asparagiini- ja ohut pinta, aprikoosinväri- agar) nen 10/B/2

Kasvualusta No 6 * kohtuullista kasvua, hiukan (peptoni-hiivauute-rauta- kovakuorinen pinta, kullan- agar) ruskea 12/D/9

Kasvualusta No 7 runsasta kasvua, pehmeä ja (tyrosiiniagar) ohut pinta, kullanruskea- ruskea 13/K/12

Kaurajauhoagar * runsasta kasvua, pehmeä pinta,

Burgundy1n-värinen 8/L/7, il-mamyseeliä kohtuullisesti, vaaleankeltai nen-harmaa 44/B/2

Hickney'n ja Tresner'in runsasta kasvua, rypistynyt agar * pinta, kullanruskea-ruskea 13/K/12

Czapeck-glukoosiagar kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, vaaleankeltainen 9/1/3 G1ukoosi-asparagiiniagar * niukkaa kasvua, kermamainen pinta, oljenvärinen-keltai-nen 9/E/1

Ravintoagar runsasta kasvua, rypistynyt pinta, vaalean oranssi, 11/C/7 6 81117 TAULUKKO I (jatk.)

Kasvualusta Tunnusmerkit

Peruna-agar * runsasta kasvua, rypistynyt pinta, Burgundy'n värinen 8/L/9

Bennett'in agar * runsasta kasvua, kovakuori nen pinta, Burgundy'n värinen 8/L/8, liukeneva pigmentti syvän kullanruskea-roosa 5/J/10

Kaisium-malaattiagar kohtuullista kasvua, pehmeä pinta, aprikoosin värinen 10/B/3

Kuorittumaitoagar runsasta kasvua, hiukan ry pistynyt pinta, oranssi 9/B/9

Czapeck-sakkaroosiagar runsasta kasvua, pehmeä pin ta, aprikoosin värinen 10/B/6

Munanvalkuaisagar runsasta kasvua, pehmeä pin ta, roosa 52/B/3, jälkiä liukenevasta pigmentistä, roosa 52/B/3

Sabouraud-agar ei kasvua

Maa-agar niukkaa kasvua, väritön, vai koisenharmaa ilmamyseeli

Dekstroosi-triptoniagar * kohtuullista kasvua, pehmeä ja ohut pinta, vaaleankeltainen 10/6/2

Peruna runsasta kasvua, oranssin- ruskea, merkkejä valkoisen-harmaasta i1mamyseelistä 7 81117

TAULUKKO II

FYSIOLOGISET TUNNUSMERKIT

Kokeet Tulokset Tärkkelyshydrolyysi negatiivinen

Rikkivedyn (H^S) muodostus negatiivinen kasvualustalla 6 positiivinen lyijyasetaatti-liuskoilla

Tyrosiinireaktio positiivinen

Ka sei inihydrolyysi positiivinen

Kalsiummalaattihydrolyysi negatiivinen

Gelatiinin nesteytys positiivinen koagulointi negatiivinen

Lakmusma i to peptonisaatio positiivinen

Selluloosan hajottaminen negatiivinen

Nitraattipelkistys positiivinen 8 81117 TAULUKKO III HIILEN HYVÄKSIKÄYTTÖ

Hiili lähde Kasvu arabinoosi + ksyloosi + mannoosi + fruktoosi + raffinoosi + ramnoosi + glukoosi + laktoosi + galaktoosi + i nosi toi i sakkaroosi + selluloosa saii s i i n i + mannitoli + riboosi + = kasvua ei kasvua 9 81117 KEMOTAKSONOMISET TUNNUSMERKIT SOLUSEINÄANALYYSI:

Soluseinässä esiintyvien aminohappojen analyysi suoritettiin menetelmillä, joita kuvataan teoksessa Becker et ai.

5 "Rapid differentation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates", Appi. Microbiol. J_2, 421 -423 ( 1964). Koko solun hydrolyysiana-lyysi osoitti meso-diaminopimeliini hapon läsnäolon.

Pelkän soluseinän analyysillä, joka suoritettiin menetel-10 mällä, jonka ovat esittäneet Kawamoto et ai. (I. Kawamoto, T. Oka and T. Nara, "Cell-wall composition of Micromono-spora oiivoasterospora, Micromonospora sagamiensis and related organism", J. of Bacteriology 146, 527-534, 1981), voitiin osoittaa glysiinin puuttuminen.

15 SOKERIANALYYSI:

Sokeripitoisuuden analyysi suoritettiin menetelmällä, jonka on esittänyt M.P. Lechevalier, "Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance", J. Lab. Clin. Med. 7J_, 934-944 ( 1968), käyttäen ohutkerroskromatografias-20 sa sei 1 uioosakalvoja kuten ovat esittäneet J.L. Staneck ja 6.D. Roberts, "Simplified approach to identification of aerobic actinomicetes by thin-layer chromatography", 28, 226-231 (1974), yhdessä seuraavan liuotin systeemin kanssa: etyyliasetaatti-pyridiini-vesi (100:35:25 tilavuuksia).

25 Saadut tulokset osoittivat, että pääasiassa esiintyi glu koosia ja riboosia, kun taas pienempiä määriä glaktoosia, mannoosia ja maduroosia (3-0-metyyli-D-galaktoosia) myös havaittiin.

MYKOLIIN I HAPOT: 30 Koe esiintyvien mykoliinihappojen havaitsemiseksi suoritettiin käyttäen menetelmää, jonka ovat esittäneet Minnikin et ai. (D.E. Minnikin, L. Alshamaony and M. Good- 10 81117 fellow, "Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole organism methanolysates", Journal of General Microbiology 88, 200-204, 1975).

5 Kokeen tulokset olivat negatiiviset; mykoliinihappoja ei 1öydetty.

KANNAN IDENTIFIOINTI:

Kanta merkitään kuuluvaksi Actinomycetes sukuun Actino-madura, koska läsnä on meso-diaminopimeliinihappo ja 10 maduroosi, glysiini puuttuu peptodoglykaanissa, mykolii-nihapot puuttuvat ja ilmamyseeliä muodostuu suhteellisen pitkin itiöketjuin.

Kuten muillakin mikro-organismeilla, antibioottia A 40926 tuottavan kannan tunnusmerkit ovat alttiit muutoksille.

15 Esimerkiksi kannan keinotekoiset muunnokset tai mutantit voidaan saada käsittelemällä erilaisilla tunnetuilla muta-geeneilla, kuten UV-säteillä, röntgensäteillä, suurtaajuisilla aalloilla, radioaktiivisella säteilyllä ja kemikaaleilla, kuten typpihapolla, N-metyyli-N 1-nitro-nitrosogua-20 nidiinilla ja monilla muilla. Kaikki luonnolliset ja keinotekoiset muunnokset ja mutantit, jotka kuuluvat Actino-madura-suvun lajeihin ja tuottavat antibiootteja A 40926, pidetään ekvivalentteina kannan Actinomadura sp. ATCC 39727 suhteen ja katsotaan kuuluvaksi tämän keksinnön pii-2 5 r i i n.

Keksinnön mukaisten antibioottien taiteenottaminen tuottavien mikro-organismien käymisliemestä tapahtuu sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti, jolloin suoritetaan uutto liuottimilla, saostaminen lisäämällä ei-1iuottimia tai 30 muuttamalla liuoksen pH-arvoa, jakaantumiskromatografia, käänteis-faa sinen jakaantumiskromatografia , ioninvaihto-kromatografia , affiniteettikromatografia ja vastaavat toimenpiteet.

i 11 81117

Edullisessa menetelmässä käytetään affiniteettikromato-grafiaa liikkumattomalla D-alanyyli-D-alaniinilla, jonka jälkeen seuraa käänteisfaasinen pyiväskromatografia .

Liikkumattomat D-alanyyli-D-alaniini-matriisit, jotka 5 ovat sopivia tähän taiteenottomenetelmään , on kuvattu EPO-patenttihakemuksessa No 83112555. Edullinen matriisi tässä menetelmässä on D-alanyyli-D-alaniini kytkettynä tasahuokoiseen ristiinkytkettyyn polydekstraaniin.

Käymisliemel1 e voidaan suorittaa affiniteettikromatogra-10 fia suoraan suodatuksen jälkeen tai alustavan puhdistus-menetelmän jälkeen. Tässä viimeksi mainitussa menetelmässä koko käymismassa tehdään emäksiseksi, mieluimmin säädetään pH-arvo välille 8,5 - 10,5 myseeliin adsorboituneen antibiootin liuottamiseksi, jonka jälkeen suodatetaan.

15 Kirkkaan suodoksen pH säädetään arvoon 2,5 - 4,5 ja suodatetaan uudestaan suodatusapuaineen läsnäollessa. Tämä suodos hylätään kun taas suodatuskakku otetaan talteen ja suspendoidaan veteen, tehdään emäksiseksi, mieluimmin säädetään pH-arvoon välille 8 - 9 ja suodatetaan. Suodatus-20 kakulle suoritetaan uudestaan tämä menetelmä, kun taas suodokset, jotka sisältävät antibiootin A 40926, yhdistetään.

Näille suodoksille tai suodatetuille käymisliemi 11 e suoritetaan sen jälkeen affiniteettikromatografia liikkumat-25 tomalla D-alanyyli-D-alaniinilla, joko pylväässä tai annoksittain.

Antibiootin sitoutuminen affi n i teetti matri isiin tapahtuu mieluimmin pH-arvossa noin 7,0 - 8,0 ja sen eluointi suoritetaan emäksisemmi11ä pH-arvoilla (mieluimmin 9,0 - 10,5) 30 käyttäen vesipitoista emästä. Tämä vesipitoinen emäs voi olla ammoniakki, haihtuva amiini, alkali- tai aikaiimetal1i-hydroksidi tai emäksisesti puskuroitu liuos mahdollisesti polaarisen, orgaanisen liuottimen, kuten polaarisen veteen sekoittuvan liuottimen, joita jäljempänä määritellään, 12 81117 1äsnäol1essa.

Sen jälkeen kun epäpuhtaudet on poistettu huuhtomalla pylväs vesipitoisella puskurilla, jonka pH-arvo on 4 - 8 ja joka mahdollisesti sisältää suoloja, kuten karbodiamidia 5 ja/tai veteen sekoittuvia liuottimia, antibiootti A 40926 eluoidaan edellä esitetyllä seoksella. Sen jälkeen raaka antibiootti otetaan talteen mieluimmin poistamalla vettä yhdistetyistä antibioottia sisältävistä fraktioista atseo-trooppisesti tislaamalla yhdessä orgaanisen liuottimen 10 kanssa, joka kykenee muodostamaan atseotrooppisia minimi-seoksia veden kanssa, jonka jälkeen lisäämällä ei-liuo-tinta seostetaan toivottu tuote.

Tyypillisiä esimerkkejä orgaanisista liuottimista, jotka pystyvät muodostamaan atseotrooppisiä minimiseoksia veden 15 kanssa, ovat n-butanoli, bentseeni, tolueeni, butyylieet-teri, hii1itetrakloridi, kloroformi, sykioheksaani , 2,5--dimetyylifuraani, heksaani ja m-ksyleeni; edullinen liuotin on n-butanoli.

Esimerkkejä ei-1iuottimista ovat petrolieetteri , alempi-20 aikyylieetterit, kuten etyylieetteri , propyylieetteri ja butyylieetteri ja aiempia 1kyylike tonit, kuten asetoni.

Vaihtoehtoisesti yhdistetyt antibioottia sisältävät fraktiot konsentroidaan pieneen tilavuuteen, mieluimmin tislaamalla atseotrooppisesti edellä määritellyn orgaanisen 25 liuottimen kanssa ja muodostunut vesipitoinen liuos lyo- fi1i soidaan.

Jos eluointiin käytetty vesipitoinen emäs on haihtumaton, voi olla tarpeen suorittaa neutralointi ja suolan poistaminen konsentraatista ennen saostamista tai pakastus-30 kuivausta.

Sopiva suolanpoistomenetelmä käsittää antibioottia sisältävän vesipitoisen liuoksen valuttamisen läpi silanoidusta piihappogeelipylväästä, joka pestään tislatulla vedellä ja 15 811-17 eluoidaan polaarisen veteen sekoittuvan liuottimen ja veden seoksella.

Tyypillisiä esimerkkejä polaarisista, veteen sekoittuvista liuottimista ovat vesiliukoiset alkoholit (kuten meta-5 noli, etanoli, isopropanoli, n-butanoli), asetoni, aseto- nitriili, aiempialkyylia 1kanoaatit (kuten etyyliasetaatti), tetrahydrofuraani, dioksaani ja dimetyyliformamidi ja näiden seokset; edullinen polaarinen, veteen sekoittuva liuotin on asetoni tri i1i.

10 Vaihtoehtoisesti suolan poistaminen voidaan suorittaa käyttäen antibioottia sisältävälle liuokselle edellä kuvattua affiniteetti pyivästä, joka pestään tislatulla vedellä ja eluoidaan haihtuvalla, vesipitoisella emäksellä, kuten edellä esitettiin affiniteettikromatografian eluoinnin yh-15 teydessä. Näin saatu tuote on antibiootti A 40926 kompleksi. Tarvittaessa se voidaan edelleen puhdistaa tai sille voidaan suorittaa sellainen erottaminen, että saadaan sen tekijät A, B, Bq, PAjaPB.

Sopiva menetelmä puhtaan antibiootin A 40926 kompleksin 20 saamiseksi on sellainen, jossa edellä saatu kompleksi puhdistetaan edelleen affiniteettikromatografiapylväässä. Tavallisesti käytetään samaa stationäärifaa sia (liikkumaton D-alanyyli-D-alaniini) ja toivottu antibiootti eluoidaan edellä kuvatun affiniteettikromatografia-menetelmän mukai-25 sesti liikkumattomalla D-alanyyli-D-alani inilla .

Edullinen liikkumaton D-alanyyli-D-alaniini on Sepharose -- h-aminokaproyyli-D-alanyyli-D-alaniini, edullinen tasapai-noitusseos on 0 ,16-prosenttinen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 M NaCl:ää, pH säädettynä arvoon 7-8, edul-30 linen huuhdeliuos on 0,16-prosenttinen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 M natriumkloridia, pH-säädettynä arvoon 8 - 9,5, edullinen eluointi1iuos on 0,16-prosentti-nen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 M natriumklo-ridia, pH säädettynä arvoon 10,5 - 12 ja kaikkein edullisin 14 81117 eluointiseos on edellä esitetty seos, jonka pH on säädetty arvoon 11,5.

Antibiootti A 40926, eli antibiootti A 40926 tekijä A, antibiootti A 40926 tekijä B, antibiootti A 40926 teki-5 jä Bq, antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A

40926 tekijä PB, eristetään antibiootti A 40926 kompleksin vesipitoisesta liuoksesta pyiväskromatografisesti ja mieluimmin käyttäen käänteisfaasipylväskromatografiaa. Edullinen stationäärifaasi, käänteisfaasipyiväskromatogra-10 f iän ollessa kyseessä, on silanoitu pi i happogeeli. Hyviä tuloksia voidaan saada pyiväskromatografisesti kuitenkin myös funktionalisoimattomal1 a polystyreeni- ja akryyli-hartseilla, kuten sellaisilla, joita myydään rekisteröidyillä nimillä Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7 ja XAD-8 15 (Rohm and Haas) tai Diaion HP 20 (Mitsubishi).

Kun käänteisfaasi-puhdistusvaihe suoritetaan käyttäen silanoitua piihappogeeliä stationäärifaasina , pylväs mieluimmin tasapainoitetaan etukäteen puskuroidulla, vesipitoisella liuoksella pH-arvossa 4-9 ja mieluimmin 5,5-20 -6,5, ja sen jälkeen eluoidaan polaarisen, veteen sekoit tuvan liuottimen lineaarisella gradientilla samassa puskuroidussa liuoksessa. Tyypillisiä esimerkkejä polaarisista, veteen sekoittuvista liuottimista ovat vesiliukoiset alkoholit (kuten metanoli, etanoli, isopropanoli , n-butanoli), 25 asetoni, asetonitrii1i , tetrahydrofuraani , dioksaani ja dimetyyliformamidi ja näiden seokset; edullinen polaarinen, veteen sekoittuva liuotin on asetoni trii1i.

Eluoiduista fraktioista tutkitaan niiden antibioottipitoi-suus käyttäen tavallisia kasvukokeita, kuten paperi-kiekko-30 tai agar-diffuusiokokeita, herkillä mikro-organismeilla. Esimerkkejä herkistä organismeista ovat Bacillus subtilis ja S.aureus.

Kromatografoi nti a seurataan myös sopivasti käyttäen TLC-tai HPLC-menetelmiä.

15 81117

Edullinen HPLC-menetelmä on käänteisfaasi-HPLC, jossa käytetään silanoidun piihappogeelin , joka on funktionali-soitu C-18-alkyyliryhmi11ä, huokoisten ja pallomaisten partikkelien, joiden läpimitta on mieluimmin 5 mikromet-5 riä, muodostamaa kolonnia (kuten 5 /jm Ultrasphere® ODS Altex; Beckman Co.)> esikolonnia, joka on piihappogeeliä funktionalisoituna C-18-alkyyliryhmi11ä (kuten RP 18 Brownlee Labs) ja eluenttia, joka on polaarisen, veteen sekoittuvan liuottimen, kuten jonkin edellä mainitun liuotit) ti men lineaarinen gradientti vesipitoisessa, puskuroidussa 1i uoksessa.

Mieluimmin tämän liuoksen pH säädetään arvoon 5-7. Edullisin eluentti on eluentin B 5 prosentista 60 prosenttiin oleva lineaarinen gradientti eluentissa A, jolloin eluent-15 ti A on asetonitriilin/vesipitoi sen puskurin, pH 5-7, 10:90-seos, ja eluentti B on asetonitrii1in/vesipitoi sen puskurin, pH 5-7, 70:30-seos. Kuten on tunnettua, voidaan sisäisinä standardeina käyttää monia aineita. Eräs tunnettu hyvin sopiva on tässä tapauksessa teikoplaniini A^ 20 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.), jonka retentioaika on lähellä keksinnön mukaisten yhdisteiden retentioaikaa tässä HPLC-systeemissä. Tämä standardiyhdiste on tunnettu ja se on kuvattu julkaisussa GB-A-2121401 .

Fraktiot, joilla on samanlainen antibioottipitoisuus , yh-25 distetään ja suola poistetaan edellä esitetyllä tavalla, jolloin saadaan olennaisesti puhtaat antibiootit A 40926 tekijä A, tekijä B, tekijä BQ, tekijä PA ja tekijä PB. Olennaisesti puhtaat antibiootti A 40926 tekijä A ja antibiootti A 40926 tekijä B, antibiootti A 40926 tekijä 30 Bg, antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A 40926 tekijä PB saadaan näistä fraktioista, joihin ne sisältyvät, erilaisilla tunnetuilla menetelmillä, kuten lyofili-soimalla, saostamalla ei-1iuottimi11 a tai seostamalla siten, että vesipitoisen liuoksen pH:ta muutetaan.

te 81117

Sopivassa menetelmässä lisätään liuotinta, joka kykenee muodostamaan atseotrooppis ia seoksia veden kanssa, vesi poistetaan atseotrooppisesti tislaamalla, jonka jälkeen sakka, joka saadaan ei-1iuottimien, kuten edellä kuvattu-5 jen lisäyksen jälkeen, kerätään suodattamalla.

Antibiootit A 40926 tekijät PA ja PB, ainakin tietyissä käymisoloissa, ovat antibioottia A 40926 tuottavan mikro-organismin paäantibioottituotteet.

Antibiootit A 40926 tekijät A ja B ovat pääasiassa anti-10 bioottien A 40926 tekijän PA ja vastaavasti tekijän PB transformaatiotuotteita ja ne esiintyvät usein jo käy-mi sii emessä.

On havaittu, että antibiootti A 40926 tekijä PA voidaan muuttaa antibiootiksi A 40926 tekijä A ja antibiootti A 15 40926 tekijä PB voidaan muuttaa antibiootiksi A 40926 te kijä B emäksisissä oloissa. Esimerkiksi antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A 40926 tekijä PB muutetaan antibiooteiksi A 40926 tekijä A ja vastaavasti tekijä B käsittelemällä 0,5 - 10-prosenttisei 1 a ammoniakilla tai 20 muulla nukleofii1isei 1 a emäksellä, kuten orgaanisella amiinilla huoneen lämpötilassa 8-24 tunnin ajan.

Näin ollen kun käymisliemen tai antibioottia A 40926 sisältävän uutteen tai sen konsentraatin annetaan seistä tietyn ajan emäksisissä oloissa (esim. nukleofii1isen 25 emäksen vesipitoisessa liuoksessa pH >9 yön yli) saadaan antibiootti A 40926 kompleksi, joka on rikastunut antibioottien A 40926 tekijä A ja tekijä B suhteen. Jos käymisliemen, sen uutteen tai konsentraatin altistusaika emäksiselle ympäristölle on lyhyt, saadaan antibiootin 30 A 40926 kompleksi, joka on rikastunut antibioottien A 40926 tekijä PA ja tekijä PB suhteen.

Edullinen menetelmä antibiootin A 40926 kompleksin saamiseksi, joka on rikastunut tekijän A ja tekijän B suhteen, i 17 81117 on sellainen, jossa antibiootin A 40926 kompleksin liuos (joka sisältää pääasiallisesti antibioottia A 40926 tekijä PA ja tekijä PB) jätetään huoneen lämpötilassa 8-12 tunnin ajaksi seisomaan vesipitoiseen, nukleofii1iseen 5 emäkseen, kuten vesipitoiseen ammoniakkiin, jonka jäl keen haluttu antibiootti kompleksi eristetään edellä kuvatulla tavalla.

Esimerkkejä antibiootin A 40926 sisältävistä liuoksista ovat käymisliemet, uutteet ja affiniteettikromatografias-10 sa eluoidut fraktiot.

Puhdas antibiootti A 40926 voidaan saada puhdistamalla edelleen raakakompleksi affiniteettikromatografisesti edellä kuvatulla tavalla.

Näin saatu tuote, joka omaa biologiset ja fysikokemial1i-15 set ominaisuudet, jotka ovat johdettavissa sen puhtaista tekijöistä, käsitellään esimerkeissä antibioottina A 40926 kompleksina AB.

Edullinen menetelmä, jossa antibiootti A 40926 kompleksi-valmiste rikastetaan tekijöiden PA ja PB suhteen, on affi-20 niteettikromatografisesti eluoitujen fraktioiden nopea neutralointi hapolla, mieluimmin mineraalihapol1 a, kuten rikkihapolla tai kloorivetyhapol1 a.

Puhtaiden antibioottien A 40926 tekijöiden PA ja PB eristäminen tästä kompleksista voidaan tehdä jollain edellä 25 mainituista menetelmistä.

Edullisessa menetelmässä käytetään käänteisfaasi-neste-kromatografiaa, mieluimmin ruostumattomissa teräskolon-neissa kohtalaisessa paineessa (5-50 bar) tai suurpaineessa (100-200 bar). Kiinteä faasi voi olla silanoitu 30 piihappogeeli, yhdessä hii1ivetyfaasin kanssa, joka muodostuu (2-18) hiiliatomeista (mieluimmin C-18) tai fenyy-liryhmästä, ja eluenttina on polaarisen, veteen sekoittu- 18 81117 van liuottimen, kuten edellä esitetyn, ja vesipitoisen puskurin seos pH-arvossa, joka sopii käytetylle hartsille (mieluimmin pH 4 - 8).

Eluointia seurataan kuten tavallista, homogeenisen anti-5 bioottipitoisuuden sisältävät fraktiot yhdistetään ja käsitellään edellä esitetyllä tavalla puhtaiden komponenttien, joilla on jäljempänä esitetyt tunnusmerkit, eristä-mi seksi.

Monimutkainen HPLC-analyysi on osoittanut, että antibiootit) ti A 40926 tekijä B itse asiassa on kahden tekijän, joita merkitään tekijä Bq ja tekijä B^ seos.

Antibiootti A 40926 tekijä BQ, jota on kaikkiaan noin 90¾ antibiootista A 40926 tekijä B, on tekijä, jonka R^. on 1,22 verrattuna teikoplaniinin komponentin 2 jäljem-15 pänä, tekijän B fysikokemialliSten tunnusmerkkien kohdassa D esitetyssä systeemissä, kun taas tekijä B^ , jota on noin 10% antibiootista A 40926 tekijä B, on yhdiste, jonka suhteellinen R^ on 1,27 samassa systeemissä.

Puhdas antibiootti A 40926 tekijä BQ saadaan puhdistamal-20 la edelleen antibiootti A 40926 tekijä B esimerkiksi toistamalla sen eristämiseen käytetty käänteisfaasi-kromato-grafiamenetelmä.

Antibiootin A 40926 tekijän Bq fysikokemiai 1iset ja biologist ominaisuudet ovat käytännöllisesti katsoen ident-25 tiset antibiootin A 40926 tekijän B arvojen kanssa paitsi, että HPLC-analyysissä systeemissä, kuten edellä mainitussa, sillä on ainoastaan yksi piikki (R^ 1,22 suhteessa teikoplaniinin A£ komponenttiin 2 kuvatussa HPLC-systeemi ssä).

30 Johtuen esitetyistä samankaltaisuuksista antibiootin A

40926 tekijän B ja antibiootin A 40926 tekijän BQ välillä, tässä selityksessä ja vaatimuksissa viitattaessa antibiootin A 40926 tekijän B biologisiin omainaisuuksiin on ym- 19 81117 märrettävä tarkoitettavan myös antibioottia A 40926 tekijää Bq, joka on antibiootin A 40926 tekijän B pääkompo-nentti (noin 90 %) ja etupäässä vaikuttaa sen biologisiin ominaisuuksiin.

5 Vaihtoehtoisesti keksinnön mukaiset antibiootit voidaan eristää käymis 1iemestä tai edelleen puhdistaa vahvojen tai heikkojen anionihartsien avulla, mukaanluettuna funk-tionalisoidut polystyreeni-, akryyli- tai polydekstraani-matriisit. Esimerkkejä heikoista anioninvaihtohartseista 10 ovat sellaiset, joita myydään seuraavilla kauppanimillä: Dowex MWA-1 tai WGR (Dow Chemical), Amberlite IRA-73 (Rohm and Haas), DEAE-Sephadex (Pharmacia). Esimerkkejä vahvoista anioninvaihtohartseista, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisesti, ovat sellaiset, joita myydään seu-15 raavilla kauppanimillä: Dowex MSA-1, SBR, SBR-P (Dow Chemical), Amberlite IR-904 (Rohm and Haas) ja QAE-Sephadex (Pharmacia).

Keksinnön mukaisten antibioottien eluointi näistä hartseista suoritetaan elektrolyyttien, kuten natrium- tai 20 kaiiumhydrokloridien vesipitoisen liuoksen lineaarisilla gradienttiseoksilla vedessä tai veden ja orgaanisen, veteen sekoittuvan liuottimen, kuten alempialkoholin (esim.

(C^-C^)aikanolin) tai aiempiaikyyliketonien (esim. asetonin) seoks i ssa.

25 Kuten jo edellä mainittiin keksinnön mukaiset antibiootit omaavat happamia ja emäksisiä funktioita ja voivat muodostaa suoloja tavanomaisten menetelmien mukaisesti.

Keksinnön mukaisten yhdisteiden tyypillisiä ja sopivia happoadditiosuoloja ovat sellaiset suolat, jotka muodos-30 tetaan tavanomaisella reaktiolla sekä orgaanisten että epäorgaanisten happojen, kuten esimerkiksi kloorivety-, bromi vety-, rikki-, fosfori-, etikka-, trifluorietikka-, trikloorietikka-, meripihka-, sitruuna-, askorbiini-, maito-, maleiini-, fumääri -, palmitiini-, koliini-, 20 81 1 1 7 pamoe-, lima-, glutamiini-, kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaa-nisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, bent-soe-, kanelihapon ja vastaavien happojen kanssa.

5 Tyypillisiä esimerkkejä näistä emäksistä ovat alkalimetal-li- tai maa-alkaiimetal1ihydroksidi, kuten natrium-, kalium- ja kaisiumhydroksidi, ammoniakki ja orgaaniset amiinit, jotka ovat aiifaattisia, ali syki isiä tai aromaattisia, kuten metyyliamiini, dimetyyliamiini, trimetyyliamiini ja 1 0 pi koii ini.

Keksinnön mukaisten vapaiden amino- tai ei-suolayhdistei -den muuttaminen vastaaviksi additiosuoloiksi ja päinvastoin, t.s. keksinnön mukaisen yhdisteen additiosuolan muuttaminen ei-suolaksi tai vapaaksi aminoksi, ovat tavanomaista, tun-15 nettua tekniikkaa ja kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

Esimerkiksi keksinnön mukainen yhdiste voidaan muuttaa vastaavaksi happo- tai emäsadditiosuolaksi liuottamalla ei--suolamuoto vesipitoiseen liuottimeen ja lisäämällä pieni molaarinen ylimäärä valittua happoa tai emästä. Sen jäl-20 keen muodostunut liuos tai suspensio lyofilisoidaan toivotun suolan taiteenottamiseksi.

Siinä tapauksessa, että lopullinen suola on liukenematon liuottimeen, johon ei-suolamuoto liukenee, se saadaan talteen suodattamalla ei-suolamuodon orgaanisesta liuoksesta 25 sen jälkeen kun stökiömetrinen määrä tai pieni molaarinen ylimäärä valittua happoa tai emästä on lisätty.

Ei-suolamuoto voidaan valmistaa vastaavasta happo- tai emässuolasta liuottamalla vesipitoiseen liuottimeen, joka sen jälkeen neutraloidaan vapaaksi ei-suolamuodoksi.

30 Kun neutralointia seuraava suolan poistaminen on tarpeen, voidaan käyttää tavanomaista suolanpoistomenetelmää. Esimerkiksi pyiväskromatografiaa silanoidulla piihappogeeli11ä , ei-funktionalisoidulla polystyreeni-, akryyli- ja tasahuo- 2i 81117 koisella polydekstraanihartsei1 la (kuten Sephadex LH 20) tai voidaan edullisesti käyttää aktivoitua hiiltä. Sen jälkeen kun ei-toivotut suolat on eluoitu vesipitoisella liuoksella, toivottu tuote eluoidaan lineaarisella gra-5 dientilla tai veden ja polaarisen tai apolaarisen liuottimen seoksen vaihegradienti11 a , kuten asetonitrii1i/vesi 50:50 - noin 100 prosenttiin asetoni trii1iä .

Kuten on tunnettua suolan muodostusta joko farmaseuttisesti hyväksyttävien happojen (emästen) tai ei-farmaseutti-10 sesti hyväksyttävien happojen (emästen) kanssa voidaan käyttää sopivana puhdistusmenetelmänä. Muodostamisen ja eristämisen jälkeen, antibiootin A 40926 suolamuoto voidaan muuttaa vastaavaksi ei-suolaksi tai farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

15 Eräissä tapauksissa keksinnön mukaisen yhdisteen emäsad-ditiosuola liukenee enemmän veteen kuin hydrofii1isiin 1i uotti mi in.

22 8 1 1 1 7

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN A FYSIKOKEMIALLISET TUNNUSMERKIT

A) ultraviolettiabsorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1, esiintyy seu-5 raavat absorptiomaksimit: X maks (nm) a) 0,1 N HC1 281 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 300 (olka) 10 c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 d) metanoli 282 e) fosfaattipuskuri pH 9,0 282 300 (olka) 15 B) infrapuna-absorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 2, on seuraavat absorp-tiomaksimit (cm ^): 3700-3100, 3100-2800 (nujoli); 1655; 1620-1560; 1510; 1480-1410 (nujoli); 1375 (nujoli); 1320-1250; 1250-1190; 20 1100-950; 845; 810; 720 (nujoli).

C) ^H-NMR-spektrissä, joka on kuviossa 3, esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitynä 270 MHz DMSO dg : ssa (heksadeuterodimetyylisulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm)(S = ppm): 25 8o,86 (tripletit, 6H); 1,21 ('v-IIH); 1,43 (2H); 2,01 (2H); 2,31-2,34 (3H) ; 4-6,2 (^16H); 6,2-8 (~23H); 8,44, 9,22, 9,66 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2,5-4: häiriö H^O-piikeistä.

23 81 1 1 7 D) retentioaika (R^) 1,12 verrattuna teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 (R^. = 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faasi-HPLC:llä seuraavissa oloissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 5 4,6 mm (si sähalkai sija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti A: CH3CN 10%) säädetty pH- (2,5 g/1) NaH^PO^.^O 90%_3 -arvoon 6,0 eluentti B: CH^CN 70¾) säädetty pH- 10 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%) -arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti, jossa 5 prosentista 60 prosenttiin eluentti B eluentissa A, 40 minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min 15 UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.)

Samoissa oloissa retentioaika verrattuna testosteroniin (Roussel Uclaf) on 0,60.

20 E) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inerttiatmosfääri ssä (Aw 4,6%), antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 55,82 %; vetyä 5,17 %; typpeä 6,31 %; klooria (ko-25 konais) 4,24 %; klooria (ioneja) 0,37 %. Epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 1,2 %.

24 81117 F) happo-emäs-titrausprofii1i 2-metoksietanolissa (MCS):vesi, 4:1, K0H:lla titraamisen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin HCL:ää, osoittaa neljä ionisoituvaa funktiota, joilla on seuraavat pk^^-arvot: 4,6; 5,6; 5 7,2 ja 9,2.

G) R^-arvo on 0,24 ja R^-arvo suhteessa teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 on 0,70 seuraavassa kromatografiasys- t e e m i s s ä : 5 % (paino/til.) vesipitoista Na2^0^ 70 10 asetonitriil iä 30 käytetään silanoituja pi i happogeel i-60 ^54 Merck-1evyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo 15 - keltainen väri Pauly-reagenssil1 a, t.s. diatsotoidulla sul f ani 1 i i n i hapol 1 a (J. Chromatog. JM), 1 71 ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografiässä käytetään B.subtilis ATCC 6633 Davisin minimialustalla.

20 H) molekyylipaino noin 1716 arvioitu FAB-MS-spektristä, jossa M+H © -piikki 1717.

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN B FYSIKOKEMIALLISET TUNNUSMERKIT

A) uitraviolettiabsorptiospektrissä , joka on esitetty 25 liitteenä olevien piirustusten kuviossa 4, esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: 25 81 1 1 7 X maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 300 (olka) 5 c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 300 (olka) e) metanoli 282 10 B) infrapuna-absorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 5, on seuraavat absorp-ti omaksimi t (cm"^): 3700-3080, 3080-2700 (nujoli); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 15 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujoli).

C) ^H-NMR-spektrissä , joka on esitetty kuviossa 6, esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppmrssä) rekisteröitäessä ^H-NMR-spektri 270 MHz DMSO dgissa (heksadeuterodimetyyli-sulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm) , 20 (& = ppm): bo,85 (d, isopropyylin CH ^: t) ; 1,15 (<\,13H); 1,44 (<ν2Η); 2,02 (2H) ; 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 (rv 16H); 6,1-8 (^23H); 8,52, 9,30, 9,68 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2,5-4 häiriö H^O-piikeistä .

25 D) retentioajat (R^.) 1,22 ja 1,27 verrattuna teikopla-niinin A2 komponenttiin 2 (R^ = 20,3 min), analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:llä seuraavissa oloissa: 26 81 1 1 7 kolonni: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisäha1 kaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti A: CH^CN 10%^ säädetty pH- 5 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 9 0 % J -arvoon 6,0 eluentti B: CH^CN 70%) säädetty pH - (2,5 g/1) NaH^PO^.H^O 30%j -arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti eluenttia B 5 prosen tista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 mi-10 nuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A^ komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A,) 15 E) a 1kuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inerttiatmosfäärissä (A w 9,6%), antaa seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 54,09 %; vetyä 5,13 %; typpeä 6,34 %, klooria (ko-20 konais) 4,12 %; klooria (ioneja) 0,39 %. Epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 5 %.

F) happo-emäs-titrausprofii1i 2-metoksietanolissa (MC$):vesi 4:1, KOH:lla titraamisen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin HCl:ää (pH 2,7), osoittaa neljää ionisoituvaa 25 funktiota, joilla on seuraavat pk^^-arvot: 4,5; 5,6; 7,2 ja 9,2.

27 81 1 1 7 G) R^-arvo 0,21 ja Rf-arvo suhteessa tei kopl ani i n i n komponenttiin 2 on 0,53, seuraavassa kromatografiasys-teemi ssä: 5 % (paino/til.) vesipitoista Na2S04 70 5 asetonitriiliä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 F254 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-vai o 10 - keltainen väri Pauly-reagenssilla, t.s. diatsotoidulla sul fani 1 i i ni hapol 1 a (J. Chromatog. 2_0, 1 7 1 ( 1 965), Z. Physiol. Chem. 292^, 99 ( 1 953)) - bioautografiassa käytetään B.subtilis ATCC 6633 Davisin mi nimi ai ustai 1 a.

15 H) molekyylipaino noin 1730 pääteltynä FAB-MS-spektris-tä, jossa M+H®-piikki 1731.

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN BQ FYSIKOKEMIALLISET TUNNUSMERKIT

A) uitraviolettiabsorptiospektrissä , joka on esitetty 20 liitteenä olevien piirustusten kuviossa 4, esiintyy seu-raavat absorptiomaksimit: X maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 25 300 (olka) c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 28 81 1 1 7 d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 300 (olka) e) metanoli 282 B) infrapuna-absorptiospektrissä, joka on esitetty liit-5 teenä olevien piirustusten kuviossa 5, on seuraavat absorp-ti omaks imit: 3700-3080, 3080-2700 (nujoli); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujoli).

10 C) 1H-NMR-spektrissä, joka on esitetty kuviossa 6, esiin tyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitäessä ^H-NMR-spektri 270 MHz, DMSO dgissa (heksadeuterodimetyyli-sulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), ( δ = ppm): 15 ^>0,85 (d, isopropyylin CH3: t) ; 1,15 (~13H); 1,44 (^2H); 2,02 (2H) ; 2,32-2,35 ( 3H); 4-6,1 («x>16H); 6,1-8 (~23H); 8,52, 9,30, 9,68 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2,5-4 häiriö H^O-piikeistä.

20 D) retentioaika (R^.) 1,22 verrattuna tei kopl ani inin A2 komponettiin 2 (R^ = 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faasi-HPLC:1lä seuraavissa oloissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 /im) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm 25 esi koi onni : Brownlee Labs RP 18 (5 /im) eluentti A: CH3CN 10 %} säädetty pH- (2,5 g/l) NaH2P04.H20 90 %J -arvoon 6,0 eluentti B: CH3CN 70 säädetty pH- (2,5 g/l) NaH2P04.H20 30 %_\ -arvoon 6,0 29 8 1 1 1 7 eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B 5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min 5 UV-detektori : 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 140°C:ssa i nertti kaasuatmosf äär i ssä (Aw 9,6%), 10 antaa tulokseksi seuraavan, likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 54,09 %; vetyä 5,13 %; typpeä 6,34 %; klooria (kokonais) 4,12 %; klooria (ioneja) 0,39 %. Epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 5 %.

15 F) happo-emäs-titrausprofii1i 2 metoksietanolissa (MCS):vesi 4:1, Κ0Η:11a titrauksen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin H C1:ä ä , osoittaa neljä ionisoituvaa funktiota, joilla on seuraavat pk^^-arvot 4,5; 5,6; 7,2 ja 9,2.

G) R^.-arvo 0,21 ja R^-arvo suhteessa tei kopl an i i n i n A2 20 komponenttiin 2 on 0,53 seuraavassa kromatografiasystee-mi s sä: 5 % (paino/til.) vesipitoista Na^O^ 70 asetoni tri i1iä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 F^^Merck-1evyjä 25 (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: 30 81 1 1 7 - UV-valo - keltainen väri Pauly-reagenssilla, t.s. diatsotoidulla sul fani 1 i i n i hapoll a (J. Chromatog. 2j), 1 71 ( 1 965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953))

5 - bioautografiässä käytetään kantaa B.subtil is ATCC

6633 Davisin minimialustal1 a.

H) molekyylipaino noin 1730 arvioituna FAB-MS-spekt-ristä, jossa M+H ® -piikki 1731.

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PA FYSIKOKEMIALLISET TUNNUS-10 MERKIT

A) ui travioi ettiabsorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 7, esiintyy seu-raavat absorptiomaksimit: A maks (nm) 15 a) 0,1 N HC1 282 b) 0,1 N kaiiumhydroksidi 300 c) fosfaattipuskuri pH 7,38 282 300 (olka) d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 20 300 (olka) B) infrapuna-absorptiospektrissä , joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 8, esiintyy seuraavat absorptioma k s imit (cm~^): 3700-3100; 3000-2800 (nujoli); 1760-1710; 1655; 1620-1550; 25 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1260, 1250-950; 845; 805; 720 (nujoli).

31 81117 C) ^H-NMR-spektrissä, joka on esitetty kuviossa 9, esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppmrssä) rekisteröitäessä ^H-NMR spektri 270 MHz DMSO d^issa (heksadeutero-dimetyylisulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), 5 ( £> = ppm): 0,86, d:t (CH3); 1,15-1,22, m (CH2 ) n ; 1,41, m (CH2); 2,01, s (CH3); 2,01, m (CHg); 2,28, s (N-CH3); 4,26-5,96, br (peptidiset ja aromaattiset CH:t); 6,33-7,73 br (aromaattiset CH:t ja peptidiset NH:t).

10 br = leveä d = dubletti dd = doublet in dubletti m = multipletti s = singletti 15 t = tri pietti D) retentioaika (R^) 1,15 verrattuna teikoplaniinin komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min) analysoitaessa käänteis- faasi-HPLC:11ä seuraavissa oloissa: kolonni: Ultrasphere 0DS (5 pm) Altex (Beckmari 20 4,6 mm (sisäha1 kaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti A: CH3CN 10% 1 säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J -arvoo 6,0 eluentti B: CH3CN 70%Ί säädettynä pH- 25 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%) -arvoon 6,0

eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B

5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm 32 8 1 1 1 7 sisäinen standardi: teikoplaniinin komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) Rf-arvo verrattuna teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 on 0,62 seuraavassa kromatografiasysteemissä: 5 5 % (paino/til.) vesipitoista Na^O^ 70 asetonitri i1iä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 F25^Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: 10 - UV-valo - keltainen väri Pauly-reagenssilla, t.s. diatsotoidulla sul fani 1 i ini hapol 1 a (0. Chromatog. ^J0 , 1 71 ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografiässä käytetään kantaa B.subtilis ATCC 6633 15 Davisin mi nimialus tai 1 a.

F) molekyy1ipaino 1 758 arvioituna FAB-MS-spektristä , jossa esiintyy piikkiryhmittymä, jonka intensiivisin piikki on 1761. FAB-MS-analyysin operatiiviset olosuhteet olivat seuraavat: 20 laite: VG Mod ZAB SE varustettuna FAB ruiskutus- ionitekni i kai 1 a olosuhteet: positiivinen FAB, Xe kiihdytysjännite 8 kV matri isi:tioglyseoroli-glyseroli 1/1 (t i 1 . /1 i 1 .) 33 8 1 1 1 7

ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PB FYSIKOKEMIALLISET TUNNUSMERKIT

A) uitraviolettiabsorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 10, esiintyy seu- 5 raavat absorptioina k s imi t: X ma ks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) 0,1 N kaiiumhydroksidi 300 c) fosfaattipuskuri pH 7,38 282 10 300 (olka) d) fosfaattipuskuri pH 9,0 282 300 (olka) B) infrapuna-absorptiospektrissä, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 11, esiintyy seuraa- _ 1 15 vat absorptiomaksimit (cm ): 3700-3100, 3000-2800 (nujoli); 1760-1710; 1655; 1620-1560; 1605; 1480-1420 (nujoli); 1375 (nujoli); 1320-1270; 1320--1270; 1230-1190; 1150, 1120-920; 845; 810; 720 (nujoli) C.1) H-NMR-spektrissä, joka on esitetty kuviossa 12, 20 esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz DMSO dgissa (heksadeuterodimetyylisulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm), ( S = ppm) multiplisiteetti ; (omi-nai suus): 0,84, d (isopropyyli CH^:t); 1,17, m (CH2)n; 1’43, m (CH2)» 25 1 ,99, s (CH3); 2,01, m (CH2) ; 2,31, s (N-CH3); 2,79, dd (C-H); 3,70, m (C-H); 4,06-6,02, br (peptidiset ja aromaattiset CH:t); 6,45-7,74, br (aromaattiset CH:t ja peptidiset N H : t) ; 8,19-9,99, br (peptidiset NH:t ja fenoliset OH : t) 34 81 1 1 7 C.2) ^H-NMR-spektrissä, joka on esitetty kuviossa 13, esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppmrssä) 270 MHz, spektri rekisteröity seoksessa DMSO dg + CF^COOD, sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm)(S = ppm) multiplisi-5 teetti ; (ominaisuus): 0,84, d (i sopropyyl i n CH3: t) ; 1,13, m (c H 2) n i 1»40> m (CH2); 1,98, s (CH3); 2,00, m (CH2) ; 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sokerin C-H:t); 4,07-6,09, s ja m (peptidiset ja aromaattiset CH: t); 6,45-7,83 , s ja m (aromaattiset CH:t ja 10 peptidiset NH:t); 8,17-10,38 (peptidiset NH:t, fenoliset 0 H : t) D) retentioajat (R^) 1,27 ja 1,32 verrattuna teiko-planiinin komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:11ä seuraavissa oloissa: 15 kolonni: Ultrasphere ODS (5 /im) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 ym) eluentti A: CH3CN 10%^ säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P0^.H20 90%J -arvoon 6,0 20 eluentti B: CHjCN 70%Ί säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30% J -arvoon 6,0

eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B

5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 minuuttia 25 virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.)

J

35 81 1 1 7 E) R^-arvo verrattuna teikoplaniinin komponenttiin 2 on 0,53 seuraavassa kromatografiasysteemissä: 5 % (paino/til.) vesipitoista Na^SO^ 70 asetoni trii1iä 30 5 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 FMerck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo - keltainen väri Pauly-reagenssilla, t.s. diatsotoidulla 10 sul f ani 1 i i ni hapol 1 a (J. Chromatog. 20^, 1 71 , ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografiassa käytetään kantaa B.subtilis ATCC 6633 Davisin mi nimi ai us tai 1 a F) molekyylipaino noin 1772 arvioituna FAB-MS-spektris-15 tä, jossa piikkiryhmä, jonka intensiivisin piikki 1776.

FAB-MS-analyysin operatiiviset olosuhteet olivat seuraavat: laite: VG Mod ZAB SE varustettuna FAB ruiskutus- ioni tekni ikai 1 a olosuhteet: positiivinen FAB, Xe kiihdytysjännite 8 kV matriisi: tioglyseroli-glyseroli 1/1 (til./til .) 36 8 1 1 1 7

Keksinnön mukaisten yhdisteiden anti bakteerinen aktiivisuus voidaan todeta in vitro standardilaimennustestien avulla erilaisilla mikro-organismiviljelmillä.

Viljelyalustat ja kasvuolot MIC-arvojen (minimaalinen in-5 hibiitio-konsentraatio) määrityksille olivat seuraavat:

Isosensitesti-kasvuliemi (Oxoid), 24 h, stafylokokit,

Strep . faecal is ja gram-negatiiviset bakteerit (Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus);

Todd-Hewit-kasvuliemi (Difco), 24 h, muut streptokokki 1 ajit; 10 GC-peruskasvuliemi (Difco) + 1 % Isovitalex (BBL), 48 h, CC^-rikastettu atmosfääri, Neisseria gonorrhoeae; GB-perusagar (Difco) + 1 % Isovitalex + 0,001 % hemiiniä, 24 h, Haemophilus influenzae; AC-kasvuliemi (Difco), 24 h, anaerobinen atmosfääri, 15 Clostridium perfringens;

Wilkins-Chalgren-agar (viit. T.D. Wilkins & S. Chalgren, 1 976 , Antimicrob. Ag. Chemother, J_0 , 926), 48 h, anaerobinen atmosfääri, muut anaerobit (C.diffici1 e , Propioni-bacterium acnes, Bacteroides fragilis); 20 PPLO-kasvuliemi (Difco) + 10 % hevosen seerumia + 1 % glukoosia, 48 h, Mycoplasma ga11isepticum ;

Hiiva-typpi-peruskasvuliemi (Difco), 24 h, Candida albicans.

Lukuunottamatta kantaa C.albicans (30°C) inkubointi tapahtui 37°C:ssa . Ymppäykset olivat seuraavat: M.gal 1isepticum 25 1 % (til./til.) 48 tunnin kasvuliemiviljelmää ; muut kasvu- 4 5 1iemi 1aimennus MIC-kokeet noin 10 -10 kolonnia muodostavaa yksikköä/ml; agar-1aimennus-MIC-kokeet (H.inf1uenzae , 4 5 C.difficile, P.acnes, B.fragilis) noin 10 -10 bakteeria/ täplä (ymppättäessä monipiste ymppäyslaitteella).

37 8 1 1 1 7

CD

CL. ----- :<o ε co

*·™>\ LO CO LO CO O CO CO

•»“CT O O O *— O *— CD

3. "

<D —' «— CVJ^OOOOOOCDOJ

H— ^ o

►—I

Σ c ^ Q.

O

IfO ·*- 00

LO *»-> -M LO LO LO LO O LO CO

C\Jm— ro LO O O O O CD C\J O

CT» Π3 Λ O CU S- OCM^CDCDOOOOO^

«d* H- «M

c c o> en ·»- e

+-> CD O

+->

O :<Ö CO CO LO LO

0,ro:fQ COCOCO LO LO co *— CO τ—

·»“ ·!— > *— ·«— <r— OO^—O^—OIO

05 :rO * * * ******* •f- O) -4-> ooo o o o o o o o +-> I— to

e <D

> < *—» e *r~ o e

^ C OJ

^ T-

ID :<T3 CL CO CO LO

_I ·«—> CO CO LO LO LO CO «— LO CO

O -Γ- *— <— CM O O <— O CVJ O

^ ^ i\ fi #1 **>*#*#«* I— <U CD CD CD CD O CD CZ> CD CD ·>— I— o i— i— 10

EE

3 3 E

H— H— •ίου-—' i— • o to oo to co —- O O CM ·!- «o- -— '— cm LO en cm cd oo eri -—''-'«—e cd co to en tn Ln ·γ- co eri

CO CO CO <_> i— CD O0 CTl_J

co 1— 1— <_> υ «— oo o -- tn _j _j i— — cr i—i o <ri ai

to — '— e co o o H- CO (O

to CD ZD C_) to <c <D

o S- S- to en cm l— e oo

O 3 3 ·Ι— Γ'' O O) <t Φ OJ O -E

I— O O TD (O en I— h- E

<=C I— I— -r- | to -r- CO e -f- «C E

E ai e -r- -I— υ o tOlOtOJ-lOCOl— S- -I- O) e 3330)·ι-α)Επ3Μ_^ΕΟ a)<ua>T3-Mcn3os-ii-ocn e i- e ·ι- -Γ- o a> <u a> -1- <o

333Q.E>tC(0Q.-O (O

io ra ia ai o. ex 4_ · —

• · · E E

ίο · · · · +j · . . e e o ai

•M _E -E _E -E CX CL O. O. +> -M ·— CO

e a.cxa.cxaiaiaia)totocxto «O fOrOrOrOEEEEOOO··-

DrC 4J+J+J+J+J4J+J+J,— ,— E OI

ooooooooooooooooc-iocxzr 38 81 1 1 7 co O- :*3 li ·ι-α> ^ co co co ^

VO OJ OsJ CM VO VO

h- ^ /\ /\ /\ o

I—I

3Ξ < —'

Cl.

o .’(O -<- co ·>-> -*-> CM -r- ro <3- CO CO CO 00

ΟΊ rö CO CM CM CM CO CM

o m e *—*—*— »— h- -t-> /\ /n /n e < cu tn

i—l E

I— CO o

'—' I— -E

• o :<o -e o ό :<o -*-> ·—!··-> <t 00 CO CO "i M ^

(O CO :r0 CO C\J CM CNJ CO CM LO

·—> i—i ai +-> «-*-<— ·«—

^ l— l·— CO /\ /N /N /N

z a> > < ·—I e

O E

^ <c a> ^ τ- ιο :ra o.

—1 TO

=> ·<- "51-oooooo^j-oo^a·

<C -Si CO CM CM CM CO CM CO

(— ai «- -r- τη- /\ /\ /N /\ ai oo en en *- «5* Ό *0" "Γ— LO ·>— CD «— CD e *—oo *— r~- xi oo ro >, o o cm cu O O O O 3 I— o «a- I— CJ o

<C I— ·>— C cj i''. E

<C CM I— CNJ 3 ai *— (ö <c cm υ fO 0C (/I *r- INI CD Lj_ O tn Li_ 4-> E -— IxC E -r- iti Q.

ai x en -Γ- i— </) ai

03 en -r- UI

i— co v— 3 en tn t- 4- -r- r— E (O Er— EEOOIEtOt— ·<- re <j co 4- υ «3 en ·γ— en tn i— to tn tn xi 3 3 ·γ— ta cu >— <o

I— > -E E Ό <0 E

<- υ o -Γ- tn .e en -I- e o «o <b to CL 3 E O E "O i— +-> o ai ai το οι -Γ- o.

e E -*-> x: 3 +-> -o o to aiooaiuEtj ro E in LO fO to >>

n: CL· UJ CL CO o S

39 81117

-P

•r- ^}-

C CM C\J CM 00 U5 CVJ I

•r- CO CO CM *— CO 3 •I— ^ tO CD /\ r—

>» CO fO

E Σ O ^

C

•r- ^ cn +-> -P ** co cd cu to to to co to cm cn

‘ CL — *— *— *— CM *— CO

C GO *— fT3 •r- O /\ 00 _C >—( 00 -- s: o 0 ··”>

-P

C * ΙΟ o j*: *i—

1 -I- -P

CU to rd <T3 Π3 <U <U S- O ί— «Ρ

-C CL C

£~ E CU ·“

i- O <—" 00 -P

o +-> c -p C <3- uo o c O tO CM ** ^ CO ·!-

CD CM —" O CVJ CM CM -P -P

I> CT> C 00 P

. O O T- ·«“ C

O Z rj- CQ 00 1/) (O

2: -Γ- cu -p ^ to <C co £- to ID 3 -C «- _J +-> ·«- ^ i— I to

ID 3 4-> -P rO **—* -r- CU

C .p CO —' CO C S-

I— ·γ- O O0 -Γ- I

rd O — V CM CM *“ CM O 00 *r- *r-

> T- *r- fO tO C

JD <_) -P *«-D >> T- c ·»- »—« (Ο (Ο Ξ ·-— CU +> 2l «3 O r— c c :ro c r- •f— <£ +J 00 ‘r— *r- "O c to -P to •r- O 0> >> J* ·*"

VO ·ι- to -P CU C

•r- +-> C <U Q. CU

S- ro O 4-> to CL

<U rO *r- P £- tO #, r> «*-> C CU >*>>» >» rd C 0) 4-> 4-> +-> CO CU C Qj p p +-> to ·!- cu cu <u <u

C *Ό r— P P P

O ·»— O 00 00 00 (/) 13 -ί— ·!— T-

<0 ·-“ ^ L L L

p :«o s- <u o> cu c > <u :ro »o ^ :ro P P ·»-··- *r- ^ ο p j*r to p p p ί c\j to rd qj oo to to

CU 00 <UJD00CU<D<U

ro to j*: to to to CU C C >> ·ρ- ·»- -Ι Ο O *r- ·Γ- :rt5 c c c JC I— * * C C Q_.r--.-T- £- O * * * CU CU Q. »r- ·!— T- S- **^^c** ·,— *»— ε »— <— ·—

O Q. Q. >) JC JC JC

c ^ r-· to to

O O O O CD Ο Ο II II II II II

CD O O CD LO VO tO

<r- OO *K

« ►—I CO * * z: _I _i _I _I _I _ί Σ Σ * -K + 40 8 1 1 1 7

Keksinnön mukaisten yhdisteiden antimikrobinen aktiivisuus todettiin myös in vivo-kokei11 a, jotka suoritettiin pääasiallisesti kuten R.Pallanza et ai ovat esittäneet julkaisussa J. Antimicrob. Chemother. JJ_, 419 (1983).

5 Kokeellinen infektio aiheutettiin hiirille annostamalla intraperitoneaalisesti S.pyogenes C 203 kannan suspensiota. Ymppäys oli laskettu siten, että käsittelemättömät eläimet kuolivat verenmyrkytykseen 48 tunnin sisällä.

Eläimet käsiteltiin subkutaanisesti testattavalla yhdis-10 teellä noin 30 minuuttia infektoinnin jälkeen.

ED5Q-arvo laskettiin 10. päivänä menetelmällä, jonka ovat esittäneet Spearman ja Karber (D.J. Finney "Statistical Methods in Biological Assay", Griffin, sivu 524, 1952) perustuen elossa olevien hiirten prosentuaaliseen määrään 15 jokaisella annoksella. Edellä esitetyissä oloissa ED^- -arvo antibiootille A 40926 tekijä A oli 0,47 mg/kg, antibiootille A 40926 tekijä B 0,33 mg/kg, antibiootille A 40926 tekijä PA ED5Q oli 0,54 mg/kg ja antibiootille A 40926 tekijä PB 0,31 mg/kg.

20 Likimääräinen akuuttimyrkyl1 isyys hiirillä (i.p.) arvioitiin tunnettujen menetelmien mukaisesti. Antibiootin A 40926 likimääräisen LD,-Q-arvon havaittiin hiirillä olevan yli 100 mg/kg, annostettaessa subkutaanisesti .

Antibiootti A 40926 kompleksi ja sen tekijät A, B, Bq, 25 PA ja PB ovat aktiivisia gram-positiivisia bakteereita vastaan, jotka aiheuttavat monia laajalti levinneitä infektioita. Koska näiden patogeenien resistenssi tavallisesti käytettyjä terapeuttisia hoitomenetelmiä vastaan on lisääntynyt, uusien antibioottien tarve on yhä suuri.

30 Kuten jo edellä esitettiin, keksinnön mukaiset antibiootit omaavat hyvän aktiivisuuden Neisseria-kantoja vastaan, kuten kantaa Neisseria gonorrhoeae, kun taas ne käytännöllisesti katsoen ovat inaktiivisia muita gram-negatiivisia 41 81117 kantoja vastaan.

On tunnettua, että tippurin esiintyminen on lisääntynyt tasaisesti viimeisten 15-20 vuoden aikana.

Infektion kontrollointi on nykyään vaivalloista, koska 5 esiintyy paljon uudelleen infektoituneita, mikä johtuu myös infektoituneiden yksilöiden käyttäytymisestä, jotka eivät tarpeeksi huolehdi siitä, että tauti ei leviä koko aikana, jonka infektio kestää. Toisaalta, taudin aiheuttaman organismin resistenssi tavallisesti käytettyjä anti-10 biootteja vastaan on lisääntynyt niin, että antibioottien uudet yhdistelmät ja pidemmät hoitoajat ovat tulleet välttämättömiksi. Sen vuoksi on enenevässä määrin tarvetta uusista antibiooteista, jotka saattavat olla tehokkaita hoidettaessa gonokokkisia infektioita ja erityisesti 15 Neisseria gonorrhoeae-infektioita, rajoitetulla määrällä annostuksia tai jopa yhdellä ainoalla annoksella.

Yleensä anti bakteerisessa hoidossa antibioottia A 40926 kompleksia, yhtä sen tekijöistä A, B, BQ, PA ja PB sekä näiden myrkyttömiä, farmaseuttisesti hyväksyttäviä suolo-20 ja tai niiden seoksia voidaan annostaa eri tavoin, kuten topikaalisesti tai parenteraalisesti. Parenteraalinen annostus on yleensä edullinen annostamistapa.

Injektoitavat koostumukset voivat olla suspensioita, liuoksia tai emulsioita öljymäisissä tai vesipitoisissa kanto-25 aineissa ja ne voivat sisältää apuaineita, kuten suspendoi-via, stabiloivia ja/tai hajottavia aineita.

Vaihtoehtoisesti aktiiviaine voi olla jauhemaisena, jolloin se rekonstruoidaan annostettaessa, kun siihen lisätään sopiva kantoaine, kuten steriili vesi.

30 Riippuen annostamistavasta, nämä yhdisteet voidaan valmistaa erilaisina annosmuotoina.

42 81 1 1 7

Joissain tapauksissa voi olla mahdollista valmistaa keksinnön mukaiset yhdisteet enteropääl1ys teisinä annosmuo-toina oraaliseen annostukseen, jolloin nämä voidaan valmistaa tunnetulla tavalla (kts. esimerkiksi "Remington's 5 Pharmaceutical Sciences", 15. Edition, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania USA, sivu 1614).

Tämä voisi tulla kysymykseen nimenomaan silloin, kun toivotaan erityisesti antimikrobisen aineen absorption tapahtuvan suolistossa samalla kun niiden toivotaan ohitta-10 van maha-alueen muuttumattomina.

Annostettavan aktiiviaineen määrä riippuu erilaisista tekijöistä, kuten potilaan koosta ja olotilasta, annostustavasta ja -tiheydestä ja taudin aiheuttajasta.

Tämän keksinnön mukaiset antibiootti A 40926 kompleksi, 15 sen tekijät A, PA, B, Bq ja PB ja näiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat ovat yleensä tehokkaita päivittäisen annoksen ollessa noin 0,5 - 50 mg aktiiviainetta per kilo potilaan ruumiinpainoa, mahdollisesti jaettuna 1-4 annokseen per päivä.

20 Erityisen toivottuja koostumuksia ovat sellaiset, jotka valmistetaan annosyksikköinä ja jotka sisältävät noin 100 - noin 5000 mg per yksikkö.

Kuitenkin käytettäessä tippurin hoitoon yhtä ainoaa annosta, tulisi käyttää antibiootin A 40926 kompleksin, sen te-25 kijöiden A, PA, B, Bq tai PB korkeampia minimiannoksia, tavallisesti noin 0,5 - 50 mg/kg, jotta lääkeaineen tehokas pitoisuus pystytään säilyttämään veressä pidennetyn ajan.

Lisäksi hoidettaessa tippuria on edullista käyttää jatkuva-vaikutteista, parenteraalista annosmuotoa. Jatkuvavaikut-30 teiset valmisteet voidaan valmistaa erilaisten mekanismien ja menetelmien mukaisesti, kuten on tunnettua.

43 81 1 1 7

Antibioottia A 40926 kompleksia, sen tekijöitä A, B, Bq, PA ja PB sisältävän jatkuvavaikutteisen valmistuksen eräässä edullisessa menetelmässä käytetään tämän antibiootin veteen liukenematonta muotoa suspendoituna vesipitoiseen 5 tai öljymäiseen väliaineeseen.

Nämä muodot, t.s. joko liukenemattomat suolat tai vapaat hapot, itse asiassa vapautuvat hyvin hitaasti lihaksensisäisen injektion jälkeen, johtuen niiden alhaisesta vesiliukoisuudesta, jolloin ne aikaansaavat antibiootin jatku-10 van pitoisuuden veressä.

FARMASEUTTISTEN KOOSTUMUSTEN VALMISTUS

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmistetaan siten, että 5 ml steriiliä suspensiota USP sisältää 8 % propyleeniglykolia ja 1 000 mg antibioottia A 40926 15 tekijää A.

Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmiste taan siten, että 5 ml steriiliä suspensiota USP sisältää 8 % propyleeniglykolia ja 500 mg antibioottia A 40926 tekijää B.

20 Yksikköannosmuoto lihaksensisäiseen injektioon valmiste taan suspendoimalla 2 000 mg antibiootin A 40926 tekijän B natriumsuolaa 5 ml:aan steriiliä vettä injektiota varten .

44 81117

Lisäksi keksinnön mukaiset antibiootit ovat käyttökelpoi-sia ehkäisten Clostridium diffici1e-kannan kasvun, joka aiheuttaa kalvoi sen paksunsuolentulehduksen suolistossa. Antibioottia voitaisiin käyttää hoidettaessa kalvoista 5 paksunsuolentulehdusta annostamalla tehokas määrä antibioottia tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa valmistettuna farmaseuttisesti hyväksyttävään annosmuo-toon. Tällaisessa käytössä antibioottia voidaan annostaa gelatiini kapseleissa tai nes temäisessä suspensiossa.

10 Paitsi, että keksinnön mukaiset yhdisteet ovat aktiivisia lääkkeinä, niitä voidaan käyttää eläinten kasvua edistävinä aineina.

Tätä tarkoitusta varten yhtä tai useampaa keksinnön mukaista yhdistettä annostetaan oraalisesti sopivassa ravinto-15 aineessa. Tarkka käyttökonsentraatio on sellainen, joka on tarpeen kasvun edistämiseksi tehokkaasti käytettäessä normaaleja määriä ravintoa.

Keksinnön mukaisten aktiiviaineiden lisääminen eläinten ravintoon suoritetaan mieluimmin valmistamalla sopiva 20 ennalta sekoitettu ravinto, joka sisältää aktiiviset yhdis teet tehokkaassa määrässä, ja tämä ennalta valmistettu ravinto yhdistetään valmiiseen päivän ravintoannokseen.

Vaihtoehtoisesti välituote konsentroituna tai ravintoväli-aine, joka sisältää aktiiviset aineosat, voidaan sekoittaa 25 ravintoon.

Tapa, jolla tällaiset ravintoseokset ja valmiit päivän ravintoannokset voidaan valmistaa ja annostaa, on kuvattu viitekirjoissa (kuten "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., S. Francisco, USA, 1969 tai "Livestock 30 Feeds and Feeding" 0 and B Books, Corvallis, Oregon, USA 1977) ja liitetään tähän selitykseen viitteinä.

Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä ja sellaisena niiden tarkoitus ei ole rajoittaa keksinnön piiriä.

« 81117

ESIMERKKI 1: KANNAN ACTINOMADURA sp. ATCC 39727 KÄYMINEN

Antibioottia A 40926 tuottavan kannan (Actinomadura sp. ATCC 39727) viljelmää kasvatetaan kaurajauhoagarvinopin-nalla 2-3 viikkoa 28°C:ssa ja käytetään ympättäessä 500 5 ml:n erlenmayer-pullo, joka sisältää 100 ml viljelyalus-taa, jonka koostumus on 0,5 % lihauutetta, 0,5 % autoly-soitua hiivaa, 0,5 % peptonia, 0,3 % hydrolysoitua kaseiinia, 2 % glukoosia, 0,15 % NaCl (pH 7,5 ennen sterilointia).

10 Pulloa inkuboidaan 28°C:ssa pyöröravistelijassa 200 kierr. /min noin 72 tuntia, jonka jälkeen viljelmä siirretään käymisastiaan, joka sisältää 4 litraa edellä mainittua vi1jelyalustaa. Tätä viljelmää kasvatetaan 28°C:ssa noin 72 tuntia, ilmastuksen ollessa noin kaksi litraa per mi-15 nuutti, ja hämmentäen noin 900 kierr./min. Sen jälkeen sitä käytetään ympättäessä 200 litran käymisastia, joka sisältää samaa vi1jelyalustaa. Tätä käymisastiaa ilmastetaan 100 litraa per minuutti, käytetään steriiliä ilmaa, ja hämmennetään 250 kierr./min noin 28°C:ssa. Anti-20 biootti tuotantoa tarkkaillaan paperi-kiekko-agardiffuu-siomenetelmä 11ä, käyttäen testiorganismina B . subti1is 1 ta minimialustalla. Maksimaalinen aktiivisuus saavutetaan 72-96 tunnin kuluttua.

ESIMERKKI 2: ANTIBIOOTIN A 40926 TALTEENOTTAMINEN

25 A) Käymisliemi jäähdytetään 4°C:seen, pH säädetään arvoon 9,5 ja hämmennetään. Noin 1 tunnin kuluttua suodatetaan ja suodoksen pH säädetään arvoon noin 3,5 käyttäen vesipitoista mineraalihappoa. Seosta hämmennetään 30 minuuttia 4°C:ssa, jonka jälkeen se suodatetaan käyttäen 30 mukana suodatusapuainetta (Hyf1o-FloMa ® ). Kirkas suodos hylätään ja suodatuskakku suspendoidaan deionisoituun veteen, pH säädetään arvoon noin 8,5, hämmennetään, jonka jälkeen suodatetaan. Saadulle suodatuskakul1 e suoritetaan sama menetelmä toistamiseen. Yhdistetyt suodokset sisä!- 46 81 1 1 7 tävät antibiootin A 40926.

B) Turvotettu D-Ala-D-Ala-£ -aminokaproyyli-Sepharose modifioitu matriisi (2 1) lisätään käymisliemeen, joka saadaan esimerkin 1 mukaisesti (sen jälkeen kun on suoda-5 tettu ja kirkkaan suodoksen pH on säädettu arvoon noin 8,5), tai yhdistettyyn suodokseen, joka saadaan edellä esitetyn esimerkin 2 A) mukaisesti. Hämmennetään yön yli huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen hartsi otetaan talteen suodattamalla ja pestään peräkkäin noin 2 x 10 litralla 10 0,45 mM HC1-tris-puskuria , jonka pH on 7,5 (tris = 2- -amino-2-hydroksimetyyli-1 ,3-propaanidioli) ja joka sisältää 5 % (paino/til.) natriumklori di a , jonka jälkeen pestään tislatulla vedellä (4 x 20 1).

Antibiootti A 40926 eluoidaan hartsista 1-prosentti sei 1 a 15 (paino/til.) ammoniumhydraati11 a (2 x 20 1). Eluaatit jä-jätetään huoneen lämpötilaan yön yli, jonka jälkeen konsentroidaan pieneen tilavuuteen (noin 2,5 litraa). Vesi poistetaan tislaamalla atseotrooppisesti n-butanolin kanssa. Sen jälkeen lisätään petrolieetteriä , jolloin saostuu 20 3,4 g raakaa antibioottia A 40926 kompleksia.

ESIMERKKI 3: ANTIBIOOTIN A 40926 KOMPLEKSIN AB PUHDISTUS

Raaka antibiootti A 40926 kompleksi, joka saadaan pääasiassa edellä esitetyn esimerkin 2 menetelmän mukaisesti, ( 750 mg; HPLC-tiitteri 70 %) , liuotetaan 400 ml :aan vettä, 25 pH säädetään arvoon 7,5, ja liuos suodatetaan. Sen jälkeen suodokselle suoritetaan affiniteettikromatografia D-Ala-D--A1a-£ -aminokaproyyli-Sepharose-pylväässä (50 ml turvonnutta hartsia; täytteen korkeus = 5 cm). Pylväs, joka on tasapainotettu 0 ,16-prosenttisei 1 a (paino/til.) ammonia-30 kiila, joka sisältää 2 M NaCl :ää ja jonka pH on säädetty arvoon 7,5 H C1 :11ä , kehitetään käyttäen peräkkäin seuraa-via, kolmea puskuriliuosta: 47 81117 puskuri A: O ,16-prosenttinen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 M N a C1:ä ä, pH säädetty arvoon 7,5 HClrllä (2,6 pyivästäytteen tilavuutta) ; 5 puskuri B: 0,16-prosenttinen (paino/til.) ammoniakki, joka sisältää 2 M NaCl:ää, pH säädetty arvoon 9,5 HCl:llä (16 pyivästäytteen tilavuutta) ;

puskuri C: 1-prosenttinen vesipitoinen ammoniakki, pH

10 11,4 (2,6 pyivästäytteen tilavuutta).

Puskuri C eluoi antibiootin A 40926 kompleksin AB yhtenä ainoana fraktiona. Tämän eluoidun fraktion pH säädetään arvoon 7,0 ja toistetaan sama affiniteetti pyiväs, puskuroituna 10 mM:lla tris-HCl:ää, pH 7,0. Pylväs pestään tis-15 Tatulla vedellä, kunnes suolan poistuminen on täysin tapahtunut. Sen jälkeen eluoidaan kahdella pyivästäytteen tilavuudella 0,39-prosenttista (paino/til.) vesipitoista ammoniakkia, pH 11,0.

Eluoidut fraktiot konsentroidaan pieneen vesipitoiseen 20 seokseen, jonka jälkeen ne pakastekuiva taan. Saadaan puhdas antibiootti A 40926 kompleksi AB (374 mg).

ESIMERKKI 4: ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÖIDEN A JA B ERISTÄMINEN

A) Antibiootti A 40926 kompleksi, joka saadaan esimer-25 kin 2 mukaisesti (3,3 g), tai antibiootin A 40926 kompleksi AB, joka saadaan esimerkin 3 mukaisesti (2,3 g) suspendoidaan 0,5 litraan vettä, hämmennetään, jonka jälkeen suodatetaan. Kirkas suodos laitetaan silanoituun pii-happogeelipyivääseen (200 g; täytteen korkeus 18 cm; si-30 lanoitua piihappogeeliä 60 g; 70-230 mesh, Merck Inc.), joka on etukäteen tasapainontettu liuoksella A (0,001 M vesipitoinen natrium-EDTA, joka sisältää 0,25 % (paino/ til.) NaH^PO^.H^O:ta ja 2,5 % (paino/til.) N a C1 : ä ä , 48 81 1 1 7 pH säädetty arvoon 6,0 NaOH:lla). Pylväs eluoidaan lineaarisella gradientil1 a , jossa on asetonitriiliä 0 prosentista 40 prosenttiin (til./til.) liuoksessa A, kokonaistilavuus on noin 7 litraa, eluointiaika noin 48 tuntia. Noin 15,5 5 ml:n fraktiot kerätään ja testataan kasvukokeel1 a käyttäen Bacillus subtilis'ta ja analysoidaan HPLC:llä. Fraktiot, joilla on samanlainen antibioottipitoisuus , yhdistetään. Fraktiot numerot 310-330 ja numerot 348-365 sisältävät antibiootit, joita vastaavasti merkitään A 40926 te-10 kijä A ja A 40926 tekijä B.

B) Yhdistetyt fraktiot, jotka sisältävät yksittäiset A 40926 tekijät A ja B, konsentroidaan alennetussa paineessa asetoni trii1in poistamiseksi, laimennetaan vedellä (alkuperäiset liuokset noin kaksinkertaisiksi) ja laitetaan 15 silanoituun piihappogeelipyivääseen , joka on edellä kuvatun tyyppinen (turvonneen matriisin tilavuus 50 ml; täytteen korkeus 15 cm). Pylväs pestään deionisoidul1 a vedellä, kunnes suolan poistuminen on täysin tapahtunut ja lopuksi pylväs kehitetään asetonitrii1i/vedel1ä 60:40 (ti1 ./ 20 ti1. ).

Eluoidut fraktiot konsentroidaan alennetussa paineessa ja jäännökset pakastuskuivataan, saadaan 134 mg antibioottia A 40926 tekijää A eluoitujen fraktioiden ensimmäisestä ryhmästä (edellä esitetyt fraktiot 310-330) ja 206 mg antibioottia 25 A 40926 tekijää B eluoitujen fraktioiden toisesta ryhmästä (edellä mainitut fraktiot 348-365).

49 81 1 1 7

ESIMERKKI 5: ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PA JA TEKIJÄN PB ERISTÄMINEN

Pääasiallisesti esimerkin 2A) menetelmän ja esimerkin 2B) menetelmän ensimmäisten vaiheiden mukaisesti, hartsiin 5 liittynyt antibiootti eluoidaan 1-prosentti sei 1 a (paino/ til.) ammoniumhydraati11 a (2 x 20 1). Eluaattien pH säädetään arvoon 7,8 rikkihapolla ja ne konsentroidaan pieneen tilavuuteen tyhjössä tislaamalla atseotrooppisesti n-buta-nolin kanssa, jolloin saadaan vesipitoinen konsentraatti , 10 joka sen jälkeen suodatetaan paperilla. Saatu suodos sisältää antibiootin A 40926 tekijän PA, antibiootin A 40926 tekijän PB ja pienempiä määriä antibiootteja A 40926 tekijää A ja tekijää B (HPLC). Erä (10 ml) tätä vesipitoista konsentraattia, joka sisältää noin 50 mg/ml puhdasta anti-15 bioottia A 40926 kompleksia (HPLC-analyysin mukaan) suodatetaan suodattimel1 a, jonka huokoskoko on 5 mikrometriä (Acrodisc® ; Gelman Science Inc.), jonka jälkeen se siirretään pylvääseen, joka on ruostumatonta terästä (halkaisija = 2 cm) ja joka sisältää 20 g oktadekyylisi1yyli-20 -käänteisfaasi-piihappogeeliä (Lichrisorb RP 18 Merck

Inc.; hiukkaskoko 10 /jm). Pi i happogeel i pakataan sen jälkeen kohtuullisessa paineessa (nimel1ispaine noin 14 bar) Chromatospac Modulprep-laitteen ruostumattomaan teräsko-lonniin (Yoben Yvon, Ranska) ja tasapainoitetaan seoksel-25 la, joka muodostuu asetoni trii1istä ja 18 mM natriumfos-faattipuskurista, pH 6,0, 25:75 (til./til.). Eluointi suoritetaan käyttäen samaa 1iuotin-seosta, jota käytettiin tasapainoitukseen, virtausnopeus on noin 10,5 ml/min. Eluiontia seurataan kasvukokei11 a, käyttäen niissä 30 Bacillus subtil is 1 ta ja H PL C : 11ä.

Ne fraktiot, joilla on samanlainen antibioottipitoisuus, yhdistetään ja viiden kromatografiakierroksen homogeeniset fraktiot konsentroidaan haihduttamalla orgaaninen liuotin.

so 81117

Muodostunut liuos laimennetaan vesipitoisella 1 M natrium-kloridilla kaksinkertaiseksi alkuperäiseen tilavuuteen verrattuna ja laitetaan silanoituun piihappogeelipyivääseen (50 g; täytteen korkaus 5 cm; silanoitua piihappogeeliä 60; 5 Merck Inc.), pylväs tasapainoitetaan vedellä.

Pylvästä pestään deionisoidul1 a vedellä, kunnes suolan poistuminen on täysin tapahtunut (eluaateissa ei tapahdu AgCl-saostumista vesipitoisen AgNO^n lisäyksen jälkeen), jonka jälkeen eluoidaan asetoni trii1i/vedel1ä 1:1 (til./ 10 til.). Eluaatit, joilla on samanlainen antibioottipitoi-suus (HPLC-analyysin mukaan) yhdistetään, konsentroidaan pieneen tilavuuteen tislaamalla atseotrooppisesti n-buta-nolin kanssa, jolloin saadaan vesipitoinen faasi, joka sen jälkeen pakastekuivataan. Saannot: 15 antibioottia A 40926 tekijää PA 55 mg antibioottia A 40926 tekijää PB 51 mg antibioottia A 40926 tekijää A 38 mg antibioottia A 40926 tekijää Bq 33 mg.

20 ESIMERKKI 6: VAIHTOEHTOINEN MENETELMÄ ANTIBIOOTIN A 40926

TEKIJÄN B ERISTÄMISEKSI

Esimerkin 2 (viimeinen vaihe) mukaisesti valmistettujen kahden valmisteen yhdistetty konsentraatti suodatetaan ja suodos laitetaan silanoituun piihappogeelikromatografia-25 pylvääseen (400 g; täytteen korkeus 30 cm; piihappogeeli 60, 70-230 mesh, Merck Inc.), joka on etukäteen tasapainotettu vedellä.

Pylväs huuhdotaan vedellä (6 1) ja adsorboitunut antibiootti eluoidaan asetonitrii1i/vedel1ä seuraavan kaavion 30 mukaisesti: 2,7 litraa 5 % (til./til.) asetoni trii1iä vedessä 1,6 litraa 10% (til./til.) asetoni trii1iä vedessä 2,97 litraa 15% (til./til.) asetoni trii1iä vedessä 3,15 litraa 20% (til./til.) asetoni trii1iä vedessä i 51 81117

Noin 18 ml:n fraktiot kerätään. Eluoitujen fraktioiden aktiivisuus testataan paperikiekko-kasvukokeel1 a herkillä mikro-organismeilla kuten B.subtilis ja analysoidaan HPLC:11ä . Fraktiot, joilla on samanlainen antibiootti-5 pitoisuus yhdistetään (fraktiot 472-526) ja konsentroidaan alennetussa paineessa. Tähän konsentraattiin lisätään n--butanolia veden poistamiseksi atseotrooppisesti . Jäljelle jäävä butanolipitoinen liuos puolestaan konsentroidaan pieneen tilavuuteen antibiootin A 40926 tekijän B saosta-10 miseksi (1,4 g). Tämä tuote pestään petrolieetteri 11ä , samalla hämmentäen, ja kerätään suodattamalla (kolme kertaa). Tyhjössä kuivaamisen jälkeen saadaan 760 mg antibioottia A 40926 tekijää B.

Suorittamalla antibiootille A 40926 tekijälle B vielä uu-15 destaan edellä mainittu pyiväskromatografia saadaan (540 mg) antibioottia A 40926 tekijää BQ, jolla on samat fysiko-kemialliset tunnusmerkit, jotka on edellä esitetty antibiootille A 40926 tekijälle B paitsi, että nyt saadaan ainoastaan yksi piikki HPLC-analyysissä, nimittäin piikki, 20 jonka retentioaika on 1,22 suhteessa teikoplaniinin A^ komponentti in 2.

ESIMERKKI 7: ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PA JA ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄN PB MUUTTAMINEN ANTIBIOOTIKSI A 40926 TEKIJÄKSI A JA VASTAAVASTI TEKIJÄKSI B

25 Antibiootti A 40926 tekijä PA ja antibiootti A 40926 tekijä PB (50 mg) liuotetaan erikseen 2,5 ml:aan vesipitoista 1-prosenttista (paino/til.) NH^OHrta ja muodostuneita liuoksia pidetään noin 24 tuntia huoneen lämpötilassa, samalla niitä hämmentäen. Antibiootti A 40926 tekijä A saadaan liuok-30 sesta, joka alunperin sisältää antibiootin A 40926 tekijän PA ja antibiootti A 40926 tekijä B saadaan liuoksesta, joka alunperin sisältää antibiootin A 40926 tekijän PB poistamalla vettä atseotrooppisesti tislaamalla n-butanolin kanssa, saostaminen tapahtuu etyylieetteri 11ä ja sakka kerätään 35 suodattamalla (saanto noin 75 %).

52 81 1 1 7

D-ALA-D-ALA-SEPHAROSEN VALMISTUS

Aktivoitua CH-Sepharose® 4B:tä (Pharmacia Fine Chemicals) (1 g) turvotetaan 15 minuutin ajan 1 mM jääkylmässä kloo-rivetyhapossa ja pestään samalla liuoksella. Saatu geeli 5 (noin 3 ml) sekoitetaan liuokseen, jossa on D-alanyyli-D--alaniinia (30 mg) 0,5 M natriumkloridissa ja 0,1 M nat-riumbikarbonaattipuskurissa pHrssa 8.

Seosta kierrätetään alhaalta ylöspäin 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa.

10 Sen jälkeen kun kytkeytymisreaktio on täysin tapahtunut, ylimääräinen ligandi pestään pois puskurilla. Dekstraani-pohjan 1 sitoutumattomat, aktivoidut ryhmät suljetaan käsittelemällä ne 1 M etanoliamiinihydrokloridi 11 a pH-ar-vossa 9 tunnin ajan.

15 Sen jälkeen Sephadex-£ -aminokaproyyli-D-alanyyli-D-ala-niini-modifioitu matriisi otetaan talteen suodattamalla ja pestään hyvin vaihtoehtoisesti 0,5 M natriumklori di 11 a ja 0,1 M natriumasetaati11 a pH 4, tai 0,5 M natriumklori-dilla ja 0,1 M tris (hydroksimetyyli) aminometaani-puskuri11 a 20 pH 8 (neljä kertaa).

i

Claims (9)

53 81 1 1 7

1. Menetelmä antibiootin valmistamiseksi, joka on antibiootti A 40926 kompleksi, antibiootti A 40926 tekijä A, antibiootti A 40926 tekijä B, antibiootti A 40926 tekijä Bq, 5 antibiootti A 40926 tekijä PA, antibiootti A 40926 tekijä PB, näiden seos tai näiden happoadditiosuola, jolla on seu-raavat tunnusmerkit: ANTIBIOOTTI A 40926 TEKIJÄ A ei-suolamuodossa: A) uitravioiettiabsorptiospektrissä esiintyy seuraavat 10 absorptiomaksimit: A ma ks (nm) a) 0,1 N HC1 281 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 300 (olka) 15 c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 d) metanoli 282 e) fosfaattipuskuri pH 9,0 282 300 (olka)

20 B) infrapuna-absorptiospektrissä on seuraavat absorp- tiomaksimit (cm-^): 3700-3100, 3100-2800 (nujoli); 1655; 1620-1560; 1510; 1480-1410 (nujoli); 1375 (nujoli); 1320-1250; 1250-1190; 1100-950; 845; 810; 720 (nujoli);

25 C) 1H-NMR-spektrissä esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitynä 270 MHz DMSO dgissa (heksadeute-rodimetyylisulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm) (ft= ppm): 54 81 1 1 7 ^0,86 (t: t. 6H) ; 1,21 ( 1 1 H ) ; 1,43 (2H); 2,01 (2H); 2,31-2,34 ( 3H) ; 4-6,2 (~16H); 6,2-8 (^23H); 8,44 , 9,22 , 9,66 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2,5-4: häiriö H^O-pii keistä;

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa kantaa viljellään lämpötilassa, joka on välillä 20°C ja 40°C.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa läm-5 pötila on välillä 24°C ja 35°C.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa antibioottien talteenotto ja eristäminen tapahtuu suorittamalla suodatetulla käymisliemel1 e affiniteettikromato-grafi a li i kkumattomalla D-alanyyli-D-alaniinilla, jonka 10 jälkeen suoritetaan jakaantumis-, käänteisfaasi- tai ioninvaihtokromatografia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa antibioottien talteenottaminen käsittää: a) käymisliemel1 e suoritetaan affiniteettikromatografia 15 liikkumattomalla D-alanyyli-D-alaniinilla b) yhdistetyt antibiootin sisältävät eluoidut fraktiot neutra1 oidaan nopeasti, ja c) mahdollisesti antibiootti A 40926 tekijät PA, PB, A, B ja Bq eristetään käänteisfaasi-nestekromatografian 20 avulla silanoidulla pi i happogeelillä.

5 B) infrapuna-absorptiospektrissä esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm-^): 3700-3100, 3000-2800 (nujoli); 1760-1710; 1655; 1620-1550; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1260, 1250-950; 845; 805 ; 720 (nujoii) ;

10 C) ^H-NMR-spektrissä esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitäessä H-NMR-spektri 270 MHz DMSO dgissa (heksadeuterodimetyylisulfoksidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm) (£ = ppm): 0,86, d: t (CH3); 1,15-1,22, m (CH2)n ; 1,41, m (CH2) ; 2,01, 15 s (C H 3 ) ; 2,01, m (CHg) ; 2,28, s (N-CH3) ; 4,26-5,96 , br (peptidiset ja aromaattiset CH:t); 6,33-7,73 br (aromaattiset CH:t ja peptidiset NH:t); b r = leveä d = dubletti 20 dd = dubletin dubletti m = multi pietti s = singletti t = t r i p 1 e 11 i D) retentioaika (Rt) 1,15 verrattuna teikoplaniinin A2 25 komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min) analysoitaessa käänteis-faasi-HPLC;llä seuraavissa oloissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 μνη) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisi ja) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 ^m) 62 8 1 1 1 7 eluentti A: CH^CN 10%^ säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90% j -arvoon 6,0 eluentti B: CH^CN 70%) säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%) -arvoon 6,0 5 eluointi: lineaarisella gradienti11 a , jossa eluentti B 5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 min virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm 10 sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) Rf-arvo verrattuna teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 on 0,62 seuraavassa kromatografiasysteemissä: 5 % (paino/til.) vesipitoista Na2S04 70 15 asetonitriiliä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 F2^4 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo 20. keltainen väri Pauly-reagenssilla, t.s. diatsotoidulla sul fani 1 i i ni hapol 1 a (J. Chromatog. ,20 , 1 71 ( 1 965), Z. Physiol .Chem. 292!, 99 ( 1953)) - bioautografiassa käytetään kantaa B.subtil is ATCC 6633 Davisin minimi alustalla;

25 F) molekyylipaino 1758 arvioituna FAB-MS-spektristä, jossa esiintyy piikkiryhmittymä, jonka intensiivisin piikki on 1761, FAB-MS-analyysin operatiiviset olosuhteet olivat seuraavat: i 63 8 1 1 1 7 laite: VG Mod ZAB SE varustettuna FAB ruiskutus- i oni tekni ikai 1 a olosuhteet: positiivinen FAB, Xe kiihdytysjännite 8 kV 5 matriisi: ti ogl yserol i-gl yserol i 1/1 (ti 1 . /ti 1 .) ; ANTIBIOOTIN A 40926 TEKIJÄ PB ei-suolamuodossa : A) ultraviolettiabsorptiospektrissä esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: maks (nm) 10 a) 0,1 N HC1 282 b) 0,1 N kaiiumhydroksidi 300 c) fosfaattipuskuri pH 7,38 282 300 (olka) 15 d) fosfaattipuskuri pH 9,0 282 300 (olka) B) infrapuna-absorptiospektrissä esiintyy seuraavat absorptiomaksimit (cm~M: 3700-3100, 3000-2800 (nujoli); 1760-1710; 1655; 1620-1560; 1605; 1480-1420 (nujoli); 1375 (nujoli); 1320-1270; 1 230-20 -1190; 1150; 1120-920; 845; 810; 720 (nujoli); C.1) ^H-NMR-spektrissä esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) 270 MHz DMS0 dg:ssa (heksadeuterodimetyylisulfok-sidi), sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm) (&= ppm) multiplisiteetti ; (ominaisuus): 25 0,84, d (i sopropyyl i n CH^it); 1,17, m 1*43, m (CHg), 1,99, s (C H 3); 2,01, m (CH2) ; 2,31, s (N-CHj); 2,79 dd (C-H); 3,70, m (C-H); 4,06-6,02, br (peptidiset ja aromaattiset CH:t); 6,45-7,74, br (aromaattiset CH:t ja peptidiset NH:t); 64 81 1 1 7 8,19-9,99, br (peptidiset NH:t ja fenoliset OH: t) ; C.2) ^H-NMR-spektrissä esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) spektri rekisteröity 270 MHz seoksessa DMSO dg + CF^COOD, sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm)(& = ppm) 5 multiplisiteetti ; (ominaisuus): 0,84, d (isopropyyliset C H 3 : t) ; 1,13, m (CH2^n; m (CH2); 1,98, s (C H 3) ; 2,00, m (CHg) ; 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sokeri C-H:t); 4,07-6,09, s ja m (peptidiset ja aromaattiset CH:t); 6,45-7.83 , s ja m (aromaatti-10 set CH:t ja peptidiset NH:t); 8,17-10,38 (peptidiset NH:t, fenoli set 0H : t) ; D) retentioajat (Rt) 1,27 ja 1,32 verrattuna teikopla-niinin A2 komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC:11ä seuraavissa oloissa: 15 kolonni: Ultrasphere ODS (5 jum) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisähalkaisi ja) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) eluentti A: CHgCN 10%) säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J -arvoon 6,0 20 eluentti B: CH^CN 70%^ säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J -arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B 5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 min 25 virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.); 65 81 1 1 7 E) R^-arvo verrattuna teikoplaniinin komponenttiin 2 on 0,53 seuraavassa kromatografia-systeemissä: 5 % (paino/til.) vesipitoista Na2S04 70 asetoni tri i1i ä 30 5 käytetään silanoituja pi ihappogeel i-60 ^54 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo - keltainen väri Pauly-reagenssi1 la, t.s. diatsotoidul1 a 10 sul fani 1 i i ni hapolla (J. Chromatog. 2_0, 1 71 , ( 1 965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografissa käytetään kantaa B.subtilis ATCC 6633 Davisin mi nimi aiustal1 a; F) molekyylipaino noin 1772 arvioituna FAB-MS-spektris-15 tä, jossa piikkiryhmä, jonka intensiivisin piikki 1776, FAB-MS-analyysin operatiiviset olot olivat seuraavat: laite: VG Mod ZAB SE varustettuna FAB ruiskutus- ioni tekn i i kai 1 a olosuhteet: positiivinen FAB, Xe 20 kiihdytysjännite 8 kV matriisi: tioglyseroli-g 1yseroli 1/1 (til ,/til.) , tunnettu siitä, että viljellään kantaa Actinomadura sp. ATCC 39727 submerssisissa, aerobisissa oloissa 25 assimiloituvien hiili-, typpi1ähteiden ja epäorgaanisten suolojen läsnäollessa, mainittu antibiootti otetaan talteen ja eristetään käymisliemistä ja muutetaan tarvittaessa toivotuksi suolaksi . 66 81 1 1 7

5 D) retentioaika (R^) 1,12 verrattuna teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 (R^ = 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faasi-HPLC:11ä seuraavissa oloissa: kolonni: Ultraspehere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 4,6 mm (sisäha 1 kaisija) x 250 mm 10 esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 ;um) eluentti A: CHgCN 10%Ί säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%j -arvoon 6,0 eluentti B: CH^CN 70%Ί säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J -arvoon 6,0 15 eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B 5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 minuuttia virtausnopeus : 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm 20 sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) samoissa oloissa retentioaika verrattuna testosteroniin (Roussel Uclaf) on 0,60; E) aikuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin 25 kuivattu noin 140°C:ssa i nertti atmosfääri ssä (Aw 4,6%), antaa tulokseksi seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 55,82 %; vetyä 5,17 %; typpeä 6,31 %; klooria (kokonais) 4,24 %, klooria (ioneja) 0,37 %; epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 1,2 %; 55 8 1 1 1 7 F) happo-emäs-titrausprofii1i 2-metoksietanolissa (MCS):vesi, 4:1, K0H:11a titraamisen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin HC1 :ää, osoittaa neljä ionisoituvaa funktiota, joilla on seuraavat pkMCS-arvot: 4,6; 5,6; 7,2 ja 5 9,2; G) R^-arvo on 0,24 ja R^.-arvo suhteessa teikoplaniinin komponenttiin 2 on 0,70 seuraavassa kromatografiasystee- missä: 5 % (paino/til.) vesipitoista ^£$0^ 70 10 asetoni triiliä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 F254 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo 15. keltainen väri Pauly-reagenssi11 a, t.s. diatsotoidulla sul fani 1 i i ni hapol 1 a (J. Chromatog. 2_0 , 171 ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292^, 99 ( 1 953)) - bioautografiässä käytetään kantaa B.subtilis ATCC 6633 Davisin mi nimi ai us tai 1 a ;

20 H) molekyylipaino noin 1716 arvioitu FAB-MS-spektristä, jossa M + H®-piikki 1717; ANTIBIOOTTI A 40926 TEKIJÄ B ei-suolamuodossa: A) uitravioiettiabsorptiospektrissä esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: 25 maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 300 (olka) 56 81 1 1 7 c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 300 (olka) 5 e) metanoli 282 B) infrapuna-absorptiospektrissä on seuraavat absorp- _ 1 t i oma k s imit (cm ): 3700-3080; 3080-2700 (nujoli); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 10 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujoli); C) ^H-NMR-spektrissä esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitäessä ^H-NMR-spektri 270 MHz DMSO dg:ssa (heksadeuterodimetyy1isu 1 foksidi) , sisäisenä stan- 15 dardina TMS (0,00 ppm)(S = ppm): & 0,85 (d, isopropyylin CH^t); 1,15 (^13H); 1,44 (r^2H); 2,02 (2H) ; 2 ,32-2,35 ( 3H); 4-6,1 (~16H); 6,1-8 (~23H); 8,52, 9,30, 9,68 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 2 0 2,5-4 häiriö H^O-p i i ke i stä; D) retentioajat (Rt) 1,22 ja 1,27 verrattuna teiko-planiinin A2 komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa käänteisfaasi-HPLC;llä seuraavissa oloissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 pm) Altex (Beckman) 25 4,6 mm (si sähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti A: CH3CN 10%1 säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J -arvoon 6,0 57 81117 eluentti B: CH^CN 70% säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30¾} -arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B 5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 5 40minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponentti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.)

10 E) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inerttiatmosfäärissä (A.w 9,6%), antaa seuraavan likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 54,09 %; vetyä 5,13 %; typpeä 6,34 %; klooria (kokonais) 4,12%, klooria (ioneja) 0,39 %; epäor-15 gaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 5 %; F) happo-emäs-titrausprofii1i 2-metoksietanolissa (MCS):vesi, 4:1, K0H:lla titraamisen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin HCl:ää (pH 2,7), osoittaa neljä ionisoituvaa funktiota, joilla on seuraavat pkMCS~arvot: 20 4,5; 5,6; 7,2 ja 9,2; G) R^-arvo 0,21 ja R^-arvo suhteessa teikoplaniinin A2 komponenttiin 2 on 0,53, seuraavassa kromatografia-systee-mi s sä : 5 % (paino/1il.) vesipitoista Na2S04 70 25 asetoni trii1iä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 F254 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: 58 81 1 1 7 - UV-valo - keltainen väri Pauly-reagenssi 11 a, t.s. diatsotoidul1 a sulfaniliinihapolla (0. Chromatog. 20^ 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) 5. bioautografiässä käytetään kantaa B.subtil is ATCC 6633 Davisin minimialustalla: H) molekyylipaino noin 1730 pääteltynä FAB-MS-spektris-tä , jossa M + H ^ -piikki 1731; ANTIBIOOTTI A 40926 TEKIJÄ BQ ei-suolamuodossa:

10 A) uitravioi ettiabsorptiospektrissä esiintyy seuraavat absorptiomaksimit: Λ maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) fosfaattipuskuri pH 7,38 281 15 300 (olka) c) 0,1 N natrium- tai kalium- hydroksidi 300 d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 300 (olka) 20 e) metanoli 282 B) infrapuna-absorptiospektrissä on seuraavat absorptiomaksimit (cm~^): 3700-3080; 3080-2700 (nujoli); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujoli); 1375 (nujoli); 1295; 1230; 1210; 1150; 25 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujoli); C) ^H-NMR-spektrissä esiintyy seuraavat signaaliryhmät (ppm:ssä) rekisteröitäessä 1H-NMR-spektri 270 MHz DMSO d^:ssa (heksadeuterodimetyylisulfoksidi) , sisäisenä standardina TMS (0,00 ppm)(^ = ppm): i 59 81117 0,85 (d, i sopropyyl i n CH3: t) ; 1,15 (~13Η); 1,44 (^'2H); 2,02 (2H) ; 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 K16H); 6,1-8 (^23H); 8,52, 9,30, 9,68 (leveät juovat; liikkuvat protonit) 5 2,5-4 häiriö H^O-piikeistä; D) retentioaika (R^.) 1,22 verrattuna tei kopl ani i nin komponenttiin 2 (Rt = 20,3 min), analysoitaessa käänteis-faas i-HPLC: 1lä seuraavissa oloissa: kolonni: Ultrasphere ODS (5 pm) AItex (Beckman) 10 4,6 mm (sisähalkaisija) x 250 mm esikolonni: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) eluentti A: CH^CN 10%1 säädettynä pH- (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90% J -arvoon 6,0 eluentti B: CH^CN 70%1 säädettynä pH- 15 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J -arvoon 6,0 eluointi: lineaarinen gradientti, jossa eluenttia B 5 prosentista 60 prosenttiin eluentissa A, 40 minuuttia virtausnopeus: 1,8 ml/min

20 UV-detektori: 254 nm sisäinen standardi: teikoplaniinin A2 komponetti 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) alkuaineanalyysi, sen jälkeen kun näytettä on ensin kuivattu noin 140°C:ssa inerttiatmosfäärissä (Am 9,6%), 25 antaa tulokseksi seuraavan, likimääräisen prosentuaalisen koostumuksen (keskiarvo): hiiltä 54,09 %; vetyä 5,13 %; typpeä 6,34 %; klooria (kokonais) 4,12 %, klooria (ioneja) 0,39 %; epäorgaaninen jäännös 900°C:ssa ilmassa: 5 %; 60 81 1 1 7 F) happo-emäs-titrausprofii1i 2-metoksietanolissa (MCS):vesi , 4:1, KOH :11a titrauksen jälkeen, kun on lisätty ylimäärin HCl:ää, osoittaa neljä ionisoituvaa funktiota, joilla on seuraavat pkMCS-arvot: 4,5; 5,6; 7,2 ja 5 9,2; G) R^-arvo 0,21 ja R^-arvo suhteessa teikoplaniinin komponenttiin 2 on 0,53 seuraavassa kromatografia-systee-mi ssä : 5 % (paino/til.) vesipitoista Na^SO^ 70 10 asetoni tri i1iä 30 käytetään silanoituja piihappogeeli-60 F254 Merck-levyjä (kerroksen paksuus 0,25 mm) näkyväksi tekeminen: - UV-valo 15. keltainen väri Pauly-regenss i11a, t.s. diatsoto idulla sulfanil i inihapol la (J. Chromatog. 2Q , 1 71 ( 1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)) - bioautografissa käytetään kantaa B.subtilis ATCC 6633 Davisin minimi ai us ta 11 a ;

20 H) molekyylipaino noin 1730 arvioituna FAB-MS-spektris-tä , jossa M + H ^ -piikki 1731; ANTIBIOOTTI A 40926 TEKIJÄ PA ei-suolamuodossa: A) ultraviolettiabsorptiospektrissä esi i ntyy seuraavat absorptiomaksimit: 25 )\ maks (nm) a) 0,1 N HC1 282 b) 0,1 N kaiiumhydroksidi 300 i e\ 81117 c) fosfaattipuskuri pH 7,38 282 300 (olka) d) fosfaattipuskuri pH 9,0 283 300 (olka)

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä yhdisteen valmistamiseksi, joka on antibiootti A 40926 kompleksi, antibiootti A 40926 tekijä A, tekijä B tai tekijä Bq, tunnettu siitä, että 25 a) käymismassa tehdään emäksiseksi pH-arvoon 8,5-10,5 b) suodatetaan c) kirkas suodos hapotetaan pH-arvoon 2,5-4,5 i 67 81 1 1 7 d) suodatetaan ja suodos hylätään e) suodatuskakku suspendoidaan veteen ja se tehdään emäksiseksi säätämällä pH välille 8-9 f) sen jälkeen kun raaka antibiootti A 40926 kompleksi 5 on otettu talteen suodattamalla, suoritetaan sille affiniteetti kromatografointi liikkumattomalla D-a 1anyy1i-D-a1a-niinillä g) mahdollisesti eristetään antibiootti A 40926 tekijä A ja tekijä B jakaantumis-, käänteisfaasi - tai ioninvaihto-10 kromatografian avulla, ja h) antibiootille A 40926 tekijälle B suoritetaan vielä affiniteettikromatografointi, jolloin haluttaessa saadaan antibiootti A 40926 tekijä Bq.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa kro-15 matografiatekniikka on käänteisfaasikromatografia ja kiin- teäfaasiosuus on silanoitu piihappogeeli tai funktionali-soimaton polystyreenihartsi.

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa kiin-teäfaasiosuus on silanoitua piihappogeeliä , joka etukäteen 20 on tasapaino!tettu puskuriliuoksella, pH-arvossa 4-9, ja eluentti on lineaarinen gradienttiseos, joka sisältää polaarisen veteen sekoittuvan liuottimen samassa puskuri-1i uoksessa.

9. Kanta Actinomadura sp. ATCC 39727. 6β 81117