DK161092B

DK161092B - Antibiotisk stof, fremgangsmaade til fremstilling deraf, farmaceutisk praeparat indeholdende det og mikroorganismestamme til brug ved fremstilling af det

Info

Publication number: DK161092B
Application number: DK457385A
Authority: DK
Inventors: Enrico Selva; Luciano Gastaldo; Grazia Beretta; Angelo Borghi; Beth P Goldstein; Vittorio Arioli; Giovanni Cassani; Francesco Parenti
Original assignee: Lepetit Spa
Priority date: 1984-10-11
Filing date: 1985-10-08
Publication date: 1991-05-27
Also published as: NO164111B; ES8609352A1; NZ213775A; PH23013A; EP0177882A2; AU599308B2; DK161092C; FI81117B; DE3575145D1; IE58708B1; EP0177882A3; JPH06225757A; MY100880A; JPS61148188A; ATE49215T1; GB8425685D0; HUT39480A; EP0177882B1; HU194317B; NO854018L

Description

DK 161092 B

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt antibiotisk stof. Det er ejendommeligt ved det i krav 1's kendetegnende del angivne. Heraf ses det at det arbitrært har fået betegnelsen antibiotikum A 40926 kompleks og dets 5 faktorer antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A

40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bg, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB. Opfindelsen angår tillige en fremgangsmåde, ejendommelig ved det i krav 2's kendetegnende del angivne, til fremstil-10 ling af det ved dyrkning af den hidtil ukendte stamme Ac-tinomadura sp. ATCC 39727; samt et farmaceutisk præparat indeholdende et antibiotisk stof som angivet i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bærestof; og en mikroorganismestamme til brug ved dets fremstilling, nemlig oven-15 nævnte Actinomadura sp. ATCC 39727.

De antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen er gly-kopeptidiske stoffer som hører til vancomycin-klassen af antibiotika, der har bindingskapacitet til acyl-D-alanyl-D-alanin.

20 Antibiotikum A 40926 kompleks og dets fakto rerantibiotikum A 40926 faktor A, faktor B, faktor Bg, faktor PA og faktor PB kan danne salte ved i og for sig kendte teknikker.

I nærværende beskrivelse og tilhørende krav angiver 25 udtrykket "antibiotikum A 40926" som sådant en forbindelse udvalgt blandt antibiotikum A 40926 kompleks, antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bg, antibiotikum A 40926 faktor PA, antibiotikum A 40926 faktor PB, salte deraf og 30 hvilke som helst balndinger deraf. Udtrykkene "antibiotikum A 40926 kompleks", "antibiotikum A 40926 faktor PA","antibiotikum A 40926 faktor PB", "antibiotikum A 40926 faktor A", "antibiotikum A 40926 faktor B" og "antibiotikum A 40926 faktor Bg" omfatter, når der er 35 tale om de biologiske egenskaber, også de tilsvarende farmaceutisk acceptable salte.

DK 161092 B

2

Antibiotikum A 40926 fremstilles ved dyrkning af en stamme af Actinomadura isoleret fra en jordprøve, og den er blevet deponeret den 8. juni 1984 hos den internationalt anerkendte samling American Type Culture 5 Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville,

Maryland 20852,-USA, under Budapest-traktatens betingelser. Stammen har fået accessionsnummeret ATCC 39727.

Den producerende stamme ansås oprindelig for at høre til slægten Streptomyces og betegnedes i begyndel-10 sen Streptomyces nov. sp. A 40926 og blev deponeret som sådan hos ATCC, hvor den fik accessionsnummeret ATCC 39727. Yderligere undersøgelser, navnlig over cellevægssammensætningen, førte til den konklusion at den nye stamme hører til slægten Actinomadura. Den stamme der oprin-15 delig blev deponeret som Streptomyces sp. ATCC 39727 er derfor ombenævnt til Actinomadura sp. ATCC 39727.

Antibiotikum A 40926 kompleks og dets faktorer er muligvis kemisk beslægtede med en gruppe antibiotiske stoffer benævnt teichomyciner. Således kendes der fra DK frem-20 læggelsesskrift nr. 141022 en fremgangsmåde til fremstilling af en antibiotisk blanding eller de enkelte komponenter betegnet teichomycin A1, teichomycin A2, teichomycin A3, antibiotisk 8327 faktor B og antibiotisk 8327 faktor C. Fremstillingen sker ved dyrkning af mikroorganismestam-25 men Actinoplanes teichomyceticus nov.sp. ATCC 31121 under i og for sig sædvanlige forhold ved mikrobiologisk antibiotikumfremstilling og påfølgende udvinding af stofferne.

Fra GB patentansøgning nr. 2121401 kendes teichomycin A2 og dets rene enkeltfaktorer 1, 2, 3, 4 og 5. De 30 fremstilles ved adskillelse af antibiotikum fremstillet ved aerob dyrkning af ovennævnte Actinoplanes teichomyceticus ATCC 31121, i enkeltfaktorerne ved reversfase-adskillel-se eller ionbytterkromatografering.

Kolonierne af nævnte stamme af Actinoplanes har ved 35 dyrkning på en række næringsmedier glat overflade hvor kolonierne af den til fremstilling af de antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen anvendte stamme af Actinomadura på de samme medier har rynket overflade.

DK 161092 B

3

Det har overraskende vist sig at de antibiotiske stoffer ifølge den foreliggende opfindelse har markant kraftigere virkning mod en række sygdomsfremkaldende mikroorganismer end teichomycinerne. Dette fremgår af nedenstå-5 ende tabel, hvor værdier for MIC (mindste inhiberende koncentration) er vist, udtrykt i mikrogram/milliliter. Der er i tabellen ikke opereret med de forskellige arter af de to grundtyper antibiotika; der er blot vist yderværdier for virkningen mod de anførte mikroorganismer.

10

Opfindelsen DK GB

141022 2121401

Staph, aureus ATCC 6538 0,13 0,02-2,0

Strept. pneumoniae 0,06 -0,063 0,5 -2,0 0,05-0,2 15 Strept. faecalis 0,06 -0,13 0,1 -0,4

Clostridium perfringens 0,008-0,016 0,05-50

Neisserie gonorrhoeae 0,5 -4 1,0-10

Produktionen af antibiotikum A 40926 kompleks, an-20 tibiotikum A 40926 faktor A, faktor B, faktor Bg, faktor PA eller faktor PB sker som angivet i krav 2 ved at man dyrker Actinomadura sp. ATCC 39727 under aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske 25 salte. Mange af de næringsmedier der sædvanligt anvendes i gæringsteknikken kan bruges, men visse medier foretrækkes. Foretrukne kulstofkilder er glukose, mannose, galaktose, stivelse, majsmel og lignende stoffer. Foretrukne nitrogenkilder er ammoniak, nitrater, sojabønnemel, pepton, kød-30 ekstrakt, gærekstrakt, trypton, aminosyrer og lignende substanser. Blandt de uorganiske salte der kan inkorporeres i næringsmedierne er de sædvanlige opløselige salte med evne til at udvikle natrium-, kalium-, jern-, zink-, kobolt-, magnesium-, kalcium-, ammonium-, klorid-, karbo-35 nat-, sulfat-, fosfat-, nitrat- og lignende ioner.

I almindelighed for-dyrkes den antibiotikumproducerende stamme i en rystekolbe hvorpå kulturen bruges til podning af krukkefermentorer til produktion af væsentlige

DK 161092B

4 mængder af de antibiotiske stoffer. Det medium der bruges til forkulturen kan være det samme som bruges til gæringer i større målestok, men der kan også bruges andre medier.

Den antibiotikum A 40926-producerende stamme kan dyrkes 5 ved temperaturer mellem 20 og 40°C, fortrinsvis mellem 24 og 35°C. Under gæringen kan antibiotikumproduktionen overvåges ved afprøvning af prøver af gæringssuppe eller mycelieekstrakt for antibiotisk aktivitet, fx ved biobe-stammelse eller TLC- eller HPLC-metoder.

10 Organismer der er følsomme for antibiotikum A 40926 såsom Bacillus subtilis og S. aureus kan bruges som testorganismer. Biobedømmelsen udføres hensigtsmæssigt ved agardiffusionsmetoden på agarplader. Den maksimale produktion af antibiotisk aktivitet indtræder i almindelig-15 hed mellem gæringens anden og femte dag.

Antibiotikum A 40926 produceret ved dyrkning af stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 findes hovedsagelig i dyrkningsmediet.

Egenskaberne af Actinomadura sp. A 40926 ATCC 39727 20 beskrives nærmere i det følgende.

Makroskopisk og mikroskopisk undersøgelse

Det vegetative mycelium er sammensat af bølgede og grenede hyfer (diameter ca. 0,8 μπι) der på nogle medier, 25 identificeret ved en asterisk i tabel I, har en svag tendens til at blive fragmenteret til stavlignende elementer efter flere dages dyrkning, mens det på glukose-aspa-ragin-medium fragmenterer til coccoide elementer.

Karakteristisk for denne stamme er det vegetative 30 myceliums bourgognefarve på nogle medier.

Luftmycelium forekommer kun i få medier; blandt dem der er anført i tabel I forekommer det specielt kun på havremelsagar og jordbundsagar. På disse medier er luftmyceliet hvidgråt og danner sporoforer der er anbragt 35 i hager og korte spiraler med omkring 10-20 sporer.

Sporerne er cylindriske og har en gennemsnitlig størrelse på 0,8 x 1,2 μπι.

DK 161092 B

5

Bestemmelse af vækstkarakterer

Til undersøgelse af kulturkaraktererne blev Actino-madura sp. ATCC 39727 dyrket på forskellige standardmedier som foreslået af Shirling og Gottlieb (E.B. Shirling 5 og D. Gottlieb, 1966 - Method for characterization of

Streptomyces species - Int. J. Syst. Bacteriol, jL6, 313-340) med tilføjelse af flere medier anbefalet af Waksman (S.A. Waksman, 1961, The Actinomycetes, The Williams and Wilkins Co., Baltimore; bind 2, 328-334).

1 q Farvebestemmelse skete hvor nødvendigt ved den metode der er angivet af Maerz og Paul (A. Maerz og M.

Rea Paul, 1950 - A Dictionary of Color - 2nd Edition McGraw-Hill Book Company Inc., New York).

Organismens evne til at udnytte forskellige kulstof-15 kilder undersøgtes ved den metode der er beskrevet af Shirling og Gottlieb.

Kulturkaraktererne og de fysiologiske karakterer samt udnyttelse af kulstofkilder er anført i tabellerne I, II og III.

20 Resultaterne i tabel I er opnoteret efter to ugers inkubering ved 28°C.

Tabel I

Kulturkarakterer hos stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 25 -

Kulturmedium Karakterer

Medium nr. 2 (gæreks- Rigelig vækst med skorpet over- trakt-maltagar) flade, 8/L/8, spor af ravfarvet 30 til lyserødt opløseligt pigment

Medium nr. 3 (havre- Rigelig vækst med glat overflade, melsagar) violet, 55/E/4, luftmycelium me get sparsomt, gråt, opløseligt pigment violet 55/H/4 35

Medium nr. 4 (uorganr- Moderat vækst med glat og tynd ske salte-stivelses- overflade, flødefarvet 10/D/2 agar)

DK 161092B

6

Tabel I (fortsat)

Kulturmedium Karakterer

Medium nr. 5 (glyce- Moderat vækst med glat og tynd rol-asparaginagar) overflade, abrikosfarvet 10/B/2

Medium nr. 6 (pepton- Moderat vækst med svagt skorpet gærekstrakt-jernagar) overflade, ravfarvet 12/D/9

Medium nr. 7 (tyrosin- Rigelig vækst med glat og tynd 1 0 agar) overflade, ravfarvet-brun 13/K/12

X

Havremelsagar Rigelig vækst med glat overflade, bourgognefarvet 8/L/7, luftmycelium moderat lysegul-gråt 44/B/2 15 Hickey og Tresners Rigelig vækst med rynket overfla- agarx de, ravfarvet-brun 13/K/12

Czapecks glukoseagar Moderat vækst med glat overflade, lysegul 9/1/3 2g Glukose-asparaginagarx Sparsom vækst med flødefarvet overflade, strågul 9/E/l Næringsagar Rigelig vækst med rynket overfla- .

de, lysorange ll/C/7

Kartoffelagarx Rigelig vækst med rynket overfla- ^ de, bourgognefarvet 8/L/9

Bennetts agarx Rigelig vækst med skorpet over flade, bourgognefarvet 8/L/8, opløseligt pigment dybt ravfarvet-30 rosa 5/J/10

Kalciummalatagar Moderat vækst med glat overflade, abrikosfarvet 10/B/3

Skummetmælksagar Rigelig vækst med svagt rynket overflade, orangefarvet 9/B/9 35

Czapecks sakkaroseagar Rigelig vækst med glat overflade, abrikosfarvet 10/B/6

DK 161092 B

7

Tabel I (fortsat)

Kulturmedium Karakterer ÆgalbuminagarX Rigelig vækst med glat overflade, 5 rosa 52/B/3, spor af opløseligt pigment, rosa 52/B/3

Sabourauds agar Ingen vækst

Jordbundsagar Sparsom vækst, farveløs, hvid- 10 gråt luftmycelium

DextrosetryptonagarX Moderat vækst med glat og tynd overflade, lysegul 10/G/2

Kartoffelstykker Rigelig vækst, orange-brun, spor 15 af hvidgråt luftmycelium * ... —---- -----— ........ . 1 1,1

Tabel II

Fysiologiske karakterer 20 Prøve Resultat

Stivelseshydrolyse negativ H^S-dannelse negativ på medium nr. 6 positiv med blyacetatstrimler 25 Tyrosinreaktion positiv

Caseinhydrolyse positiv

Kalciummalathydrolyse negativ

Gelatinesmeltning positiv

Lakmusmælk, koagulering negativ 30 lakmusmælk, peptonise- ring positiv

Cellulosenedbrydning negativ

Nitratreduktion positiv 35

DK 161092 B

8

Tabel III

Udnyttelse af kulstofkilder

Kulstofkilde Vækst 5

Arabinose . +

Xylose +

Mannose +

Fruktose + 1 q Raffinose +

Rhamnose +

Glukose +

Laktose +

Galaktose + 15 Inositol -

Sakkarose +

Cellulose

Salicin +

Mannitol + 20 Ribose + = vækst - = ingen vækst 25 Kemotaxonomiske karakterer Cellevækstanalyse

Analyse af i cellevæggen tilstedeværende aminosyrer udførtes ved de metoder der er beskrevet i Becker et al: "Rapid differentation between Nocardia and Streptomyces 30 by paper chromatography of whole cell hydrolysates", Appl. Microbiol. _12, 421-423 (1964). Analysen af hydrolyserede hele celler viste tilstedeværelse af meso-diaminopimelinsy-re.

Analysen af den rene cellevæg, der opnåedes ved 35 den metode der er angivet af Kawamoto et al. (I. Kawamoto, T. Oka og T. Nara, "Cell-wall composition of Micromono-spora olivoasterospora, Micromonospora sagamiensis, and

DK 161092 B

9 related organism", J. of Bacteriology 146, 527-534, 1981) viste fravær af glycin.

Sukkeranalyse 5 Analysen af sukkerindholdet udførtes ved den metode der er angivet af M.P. Lechevalier, "Identification of aerobic actinomycetes of clinical importance", J. Lab.

Clin. Med. 71, 934-944 (1968) under anvendelse af tynd-lagskromatografiske celluloseark som beskrevet af J.L.

10 Staneck og G.D. Roberts, "Simplified approach to identification of aerobic actinomycetes by thin-layer chromatography", 28, 226-231 (1974) med følgende opløsningsmiddelsystem: ætylacetat/pyridin/vand 100:35:25 (rumfang).

De opnåede resultater viste tilstedeværelse af i hoved-15 sagen glukose og ribose, mens der også konstateredes mindre mængder galaktose, mannose og madurose (3-0-metyl-D-galaktose).

Mycolinsyrer 20

En prøve til opdagelse af tilstedeværelse af myco- linsyrerudførtes ved følgende metode ifølge Minnikin et al. (D.E. Minnikin, L. Alshamaony og M. Goodfellow, "Differentiation of Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin layer chromatography analysis of whole 25 organism methanolysates", Journal of General Microbiology 88, 200-204, 1975). Resultaterne af denne prøve var negative, der fandtes ikke mycolinsyrer.

Stammens identitet 30 .

Stammen henføres til actmomycetslægten Actmomadura på grund af tilstedeværelsen af mesodiaminopimelinsyre og madurose, manglen på glycin i peptodoglykan, manglen på mycolinsyrer og dannelse af luftmycelium med moderat lange sporekæder.

35

DK 161092B

10

Udvindingen af de antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen fra gæringssuppen med den producerende mikroorganisme udføres ved i og for sig kendte teknikker som indbefatter ekstraktion med opløsningsmidler, fældning ved tilsætning af ikke-opløsningsmidler eller ved ændring 5 af opløsningens pH-værdi, fordelingskromatografering, reversfase-fordelingskromatografering, ionbytterkromato-grafering, affinitetskromatografering og lignende metoder.

En foretrukken fremgangsmåde indbefatter en affini-nitetskromatografering på immobiliseret D-alanyl-D-alanin efterfulgt af reversfase-søjlekromatografering.

Immobiliserede D-alanyl-D-alanin-matrixer som egner sig til den foreliggende udvindingsproces er angivet i europæisk patentansøgning nr. 83112555. Den foretrukne matrix ved den foreliggende fremgangsmåde er D-alanyl-15 D-alanin koblet med tværbundet polydextran med kontrolleret porestørrelse.

Gæringssuppen kan underakstes affinitetskromatogra-feringen direkte efter filtrering eller efter en indleden-de rensningsprocedure-. Sidstnævnte procedure omfatter at man gør hele gæringsmassen basisk, fortrinsvis til mellem pH 8,5 og 10,5, for at opløseliggøre det antibiotiske stof som er adsorberet på myceliet, og derefter filtrerer det. Det klare filtrat bringes til pH 2,5-4,5 ^ og filtreres på ny i nærværelse af et filterhjælpemiddel.

30 35

DK 161092 B

11

Dette filtrat kasseres mens den udvundne filterkage suspenderes i vand, gøres basisk fortrinsvis til en pH-værdi mellem 8 og 9 og filtreres. Filterkagen underkastes på ny samme procedure mens filtraterne, der indeholder anti-5 biotikum A 40926, forenes.

Disse filtrater eller de filtrerede gæringssupper underkastes derefter affinitetskromatografering på immo-biliseret D-alanyl-D-alanin, enten i kolonne eller portionsvis .

1 q Bindingen af det antibiotiske stof til affinitets matrixen udføres fortrinsvis ved en pH-værdi på omkring 7,0-8,0, og eluering udføres ved mere basiske pH-værdier (fortrinsvis mellem 9,0 og 10,5) ved hjælp af en vandig base. Denne vandige base kan være ammoniak, en flygtig 15 amin, et alkali eller et alkalimetalhydroxyd eller en basisk pufret opløsning, eventuelt i nærværelse af et polært organisk opløsningsmiddel såsom et polært vandblandbart opløsningsmiddel som defineret nedenfor.

Efter fjernelse af urenheder ved skylning af ko-2Q lonnen med en vandig puffer pH 4-8, eventuelt indeholdende salte, urinstof og/eller vandblandbare opløsningsmidler, elueres antibiotikum A 40926 med ovennævnte elueringsblan-ding. Det rå antibiotiske stof udvindes derefter fortrinsvis ved fjernelse af vand fra de forenede antibiotikumhol-25 dige fraktioner ved azeotrop destillation med et organisk opløsningsmiddel med evne til at danne minimumsazeotrope blandinger med vand, efterfulgt af tilsætning af et ikke-opløsningsmiddel for at udfælde det ønskede produkt.

Repræsentative eksempler på organiske opløsnings-2Q midler med evne til at danne minimumsazeotrope blandinger med vand er n-butanol, benzen, toluen, butylæter, kul-stoftetraklorid, kloroform, cyklohexan, 2,5-dimetylfuran, hexan og m-xylen; det foretrukne opløsningsmiddel er n-butanol.

Eksempler på ikke-opløsningsmidler er petroleumsæter, lavere alkylætere såsom ætylæter, propylæter og butylæter samt lavere alkylketoner såsom acetone. De for-

DK 161092 B

12 enede antibiotikumholdige fraktioner kan også koncentreres til et lille rumfang, fortrinsvis ved azeotrop destillation med et organisk opløsningsmiddel som defineret ovenfor, hvorpå den resulterende vandige opløsning fryse-2 tørres. Hvis den vandige base son anvendes ved elueringen ikke er flygtig, kan. det være nødvendigt at neutralisere og afsalte koncentratet før udfældning eller frysetørring.

En hensigtsmæssig afsaltningsprocedure indebærer at man overfører den antibiotikumholdige vandige opløs-^ q ning til en silaniseret silikagelkolonne, vasker med destilleret vand og eluerer med en blanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel og vand.

Repræsentative eksempler på polære vandblandbare opløsningsmidler er vandopløselige alkoholer (fx metanol, .j j. ætanol, isopropanol og n-butanol), acetone, acetonitril, lavere alkylalkanoater (fx ætylacetat), tetrahydrofuran, dioxan og dimetylformamid samt blandinger deraf; det foretrukne polære vandblandbare opløsningsmiddel er acetonitril.

2Q Afsaltningen kan eventuelt også udføres ved at man overfører den antibiotikumholdige opløsning til den foran beskrevne affinitetskolonne, vasker med destilleret vand og eluerer med en flygtig vandig base som beskrevet ovenfor til eluering i affinitetskromatograferingen.

22 Det således vundne produkt er antibiotikum A

40926 kompleks. Om nødvendigt kan det renses yderligere ellr som sådant underkastes adskillelse af dets faktorer A, B, Bq, PA og PB.

En hensigtsmæssig fremgangsmåde til udvinding af 2Q et rent antibiotikum A 40926 kompleks består i en yderligere rensning af komplekset, vundet som beskrevet ovenfor, på en affinitetskromatograferingskolonne. Der bruges i almindelighed samme stationære fase som ovenfor (immobi-liseret D-alanyl-D-alanin), og det ønskede antibiotiske ^ stof elueres ved at man følger den affinitetskromatogra-feringsprocedure på immobiliseret D-alanyl-D-alanin, der er beskrevet foran. En foretrukket immobiliseret D-alanyl-

DK 161092 B

13 D-alanin er "Sepharose"® -ε-aminokaproyl-D-alanyl-D-alanin og en foretrukken ækvilibreringsblanding er 0,16% v/r (vægt/rumfang, dvs. forholdet mellem faststof og væske som mellem g og ml) ammoniak indeholdende 2M NaCl regule-5 ret til pH 7-8 og en foretrukken skylleopløsning er 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 8-9,5 mens en foretrukken elueringsblanding er 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 10,5-12 idet en særlig foretrukken elueringsblanding er ovennævnte 1Q blanding reguleret til pH 11,5.

Antibiotikum A 40926-faktorerne, nemlig antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bq, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB isoleres fra en van-15 dig opløsning af antibiotikum A 40926 kompleks ved søjle-kromatografering og fortrinsvis ved reversfase-søjlekro-matografering. Den foretrukne stationære fase i tilfælde af reversfase-søjlekromatografering er silaniseret silika-gel. Der kan imidlertid også opnås gode resultater ved 20 søjlekromatografering på ikke-funktionaliserede polysty renharpikser og akryliske harpikser såsom dem der sælges under varemærkerne "Amberlite" ® XAD-2, XAD-4, XAD-7 og XAD-8 (fra Rohm og Haas) eller "Diaion" HP 20 (Mitsubishi). I tilfælde af at reversfase-rensningstrinnet ud-25 føres ved hjælp af en silaniseret silikagel som den stationære fase for-ækvilibreres kolonnen fortrinsvis med en pufret vandig opløsning ved pH mellem 4 og 9 og fortrinsvis mellem 5,5 og 6,5, og derefter elueres der med en lineær gradient af et polært vandblandbart opløsnings-2o middel i samme pufrede opløsning. Repræsentative eksempler på polære vandblandbare opløsningsmidler er vandopløselige alkoholer (fx metanol, ætanol, isopropanol og n-butanol), acetone, acetonitril, tetrahydrofuran, dioxan, dimetyl-formamid og blandinger deraf; det foretrukne polære vand-25 blandbare opløsningsmiddel er acetonitril.

De eluerede fraktioner bestemmes med hensyn til antibiotikumindhold ved hjælp af de sædvanlige biobestem-

DK 161092 B

14 melsesmetoder såsom papirskivebestemmelser eller agardiffusionsbestemmelser på følsomme mikroorganismer. Eksempler på følsomme organismer er Bacillus subtilis og S. aureus.

Kromatograferingen kan også hensigtsmæssigt over-2 våges ved TLC- eller HPLC-teknikker.

En foretrukken HPLC-teknik repræsenteres af en reversfase-HPLC under anvendelse af en kolonne af porøse og kugleformede partikler af silaniseret silikagel funk-tionaliseret ved C-18 alkylgrupper med en diameter på .jq fortrinsvis 5 mikrometer (såsom 5 μιη "Ultrasphere" ODS

Altex fra Beckman Co.), en for-kolonne som er en silikagel funktionaliseret med C-18 alkylgrupper (såsom RP 18 Brownlee Labs) og en eluent som er en lineær gradientblanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel så-som et af dem der er beskrevet ovenfor, i en vandig puf-ret opløsning.

Fortrinsvis reguleres denne opløsning til pH 5- 7. Et i særlig grad foretrukket elueringsmiddel er repræsenteret af en lineær gradient fra 5 til 60% elueringsmid-2Q del B i elueringsmiddel A, hvor elueringsmiddel A er en blanding af acetonitril/vandig puffer pH 5-7, 10:90, og elueringsmiddel B er en blanding af acetonitril/vandig puffer pH 5-7, 70:30. Som kendt i teknikken kan mange stoffer bruges som intern standard. En meget hensigtsmæs-2^ sig standard er i dette tilfælde teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.), der har en retentionstid der ligger nær ved forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse i dette HPLC-system. Dette standardstof er kendt og er beskrevet i GB patentskrift A 2121401.

2Q Fraktioner med ensartet antibiotikumindhold forenes og afsaltes som beskrevet ovenfor til frembringelse af i det væsentlige rent antibiotikum A 40926 faktor A, faktor B, faktor Bq, faktor PA og faktor PB.

I det væsentlige rent antibiotikum A 40926 faktor 22 A o? antibiotikum A 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bq, antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB vindes fra de fraktioner der indeholder

DK 161092 B

15 dem ved hjælp af forskellige kendte teknikker såsom frysetørring, udfældning ved hjælp af .ikke-opløsningsmidler eller udfældning ved ændring af pH-værdien af den vandige opløsning.

5 En hensigtsmæssig fremgangsmåde indbefatter tilsæt ning af et opløsningsmiddel med evne til at danne azeotrope blandinger med vand, fjernelse af vandet ved azeotrop destillation og derefter ved filtrering opsamle det bundfald der vindes ved tilsætning af et ikke-opløsningsmid-10 del såsom de ovenfor beskrevne.

Antibiotikum A 40926 faktorerne PA og PB er, i det mindste under visse gæringsbetingelser, de antibiotiske hovedprodukter af den A 40926-producerende mikroorganisme. Antibiotikum A 40926 faktorerne A og B er i hoved-15 sagen omdannelsesprodukter af henholdsvis antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB og er ofte allerede til stede i gæringssuppen.

Det har faktisk vist sig at antibiotikum A 40926 faktor PA kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor 20 A og antibiotikum A 40926 faktor PB og kan omdannes til antibiotikum A 40926 faktor B under basiske betingelser.

Fx omdannes antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB til antibiotikum A 40926 henholdsvis faktor A og faktor B ved behandling med 0,5-10% ammoniak-25 vand eller andre nukleofile baser som fx en organisk amin ved stuetemperatur i 8-24 timer.

Som følge heraf vil der, når gæringssuppen eller en antibiotikum A 40926-holdig ekstrakt eller et koncentrat henstår en vis tid under basiske betingelser (fx en vandig 30 opløsning af en nukleof .il base ved- en pH-værdi på over 9 natten over), vindes et antibiotikum A 40926-kompleks som er beriget med hensyn til antibiotikum A 40926 faktor A og faktor B. Hvis den periode under hvilken gæringssuppen, ekstrakten eller koncentratet deraf er udsat for 35 det basiske miljø er kort, vindes der et antibiotikum A 40926-kompleks som er beriget med hensyn til antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB.

DK 161092 B

16

En foretrukken fremgangsmåde til opnåelse af et antibiotikum A 40926-kompleks der er beriget med hensyn til faktor A og faktor B omfatter derfor den forholdsregel at man lader opløsningen af antibiotikum A 40926 kompleks 5 (der hovedsagelig indeholder antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB) ved stuetemperatur i 8-12 timer i en vandig nu-kleofil base såsom ammoniakvand, hvorpå man isolerer det ønskede antibiotikum-kompleks som beskrevet ovenfor.

Eksempler på A 40926-holdige opløsninger er gærings-10 supper, ekstrakter og fraktioner elueret ved affinitets-kromatografering.

Rent antibiotikum A 40926 kan vindes ved yderligere rensning af det rå kompleks ved affinitetskromatogra-fering som beskrevet foran.

15 Det således vundne produkt, der har biologiske og fysisk-kemiske egenskaber som kan afledes af de rene faktorer deraf, vil i eksemplerne blive benævnt antibiotikum A 40926 kompleks AB.

En foretrukken fremgangsmåde til berigelse af et 2o antibiotikum A 40926-komplekspræparat med hensyn til faktorerne PA og PB indbefatter at man hurtigt neutraliserer de ved affinitetskromatografering eluerede fraktioner med en syre, fortrinsvis en mineralsk syre såsom svovlsyre eller saltsyre.

25 Isolering af rent antibiotikum A 40926 faktorer PA og PB fra dette kompleks kan opnås ved hjælp af en af de ovenfor beskrevne procedurer.

En foretrukken fremgangsmåde indbefatter revers-fase-væskekromatografering, fortrinsvis i kolonner af 30 rustfrit stål under moderat tryk (5-50 bar) eller ved højere tryk (100-200 bar). Den faste fase kan være en silanise-ret silikagel med en kulbrintefase med 2-18 kulstofatomer (især foretrukket C 18) eller en fenylgruppe, og elue-ringsmidlet er en blanding af et polært vandblandbart 35 opløsningsmiddel som defineret foran og en vandig puffer ved en pH-værdi som er forenelig med harpiksen (fortrinsvis pH 4-8).

DK 161092 B

17

Elueringen overvåges på sædvanlig måde og de fraktioner som har homogent antibiotikumindhold forenes og behandles som beskrevet ovenfor til isolering af de rene forbindelser med de rene forbindelser med de nedenfor 5 angivne karakteristika.

Sofistikeret HPLC-analyse har vist at antibiotikum A 40926 faktor B faktisk er en blanding af to faktorer der benævnes faktor Bq og faktor B^.

Antibiotikum A 40926 faktor Bq, der tegner sig 10 for ca. 90% af antibiotikum A 40926 faktor B, er den faktor som har R på 1,22 i forhold til teicoplanin A£ kom ponent 2 i det system der er beskrevet nedenfor under punkt D med hensyn til fysisk-kemiske karakterer for faktor B, mens faktor B^, der tegner sig for ca. 10% af an- 15 tibiotikum A 40926 faktor B, er den faktor med den relative R -værdi på 1,27 i samme system.

Rent antibiotikum A 40926 faktor Bq vindes ved yderligere rensning af antibiotikum A 40926 faktor B fx ved gentagelse af den reversfase-kromatograferingsproce-20 dure der er anvendt til isolering deraf.

De fysisk-kemiske og biologiske egenskaber af antibiotikum A 40926 faktor Bq er i det væsentlige identiske med dem for antibiotikum A 40926 faktor B, med den forskel at HPLC-analysen i et system som det ovenfor citerede 25 kun udviser én top (Rt = 1,22 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 i det beskrevne HPLC-system).

På grund af de ovenfor angivne ligheder mellem antibiotikum A 40926 faktor B og antibiotikum A 40926 faktor Bq gælder det i nærværende beskrivelse med tilhø-3q rende krav at henvisning til biologiske egenskaber af antibiotikum A 40926 faktor B skal forstås som refererende også til antibiotikum A 40926 faktor Bq som er hovedkomponenten (ca. 90%) af antibiotikum A 40926 faktor B og i hovedsagen bidrager til dets biologiske egenskaber.

De antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen kan også isoleres fra gæringssuppen eller yderligere renses med stærke eller svage anionbytterharpikser, herunder

DK 161092B

18 funktionaliserede polystyren-, akryliske eller polydextran-matrixer. Eksempler på svage anionbytterharpikser er dem der sælges under følgende varemærker: "Dowex" ® MWA-1 eller WGR (Dow Chemical), "Amberlite" ® IRA-73 (Rohm and 5 Haas), DEAE-"Sephadex" ® (Pharmacia). Eksempler på stærke anionbytterharpikser som kan bruges i henhold til opfindelsen indbefatter dem der sælges under følgende handelsnavne: "Dowex" ® MSA-1, SBR, SBR-P (Dow Chemical), "Amber-lite"® IR-904 (Rohm and Haas) og QAE-"Sephadex" ® 1Q (Pharmacia).

Eluering af de antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen fra disse harpikser udføres ved hjælp af lineære gradientblandinger af vandige opløsninger af elektrolytter såsom natrium- eller kaliumhydroklorider, i vand eller 15 blandinger af vand og et vandblandbart opløsningsmiddel såsom en lavtkogende alkohol (fx en alkanol) eller en lavtkogende alkylketon, fx acetone.

Som allerede nævnt har de antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen sure og basiske funktioner og kan danne 20 salte på konventionel'måde. Repræsentative og egnede syreadditionssalte af forbindelserne ifølge opfindelsen er salte dannet ved standardreaktion med både organiske og uorganiske syrer som fx saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre, fosforsyre, eddieksyre, trifluoreddikesyre, triklor-25 eddikesyre, ravsyre, citronsyre, askorbinsyre, mælkesyre, maleinsyre, fumarsyre, palmitinsyre, cholsyre, pamoesyre, mucinsyre, glutaminsyre, kamfersyre, glutarsyre, glykol-syre, ftalsyre, vinsyre, laurinsyre, stearinsyre, salicylsyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre, sorbinsyre, picrin-20 syre, benzoesyre og kanelsyre.

Repræsentative eksempler på egnede baser er alkalimetal- eller jordalkalimetalhydroxyder såsom natrium-, kalium- og kalciumhydroxyd, ammoniak og organiske aminer, være sig alifatiske, alicykliske eller aromatiske såsom 25 metylamin, dimetylamin, trimetylamin og picolin.

Omdannelsen af de frie aminoforbindelser eller ikke-saltforbindelser ifølge opfindelsen til de tilsvarende

DK 161092 B

19 additionssalte og omvendt, dvs. omdannelse af et additionssalt af en forbindelse ifølge opfindelsen til ikke-• saltform eller fri aminform, ligger inden for normal teknisk viden og omfattes af den foreliggende opfindelse.

5 Fx kan en forbindelse ifølge opfindelsen omdannes til det tilsvarende syre- eller baseadditionssalt ved opløsning af ikke-saltformen i et vandigt opløsningsmiddel og tilsætning af et svagt molært overskud af den valgte syre eller base. Den resulterende opløsning eller sus-1 q pension frysetørres herefter til udvinding af det ønskede salt.

I tilfælde af at det endelige salt er uopløseligt i et opløsningsmiddel hvor ikke-saltformen er opløselig, udvindes saltet ved filtrering fra den organiske opløs-15 ning af ikke-saltformen efter tilsætning af den støkiometriske mængde eller svagt molært overskud af den valgte syre eller base. Ikke-saltformen kan fremstilles ud fra et tilsvarende syre- eller basesalt opløst i et vandigt opløsningsmiddel som derefter neutraliseres til at frigø-2Q re ikke-saltformen.

Når efter neutralisationen afsaltning er nødvendigt kan der bruges en almindelig afsaltningsprocedure. Fx kan der hensigtsmæssigt bruges søjlekromatografering på silaniseret silikagel, ikke-funktionaliseret polystyren 25 eller akryliske harpikser eller polydextranharpikser med kontrolleret porestørrelse (fx "Sephadex" ®LH 20) eller aktiveret kul. Efter eluering af de uønskede salte med en vandig opløsning elueres det ønskede produkt ved hjælp af en lineær gradient eller en trinvis gradient af en 5Q blanding af vand og et polært eller apolært organisk opløsningsmiddel såsom acetonitril/vand fra 50:50 til ca.

100% acetonitril.

Som kendt i teknikken kan der bruges saltdannelse enten med farmaceutisk acceptable syrer (eller baser) 25 eller farmaceutisk ikke-acceptable syrer (eller baser) som en hensigtsmæssig rensningsteknik. Efter dannelse og isolering kan saltformen af et A 40926-antibiotikum 20

DK 161092 B

omdannes til det tilsvarende ikke-salt eller til et farmaceutisk acceptabelt salt.

I nogle tilfælde er baseadditionssaltet af en forbindelse ifølge opfindelsen mere opløseligt i vand og 5 hydrofile opløsningsmidler.

Fysisk-kemiske karakterer af antibiotikum A 40926 faktor A

A) Det ultraviolette absorptionspektrum, der er vist på tegningens fig. 1, udviser følgende absorptionsmaxima: 10 λ max (nm) a) 0,IN HC1 281 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) ^ c) 0,IN natrium- eller kaliumhydroxyd 300 d) metanol 282 e) fosfatpuffer pH 9,0 282 300 (skulder) B) Det infrarøde absorptionsspektrum, der er vist ? 0 på tegningens fig. 2, udviser følgende absorptionsmaxima (i cm"1): 3700-+3100, 3100-2800 (nujol); 1655; 1620-1560; 1510; 1480-1410 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1250; 1250-1190; 11-950; 845; 810; 720 (nujol).

2 c i J C) H-NMR-spektret er vist på fig. 3 og udviser føl gende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz og opno.teret i DMSO-d, (hexadeuterodimetylsulfoxid) med tetrametylsilan b (TMS) som intern standard (0,00 ppm), (δ = ppm)s δ 0,86 (t'er, 6H); 1,20 (*vllH); 1,43 (2H); 2,01 (2H); 2,31-2,34 30 (3H); 4-6,2 U/16H); 6,2-8 (^*23H); 8,44, 9,22, 9,66 (brede bånd; mobile protoner); 2,5-4: interferens fra ^O-toppe.

D) Retentionstid (Rfc) 0,60 i forhold til testosteron (Roussel Uclaf) ved analyse ved reversfase-HPLC under føl- gende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μια) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 35 21

DK 161092 B

for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) elueringsmiddel A: CH^CN 10% \ reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90% J til pH 6,0 5 elueringsmiddel B: CH^CN 70%"] reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel ^ q Bi elueringsmiddel A i 40 minutter.

strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 15 E) Elementæranalyse efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (Aw 4,6%), viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gen- 20 nemsnit): kulstof 55,82%, hydrogen 5,17%, nitrogen 6,31%, klor (ialt) 4,24%, klor (ionisk) 0,37%. Uorganisk rest ved 900°C i luft: 1,2%.

F) Syre-base titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ 25 vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af overskud af HC1, hvilket viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for PkMCS: 4r6> 5,6, 7,2, 9,2.

G) En Rf-værdi på 0,24 og en R^-værdi i forhold til 30 teicoplanin A2 komponent 2 på 0,70 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2SC>4 7 0 acetonitril 30 35

DK 161092 B

22 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F254 Merck-plader (lagtykkelse 0,25 mm).

Synliggørelse:

Ultraviolet lys.

5 Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanil-syre (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem.

292, 99 (1953)).

Bioautografi under anvendelse af B. subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium.

10 H) Molekylvægt på ca. 1716 anslået ud fra et FAB-MS spektrum som udviser en M+H+ top ved 1717.

Fysisk-kemiske karakterer af antibiotikum A 40926 faktor B 15 A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 4 og udviser følgende absorptionsmaxima: x max (nm) a) 0, IN HC1 282 20 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxid 300 d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) 25 e) metanol 282 B) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 5 og udviser følgende absorptionsmaxima i cm-1: 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625? 1625-1560; 30 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210? 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol).

C) ^H-NMR spektret er vist i fig. 6 og udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz ^H-NMR opnoteret 35 i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (δ = ppm): δ 0,85 (d, isopropyl CHg'er)? 1,15 (<vl3H) ? 1,44 («,2H); 2,02 (2H);

DK 161092 B

23 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 0vl6H); 6,1-8 (*,23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd; mobile protoner). 2,5-4 interferens fra E^O-toppe.

5 D) Retentionstid (Rt) 1,22 og 1,27 i forhold til tei-coplanin A2 komponent 2 (Rt = 20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μπι) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 10 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) elueringsmiddel A: CH^CN 10% ") reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90% J til pH 6,0 15 elueringsmiddel B: CH^CN 70% \ reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel 2q Bi elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 25 intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.) E) Elementæranalyse efter at prøven i forvejen er tør-3Q ret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (Aw 9,6%) viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 54,09%, hydrogen 5,13%, nitrogen 6,34%, klor (ialt) 4,12%, klor (ionisk) 0,39%. Uorganisk rest ved 900°C i luft: 5%.

35 F) Syre-base titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af over-

DK 161092B

24 skud af HC1 (pH 2,1), der viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for 4,5, 5,6, 7,2, 9,2.

G) R^-værdi 0,21 og en R^-værdi i forhold til teico-5 planin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na^O^ 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 ^54 Merck 1 q plader (lagtykkelse 0,25 mm).

Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanil-syre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem.

15 292, 99 (1953)).

Bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium.

H) Molekylvægt på ca. 1730, anslået ud fra et FAB-2Q MS spektrum som udvisér M+H+ toppen ved 1731.

Fysisk-kemiske karakterer af antibiotikum A 40926 faktor Bq___ A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på 2j. tegningens fig. 4 og udviser følgende absorptionsmaxima: λ max (nm) a) 0,IN HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) 30 c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxid 300 d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) e) metanol 282 35 Β) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 5 og udviser følgende absorptionsmaxima (cm_1): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625; 1625-

DK 161092 B

25 1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol).

5 C) ^H-NMR spektret, der er vist i fig. 6, udviser følgende grupper signaler (i ppm) i 270 MHz H-NMR opno-teret i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm) (δ = ppm): δ 0,85 (d, isopropyl CH3'er); 1,15 (<vl3H); 1,44 (^2H); 10 2,02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 U,16H); 6,1-8 U,23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd; mobile protoner). 2,5-4 interferens fra H20-toppe.

D) Retentionstid (Rfc) 1,22 i forhold til teicoplanin 15 A2 komponent 2 (R^ = 20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 20 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) elueringsmiddel A: CH^CN 10% ") reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90% j til pH 6,0 25 elueringsmiddel B: CH^CN 70%Ί reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%j til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A i 40 minutter 30

Strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 35 intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.) 26

DK 161092 B

E) Elementæranalysen viser, efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (Aw 9,6%), følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 54,09%, hydrogen 5,13%, nitrogen 6,34%, 5 klor (ialt) 4,12%, klor (ionisk) 0,39%. Uorganisk rest ved 900°C i luft: 5%.

F) Syre-base titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af over- 1 q skud af HC1 viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for pkMCS: 4,5, 5,6, 7,2, 9,2.

G) R^-værdi 0,21 og en R^-værdi i forhold til teico-planin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske ^ system: 5% v/r vandigt Na2S04 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniserede silikagel 60 F2^4 Merck-plader (lagtykkelse 0,25 mm).

2Q Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre (J. Chromatog. 20, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)).

2i- Bioautograf i under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC

6633 på minimalt Davis medium.

H) Molekylvægt ca. 1730, anslået ud fra et FAB-MS spektrum der udviser M+H+ toppen ved 1731.

30

Fysisk-kemiske karakterer for antibiotikum A 40926 faktor PA ____ A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 7 og udviser følgende absorptionsmaxima: 35 27

DK 161092 B

_λ max (nm) a) 0, IN HC1 282 b) 0,1N kaliumhydroxid 300 c) fosfatpuffer pH 7,38 282 300 (skulder) ^ d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) B) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 8 og udviser følgende absorptionsmaxima 10 (cm"1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1655; 1620-1550; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1260, 1250-950; 845; 805; 720 (nujol).

C) ^H-NMR spektret, der er vist på tegningens fig.

15 9 udviser følgende grupper signaler (i ppm) i 270 MHz ^H~NMR opnoteret i DMSO-dg (-hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (6 = ppm): 0,86, d'er (CH3); 1,15-1,22, m (CH2)n; 1,41, m (CH2); 2,01, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,28, s (N-CH3); 20 4,26-5,96, br (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,33-7,73 br (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er). Her står br for bred, d for dublet, dd for dublet af dubletter, m for multiplet, s for singlet og t for triplet.

25 D) Retentionstid (Rfc) 1,15 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rfc = 20,3 min) ved analyse ved reversfa-se-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μια) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 30 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 pm) elueringsmiddel A: CH3CN 10% reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70% reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 35 28

DK 161092 B

eluering; lineær gradient fra 5% til 60% af elueringsmid-del B i elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min 5 UV-detektor: 25.4 nm intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.) 10 E) R^-værdi i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 på 0,62 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2SC>4 70 acetonitril 30 15 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 ^254 Merck-plader (lagtykkelse 0,25 mm).

Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre 2Q (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99 (1953)).

25 F) Molekylvægt på ca. 1758 anslået ud fra et FAB-MS

spektrum som udviser en klynge toppe med den mest intense top ved 1761. Arbejdsbetingelserne ved FAB-MS analysen var som følger: 3Q Instrument: VG Mod ZAB SE udstyret med FAB gun Ion Tech

Betingelser: Positiv FAB, Xe

Accelererende spænding, 8KV

Matrix: tioglycerol/glycerol 1:1 (rumfang).

35

DK 161092 B

29

Fysisk-kemiske karakterer for antibiotikum A 40926 faktor PB_ A) Det ultraviolette absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 10 og udviser følgende absorptionsmaxima: 5 _λ max (nm)_ a) 0, IN HC1 282 b) 0,1N kaliumhydroxid 300 c) fosfatpuffer pH 7,38 282 1Q 300 (skulder) d) fosfatpuffer pH 9,0 282 300 (skulder) B) Det infrarøde absorptionsspektrum er vist på tegningens fig. 11 og udviser følgende absorptionsmaxima (cm_1): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 1760-1710; 1655; 1620-1560; 1605; 1480-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1270; 1230-1190; 1150, 1120-920; 845; 810; 720 (nujol).

C.l) H-NMR-spektret, der er vist på tegningens fig.

12 udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (6 = ppm) multi- plicitet; (tilskrivning): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,17, m (CH-) ; 1,43, m (CH0), 1,99, s (CHQ); 2,01, m 25 z n z j (CH2); 2,31, s (N-CH3); 2,79, dd (C~H); 3,70, m (C-H); 4,06-6,02, br (peptiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,74, br (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,19-9,99, br (peptidiske NH'er og fenoliske OH'er).

30 C.2) xH-NMR-spektret, der er vist på tegningens fig.

13 udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz i DMSO-dg plus CF3C00D under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (6 = ppm) multiplicitet; (tilskrivning): 0,84, d (isopropyl CH0'er); 1,13, m (CH_) ; 35 j z n 1,40, m (CH2); 1,98, s (CH3); 2,00, m (CH2); 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sukker C-H'er); 4,07-6,09, s og m

DK 161092 B

30 (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,83, s og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,17-10,38 (peptidiske NH'er, fenoliske OH'er).

5 D) Retentionstider (Rfc) på 1,27 og 1,32 i forhold til teicoplanin_A2 komponent 2 (Rt =20,3 min) ved analyse ved reversfase-PHLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μπι) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm 10 for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μιη) elueringsmiddel A: CH^CN 10%" reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90% jtil pH 6,0 15 elueringsmiddel B: CH^CN 70% } reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30% J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmid-20 del B i elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm 25 intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo

Lepetit S.p.A.) E) R^-værdi i forhold til teicoplanin A2 komponent 20 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2S04 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F254 Merc^“ plader (lagtykkelse 0,25 mm).

35 Synliggørelse:

Ultraviolet lys

Gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre

DK 161092B

31 (J. Chromatog. 2:0, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)).

5 F) Molekylvægt på ca. 1772 anslået ud fra et FAB-MS spektrum som udviser en klynge toppe med den mest intense top ved 1776. Arbejdsbetingelserne ved FAB-MS analysen var som følger: 10

Instrument: VG Mod ZAB SE udstyret med FAB gun Ion Tech

Betingelser: Positiv FAB, XE

Accelererende spænding, 8KV

15 Matrix: tioglycerol/glycerol 1:1 (rumfang)

Den antibakterielle aktivitet af forbindelserne ifølge opfindelsen kan påvises in vitro ved hjælp af standard fortyndingsprøver på forskellige mikroorganismekulturer.

20 Dyrkningsmedier og vækstbetingelser til bestemmel ser af MIC (mindste inhiberende koncentration) var som følger: "Isosensitest" suppe ( "Oxoid" ® ), 24 timer for stafylokokker, Streptococcus faecalis og gramnegative bakterier (Escherichia coli, Pseudomonas, Proteus); Todd-25 Hewitt suppe ("Difco" ® ), 24 timer for andre streptokokarter; GC basesuppe ("Difco”®) + 1% "Isovitalex" (BBL), 48 timer, CC>2-beriget atmosfære for Neisseria gonorrhoeae; GB baseagar ("Difco"®) + 1% "Isovitalex" + 0,001% hæmin, 24 timer for Haemophilus influenzae; AC suppe ("Difco'®), 3q 24 timer, anaerob atmosfære for Clostridium perfringens; Wilkins-Chalgren agar (se T.D. Wilkins & S. Chalgren, 1976, Antimicrob. Ag. Chemother. 3j0, 926), 48 timer, anaerob atmosfære for de andre anaerobe organismer (C. difficile, Propionibacterium acnes, Bacteroides fragilis); 35 PPLO suppe ("Difco" ® ) + 10% hesteserum + 1% glukose, 48 timer for Mycoplasma gallisepticum; gærnitrogenbasesuppe ("Difco"® ), 24 timer for Candida albicans. Med undtagel- 32

DK 16 1092 B

se af Candida albicans (30°C) skete inkuberingerne ved 37°C. Podningerne var som følger: 1 rumfangs% af en 48 4 timer gammel suppekultur for M.gallisepticum; ca. 10 - 5 10 kolonidannende enheder/ml for andre suppefortyndings- 4 5 5 MIC-værdier; omkring 10 -10 bakterier/plet (podet med en mangepunkts-inokulator) for agarfortyndinger til bestemmelse af MIC-værdier (H. influenzae, C. difficile, P. Aenes, B. fragilis).

33

DK 161092 B

CQ oo d co co vo m o co m

O O O iH O rH O

». ·» K s w ^ *· O rHtN'i'OOOOOOOCNl’i'COCOCO'a' 'S* jj W N N N iD ω

yr rH pH i—I

ΰ (5 Λ Λ A

CN |χι σι 0

cf < CO

d vo o (£> o o in m

<; ^ LD OOOOOCNO

^4 rH ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ g O £ 0(^^0000000^^00 00 00^ oo 3 \ CO (M OJ CM NO 03

rp rH rH rH rH

H (0 =L Λ Λ Λ 4J d 0 hu η m vo no

ΛΟΟη ro co co no no cn rH co rH

• H g rH rH rH ΟΟγΗΟγΗΟΙΠ 4J ^_| * κ s ^ »* *» ^ ** CO ΟΟΟ OOOOOOO^COOOCO'tfOO'd' -Hi) Λ Ν IN ΙΊ Ό Μ Ό

ν* rH rH rH ι—I

(Q ΑΛΛΑ γο η νο < σ m in no >ο m rH σ γα

ΗιΗΓΊ OOrHOCNO

< w *****·«· Ο ΟΟΟ ΟΟΟΟΟΟΓΗ^ΟΟΟΟΟΟ^ΟΟ-ςΤ 4J VOCMCNCNVDCM^

y rH ι—ί rH rH

(β Λ Λ Λ Λ Ρη ^ Η Η η ε ε \ \ Η 3 3 ^ <υ m 4η · Λ ο υ 7ί (0 ο g) η* VO to Ο Ο · ·Η ΓΗ Η 00 (Λ CM -Η · Φ .—. cn η Coo ιη ετ> ΙΛ 1/1 (Ν ι Ο Η1 ΟΙ Η Η ^ Ό ίο ίο ιο η C oo m σ rH rH ^ η ι/ι ·η m rH rH ·Η ΟΟΟΟσασιΗ Ο Η1 Μ ^JiJUr-l ΗΙ'ΠΙΑΙ0^ΗΟ3 rH Γ" Xi no w w ο υ ^ σ 00 η·Η Επ — η ο Ο ω ut^u U Ν Ο

Ο U U < oDUWUUcnUOoU S

(JSC no cm E-'ihOE-'^ E-'U'S’EhUO

ΕΗθθωσυ<1)<; Eh<C < Eh η <C U £

iC Eh Eh ·Η Γ' (0 (0 < J COM Eh CM CJ

£ CO Ή CO C CD Q) rH fd < CN 0 cncocQE-ij(DC-H(U(UC(l)fdtri cn -h 3 3 3 <u ΰΟΗσΉΟΌΝσίχτΟίηΐΗ-Ρ Q)<U(l)O[Oa)gc0C-H(d(UCrHfc£:C-Hi£!Cii

MShEn-H-HCOPO-HO OOXW-HiHCOO

CCSaH»0(D(l)SH-Hg£|C tn-H CO

fddcaaJ-H^CCOUHUHCSHrHCO-HdCnlO-H

£ Q( a ή ΜΉ-ΗγΗΜ cd CrH

CO (0 CO CO (D-HSHOfiMOOMCOrH

cadDcficoæcooj'COC-Hcdocdmocd 00003333 -pO Cn -rHtT> υοοοουυοεευσίβ'-Ηΐοωω,β oooooooo33cd 3 3 -h to ο .h to uuoooooo-H-ri^fCrH>£:craco6 οοοουυυοΌΌ-ιΗ-ιΗ-Η οο·η co HHHrH Ο Ο Ο 0·η·η C Μ ΐ co-H £ 0(0 cd Ο) ^^^^.μ-Ρ-Ρ-ί-ίΕ-ΐί-ΐΟΟΟί^ΡΟΜ'ΌιΗ s £££:£:ϋ&ι&ιθ4-ι->-ρ·Η[οθ(υ(υΓθ(ΐ)·Ηα) 1 dOiaiSiiCDQJoajtfi'Oidcog.p.ccs.pOo

cd cdcdfdidMPiHSHOOO-HCDOOCUOCO

4J 4J4J4J4J4J-P4J-P1—li—i O cd cd M co to cd cd rH

co cncflcowcococowouorizæi^wi^fflus

DK 161092 B

3 h £ m ^r te

CM

— Μ N VO OO li) N ti? co co rH cm rH co σ\ O i—i d PQ λ σι H S o

O

>) d

g ~ CD

O Λ .¾ d oo - r-1

•H -¾1 -H

-p ·— ΙΟ lO t£> CO lO CM > U iHrHrHCMrHCO rd '—' (DO H g ft Η Λ Od

(Π S (DM

> tn Ό

tn C -H

A! O -P

(D -H

Η — -P <D

di x! td d g M >

O cm m -P -H

x ^ d tji H O CM CM i—I CM (Dd ίο O o <d CM PQ d

Μ σι S O -P

(Do a: <d g ^ Ό

g <D

<d < -PM

p tn o

tn g (D m -P

d > d

<D A! (d d (D

td -H —- IH <D +> +) > m -P i — Ό in d

O O 00 d -H <D

h x! -h d d -H tn -P

(ϋ Μ X ^ O O (D tn

X M ·Η rH rH CM CM rH CM -Η -H in p -H

td O -P o +) +j (ϋ i in

EnddH td td x d (D

O < S P P iti -H p

Cn +> 4J p O I

d d Ό >i d

Cd (D <U g -H

•H O O g O H

p d d d d h (D O O i—I "Η Ή tn (D M Αί d -P o tn g μ o ή •Hg (D <D O (ϋ d <D td Ό 'd d cu <d !s -P d -π -π tn Οι tn <d o otd p -H (D - -

Qj (D Q)PCn-P-P4J

td XJ <D -η td td td

!J1<D -Η -P i—I H ι-H rH

do X A! (D O O O

•hx! — d td rø t n in t n

d P o -H x d -H -H -H

Al P cm -H

P O oo (D (ϋ P A! Ai AJ

-Hd vo XXOitnintn >0 tn tn o -η -η ·η ετ> O X Ό d d d *ϋ em d d -P -π -π ή

•H td O ΙΑ K -Η -H (D iH rH rH

ϋ ·Η g g Al Ai A! η p a % κ κ Μ (D Κ’^Γ'ΐηΗΐη

0) 03 Η Ο Ο σι Ο Ο Ι1 II II II II

+) tn ο ο ο tfl to tø

Α ·Η r—) rH r—I ι—I rH rH O O X

td (D H PQ IK IK

PQ I !S PI X Pi Pi Pi X g S KUK

DK 161092 B

35

Den antimikrobielle aktivitet af stofferne ifølge opfindelsen bekræftes også af forsøg in vivo udført i det væsentlige som beskrevet af R. Pallanza et al., J. Antimicrob. Chemother. 11, 419 (1983). Den eksperimen-5 telle infektion skete hos mus ved intraperitoneal indgift af en suspension af S. pyogenes C 203. Podemængderne var reguleret på en sådan måde at de ubehandlede dyr døde af septicæmi i løbet af 48 timer. Dyrene behandledes subkutant med testforbindelsen ca. 30 minutter efter infek-1 g tionen. EDg^-værdien beregnedes på den 10. dag ved den af Spearman and Karber angivne metode (D.J. Finney "Statistical Methods in Biological Assay", Griffin, side 524, 1952) på basis af den procentuelle overlevelse ved hver dosis. Under de ovennævnte betingelser var ED^q for ^ antibiotikum A 40926 faktor A 0,47 mg/kg, for antibiotikum A 40926 faktor B 0,33 mg/kg, for antibiotikum A 40926 faktor PA 0,54 mg/kg og for antibiotikum A 40926 faktor PB 0,31 mg/kg.

Den tilnærmede akutte toxicitet hos mus (efter 2q intraperitoneal indgift) bedømtes i henhold til kendte metoder. De tilnærmede LD5Q-værdier for antibiotikum A 40926 viste sig at være over 100 mg/kg hos mus efter subkutan indgift hos mus.

Antibiotikum A 40926 kompleks og dets faktorer 2(- A, B, Bq, PA og PB er virksomme mod grampositive bakterier som er ansvarlige for mange vidt udbredte infektioner.

På grund af den stigende resistens hos disse patogener mod de sædvanlige terapeutiske behandlinger er behovet for nye antibiotiske stoffer stadigt stort.

Som allerede anført udviser-de antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen god aktivitet mod Neisseria-stammer såsom Neisseria gonorrhoeae, mens de er praktisk talt uvirksomme mod andre gramnegative bakterier.

Det er kendt at forekomsten af gonorré er steget stadig gennem de seneste 15-20 år.

Bekæmpelsen af denne infektion er for tiden vanskelig på grund af det høje antal geninfektioner som også

DK 161092 B

36 hænger sammen med opførslen af smittede personer som ikke udviser den nødvendige omhu for at undgå overførslen af sygdommen under hele infektionens varighed. På den anden side er der stigende resistens hos den gonorréfremkalden-5 de organisme mod sædvanligt anvendte antibiotika, så at nye sammenstillinger af antibiotika og længere behandlingstider bliver nødvendige. Der er derfor et stigende behov for nye antibiotiske stoffer som kan være effektive til helbredelse af gonokokinfektioner, navnlig infektio-1Q ner af Neisseria gonorrhoeae, med et begrænset antal indgivelser eller endog ved indgift af en enkelt dosis.

Generelt gælder det for antibakteriel behandling med antibiotikum A 40926 kompleks, en af dets faktorer A, B, Bq, PA og PB og ugiftige, farmaceutisk acceptable salte deraf eller blandinger deraf at stofferne kan indgives ad forskellige veje såsom topisk eller parenteralt.

Den parenterale indgift er i almindelighed den foretrukne indgiftsvej.

Præparater til injektion kan have sådanne former 2Q som suspensioner, opløsninger eller emulsioner i olieagti-ge eller vandige bærevæsker, og de kan indeholde adjuvan-ser såsom suspenderingsmidler, stabiliseringsmidler og/el-ler dispergeringsmidler.

Det virksomme stof kan også være i pulverform til 25 rekonstitution ved anvendelsestidspunktet når en passende bærevæske såsom sterilt vand sættes dertil.

I afhængighed af indgiftvejen kan disse forbindelser oparbejdes i forskellige dosisformer.

I nogle tilfælde kan det være muligt at oparbejde 2Q forbindelserne ifølge opfindelsen i såkaldte tarmovertruk-ne dosisformer til oral indgift, og de kan fremstilles på kendt måde (se fx "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. udgave, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, side 1614).

25 Dette kan især være tilfældet når absorptionen af det antimikrobieIle stof i tarmkanalen ønskes i særlig grad samtidig med at det ønskes at stoffet går uændret gennem maven.

DK 161092 37

Den mængde virksomme stof der skal indgives afhænger af forskellige faktorer såsom størrelsen og tilstanden af den person der skal behandles, indgiftvejen og indgifthyppigheden og af hvad der har fremkaldt den tilstand 5 som skal bekæmpes.

De antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen, nemlig antibiotikum A 40926 kompleks, dets faktorer A, PA, B,

Bg og PB og de fysiologisk acceptable salte deraf er i almindelighed effektive ved dagsdoser mellem 0,5 og 50 Ί0 mg virksomt stof pr. kg af patientens legemsvægt, eventuelt opdelt i 1-4 doser om dagen.

Særlig ønskværdige præparater er dem der fremstilles som dosisenheder indeholdende fra ca. 100 til ca.

5000 mg pr. enhed.

15 Når de bruges til enkelt-dosisbehandling af gonorré bør der imidlertid bruges højere minimumsdoser af antibiotikum A 40926 kompleks, dets faktorer A, PA, B, Bq eller PB, i almindelighed mellem 0,5 og 50 mg/kg, for at opretholde en effektiv koncentration i blodet af lægemiddel 20 over en rimelig lang tidsperiode.

Ved behandling af gonorré anvendes der desuden fortrinsvis en parenteral dosisform med forlænget virkning. Præparater med forlænget virkning kan fremstilles ved forskellige mekanismer og metoder som kendt i farmaci- 25 en*

En foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af et præparat med forlænget virkning og indeholdende antibiotikum A 40926 kompleks eller dets faktorer A, B, Bq, PA eller PB indebærer anvendelse af en vanduopløselig 2o form af dette antibiotikum, suspenderet i et vandigt eller olieagtigt medium.

Disse former, dvs. enten som et uopløseligt salt eller som den frie syre, frigives faktisk meget langsomt ved intramuskulær injektion på grund af deres lave vand-25 opløselighed, hvorved de giver blodkoncentrationer med forlænget varighed af det antibiotiske stof.

DK 161092 B

38

Fremstilling af farmaceutiske præparater:

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion kan fremstilles med 5 ml steril suspension USP indehol-5 dende 8% propylenglykol og 1000 mg antibiotikum A 40926 faktor A.

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion kan fremstilles med 5 ml steril suspension USP indeholdende 8% propylenglykol og 500 mg antibiotikum A 40926 fak-10 tor B.

En enhedsdosisform til intramuskulær injektion kan fremstilles med 2000 mg antibiotikum A 40926 faktor B-natriumsalt suspenderet i 5 ml sterilt vand til injektion.

15

De antibiotiske stoffer ifølge opfindelsen er endvidere nyttige til at undertrykke væksten af Clostridium difficile, der fremkalder pseudomembranøs colitis i tarmen. Det antibiotiske stof kan bruges ved behandling af pseudo-20 membranøs colitis ved oral indgift af en effektiv dosis af antibiotiket eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, fremstillet i en farmaceutisk acceptabel dosisform.

Til en sådan anvendelse kan antibiotiket indgives i gelatinekapsler eller som suspension i en væske.

25 Foruden deres virkning som medikamenter kan forbin delserne ifølge opfindelsen bruges til fremme af dyrs vækst.

Til dette formål indgives en eller flere af forbindelserne ifølge opfindelsen oralt i et passende foder.

30 Den anvendte nøjagtige koncentration er den som sikrer at vedkommende dyr indtager det virksomme stof i en vækstfremmende effektiv mængde når de indtager normale foder-mængder.

Tilsætningen af de virksomme forbindelser ifølge 35 opfindelsen til dyrefoder udføres fortrinsvis ved fremstilling af en passende foder-forblanding som indeholder den eller de virksomme forbindelser i en effektiv mængde

DK 161092 B

39 og derefter inkorporerer forblandingen i den fuldstændige foderration.

Man kan også i foderet indblande et koncentrat eller et fodersupplement som indeholder det virksomme 5 stof.

Den måde på hvilken sådanne foderblandinger og fuldstændige foderrationer kan fremstilles og indgives er beskrevet i opslagsbøger .(fx "Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and CO., San Francisco, USA, 1969, eller 10 "Livestock Feeds and Feeding", 0 and B books, Corvallis, Oregon, USA, 1977).

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

15 Eksempel 1 Gæring af Actinomadura sp. ATCC 39727

En kultur af en antibiotikum A 40926-producerende stamme (Actinomadura sp. ATCC 39727) dyrkes på en skråkultur af havremelsagar i 2-3 uger ved 28°C og bruges til 20 podning af en 500 ml stor Erlenmeyer-kolbe indeholdende 100 ml medium sammensat af 0,5% kødekstrakt, 0,5% autolyse- ret gær, 0,5% pepton, 0,3% kaseinhydrolysat, 2% glukose, 0,15% NaCl (pH 7,5 før sterilisation).

Kolben inkuberes ved 28°C på en roterende ryster 25 ved 200 opm i ca. 72 timer hvorpå kulturen overføres til en gæringsbeholder indeholdende 4 liter af ovennævnte medium. Denne kultur dyrkes ved 28°C i ca. 72 timer med en luftning på ca. to liter pr. minut og omrøring ved ca. 900 opm. Derefter bruges denne kultur til at pode 30 en 200 liter stor gæringsbeholder med samme medium. Denne gæringsbeholder luftes med 100 liter steril luft pr. minut og omrøres ved 250 opm ved ca. 28°C. Antibiotikumproduktionen overvåges ved papirskive-agardiffusionsmetoden under anvendelse af Bacillus subtilis på et minimalt medium som testorganisme. Den maximale aktivitet opnås efter 72-96 timer.

DK 161092B

40

Eksempel 2

Udvinding af antibiotikum A 40926 A) Gæringssuppen afkøles til 4°C, bringes til pH 9,5 og omrøres. Efter ca. 1 time filtreres den og filtratet 5 reguleres til pH ca. 3,5 med en vandig mineralsyre. Blandingen omrøres i 30 minutter ved 4°C og filtreres derefter med filterhjælp ("Hyflo-FloMa" ® ). Det klare filtrat kasseres og filterkagen suspenderes i deioniseret vand, reguleres til pH ca. 8,5, omrøres og filtreres derefter.

10

Den herved genvundne filterkage underkastes samme proces.

De forenede filtrater indeholder A 40926.

B) 2 liter opsvulmet D-Ala-D-Ala-e-aminokaproyl-"Se- pharose" ® -modificeret matrix sættes til den ifølge ek-15 sempel 1 vundne gæringssuppe (efter filtrering deraf og efter at det klare filtrats pH-værdi er bragt til ca.

8,5) eller til de forenede filtrater vundet i henhold til foranstående eksempel 2 A. Efter omrøring natten over ved stuetemperatur fraskilles harpiksen ved filtrering 20 og vaskes i rækkefølge med ca. 2 x 10 liter 0,45 mM HC1- TRIS-puffer pH 7,5 (TRIS: 2-amino-2-hydroxymetyl-l,3-pro- pandiol) som indeholder 5% v/r NaCl, og derefter med 4 x 20 liter destilleret vand.

Antibiotikum A 40926 elueres fra harpiksen med 25 2 x 20 liter l%s v/r ammoniakvand. Eluaterne henstår natten over ved stuetemperatur og koncentreres derefter til et ringe rumfang (ca. 2,5 liter). Vand fjernes ved azeo-trop destillation med n-butanol. Derefter tilsættes der petroleumsæter hvorved der udfældes 3,4 g råt antibioti-30 kum A 40926 kompleks.

Eksempel 3

Rensning af antibiotikum A 40926 kompleks. AB 35 Råt antibiotikum A 40926 kompleks, opnået i dét væsentli

ge ved fremgangsmåden i foranstående eksempel 2 (750 mg; HPLC-titer 70%) opløses i 400 ml vand, reguleres til pH

DK 161092 B

41 7,5 og filtreres. Derefter underkastes filtratet affini-tetskromatografering på en D-Ala-D-Ala-ε-aminokaproyl-"Sepharose"® -kolonne (50 ml opsvulmet harpiks; lejehøjde 5 cm). Kolonnen, ækvilibreret med 0,16% v/r ammoniak 5 indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 7,5 med HC1, fremkaldes med følgende tre pufferopløsninger i rækkefølge: puffer A: 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 7,5 med HC1 (2,6 kolonnelejerumfang); 10 puffer B: 0,16% v/r ammoniak indeholdende 2M NaCl reguleret til pH 9,5 med HC1 (16 kolonnelejerumfang); puffer C: 1% v/r ammoniakvand pH 11,4 (2,6 kolonneleje-1 g rumfang).

Puffer C eluerer antibiotikum A 40926 kompleks AB i en enkelt fraktion. Denne eluerede fraktion reguleres til pH 7,0 og overføres igen til samme affinitetskolonne puf-2q ret med 10 mM TRIS-HC1 pH 7,0. Kolonnen vaskes med destilleret indtil afsaltningen er fuldstændig. Antibioti-ket elueres derefter med 2 kolonnelejerumfang 0,39%s v/r ammoniakvand pH 11,0.

De eluerede fraktioner koncentreres til en lille 2^ vandig blanding og frysetørres derefter. Der vindes 374 mg rent antibiotikum A 40926 kompleks AB.

Eksempel 4

Isolering af antibiotikum A 40926 faktor A og B

A) 3,3 g antibiotikum A 40926 kompleks vundet i henhold til eksempel 2, eller 2,3 g antibiotikum A 40926 kompleks AB vundet i henhold til eksempel 3, suspenderes i 0,5 ml vand, omrøres og filtreres derefter. Det klare filtrat overføres til en silaniseret silikagelkolonne 35 (200 g; lejehøjde 18 cm; silaniseret silikagel 60; 70-230 mesh, Merck Inc.), for-ækvilibreret med opløsning A (0,001M vandig natrium-EDTA indeholdende 0,25% v/r

DK 161092 B

42

Nal^PO^.I^O og 2,5% v/r NaCl reguleret til pH 6,0 med NaOH). Kolonnen elueres med en lineær gradient fra 0% til 40% (rumfang) acetonitril i opløsning A med et samlet rumfang på ca. 7 liter i løbet af ca. 48 timer. Der 5 opsamles fraktioner på ca. 15,5 ml og de prøves ved biobestemmelse på Bacillus subtilis og analyseres ved HPLC. Fraktioner med ensartet antibiotikumindhold forenes. Fraktionerne nr. 310-330 og nr. 348-365 indeholdt de antibiotiske stoffer der er betegnet henholdsvis A 40926 1 q faktor A og A 40926 faktor B.

B) De forenede fraktioner indeholdende de enkelte fraktioner A 40926 faktor A og faktor B koncentreres under nedsat tryk for at fjerne acetonitril, fortyndes 15 med vand (ca. det dobbelte rumfang af de oprindelige opløsninger) og overføres til en silaniseret silikagelkolon-ne af den ovenfor beskrevne type (rumfang af den opsvulmede matrix: 50 ml; lejehøjde 15 cm). Kolonnen vaskes med deioniseret vand indtil afsaltningen er fuldstændig og 2ø fremkaldes til sidst med acetonitril/vand 60:40 (rumfang).

De eluerede fraktioner koncentreres under nedsat tryk og remanenserne frysetørres til udvinding af 134 mg antibiotikum A 40926 fra den første gruppe eluerede fraktioner (ovennævnte fraktioner 310-330) og 206 mg A 25 40926 faktor B fra den anden gruppe eluerede fraktioner (ovennævnte fraktioner 348-365).

Eksempel 5

Isolering af antibiotikum A 40926 faktor PA og faktor PB

3o--;-

Ved i det væsentlige at ga frem som beskrevet i eksempel 2 A og det første trin i eksempel 2 B elueres det til harpiksen koblede antibiotikum med 2 x 20 liter l%s v/r ammoniakvand. Eluaterne reguleres til pH 7,8 med svovlsyre og koncentreres til et lille rumfang under va-35 kuum ved azeotrop destillation med n-butanol for at vinde et vandigt koncentrat som derefter filtreres på papir.

DK 161092 B

43

Det udvundne filtrat indeholder antibiotikum A 40926 faktor PA, A 40926 faktor PB og mindre mængder A 40926 faktor A og faktor B (HPLC). En prøve på 10 ml af dette vandige koncentrat indeholdende ca. 50 mg/ml rent antibioti-5 kum A 40926 kompleks (HPLC-analyse) filtreres på et filter med en porestørrelse på 5 μπι ("Acrodisc"; Gelman Science Inc.) og overføres derefter til en kolonne af rustfrit stål (diameter 2 cm) indeholdende 20 g oktadecyl-silyl-reversfase-silikagel ("Lichrosorb"® RP 18, Merck JO Inc; partikelstørrelse 10 μιη) . Silikagelen pakkes derefter under moderat tryk (et nominelt tryk på ca. 14 bar) i en kolonne af rustfrit stål hørende til et "Chromatospac Modulprep" apparat (Yoben Yvon, Frankrig) og ækvilibreres med en blanding bestående af acetonitril og 18 mM natrium-15 fosfatpuffer pH 6,0, 25:75 (rumfang). Elueringen udføres med samme opløsningsmiddelblanding som brugtes til ækvili-breringen og med en strømningshastighed på ca. 10,5 ml/min. Eluatet overvåges ved biobestemmelse på Bacillus subtilis og ved HPLC. De fraktioner som har ensartet antibiotikum-2o indhold forenes og de homogene fraktioner af 5 kromatografiske gennemløb koncentreres for at afdampe det organiske opløsningsmiddel.

Den resulterende opløsning fortyndes med vandigt 1M natriumklorid til det dobbelte af det oprindelige rum-25 fang og overføres til en silaniseret silikagelkolonne (50 g; lejehøjde 5 cm; silaniseret silikagel 60, Merck Inc.) ækvilibreret med vand.

Kolonnen vaskes med deioniseret vand indtil afsalt-ningen er fuldstændig (ingen udfældning af AgCl i eluater-30 ne efter tilsætning af vandigt AgNO^) og elueres derefter med acetonitril/vand 1:1 (rumfang). De eluater som har ensartet antibiotikumindhold (HPLC-analyse) forenes, koncentreres til et lille rumfang ved azeotrop destillation med n-butanol til opnåelse af en vandig fase som derefter 35 frysetørres. Udbytter: antibiotikum A 40926 faktor PA: 55 mg antibiotikum A 40926 faktor PB: 51 mg

DK 161092 B

44 antibiotikum A 40926 faktor A: 38 mg antibiotikum A 40926 faktor BQ: 33 mg

Eksempel 6

Anden fremgangsmåde til isolation af antibiotikum A 40926 faktor B_

Det forenede koncentrat af to præparater fremstillet i henhold til eksempel 2 (sidste trin) filtreres og filtratet overføres til en silaniseret silikagel-kromato- 10 grafikolonne (400 g; lejehøjde 30 cm; silikagel 60, 70- 230 mesh, Merck Inc.) for-ækvilibreret med vand.

Kolonnen skylles med 6 liter vand og det adsorbe- rede antibiotikum elueres med acetonitril/vand i henhold til følgende rækkefølge, hvor procenterne er rumfangspro-15 center: 2,7 liter 5% acetonitril i vand 1,6 liter.10% acetonitril i vand 2,97 liter 15% acetonitril i vand 3,15 liter 20% acetonitril i vand.

20

Der opsamles fraktioner på ca. 18 ml. Aktiviteten af de eluerede fraktioner afprøves ved papirskive-biobestemmel-se på følsomme mikroorganismer såsom Bacillus subtilis og analyseres ved HPLC. Fraktioner med ensartet antibiotikumindhold forenes (fraktionerne nr. 472-526) og koncen-25 treres under nedsat tryk. Der sættes n-butanol til dette koncentrat for azeotropt at fjerne vand. Den butanoliske opløsning som er tilbage koncentreres derefter til et lille rumfang for at udfælde A 40926 faktor B (1,4 g).

Dette produkt vaskes med petroleumsæter under omrøring 30 og opsamles ved filtrering (3 gange). Efter tørring under vakuum vindes der 760 mg A 40926 faktor B.

Ved på ny at underkaste antibiotikum A 40926 faktor B den ovenfor beskrevne søjlekromatografering vindes der et produkt (540 mg) i form af antibiotikum A 40926 fak-35 tor Bq, der har samme fysisk-kemiske karakterer som er beskrevet foran for antibiotikum A 40926 faktor B, med den forskel at det kun udviser én top ved HPLC-analyse,

DK 161092 B

45 nemlig toppen med retentionstid 1,22 i forhold til teico-planin A2 komponent 2.

Eksempel 7

Omdannelse af antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum 40926 faktor PB til antibiotikum A 40926 henholds- vis faktor A og faktor B_

Antibiotikum A 40926 faktor PA og antibiotikum A 40926 faktor PB (50 mg) opløses hver for sig i 2,5 ml ^ vandigt l%s v/r NH^OH og de resulterende opløsninger opbevares i ca. 24 timer ved stuetemperatur under omrøring. Antibiotikum A 40926 faktor A vindes fra den opløsning der oprindelig indeholdt antibiotikum A 40926 faktor PA, og antibiotikum A 40926 faktor B vindes fra den opløsning der oprindelig indeholdt antibiotikum A 40926 faktor PB ved fjernelse af vand ved azeotrop destillation med n-butanol, udfældning med ætylæter og opsamling af bundfaldet ved filtrering (udbytte ca. 75%).

Fremstilling af D-Ala-D-Ala-"Sepharose" ® --i---- 1 g aktiveret CH-"Sepharose" ^ 4b (Pharmacia Fine

Chemicals) kvældes i 15 minutter i 1 mM iskold saltsyre og vaskes med samme opløsning. Den vundne gel, ca. 3 ml, blandes med en opløsning af 30 mg D-alanyl-D-alanin i 25 0,5M natriumklorid og 0,1M natriumbikarbonatpuffer ved pH 8. Blandingen underkastes rotation og endevending i 1 time ved stuetemperatur.

Efter at koblingsreaktionen er fuldført bortvaskes overskud af ligand med pufferen. De ubundne aktiverede 30 grupper af dextranbæreren blokeres ved behandling deraf med 1M ætanolamin-hydroklorid ved pH 9 i 1 time.

(g\

Derefter udvindes den "Sephadex" w-e-aminokaproyl- D-alanyl-D-alanin-modificerede matrix ved filtrering og vaskes grundigt skiftevis med 0,5M natriumklorid og 0,1M 35 natriumacetat pH 4, og med 0,5M natriumklorid og 0,1M tris-(hydroxymetyl)-aminometanpuffer pH 8 (fire gange).

Claims

1. D) retentionstider (Rfc) på 1,22 og 1,27 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (Rfc = 20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 pm) "Altex" (Beckman) 15 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μιη) elueringsmiddel A: CH3CH 10% reguleret 2Q (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70% ) reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 25 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% af elueringsmiddel B i elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min

30 UV-detektor: 254 nm intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.); 3c- E) elementæranalyse efter at prøven i forvejen er blevet tørret ved ca. 140°C under inert atmosfære (Aw 9,6%) viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning DK 161092 B (gennemsnit): kulstof 54,09%, hydrogen 5,13%, nitrogen 6,34%, klor (ialt) 4,12%, klor (ionisk) 0,39%; uorganisk rest ved 900°C i luft: 5%;

1. Antibiotisk stof, kendetegnet ved at det udgøres af antibiotikum A 40926 faktor A, antibiotikum A i- 40926 faktor B, antibiotikum A 40926 faktor Bq, antibiotikum A 40926 faktor PA, antibiotikum A 40926 faktor PB eller en blanding af to eller flere af disse eller additionssalte deraf eller den blanding som indeholder de fem nævnte coproducerede antibiotiske faktorer og som kan opnås ved ^q dyrkning af stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 (betegnet antibiotikum A 40926 kompleks), hvilke faktorer har følgende egenskaber i ikke-saltform: ^Stibiotikum_A_40926_faktor_A_i_ikke^saltform ^ A) ultraviolet absorptionsspektrum som udviser føl gende absorptionsmaxima: _λ max (nm) a) 0, IN HC1 281 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) 20 c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxid 300 d) metanol 282 e) fosfatpuffer pH 9,0 282 300 (skulder) 25 B) infrarødt absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima (cm ^): 3700-3100, 3100-2800 (nujol); 1655; 1620-1560; 1510; 1480-1410 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1250; 1250-1190; 1100-950; 845; 810; 720 (nujol); 30 C) ^H-NMR-spektrum der udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz målt i DMSO-d^ (hexadeutero-dime-tylsulfoxid) med tetrametylsilan (TMS) som intern standard (0,00 ppm), (6 = ppm): δ 0,86 (t'er, 6H); 1,21 35 (fvllH); 1,43 (2H); 2,01 (2H); 2,31-2,34 (3H); 4-6,2 (-ul6H); 6,2-8 (^.23H); 8,44, 9,22, 9,66 (brede bånd; mobile protoner), 2,5-4: interferens fra ^O-toppe; DK 161092 B D) retentionstid (R^) på 0,60 i forhold til testosteron (Roussel Uclaf) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μπι) "Altex" (Beckman) 5 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) elueringsmiddel A: OL^CN 10% 1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH-jCN 70% reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 15 eluenng: lineær gradient fra 5% til 60% af elueringsmiddel B i elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min 20 UV-detektor: 254 nm E) elementæranalyse efter at prøven i forvejen er tørret ved ca. 140°C under en inert atmosfære (aw 4,6%) 25 viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit): kulstof 55,82%, hydrogen 5,17%, nitrogen 6,31%, klor (ialt) 4,24%, klor (ionisk) 0,37%. Uorganisk rest ved 900°C i luft: 1,2%; 30 f) syre-base-titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af over- 35 DK 161092B skud af HC1 viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for pk^g: 4,6, 5,6, 7,2, 9,2; G) R^-værdi på 0,24 og en R^-værdi i forhold til 5 teicoplanin komponent 2 på 0,70 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2SO^ 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 Merck- *1 q plader (lagtykkelse 0,25 mm); synliggørelse: ultraviolet lys, gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanil-syre (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 15 292, U953)), bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium; H) molekylvægt på ca. 1716 anslået ud fra et FAB-MS 2. spektrum der udviser M+H+ toppe ved 1717; ^tibiotikum_A_40926_f aktor _B_i_ikke-saltf orm A) ultraviolet absorptionsspektrum der udviser føl gende absorptionsmaxima: 25 _λ max (nm) a) 0,IN HC1 282 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxid 300 og d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) e) metanol 282 B) infrarødt absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima (cm ^): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 35 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; 840; 810; 720 (nujol); DK 161092 B C) ^H-NMR-spektrum der udviser følgende grupper sig naler (i ppm) ved 270 MHz med ^H-NMR målt i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS son intern standard (0,00 ppm), (δ = ppm): δ 0,85 (d, 5 isopropyl CH-^'er); 1,15 (.^13H); 1,44 (~2H); 2,02 (2H); 2,32-2,35 (3H); 4-6,1 U16H); 6,1-8 (~23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd; mobile protoner), 2,5-4 interferens fra toppe;

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et antibiotisk stof ifølge krav 1, kendetegnet ved at man dyrker stammen Actinomadura sp. ATCC 39727 eller en antibiotikum A 40926-producerende mutant deraf med i det væsentlige samme egenskaber under submerse aerobe betingelser 15 i nærværelse af assimilerbare kilder til kulstof, nitrogen og uorganiske salte, udvinder og isolerer antibiotiket fra gæringssuppen og om ønsket omdanner det til et salt deraf.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at stammen dyrkes ved en temperatur mellem 20 og 40°C, 20 fortrinsvis mellem 24 og 35°C.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved at udvindingen og isolationen af de antibiotiske stoffer opnås ved at den filtrerede gæringssuppe underkastes affinitetskromatografering på immobiliseret D-alanyl-D-alanin efterfulgt af fordelings-, reversfasekromatografering eller ionbytterkromatografering.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at der i udvindingen af det antibiotiske stof indgår følgende: 3Ω J a) at gæringssuppen underkastes affinitetskromatogra fering på immobiliseret D-alanyl-D-alanin, b) at man hurtigt neutraliserer de forenede antibioti-kumholdige eluerede fraktioner og c) at man om ønsket isolerer antibiotikum A 40926 35 faktorerne PA, PB, A, B og Bq ved hjælp af reversfase- væskekromatografering på silaniseret silikagel. DK 161092 B

5 F) syre-base-titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MSC)/ vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af overskud af HC1 (pH 2,7) viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for pkMCS: 4,5, 5,6, 7,2, 9,2;

10 G) R^-værdi 0,21 og en Rf-værdi i forhold til teico- planin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2S0^ 70 acetonitril 30 15 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F2^ Merck-plader (lagtykkelse 0,25 mm) synliggørelse: ultraviolet lys gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanil-20 syre (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)) bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium;

25 H) molekylvægt på ca. 1730 anslået ud fra et FAB-MS-spektrum der udviser M+H+ toppe ved 1731; Antibiotikum_A_4 09 2 6_f-akt.gr _BQ_i_ikke-saltf orm A) ultraviolet absorptionsspektrum som udviser følgen- 30 de absorptionsmaxima: λ max (nm) a) 0, IN HC1 2 82 b) fosfatpuffer pH 7,38 281 300 (skulder) 25 c) 0,1N natrium- eller kaliumhydroxid 300 d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) e) metanol 282 DK 161092 B B) infrarødt absorptionsspektrum som udviser følgende absorptionsmaxima (cm ^): 3700-3080, 3080-2700 (nujol); 1720-1625; 1625-1560; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1295; 1230; 1210; 1150; 1100-1040; 1030; 1015; 970; 890; j. 840; 810; 720 (nujol); C) "^-NMR-spektrum som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz med.^H-NMR målt i DMSO-d^ (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som ^g intern standard (0,00 ppm), (« = ppm): δ 0,85 (d, isopropyl CH3'er); 1,15 U13H); 1,44 U2H); 2,02 (2H); 2,32- 2,35 (3H); 4-6,1 U16H); 6,1-8 U23H); 8,52, 9,30, 9,68 (brede bånd, mobile protoner); 2,5-4 interferens fra H20-toppe; 15 D) retentionstid (Rt) på 1,22 i forhold til teicopla-nin A2 komponent 2 (R^. = 20,3 min) ved analyse ved revers-fase-HPLC under følgende betingelser: 20 kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μπι) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) 25 elueringsmiddel Å: CH3CN 10%Ί reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%.i til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70%1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 30 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% elueringsmiddel B i elueringsmiddel A i 40 minutter strømningshastighed: 1,8 ml/min 35 UV-detektor: 254 nm DK 161092 B intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.); Ξ) elementæranalyse efter at prøven i forvejen er ble- ^ vet tørret ved ca. 140°C under inert atmosfære (Aw 9,6%) viser følgende tilnærmede procentvise sammensætning (gennemsnit) : kulstof 54,09%, hydrogen 5,13%, nitrogen 6,34%, klor (ialt) 4,12%, klor (ionisk) 0,39%; uorganisk rest ved 900°C i luft: 5%; 10 F) syre-base-titreringsprofil i 2-metoxyætanol (MCS)/ vand 4:1 efter titrering med KOH efter tilsætning af overskud af HC1 viser fire ioniserbare funktioner med følgende værdier for pkMQg: 4,5, 5,6, 7,2, 9,2; 15 G) Rf-værdi 0,21 og en Rf-værdi i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2S04 70 2q acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F2g4 Merck-plader (lagtykkelse 0,25 mm) synliggørelse: ultraviolet lys gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanil-25 syre (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)) bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium; 30 H) molekylvægt på ca. 1730 anslået ud fra et FAB-MS-spektrum der udviser M+H+-toppen ved 1731; Ant ib i g t ikum_A _4 0 9 2 6 _ faktor _PA_i _ikke-saltform

35 A) et ultraviolet absorptionsspektrum der udviser følgende absorptionsmaxima: λ max (nm) a) 0,IN HC1 282 b) OflN kaliumhydroxid 300 c) fosfatpuffer pH 7,38 282 300 (skulder) ^ d) fosfatpuffer pH 9,0 283 300 (skulder) B) infrarødt absorptionsspektrum som udviser følgende -1 absorptionsmaxima (cm ): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 10 1760-1710; 1655; 1620-1550; 1505; 1460 (nujol); 1375 (nujol); 1260, 1250-950; 845; 805; 720 (nujol); C) ^H-NMR-spektrum som udviser følgende grupper signaler (i ppm) ved 270 MHz med ^H-NMR målt i DMSO-dg 15 (hexadeuterodimetylsulfoxid) under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (δ = ppm): 0,86, d'er (CH3); 1,15-1,22, m (CH2)n; 1,41, m (CH2); 2,01, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,28, s (N-CH3); 4,26-5,96, br (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,33-7,73 br (aromatiske CH'er og pep-20 tidiske NH'er); D) retentionstid (Rt) 1,15 i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 (R^_ = 20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: 25 kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μπι) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μπι) 30 elueringsmiddel A: CH3CN 10% ) reguleret (2,5 g/1) NaH2P04-H20 90%J til pH 6,0 elueringsmiddel B: CH3CN 70%| reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% af elueringsmiddel B i elueringsmiddel A i 40 minutter 35 DK 161092 B strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm ^ intern standard: teicoplanin komponent 2 (Gruppo Lepetit S.p.A.) E) R^-værdi i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 på 0,62 i følgende kromatografiske system: 1 q 5% v/r vandigt Na2S04 70 acetonitril 30 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 £^54 Merck" plader (lagtykkelse 0,25 mm) synliggørelse: 1 ultraviolet lys, gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre (J. Chromatog. 2£, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)), bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 2q 6633 på minimalt Davis medium; F) molvægt på ca. 1758 anslået ud fra et FAB-MS-spek-trum viser en klynge af toppe med den mest intense top ved 1761. Arbejdsbetingelserne ved FAB-MS-analysen var 2c- som følger: instrument: VG Mod ZAB SE udstyret med FAB gun Ion Tech betingelser: positiv FAB, Xe accelererende spænding, 8KV matrix: tioglycerol/glycerol 1:1 (rumfang) ^Qtibigtikum_A_40926_faktor_PB_i_ikke-saltform A) et ultraviolet absorptionsspektrum som udviser 35 følgende absorptionsmaxima: DK 161092 B λ max (nm) a) 0, IN HC1 282 b) 0,1N kaliumhydroxid 300 c) fosfatpuffer pH 7,38 282 300 (skulder) ^ d) fosfatpuffer pH 9,0 282 300 (skulder) B) infrarødt absorptionsspektrum som udviser følgen de absorptionsmaxima (cm ^): 3700-3100, 3000-2800 (nujol); 10 1760-1710; 1655; 1620-1560; 1605; 1480-1420 (nujol); 1375 (nujol); 1320-1270; 1230-1190; 1150, 1120-920; 845; 810; 720 (nujol); C.l) 1H-NMR-spektrum som udviser følgende grupper signa-15 ler (i ppm) ved 270 MHz i DMSO-dg (hexadeuterodimetylsulf-oxid) under anvendelse af TMS som intern .standard (0,00 ppm), (6 = ppm) multiplicitet; (tilskrivning): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,17, m (CH2)n; 1,43, m (CH2), 1,99, s (CH3); 2,01, m (CH2); 2,31, s (N-CH3); 2,79, dd (C-H); 20 3,70, m (C-H); 4,06-6,02, br (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,74, br (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,19-9,99, br (peptidiske NH'er og fenoliske OH'er); i C.2) H-NMR-spektrum som udviser følgende grupper signa-25 ler (i ppm) ved 270 MHz i DMSO-dg plus CFgCOOD under anvendelse af TMS som intern standard (0,00 ppm), (δ = ppm) multiplicitet; (tilskrivning): 0,84, d (isopropyl CH3'er); 1,13, m (CH2)n; 1,40, m (CH2); 1,98, s (CH3); 2,00, m (CH2); 2,92, dd (C-H); 3,29-3,71, m (sukker C-H'er); 4,07-30 6,09, s og m (peptidiske og aromatiske CH'er); 6,45-7,83, s og m (aromatiske CH'er og peptidiske NH'er); 8,17-10,38 (peptidiske NH'er, fenoliske OH'er); D) retentionstider (Rt) på 1,27 og 1,32 i forhold 35 til teicoplanin A2 komponent 2 (Rfc = 20,3 min) ved analyse ved reversfase-HPLC under følgende betingelser: DK 161092 B kolonne: "Ultrasphere" ODS (5 μια) "Altex" (Beckman) 4,6 mm (indvendig diameter) x 250 mm for-kolonne: Brownlee Labs RP 18 (5 μιη) 5 elueringsmiddel A: CH^CN 10%1 reguleret (2,5 g/1) NaH2P04.H20 90%J til pH 6.0 elueringsmiddel B: CH^CN 70%1 reguleret 10 (2,5 g/1) NaH2P04.H20 30%J til pH 6,0 eluering: lineær gradient fra 5% til 60% af elueringsmiddel B i elueringsmiddel A i 40 minutter I,. strømningshastighed: 1,8 ml/min UV-detektor: 254 nm intern standard: teicoplanin A2 komponent 2 (Gruppo 2q Lepetit S.p.A.) E) R^-værdi i forhold til teicoplanin A2 komponent 2 på 0,53 i følgende kromatografiske system: 5% v/r vandigt Na2S04 70 „r acetonitril 30 25 under anvendelse af silaniseret silikagel 60 F2^4 Merc^“ plader (lagtykkelse 0,25 mm) synliggørelse: ultraviolet lys, 2Q gul farve med Paulys reagens, dvs. diazoteret sulfanilsyre (J. Chromatog. 2J0, 171 (1965), Z. Physiol. Chem. 292, 99, (1953)), bioautografi under anvendelse af Bacillus subtilis ATCC 6633 på minimalt Davis medium; 35 F) molvægt på ca. 1772 anslået ud fra et FAB-MS-spektrum der viser en klynge af toppe med den mest intense top DK 161092 B ved 1776. Arbejdsbetingelserne ved FAB-MS-analysen var som følger: instrument: VG Mod ZAB SE udstyret med FAB gun Ion Tech 5 betingelser: positiv FAB, Xe accelererende spænding, 8 KV matrix: tioglycerol/glycerol 1:1 (rumfang).

6. Fremgangsmåde ifølge krav 2 til fremstilling af antibiotikum A 40926 kompleks, antibiotikum A 40926 faktor A, faktor B eller faktor Bq, kendetegnet ved at man [. a) gør gæringsmassen basisk til en pH-værdi mellem 8,5 og 10,5, b) filtrerer, c) syrner det klare filtrat til pH 2,5-4,5, d) filtrerer og kasserer filtratet, ^ e) suspenderer filterkagen i vand og gør den basisk til en pH-værdi mellem 8 og 9, f) efter udvinding af det rå antibiotikum A 40926 kompleks ved filtrering underkaster det affinitetskromato- grafering på immobiliseret D-alanyl-D-alanin, „ _ q) om ønsket isolerer antibiotikum A 40926 faktor 1 5 A og faktor B ved hjælp af fordelings-, reversfasekromato-grafering eller ionbytterkromatografering, og h) underkaster antibiotikum A 40926 faktor B en yder ligere affinitetskromatografisk behandling såfremt man 2q ønsker A 40926 faktor Bq.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved at kromatografiteknikken er reversfasekromatografe-ring og at den stationære fase er udvalgt blandt silani-seret silikagel og ikke-funktionaliserede polystyrenhar- 2^ pikser.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved at den stationære fase er silaniseret silikagel som er for-ækvilibreret med en pufret opløsning til en pH-værdi mellem 4 og 9 og at elueringsmidiet er en lineær 2Q gradientblanding af et polært vandblandbart opløsningsmiddel i samme pufrede opløsning.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved at det indeholder et antibiotisk stof ifølge krav 1 i blanding med et farmaceutisk acceptabelt bærestof.

10. Mikroorganismestamme til brug ved fremstilling af 3 3 det antibiotiske stof ifølge krav 1, kendetegnet ved at den er stammen Actinomadura sp. ATCC 39727.