KR20220024513A - 다단 크로마토그래피 공정 동안 원치 않는 성분을 제거하기 위한 방법 - Google Patents

다단 크로마토그래피 공정 동안 원치 않는 성분을 제거하기 위한 방법 Download PDF

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KR20220024513A
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트래비스 트랜
앤드류 투스티안
마크 시보로스키
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

단일 크로마토그래피 기질을 사용하여 친화성 분해 및 친화성 포획 공정들을 조합한 고 분해능 친화성 크로마토그래피는 밀접하게 관련된 분자 종 간의 분해능을 개선하고 양특이성 항체와 같은 이종이량체 단백질의 대규모 상업적 생산을 위한 전체 생산 수율을 크게 향상시킨다. 또한, 희석, 한외 여과 또는 정용 여과 없이도, 염 농도를 낮추면서, 산물 순도와 농도를 높일 수 있는 능력을 통해 탱크 및 장비 요건들이 감소된다.

Description

다단 크로마토그래피 공정 동안 원치 않는 성분을 제거하기 위한 방법
본 발명은 단백질 산물의 정제, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피를 통한 단백질의 복합 혼합물로부터 이종이량체 단백질의 정제를 위한 크로마토그래피 공정 스트림으로부터 원치 않는 성분을 제거하는 방법들에 관한 것이다. 구체적으로, 본 방법들은 친화성 크로마토그래피(단백질 A 크로마토그래피 포함)를 통해 단량체 및 동종이량체의 복합 혼합물로부터 이종이량체(양특이성 항체 포함)를 분리하는 단계를 포함하며, 여기서 정제된 이종이량체는 이종이량체 단백질의 추가 다운스트림 공정을 가능하게 하기 위해 저 염도 및 전도도 용출물에 수집된다.
단백질 산물의 정제는 숙주 세포 단백질, DNA 및 원치 않는 단백질종 산물과 같은 불순물을 제거하기 위해 다양한 크로마토그래피 단계들을 이용하는 다단 공정을 필요로 하는 경우가 많다. 많은 경우, 크로마토그래피 칼럼 또는 완충제의 성분은 각 크로마토그래피 단계에서 나오는 용출물의 일부를 형성하지만, 이러한 성분은 다운스트림 공정 단계들에서 바람직하지 않을 수 있다. 예를 들어, 불순물 또는 원치 않는 분자종으로부터 단백질 산물의 분리를 촉진하기 위해 고농도의 염이 사용될 수 있지만, 염은 추가적인 크로마토그래피 단계들 또는 바이러스 불활화와 같은 다운스트림 공정 단계들과 양립할 수 없을 수 있다.
다수의 양특이성 항체 형태들이 제안되었으며 현재 개발 중이다. 이러한 형태들 중 하나는 개선된 약동학적 프로파일 및 최소 면역원성을 갖는 표준 완전 인간형 IgG 항체를 기반으로 한다(전문이 본원에 원용되는 미국 특허 제8, 586, 713호 참조). 단일 공통 경쇄와 두 개별 중쇄들이 결합하여 양특이성 항체를 형성한다. 중쇄들 중 하나는 단백질 A에 대한 Fc*의 결합을 감소시키거나 제거하는 치환된 Fc 서열(이하 "Fc*")을 포함한다. 예를 들어, 이러한 Fc* 서열 중 하나는 CH3 도메인에서의 H435R/Y436F(EU 번호 체계에 의함; 엑손 번호 체계에 의해서는 H95R/Y96F) 치환을 포함한다. 두 중쇄들 및 공통 경쇄의 동시 발현은 세 개의 산물 - 이 중 두 개는 중쇄들에 대한 동종이량체이고 이 중 하나는 원하는 이종이량체 양특이성 산물 - 을 생성한다. Fc* 서열은 고 친화성의 FcFc 중쇄 동종이량체, 또는 약하게 결합하는 Fc*Fc* 동종이량체와 비교하여 단백질 A에 대한 중간 결합 친화성으로 인해 시판되는 친화성 칼럼들에서 FcFc* 양특이성 산물의 선택적 정제를 가능하게 할 수 있다.
양특이성 이종이량체의 상업적 규모의 정제를 달성하기 위해서는 처리될 물질의 체적, 및 정제 공정에 사용되는 장비 및 물질에 대한 비용 및 공간 요건들과 같은 고려 사항들과 함께 FcFc 동종이량체, Fc*Fc 이종이량체, 및 Fc*Fc* 동종이량체 간의 우수한 분해능이 요구된다.
하나 이상의 양태 또는 이의 실시예에서, 본 발명은 크로마토그래피 용출물로부터 성분을 제거하는 방법들로서: (a) 성분이 크로마토그래피 칼럼에 인가된 제1 완충제에 존재하는 제1 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계; (b) 제1 크로마토그래피 단계로부터 중간 용출물을 수집하는 단계 - 중간 용출물은 단백질 산물 및 성분을 함유함 -; (c) 중간 용출물을 크로마토그래피 칼럼에 재인가하고, 중간 용출물의 농도보다 낮은 농도로 성분을 함유하는 제2 완충제를 이용해 단백질 산물을 용출하는 단계; (d) 단계 (c)로부터의 크로마토그래피 용출물을 수집하는 단계 - 성분은 중간 용출물의 농도보다 낮은 농도로 크로마토그래피 용출물에 존재함 -; 및 (e) 크로마토그래피 용출물을 후속 공정 단계에 인가하는 단계를 포함하는, 방법들에 관한다. 일부 실시예들에서, 성분은 제2 완충제에 존재하지 않는다.
일부 실시예들에서, 성분은 염이다. 일부 경우들에서, 중간 용출물 중 염의 농도는 50 mM을 초과한다. 일부 경우들에서, 중간 용출물 중 염의 농도는 ≥ 100 mM, ≥ 250 mM, ≥ 500 mM, ≥ 600 mM, ≥ 700 mM, ≥ 800 mM, ≥ 900 mM, 또는 ≥ 1000 mM이다. 일부 경우들에서, 중간 용출물 중 염 농도는 500 mM ± 50 mM이다.
일부 실시예들에서, 제1 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 후속 공정 단계는 제2 크로마토그래피 단계이다. 일부 경우들에서, 후속 공정 단계는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피, 또는 바이러스 불활화로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 단백질 산물은 항체(예를 들어, 양특이성 항체)이다.
하나 이상의 양태 및 이의 실시예에서, 본 발명은 친화성 포획 및 용출 공정을 채용함으로써, 동종이량체 및 이종이량체를 포함하는 단백질의 복합 혼합물로부터, 예를 들어 양특이성 항체와 같은 이종이량체 단백질을 정제하는 방법들에 관한다.
일 양태에서, 본 발명은 이종이량체 단백질을 정제하는 방법으로서, (a) 이종이량체 단백질 및 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화성 기질에 도입하는 단계 - 이종이량체 단백질은 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하고 적어도 하나의 불순물은 단백질 결합 리간드에 결합하지 않음 -; (b) 불순물을 제거하기 위해 5 내지 9의 제1 pH 및 200 mM를 초과하는 염 농도를 포함하는 제1 세척 완충제를 이용해 친화성 기질을 세척하는 단계; (c) 4 내지 5의 제2 pH 및 200 mM을 초과하는 농도의 염을 포함하는 제1 용출 완충제에서 친화성 기질로부터 이종이량체 단백질을 용출 및 수집하여 제1 용출물에서 정제된 이종이량체 단백질을 수득하는 단계; (d) 불순물을 제거하기 위해 4 미만의 제3 pH를 포함하는 제2 세척 완충제를 이용해 친화성 기질을 세척하는 단계; (e) 친화성 기질을 5 내지 9의 제4 pH로 평형화하는 단계; (f) 제1 용출물을 pH 5 내지 9로 중화한 다음, 제1 용출물을 친화성 기질에 재인가하는 단계; (g) 100 mM 미만의 염을 포함하는 제3 세척 완충제를 이용해 친화성 기질을 세척하는 단계; 및 (h) 제2 용출물에서 정제된 이종이량체 단백질을 용출 및 수집하는 단계 - 제2 용출물은 100 mM 미만의 염을 포함함 - 를 포함하는, 방법을 제공한다. 방법의 다양한 실시예들에서, 정제된 이종이량체 단백질이 제3 세척 완충제를 통해 제2 용출물에서 용출 및 수집된다. 방법의 일부 실시예들에서, 제3 세척 완충제는 50 mM 미만의 염을 포함한다.
일부 실시예들에서, 불순물은 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 동종이량체 종을 포함한다.
일부 실시예들에서, 단백질 결합 리간드는 단백질 A이고, 친화성 기질은 기재에 부착된 단백질 A 리간드를 포함한다. 일부 경우들에서, 단백질 A 리간드는 Z-도메인 사량체를 포함하는 조작된 단백질 A, Y-도메인 사량체를 포함하는 조작된 단백질 A, 또는 D 및 E 도메인들이 없는 조작된 단백질 A이다. 일 실시예에서, 단백질 A 리간드는 Z-도메인 사량체를 포함한다.
일부 실시예들에서, 단백질 결합 리간드는 단백질 G이고, 친화성 기질은 기재에 부착된 단백질 G 리간드를 포함한다.
방법의 다양한 실시예들에서, 기재는 입자이고 친화성 기질은 평균 직경 25 ㎛ 내지 100 ㎛의 다수의 입자를 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자는 40 ㎛ 내지 60 ㎛의 평균 직경을 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자는 45 ㎛ 내지 55 ㎛의 평균 직경을 포함한다. 일부 실시예들에서, 입자는 약 50 ㎛의 평균 직경을 포함한다. 일부 경우들에서, 입자는 약 1100 Å의 평균 직경을 갖는 기공을 포함한다.
다양한 실시예들에서, 기재는 아가로스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 셀룰로오스, 제어된 다공성 유리, 및 구상 실리카 중 어느 하나 이상을 포함한다.
방법의 일부 실시예들에서, 제1 용출 완충제는 250 mM을 초과하는 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 염 농도는 300 mM 초과 또는 400 mM 초과이다. 일부 실시예들에서, 염 농도는 약 500 mM이다.
방법의 다양한 실시예들에서, 염은 (i) Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CH3)4 +, NH4 +, Cs+, Rb+, K+, Na+, H+, Ca2+, Mg2+, Al3+; 또는 (ii) CaCl2, MgCl2 또는 NaCl을 함유하는 염으로부터 선택된다.
방법의 다양한 실시예들에서, 제2 용출물은 50 mM 미만의 염을 포함한다. 일부 실시예들에서, 제2 용출물은 10 mM 미만의 염을 포함한다.
방법의 다양한 실시예들에서, 제1 폴리펩티드는 단백질 결합 리간드에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 단백질 결합 리간드에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시예들에서, 제1 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시예들에서, 제1 폴리펩티드는 단백질 G에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 단백질 G에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 제2 폴리펩티드는 자신의 CH3 도메인에 HY에서 RF로의 치환을 포함한다.
방법의 다양한 실시예들에서, 제1 pH는 6 내지 8이다. 일부 실시예들에서, 제2 pH는 4.0 내지 4.25이다. 일부 경우들에서, 제2 pH는 4.10 ± 0.05이다. 일부 실시예들에서, 제3 pH는 2.8 내지 3.5이다. 일부 실시예들에서, 제4 pH는 6 내지 8이다.
일부 실시예들에서, 본 방법은 저염(예를 들어, 100 mM 미만, 50 mM 미만 또는 25 mM 미만) 용출물에서 정제된 이종이량체 단백질의 용출 및 수집 이후 추가적인 크로마토그래피 단계 또는 바이러스 불활화 단계를 더 포함한다. 일부 경우들에서, 정제된 조성물의 전도도는 < 5.0 mS/cm로 감소된다. 일부 경우들에서, 정제된 조성물의 전도도는 < 2.0 mS/cm로 감소된다. 일부 실시예들에서, 추가적인 크로마토그래피 단계 또는 바이러스 불활화 단계는 100 mM 미만의 염을 갖는 조건들 하에서 수행된다. 일부 경우들에서, 추가적인 크로마토그래피 단계는 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시예들에서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이고, 50 mM 미만의 염을 갖는 조건들 하에서 수행된다.
방법의 다양한 실시예들에서, 이종이량체 단백질은 양특이성 항원 결합 단백질이다. 일부 실시예들에서, 양특이성 항원 결합 단백질은 양특이성 항체이다.
다양한 실시예들은, 상기에 또는 본원에서 논의된 실시예의 임의의 특징 또는 구성요소는 조합될 수 있으며, 이러한 조합은 본 발명의 범주 내에 포괄된다. 상기에 또는 본원에서 논의된 임의의 특정한 값은 상기에 또는 본원에서 논의된 또 다른 관련 값과 조합되어, 범위의 상단과 하단을 나타내는 값을 갖는 범위를 인용하고, 이러한 범위는 본 발명의 범주 내에 포괄된다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 정제 공정의 도해이다.
본 발명을 설명하기 전에, 본 발명은 특정 방법 및 기재된 실험 조건으로 제한되지 않으며, 이러한 방법 및 조건은 변할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 것이며, 제한하려는 의도는 아님을 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 사용될 때, 용어 "약"은 나열된 특정 수치에 관하여 사용될 때, 그 값이 나열된 값과 1%보다 적게 달라질 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본원에서 사용될 때, 표현 "약 100"은 99과 101 및 그 사이의 모든 값들(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법들 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 이제 바람직한 방법들 및 물질이 설명된다. 본원에 언급된 모든 특허, 출원 및 비특허 공개는 그 전문이 원용에 의해 본원에 포함된다.
개괄
본 발명은 최소한 부분적으로라도 단백질 정제에 사용된 동일한 친화성 기질에 정제된 이종이량체 단백질(예를 들어, 양특이성 항체)을 함유하는 중화된 용출물을 재인가하면 대규모 상업적 제조를 위한 정제 시스템의 비용 및 차지 공간을 줄이면서 전체 생산 수율을 상당히 향상시키고 고분자량 종의 존재를 최소화할 수 있다는 발견에 입각하고 있다. 치료용 양특이성 항체들의 대규모 제조 및 정제를 위한 물질의 비용 및 공간 고려 사항들은 중요한 우려 사항들이다. 다수의 공정들에 크로마토그래피 칼럼들을 재사용하면 칼럼 물질(예를 들어, 크로마토그래피 배지 또는 레진)의 비용뿐만 아니라 원하는 산물을 얻는 데 필요한 장비가 차지하는 공간을 최소화한다. 친화성 크로마토그래피를 통한 양특이성 항체의 정제는 전술되었지만 이러한 공정들은 일반적으로 두 별개의 친화성 칼럼들(예를 들어, MabSelect SuRe™ 및 MabCapture A™）을 활용하고 한외 여과/정용 여과, 또는 친화성 크로마토그래피 공정 단계들로부터 염을 제거하기 위해 내염성 복합 레진에 의존한다. 본 발명자들은 양 친화성 크로마토그래피 처리 단계들에 단일 칼럼을 이용함으로써, 전체 생산 수율이 상당히 개선될 수 있음을 발견하고(두 별개의 칼럼들을 사용할 때 평균 약 77%에 비해 평균 약 92%로), 동종이량체 불순물로부터 이종이량체를 강력하게 분리하는 데 사용되는 염은 한외 여과 또는 정용 여과 없이 제거될 수 있으므로, 비용 및 공간 고려 사항들을 줄이면서, 고가의 내염성 물질 필요 없이 추가적인 크로마토그래피 또는 기타 연마 단계들을 위한 생성 스트림을 제공한다.
정의
용어 "항체"는 본원에서 사용될 때, 이황화 결합에 의해 상호연결된 네 개의 폴리펩티드 사슬인 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인들(CH1, CH2 및 CH3)을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨)을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL1)을 포함한다. VH 영역 및 VL 영역들은 보다 보존적인 영역들(구조틀 영역(framework region, FR)이라 칭해짐)이 개재된 초가변 영역들(상보 결정 영역들(complementarity determining region, CDR)이라 칭해짐)로 더 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 다음 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4(중쇄 CDR들은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR들은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로 약칭될 수 있음)로 배열된 세 개의 CDR들 및 네 개의 FR들로 구성된다. 용어 "고 친화성" 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어 BIACORE™ 또는 용액 친화성 ELISA에 의해 측정할 때, 적어도 10-9 M, 적어도 10-1 M; 적어도 10-11 M; 또는 적어도 10-12 M의 표적에 대한 결합 친화성을 갖는 항체를 지칭한다.
어구 "양특이성 항체"는 두 개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 양특이성 항체는 일반적으로 두 개의 상이한 중쇄들을 포함하며, 이때 각 중쇄는 - 두 개의 상이한 분자(예를 들어, 항원) 상에서 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원 상에서) 상에서 - 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 양특이성 항체가 두 개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화성은 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 경쇄의 친화성보다 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4 자릿수 더 낮을 것이고, 그 반대도 가능하다. 양특이성 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에(예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상에) 있을 수 있다. 양특이성 항체는 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄들을 결합함으로써, 만들어질 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열들을 코딩하는 핵산 서열들은 상이한 중쇄 불변 영역들을 코딩하는 핵산 서열들에 융합될 수 있고, 이러한 서열들은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 양특이성 항체는 각각 세 개의 중쇄 CDR들, 이어서(N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는 두 개의 중쇄들, 및 두 개의 중쇄, 및 항원 결합 특이성을 부여하지 않지만 각 중쇄와 회합할 수 있거나, 또는 각 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원 결합 영역들에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 또는 각 경쇄와 회합하여 중쇄들 중 하나 또는 양자를 하나 또는 양 에피토프에 결합할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 가진다.
본원에서 논의된 방법들의 다양한 실시예들에서, 이종이량체 단백질, 양특이성 항체, Fc 함유 단백질 등은 동종 IgG를 가진다. 일부 경우들에서, 이종이량체 단백질, 양특이성 항체, Fc 함유 단백질 등은 동종 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4를 가진다. 일부 경우들에서, 이종이량체 단백질, 양특이성 항체, Fc 함유 단백질 등은 동종 IgG1을 가진다. 일부 경우들에서, 이종이량체 단백질, 양특이성 항체, Fc 함유 단백질 등은 동종 IgG4를 가진다. 다양한 실시예들에서, 이종이량체 단백질, 양특이성 항체, Fc 함유 단백질 등은 완전 인간형이다.
어구 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인들은 달리 명시되지 않는 한 세 개의 중쇄 CDR들 및 네 개의 FR 영역들을 포함한다. 중쇄들의 단편들은 CDR들, CDR들 및 FR들, 및 이들의 조합들을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인(N-말단에서 C-말단까지), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 가진다. 중쇄의 기능적 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있고(예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위 내의 KD로 항원을 인식함), 세포로부터 발현하거나 분비될 수 있으며, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.
어구 "경쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않는 한 인간 카파 및 람다 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변(VL) 도메인들은 달리 명시되지 않는 한 전형적으로 세 개의 경쇄 CDR들 및 네 개의 형틀(FR) 영역들을 포함한다. 일반적으로, 전체 길이 경쇄는 아미노 말단에서 카르복실 말단까지, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인, 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 경쇄들은 예를 들어, 항원 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 첫 번째 또는 두 번째 항원 중 어느 하나에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 적합한 경쇄들은 기존의 항체 라이브러리들(Ÿ‡ 라이브러리들 또는 인 실리코)에서 가장 통용되는 경쇄들에 대한 스크리닝에 의해 확인될 수 있는 것을 포함하며, 여기서 경쇄들은 항원 결합 단백질의 항원 결합 도메인들의 친화성 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않는다. 적합한 경쇄들은 항원 결합 단백질의 항원 결합 영역들에 의해 결합되는 하나 또는 양 에피토프에 결합할 수 있는 것들을 포함한다.
어구 "가변 도메인"은 N-말단에서 C-말단까지의 서열(달리 표시되지 않는 한): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4아미노산 영역들을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄(원하는 대로 개질됨)의 아미노산 서열을 포함한다. "가변 도메인"은 이중 베타 시트 구조 - 베타 시트는 첫 번째 베타 시트의 잔기와 두 번째 베타 시트 사이의 이황화 결합에 의해 연결됨 - 를 갖는 정규 도메인(VH 또는 VL)으로 접힐 수 있는 아미노산 서열을 포함한다.
어구 "상보 결정 영역" 또는 "CDR"은 통상적으로 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자(예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 두 개의 형틀 영역들 사이에 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어, 생식 계통 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열, 및 예를 들어, 나이브 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 상황들에서(예를 들어, CDR3의 경우), CDR들은 (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) 연접하지 않지만 예를 들어, 서열들을 스플라이싱하거나 연결(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)한 결과로서, B 세포 핵산 서열에서는 연접하는 두 개 이상의 서열들(예를 들어 생식 계통 서열들)에 의해 코딩될 수 있다.
어구 "Fc 함유 단백질"은 항체, 양특이성 항체, 이종이량체 단백질 및 면역접합체, 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 적어도 기능적 부분을 포함하는 다른 결합 단백질을 포함한다. "기능적 부분"은 Fc 수용체(예를 들어, FcγR; 또는 FcRn, 즉 신생아 Fc 수용체)에 결합할 수 있고/거나 보체의 활성화에 참여할 수 있는 CH2 및 CH3 영역을 지칭한다. CH2 및 CH3 영역이 임의의 Fc 수용체에 결합할 수 없고 또한 보체를 활성화할 수 없게 만드는 결실, 치환 및/또는 삽입 또는 다른 개질을 함유하는 경우, CH2와 CH3 영역은 기능성이 아니다.
Fc 함유 단백질은 결합 단백질의 하나 이상의 반응기 기능에 영향을 미치는 경우(예를 들어, FcγR 결합, FcRn 결합 및 이에 따른 반감기, 및/또는 CDC 활성에 영향을 미치는 개질)를 포함하여, 면역글로불린 도메인들에서의 개질을 포함할 수 있다. 이러한 개질은 면역글로불린 불변 영역의 EU 번호 체계를 참조하여, 다음의 개질 및 이들의 조합들을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 및 439.
예를 들어, 그리고 제한 없이, 결합 단백질은 Fc 함유 단백질이고, (언급된 개질(들)이 없는 동일한 Fc 함유 단백질과 비교할 때) 향상된 혈청 반감기를 나타내며, 위치 250(예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428(예를 들어, L 또는 F); 252(예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254(예를 들어, S 또는 T), 및 256(예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 개질; 또는 428 및/또는 433(예를 들어, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 개질; 또는 250 또는 428; 또는 307 또는 308(예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 개질을 가진다. 또 다른 예에서, 개질은 428L(예를 들어, M428L) 및 434S(예를 들어, N434S) 개질; 428L, 259I(예를 들어, V259I), 및 308F(예를 들어, V308F) 개질; 433K(예를 들어, H433K) 및 434(예를 들어, 434Y) 개질; 252, 254, 및 256(예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 개질; 250Q 및 428L 개질(예를 들어, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 개질(예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다.
용어 "별표 치환", "Fc*", 및 "HC*"는 단백질 A에 대한 결합을 저지하는 CH3 도메인 내의 서열을 함유하는 임의의 분자, 면역글로불린 중쇄, Fc 단편, Fc 함유 분자, 이종이량체 단백질 등을 포함한다. CH3 도메인에서 단백질 A 결합을 약화하거나 저지할 수 있는 H95R 및 Y96F와 같은 구체적 개질은 US 8, 586, 713에 논의되어 있다. 이러한 디펩티드 변이는 "별표 치환"으로 표기된다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스 감염 곤충 세포, Trichoplusia ni 등), 비인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합체, 이를테면, 예를 들어, 하이브리도마 또는 쿼드로마를 포함한다. 일부 실시예들에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 쥐 또는 생쥐 세포이다. 일부 실시예들에서, 세포는 진핵 세포이고, CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431(표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli cell, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상술된 세포로부터 유래된 세포주로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6™ 세포)를 포함한다.
어구 "이동상 개질제"는 단백질 사이의 비특이성(즉, 비친화성) 이온 및 다른 비공유 상호반응의 효과를 감소시키거나 또는 그러한 상호반응을 방해하는 모이어티를 포함한다. "이동상 개질제"는 예를 들어, 염, I족 및 II족 금속과 아세트산염, 중탄산염, 탄산염, 할로겐(예를 들어, 염화물 또는 불화물), 질산염, 포스페이트 또는 황산염의 이온 결합을 포함한다. "이동상 개질제"의 비제한적인 예시적인 리스트는 베릴륨, 리튬, 나트륨 및 칼륨 아세트산염; 나트륨 및 칼륨 중탄산염; 리튬, 나트륨, 칼륨, 및 세슘 탄산염; 리튬, 나트륨, 칼륨, 세슘, 및 마그네슘 염화물; 나트륨 및 칼륨 불화물; 나트륨, 칼륨, 및 칼슘 질산염; 나트륨 및 칼륨 인산염; 및 칼슘 및 마그네슘 황산염을 포함한다.
"이동상 개질제"는 또한 생체분자계 내에서 공유력을 약화시키거나 달리 방해하고 엔트로피를 증가시키는 수소 결합 억제제를 포함한다. 수소 결합 억제제의 비제한적 예들은 부탄올, 염화칼슘, 에탄올, 염화구아니디늄, 과염소산리튬, 아세트산리튬, 염화마그네슘, 페놀, 프로판올, 황산도데실나트륨, 티오요소 및 요소를 포함한다. 수소 결합 억제제는 단백질의 용해도에 영향을 미치는 염을 포함한다. 더 많은 수소 결합 억제 음이온은 예를 들어, 염화물, 질산염, 브롬화물, 염소산염, 요오드화물, 과염소산염, 및 티오시안산염을 포함한다. 더 많은 카오트로픽 양이온은 예를 들어, 리튬, 마그네슘, 칼슘, 및 구아니디늄을 포함한다.
"이동상 개질제"는 pH 구배 또는 단계에의 첨가시, 또는 "이동상 개질제"에서의 단백질 A 지지체의 평형화 및 pH 단계 또는 구배의 적용시, 동종이량체 IgG 및 이종이량체 IgG(예를 들어, 야생형 인간 IgG 및 동일하지만 본원에 기술된 바와 같은 이의 CH3 도메인의 하나 이상의 개질을 지닌 IgG)의 용출 사이의 pH 단위 거리의 확장을 초래하는 이온 또는 기타 비공유 상호반응에 영향을 미치는 모이어티를 포함한다. "이동상 개질제"의 적합한 농도는 소정의 pH 단계 또는 pH 구배에서 최대 pH 거리에 도달할 때까지 "이동상 개질제"의 농도를 증가시키면서, 동일한 컬럼, pH 단계, 또는 구배를 채용하는 이의 농도에 의해 결정될 수 있다. "이동상 개질제"는 또한 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜 등을 포함하여, 비극성 개질제를 포함할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "친화성 크로마토그래피"는 크로마토그래피 분리를 수행하기 위해, 등전점, 소수성 또는 크기와 같은 생체분자의 일반적인 속성들보다는 생체분자 사이의 특이적이고 가역적인 상호반응을 이용하는 크로마토그래피 방법이다. "단백질 A 친화성 크로마토그래피" 또는 "단백질 A 크로마토그래피"는 면역글로불린 분자의 Fc 부분에 대한 단백질 A의 IgG 결합 도메인들의 친화성을 이용하는 특이적 친화성 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 이 Fc 부분은 인간 또는 동물 면역글로불린 불변 도메인들 CH2 및 CH3 또는 이들과 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인들을 포함한다. 단백질 A는 Staphylococcus aureus의 세포벽으로부터의 천연 단백질, 재조합 또는 합성법들에 의해 생산된 단백질 A, 및 Fc 영역에 결합할 수 있는 능력을 보유하는 변이체를 포괄한다. 실제로, 단백질 A 크로마토그래피는 고체 지지체에 고정된 단백질 A를 사용하는 것을 수반한다. Validated Biosystems, 1996, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, Protein Affinity Chromotography, Gagnon, pp.155-198을 참조한다. 단백질 G 및 단백질 L 또한 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 고체 지지체는 단백질 A가 부착되는 비수성 기질이다. 이러한 지지체는 아가로스, 세파로스, 유리, 실리카, 폴리스티렌, 니트로셀룰로스, 목탄, 모래, 셀룰로스 및 임의의 다른 적합한 물질을 포함한다. 이러한 물질은 당업계에 잘 알려져 있다. 두 번째 단백질을 고체 지지체에 부착시키기 위해 임의의 적합한 방법이 사용될 수 있다. 단백질을 적합한 고체 지지체에 부착시키기 위한 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, Methods in Enzymology 182, Guide to Protein Purification, Ostrove: 357-371, 1990 참조. 단백질 A가 고정되거나 되지 않은 이러한 고체 지지체는 Vector Laboratory(캘리포니아, 벌링게임), Santa Cruz Biotechnology(캘리포니아, 산타 크루즈), Biorad(캘리포니아, 허큘러스), Amersham Biosciences(스웨덴, 웁살라, GE Healthcare의 일부), Pall(뉴욕, 포트 워싱턴) 및 EMD-Millipore(매사추세츠, 빌레리카)와 같은 많은 상업적 공급원들로부터 쉽게 입수할 수 있다. 다공성 유리 기질에 고정된 단백질 A는 PROSEP®-A(Millipore)로 시판되고 있다. 고체상은 또한 아가로스계 기질일 수 있다. 아가로스 기질에 고정된 단백질 A는 MabSelect™ (Amersham Biosciences)로 시판되고 있다.
친화성 크로마토그래피는 또한 항체, 항체의 단편들, 또는 면역글로불린 도메인들 및/또는 서열들을 함유하는 키메라 융합 단백질에 선택적으로 결합하고 이에 따라 정제하는데 사용될 수 있는 배지를 포함한다. 항체는 IgG, IgA, IgM, IgY, IgD 및 IgE 유형을 포함한다. 항체는 또한 낙타류 항체, 조작된 낙타류 항체, 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 나노바디 등과 같은 단쇄 항체를 포함한다. 항체 단편들은 VH, VL, CL, CH 서열들을 포함한다. 항체 단편들 및 항체 서열들을 함유하는 융합 단백질은 예를 들어, F(ab')3, F(ab')2, Fab, Fc, Fv, dsFv, (scFv)2, scFv, scAb, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fc 융합 단백질, 트랩 분자 등을 포함한다(Ayyar 외의 Methods 56(2012): 116-129 참조). 이러한 친화성 크로마토그래피 배지은 항체, 이의 단편들, 및 이의 단편들을 포함하는 융합 단백질에 선택적으로 결합하는 리간드를 함유할 수 있다. 이러한 리간드는 표적 분자에 관한 항체 결합 단백질, 세균 유래 수용체, 항원, 렉틴 또는 항-항체를 포함한다. 항체는 정제를 필요로 한다. 예를 들어, IgG-CH1, IgG-Fc, IgG-CH3, IgG1, LC-카파, LC-람다, IgG3/4, IgA, IgM 등 중 임의의 하나 이상에 대한 낙타 유래 친화성 리간드는 친화성 리간드로 사용될 수 있다(캘리포니아, 칼트배드, Life Technologies, Inc., CAPTURESELECT 크로마토그래피 레진으로 시판되고 있음).
정제 스트림으로부터 원치 않는 성분을 제거하는 방법들
본 발명의 방법들의 실시예들은 단백질 산물의 정제를 위한 공정 스트림으로부터 원치 않는 성분을 제거하는 방법들을 포함한다. 본 방법들은 다운스트림 공정 단계에 해로울 수 있는 크로마토그래피 단계로부터 생성된 용출물로부터 하나 이상의 성분(예를 들어, 화학 성분 또는 염)을 제거하기 위한 것이다. 일부 실시예들에서, 방법은 (a) 성분이 크로마토그래피 칼럼에 인가된 제1 완충제에 존재하는 제1 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계; (b) 제1 크로마토그래피 단계로부터 중간 용출물을 수집하는 단계 - 중간 용출물은 단백질 산물 및 성분을 함유함 -; (c) 중간 용출물을 크로마토그래피 칼럼에 재인가하고, 중간 용출물의 농도보다 낮은 농도로 성분을 함유하는 제2 완충제를 이용해 단백질 산물을 용출하는 단계; (d) 단계 (c)로부터의 크로마토그래피 용출물을 수집하는 단계 - 성분은 중간 용출물의 농도보다 낮은 농도로 크로마토그래피 용출물에 존재함 -; 및 (e) 크로마토그래피 용출물을 후속 공정 단계에 인가하는 단계를 포함하는, 방법들에 관한다. 일부 실시예들에서, 성분은 제2 완충제에 존재하지 않는다.
이종이량체 단백질을 정제하기 위한 방법들과 관련하여 아래에서 더 상세히 논의될 바와 같이, 일부 실시예들에서 성분은 염이다. 일부 경우들에서, 중간 용출물 중 염의 농도는 50 mM을 초과한다. 일부 경우들에서, 중간 용출물 중 염의 농도는 ≥ 100 mM, ≥ 150 mM, ≥ 200 mM, ≥ 250 mM, ≥ 300 mM, ≥ 350 mM, ≥ 400 mM, ≥ 450 mM, ≥ 500 mM, ≥ 600 mM, ≥ 700 mM, ≥ 800 mM, ≥ 900 mM, 또는 ≥ 1000 mM이다. 일부 경우들에서, 중간 용출물 중 염 농도는 500 mM ± 50 mM이다. 일부 실시예들에서, 중간 용출물 중 염의 농도는 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 또는 600 mM - 각 값은 ± 10%의 편차를 포함함 - 이다.
일부 실시예들에서, 제1 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 후속 공정 단계는 제2 크로마토그래피 단계이다. 일부 경우들에서, 후속 공정 단계는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피 또는 바이러스 불활화로부터 선택된다. 일부 경우들에서, 본원에서 논의된 방법들은 제1 이온 교환 단계가 풀의 전도도를 후속 이온 교환 단계가 적절하게 수행할 수 있는 상한치를 초과하여 증가시키는 두 이온 교환 단계들 사이에 이용될 수 있다. 일부 경우들에서, 본원에서 논의된 방법들은 제1 단계가 후속 크로마토그래피 단계를 적절하게 수행하기 위해 제거되어야 하는 화학적 성분을 도입하는 두 크로마토그래피 단계들 사이에 이용될 수 있다. 일부 경우들에서, 본원에서 논의된 방법들은 전도도를 감소시키고 이에 따라 여과 성능을 증가시키며 실행 시간을 감소시키기 위해 바이러스 여과 전에 이용될 수 있다. 일부 경우들에서, 본원에서 논의된 방법들은 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography, MMC) 배지를 방해하거나 저하시키는 화학적 성분들을 제거하기 위해 혼합 모드 크로마토그래피 전에 이용될 수 있다. 예를 들어, 세라믹 수산화인회석과 양립할 수 없는 스트림으로부터 시트레이트를 제거하는 것이 바람직하다.
일부 실시예들에서, 단백질 산물은 항체(예를 들어, 양특이성 항체)이다.
이종이량체 단백질을 정제하는 방법들
본 발명의 방법들의 실시예들은 도 1에 도시된 단계들을 포함한다. 예를 들어, 이종이량체 단백질을 정제하는 방법들은 (a) 이종이량체 단백질과 불순물의 혼합물을 친화성 기질 상에 로딩하는 단계, (b) 친화성 기질을 5-8의 pH 및 200 mM 초과의 염 농도의 제1 세척 완충제를 이용해 세척하는 단계, (c) 이종이량체 단백질을 4-5의pH 및 200 mM 초과의 염 농도의 제1 용출 완충제를 이용해 용출 및 수집하는 단계, (d) 친화성 기질을 4 미만의 pH의 제2 세척 완충제를 이용해 세척하는 단계, (e) 친화성 기질을 5-9의 pH로 평형화하는 단계, (f) 이종이량체 단백질을 함유하는 용출물을 5-9의 pH로 중화시키고, 중화된 용출물을 친화성 기질에 재인가하는 단계, (g) 100 mM 미만의 염을 함유하는 제3 세척 완충제를 이용해 친화성 기질을 세척하는 단계, 및 (h) 100 mM 미만의 염을 함유하는 용출물에서 동종이량체 단백질을 용출 및 수집하는 단계를 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 방법들은 친화성 기질이 5-9의 pH로 평형화되는 초기 평형화 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 본 방법들은 이종이량체 단백질의 용출 및 수집 전에, 친화성 기질을 제1 세척 완충제를 이용한 세척 이후 100 mM 미만의 염을 갖는 세척 완충제를 이용해 세척하는 단계를 더 포함한다.
다양한 실시예들에서, 이종이량체 단백질 및 불순물의 혼합물을 친화성 기질 상에 로딩하는 단계는 이종이량체 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열들을 발현하는 세포를 함유하는 하나 이상의 생물반응기로부터 정화된 세포 배양물을 로딩하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 세포는 양특이성 항체(예를 들어, CD3xCD20 양특이성 항체, 두 개의 아암이 MET의 개별 에피토프에 결합하는 METxMET 양특이성 항체, CD3xBCMA 양특이성 항체, CD22xCD28 양특이성 항체, PSMAxCD28 양특이성 항체, CD3xPSMA 양특이성 항체, CD3xMUC16 양특이성 항체, CD3xSTEAP2 양특이성 항체 등)를 형성하는 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 일부 경우들에서, 양특이성 항체의 항원 결합 아암 각각은 공통 경쇄를 포함한다. 정화된 세포 배양물은 이종이량체 단백질(예를 들어, 양특이성 항체)을 동종이량체 종, 숙주 세포 단백질, 및 DNA와 같은 불순물과 함께 포함할 것이다. 일부 경우들에서, 이종이량체 단백질은 예를 들어, 중국산 햄스터 난소(Chinese hamster, CHO) 세포와 같은 진핵 세포에서 생산될 수 있다.
일부 실시예들에서, 친화성 기질 상에 로딩된 혼합물은 (i) 제1 폴리펩티드의 두 개의 카피를 포함하는 제1 동종이량체, (ii) 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종이량체, 및 (iii) 제2 폴리펩티드의 두 개 카피를 포함하는 제2 동종이량체를 함유하는 단백질의 혼합물을 포함한다. 제1 및 제2 폴리펩티드는 친화성 기질에 대해 상이한 친화도들을 가지며, 이에 따라 제1 동종이량체, 이종이량체 및 제2 동종이량체가 친화성 기질에 대한 차등 결합에 기초하여 분리될 수 있게 된다. 친화성 기질에 대한 차등 결합은 특히 친화성 기질을 통과한 용액의 pH 및/또는 이온 강도를 변경함으로써 조작할 수 있다.
다양한 실시예들에서, 임의의 완충제 또는 용출물(또는 그 외)과 관련하여 아래 또는 본원에서 논의된 염은 Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CH3)4 +, NH4 +, Cs+, Rb+, K+, Na+, H+, Ca2+, Mg2+ 또는 Al3+를 포함하는 염이다. 일부 실시예들에서, 염은 Na+, H+, Ca2+, Mg2+ 또는 Al3+를 포함한다. 일부 실시예들에서, 염은 Cl-, Br-, I-, NO3 -, 또는 ClO4 -를 포함한다. 일부 실시예들에서, 염은 Na+, H+, Ca2+, Mg2+ 또는 Al3+ with Cl-, Br-, I-, NO3 -, 또는 ClO4 -를 포함한다. 일부 실시예들에서, 염은 CaCl2, MgCl2 또는 NaCl로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 염은 NaCl이다. 일부 실시예들에서, 염은 CaCl2이다. 일부 실시예들에서, 염은 MgCl2이다.
정화된 세포 배양물의 로딩 이후, 친화성 기질은 5 내지 9의 pH 및 200 mM을 초과하는 염을 포함하는 세척 완충제(도 1의 제1 세척 완충제)을 이용해 세척된다. 일부 경우들에서, 세척 완충제의 pH는 6 내지 8이다. 일부 경우들에서, 세척 완충제의 pH는 약 7 내지 약 7.5이다. 다양한 실시예들에서, 세척 완충제의 pH는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제의 pH는 약 7.2이다. 다양한 실시예들에서, 완충제는 pH를 원하는 지점 또는 원하는 범위 내로 유지할 수 있는 임의의 완충제일 수 있다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 5 mM 내지 약 15 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 5 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 10 mM 내지 약 25 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 20 mM 내지 약 40 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 (또는 약) 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 또는 50 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제 농도는 (또는 약) 10 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제 농도는 (또는 약) 40 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제는 나트륨 인산염이다.
일부 경우들에서, 세척 완충제는 약 200 mM 내지 약 800 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 세척 완충제는 약 250 mM 내지 약 750 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 세척 완충제는 약 300 mM 내지 약 700 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 세척 완충제는 약 350 mM 내지 약 650 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 세척 완충제는 약 400 mM 내지 약 600 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 세척 완충제는 약 450 mM 내지 약 550 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 세척 완충제는 (또는 약) 200 mM, 210, mM, 220 mM, 225 mM, 230 mM, 240 mM, 250 mM, 260 mM, 270 mM, 275 mM, 280 mM, 290 mM, 300 mM, 310 mM, 320 mM, 325 mM, 330 mM, 340 mM, 350 mM, 360 mM, 370 mM, 375 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM, 420 mM, 425 mM, 430 mM, 440 mM, 450 mM, 460 mM, 470 mM, 475 mM, 480 mM, 490 mM, 500 mM, 510 mM, 520 mM, 525 mM, 530 mM, 540 mM, 550 mM, 560 mM, 570 mM, 575 mM, 580 mM, 590 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 625 mM, 630 mM, 640 mM, 650 mM, 660 mM, 670 mM, 675 mM, 680 mM, 690 mM, 700 mM, 710 mM, 720 mM, 725 mM, 730 mM, 740 mM, 750 mM, 760 mM, 770 mM, 780 mM, 790 mM 또는 800 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 세척 완충제의 염 농도는 (또는 약) 500 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제는 약 500 mM NaCl을 포함한다. 일부 경우들에서, 친화성 기질의 이러한 세척은 친화성 기질 물질(예를 들어, 단백질 A)에 대한 친화성이 거의 또는 전혀 없는 숙주 세포 단백질, DNA 및 동종이량체 종과 같은 비결합 불순물을 제거한다.
일부 실시예들에서, 본 방법들은 5 내지 9의 pH에서 염을 거의 포함하지 않거나(< 25 mM) 또는 전혀 포함하지 않는 세척 완충제를 이용해, 이종이량체 단백질의 용출 전에 선택 사항인 제2 세척을 포함한다. 일부 실시예들에서, 이러한 세척 완충제는 약 10 mM 내지 약 50 mM 트리스[트리스(히드록시메틸)아미노메탄]], 나트륨 인산염, 또는 아세트산염, 또는 이들의 조합들을 포함한다. 다양한 실시예들에서, 이러한 세척 완충제는 상술된 제1 세척 완충제의 pH와 동일한 pH를 가진다.
이 세척 또는 상술된 세척 이후, 이종이량체 단백질이 용출 완충제(도 1의 제1 용출 완충제)에서 친화성 기질로부터 용출되고 용출물에 수집된다. 용출 완충제는 약 4 내지 약 5의 pH를 갖고, 200 mM을 초과하는 농도의 염을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 약 4.0 내지 약 4.2이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 약 4.4 내지 약 4.6이다. 다양한 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 (또는 약) 4.0, 4.05, 4.1, 4.15, 4.2, 4.25, 4.3, 4.35, 4.4, 4.45, 4.5, 4.55, 4.6, 4.65, 4.7, 4.75, 4.8, 4.85, 4.9, 4.95 또는 5.0이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 4.1이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 4.55이다. 다양한 실시예들에서, 완충제는 pH를 원하는 지점 또는 원하는 범위 내로 유지할 수 있는 임의의 완충제일 수 있다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 25 mM 내지 약 55 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 (또는 약) 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 또는 50 mM이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제 농도는 (또는 약) 40 mM이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제는 아세트산이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제는 아세트산염이다.
일부 경우들에서, 용출 완충제는 약 200 mM 내지 약 800 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 용출 완충제는 약 250 mM 내지 약 750 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 용출 완충제는 약 300 mM 내지 약 700 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 용출 완충제는 약 350 mM 내지 약 650 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 용출 완충제는 약 400 mM 내지 약 600 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 용출 완충제는 약 450 mM 내지 약 550 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 경우들에서, 용출 완충제는 (또는 약) 200 mM, 210, mM, 220 mM, 225 mM, 230 mM, 240 mM, 250 mM, 260 mM, 270 mM, 275 mM, 280 mM, 290 mM, 300 mM, 310 mM, 320 mM, 325 mM, 330 mM, 340 mM, 350 mM, 360 mM, 370 mM, 375 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM, 420 mM, 425 mM, 430 mM, 440 mM, 450 mM, 460 mM, 470 mM, 475 mM, 480 mM, 490 mM, 500 mM, 510 mM, 520 mM, 525 mM, 530 mM, 540 mM, 550 mM, 560 mM, 570 mM, 575 mM, 580 mM, 590 mM, 600 mM, 610 mM, 620 mM, 625 mM, 630 mM, 640 mM, 650 mM, 660 mM, 670 mM, 675 mM, 680 mM, 690 mM, 700 mM, 710 mM, 720 mM, 725 mM, 730 mM, 740 mM, 750 mM, 760 mM, 770 mM, 780 mM, 790 mM 또는 800 mM 농도의 염을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제의 염 농도는 (또는 약) 500 mM이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제는 약 500 mM NaCl을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제는 약 500 mM CaCl2를 포함한다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제는 약 500 mM MgCl2를 포함한다.
친화성 기질로부터 이종이량체 단백질의 용출 및 수집 이후, 친화성 기질은 약 4 미만의 pH에서 세척 완충제(도 1의 제2 세척 완충제)을 이용해 세척된다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제의 pH는 약 2.5 내지 약 3.5이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제의 pH는 3.0 ± 0.2이다. 다양한 실시예들에서, 세척 완충제의 pH는 (또는 약) 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 또는 3.9. 세척 완충제는 상술된 pH 또는 pH 범위를 제공하기에 적합한 임의의 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제는 약 20 mM 내지 약 60 mM 농도의 아세트산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제는 약 30 mM 내지 약 50 mM 농도의 아세트산을 포함한다. 일부 경우들에서, 세척 완충제는 약 40 mM 아세트산을 포함한다. 일부 경우들에서, 친화성 기질의 이러한 세척은 이종이량체 단백질보다 친화성 기질 물질(예를 들어, 단백질 A)에 대한 친화성이 큰 동종이량체 종과 같은 이전에 결합된 불순물을 제거한다. 일부 경우들에서, 본 발명의 방법들은 또한 바로 상술된 세척 완충제보다 낮은 pH(예를 들어, 2.45 ± 0.2) 및 보다 높은 농도의 완충 물질(예를 들어, 500 mM 아세트산)을 포함하는 완충제를 이용해 친화성 기질을 추가로 세척하는 단계를 포함할 수 있다.
상술된 세척체(또는 세척제들)를 이용한 추가 불순물의 제거 이후, 친화성 기질은 5 내지 9의 pH로 재평형화된다. 다양한 실시예들에서, 친화성 기질은 (또는 약) 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0의 pH로 평형화된다. 일부 실시예들에서, 친화성 기질은 약 7.2의 pH로 평형화된다. 평형화는 원하는 pH를 갖는 평형화 완충제를 이용해 수행될 수 있다. 다양한 실시예들에서, 완충제는 pH를 원하는 지점 또는 원하는 범위 내로 유지할 수 있는 임의의 완충제일 수 있다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 10 mM 내지 약 30 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 (또는 약) 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, 55 mM, 56 mM, 57 mM, 58 mM, 59 mM 또는 60 mM이다. 일부 실시예들에서, 완충제 농도는 (또는 약) 20 mM이다. 일부 실시예들에서, 완충제 농도는 (또는 약) 40 mM이다. 일부 실시예들에서, 완충제 농도는 (또는 약) 50 mM이다. 일부 실시예들에서, 완충제는 나트륨 인산염이다. 일부 실시예들에서, 이 완충제는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 트리스, 나트륨 인산염, 또는 아세트산염, 또는 이들의 조합을 포함한다.
친화성 기질의 평형화 후, 이종이량체 단백질을 함유하는 중화된 용출물(이제 동종이량체 오염물 및 기타 불순물로부터 정제됨)은 5 내지 9의 pH에서 상술된 정제 공정 단계에서 사용된 동일한 친화성 기질에 재인가된다. 다양한 실시예들에서, 중화된 용출물은 (또는 약) 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9 또는 9.0 pH의 친화성 기질로 재인가된다. 일부 실시예들에서, pH는 (또는 약)약 7.2이다.
친화성 기질에 중화된 용출물을 재인가한 후, 기질은 중성 pH 및 100 mM 미만의 염 농도에서 세척 완충제(도 1의 세 번째 세척 완충제)으로 세척된다. 일반적으로, 이 세척 완충제의 pH는 상술된 바와 같이 친화성 기질에 재인가된 중화된 용출물의 pH와 거의 부합할 것이다. 다양한 실시예들에서, 이러한 세척 완충제의 염 농도는 약 0 mM 내지 약 100 mM, 약 0 mM 내지 약 75 mM, 약 0 mM 내지 약 50 mM, 약 0 mM 내지 약 25 mM, 또는 약 0 mM 내지 약 10 mM이다. 다양한 실시예들에서, 이러한 세척 완충제의 염 농도는 (또는 약) 99 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM 이하이거나, 또는 0 mM이다. 다양한 실시예들에서, 완충제는 pH를 원하는 지점 또는 원하는 범위 내로 유지할 수 있는 임의의 완충제일 수 있다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 약 5 mM 내지 약 100 mM일 수 있다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 10 mM 내지 약 30 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 30 mM 내지 약 50 mM이다. 일부 경우들에서, 완충제 농도는 약 40 mM 내지 약 60 mM이다. 다양한 실시예들에서, 완충제 농도는 (또는 약) 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 26 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 31 mM, 32 mM, 33 mM, 34 mM, 35 mM, 36 mM, 37 mM, 38 mM, 39 mM, 40 mM, 41 mM, 42 mM, 43 mM, 44 mM, 45 mM, 46 mM, 47 mM, 48 mM, 49 mM, 50 mM, 51 mM, 52 mM, 53 mM, 54 mM, 55 mM, 56 mM, 57 mM, 58 mM, 59 mM 또는 60 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제 농도는 (또는 약) 20 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제 농도는 (또는 약) 40 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제 농도는 (또는 약) 50 mM이다. 일부 실시예들에서, 세척 완충제는 나트륨 인산염이다. 일부 실시예들에서, 이러한 세척 완충제는 약 10 mM 내지 약 50 mM의 트리스, 나트륨 인산염, 또는 아세트산염, 또는 이들의 조합들을 포함한다.
상술된 세척 이후, 정제된 이종이량체 단백질이 약 100 mM 미만의 염을 함유하는 용출물에서 친화성 기질로부터 용출 및 수집된다. 다양한 실시예들에서, 용출물의 염 농도는 (또는 약) 99 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM 미만이거나, 또는 0 mM이다. 일반적으로, 이종이량체 단백질의 용출은 약 4 미만의 pH의 완충제를 이용해 수행된다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 약 2.5 내지 약 3.5이다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 3.0 ± 0.2이다. 다양한 실시예들에서, 용출 완충제의 pH는 (또는 약) 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8 또는 약 3.9이다. 용출 완충제는 상술된 pH 또는 pH 범위를 제공하기에 적합한 임의의 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제는 약 20 mM 내지 약 60 mM 농도의 아세트산을 포함한다. 일부 실시예들에서, 용출 완충제는 약 30 mM 내지 약 50 mM 농도의 아세트산을 포함한다. 일부 경우들에서, 용출 완충제는 약 40 mM 아세트산을 포함한다.
다양한 실시예들에서, 정화된 세포 배양물로부터 또는 이종이량체성 단백질을 함유하는 중화된 용출물로부터의 친화성 기질의 로딩은 최대 약 75 g/L의 친화성 기질 레진의 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 다양한 실시예들에서, 친화성 기질에는 65 g/L, 60 g/L, 55 g/L 또는 50 g/L 이하의 물질이 로딩된다.
본원에서 논의된 방법들의 다양한 실시예들에서, 정제된 이종이량체 단백질 용출물로부터 염을 제거하기 위해 정용 여과도 한외 여과도 사용되지 않는다. 후속 처리를 위한 염 농도를 낮추는 데 원하는 산물의 희석 또한 필요하지 않다. 이렇게 희석, 한외 여과 또는 정용 여과 없이 염 농도를 낮추면 이러한 양특이성 항체의 정제에 필요한 장비 및 탱크 공간이 줄어든다.
일부 실시예들에서, 친화성 기질은 기질에 부착된 리간드(예를 들어, 단백질 A)를 포함한다. 일부 경우들에서, 기질은 비드 또는 입자이며, 이에 따라 친화성 기질은 리간드가 부착된 복수의 입자가 된다. 다양한 실시예들에서, 리간드는 단백질 A 또는 단백질 G이다. 리간드가 단백질 A일 때, 단백질 A는 자연 발생 또는 개질된 Staphylococcal 단백질 A일 수 있거나, 또는 조작된 단백질 A일 수 있다. 조작된 단백질 A는 예를 들어, D 및 E 도메인들이 없는 조작된 단백질 A, Y-도메인 사량체, 또는 Z-도메인 사량체일 수 있다. 이러한 조작된 단백질 A 예시들은 면역글로불린의 VH3 도메인에 결합할 수 없지만(또는 매우 낮은 친화도로 결합함) 여전히 IgG1, IgG2 및 IgG4의 CH3 도메인들에 결합할 수 있다.
일부 경우들에서, 친화성 기질 기질은 아가로스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 제어된 다공성 유리, 구상 실리카, 셀룰로오스 등을 함유하거나 이로 이루어진다. 기재가 비드 또는 입자로서 성형되는 실시예들에서, 입자의 평균 직경은 25 ㎛ 내지 100 ㎛이다. 일부 실시예들에서, 입자의 평균 직경은 약 40 ㎛ 내지 약 60 ㎛이다. 일부 실시예들에서, 입자의 평균 직경은 약 45 ㎛ 내지 약 55 ㎛이다. 일부 실시예들에서, 입자의 평균 직경은 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 또는 55 ㎛이다. 일부 경우들에서, 입자의 평균 직경은 약 45 ㎛이다. 일부 경우들에서, 입자의 평균 직경은 약 50 ㎛이다. 일부 실시예들에서, 입자는 35 ㎛, 45 ㎛, 60 ㎛, 75 ㎛, 또는 85 ㎛의 평균 직경을 가진다. 일부 실시예들에서, 입자는 약 1000 Å, 1050 Å, 1100 Å, 1150 Å 또는 1200 Å의 평균 직경을 갖는 기공들을 함유한다. 일부 실시예들에서, 입자는 약 1100 Å의 평균 직경을 갖는 기공들을 함유한다.
방법들의 일부 실시예들에서, 이종이량체성 단백질은 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리텝티드("Fc") 및 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드("Fc*")를 포함하는 양특이성 항체이다. 일부 경우들에서, 제2 폴리펩티드는 CH3 도메인에서의 H435R/Y436F(EU 번호 체계에 의함; 엑손 번호 체계에 의해서는 H95R/Y96F) 치환(일명 "Fc*" 또는 "별표 치환")을 포함한다. 이에 따라, 일부 실시예들에서, 제1 동종이량체는 두 개의 비치환 CH3 도메인들(즉, FcFc)을 갖는 단일특이성 항체이고; 제2 동종이량체는 두 개의 H435R/Y436F 치환된 CH3 도메인들(즉, Fc*Fc*)을 갖는 단일특이성 항체이며; 이종이량체 단백질은 하나의 비치환 CH3 도메인 및 하나의 H435R/Y436F 치환된 CH3 도메인(즉, Fc*Fc)을 갖는 양특이성 항체이다.
예들
예 1: CD3xCD20 양특이성 항체(BsAb1)의 정제.
BsAb1의 정제는 친화성 분해 크로마토그래피 단계 및 친화성 포획 크로마토그래피 단계를 포함하는 2단계 공정으로서 수행했다. 친화성 분해 단계는 정화된 조정 배지로부터 양특이성 항체를 포획함으로써, 산물 체적을 감소시키고, 단백질 농도를 증가시키며, Fc*Fc* 및 FcFc 동종이량체 종의 제거를 통해 양특이성 순도를 증가시킬 수 있었다. 친화성 분해 공정으로부터 양특이성 항체의 용출 이후, 완충제 교환 및 바이러스 불활화를 위해 동일한 친화성 칼럼으로 후속 재로딩을 준비하기 위해 용출물을 더 높은 pH(~7.2)로 조정했다. 친화성 포획 단계는 중성 친화성 분해 풀로부터 양특이성 항체를 포획함으로써, 산물 체적을 줄이고, 단백질 농도를 증가시키며, 친화성 분해 단계에서 사용된 용출물로부터 염을 제거할 수 있었다: 모두 증가된 장비 및 탱크 요건들을 필요로 할 수 있는 한외 여과, 정용 여과, 또는 희석을 필요로 하지 않는다. 양 크로마토그래피 단계들은 Z-도메인의 사량체를 포함하는 MabSelect SuReTM pcc 레진(GE Healthcare Life Sciences)을 포함하는 동일한 기질을 채용했다.
친화성 포획 공정 뒤에는 바이러스 불활화가 뒤따르고 양특이성 항체 풀을 3.50-3.65의 pH(0.25M 글리신 HCl 이용)에서 30-50분 동안 유지하는 것을 포함했다. 바이러스 불활화 뒤에는 중성 pH에서 양특이성 항체의 풀 여과가 뒤따랐다.
정제 공정은 각각 표 1 및 2에 나타낸 친화성 분해 및 친화성 포획 단계들을 포함했다.
표 1: 친화성 분해 공정 단계들
Figure pct00001
표 2: 친화성 포획 공정 단계들
Figure pct00002
결과들: 다회 정제 실행은 BsAb1에 대해 92.8%의 바이러스 불활화 이후 여과를 통한 양특이성 수율과 함께 97.1%의 평균 양특이성 순도를 냈다. 약 71.79 mS/cm로부터 < 2.0 mS/cm로 전도도 감소가 달성되었다. 친화성 분해 공정의 용출 단계에서 표 1에 언급된 나트륨 염화물 대신 pH 4.45의 500 mM CaCl2를 이용한 BsAb1에 대해 유사한 결과들이 달성되었다.
예 2: METxMET(상이한 에피토프) 양특이성 항체(BsAb2)의 정제.
BsAb2의 정제는 예 1에 기술된 공정에 따라 수행되었지만, 각각 표 3 및 4에 나타낸 친화성 분해 및 친화성 포획 단계들을 포함했다.
표 3: 친화성 분해 공정 단계들
Figure pct00003
표 4: 친화성 포획 공정 단계들
Figure pct00004
결과들: 다회 정제 실행은 BsAb2에 대해 90.9%의 바이러스 불활화 이후 여과를 통한 양특이성 수율과 함께 96.0% ± 0.7%의 평균 양특이성 순도를 냈다. 약 70.75 mS/cm로부터 < 2.0 mS/cm로 전도도 감소가 달성되었다.
예 3: BCMAxCD3 양특이성 항체(BsAb3)의 정제.
BsAb3의 정제는 예 1에 기술된 공정에 따라 수행되었지만, 각각 표 5 및 6에 나타낸 친화성 분해 및 친화성 포획 단계들을 포함했다.
표 5: 친화성 분석 공정 단계들
Figure pct00005
표 6: 친화성 포획 공정 단계들
Figure pct00006
결과들: 다회 정제 실행은 BsAb3에 대해 93.4%의 바이러스 불활화 이후 여과를 통한 양특이성 수율과 함께 97.4% ± 0.5%의 평균 양특이성 순도를 냈다. 약 72.80 mS/cm로부터 < 2.0 mS/cm로 전도도 감소가 달성되었다.
예 4: BCMAxCD3 양특이성 항체(BsAb4)의 정제.
BsAb4의 정제는 예 1에 기술된 공정에 따라 수행되었지만, 각각 표 7 및 8에 나타낸 친화성 분해 및 친화성 포획 단계들을 포함했다.
표 7: 친화성 분해 공정 단계들
Figure pct00007
표 8: 친화성 포획 공정 단계들
Figure pct00008
결과들: 다회 정제 실행은 BsAb4에 대해 86.0%의 바이러스 불활화 이후 여과를 통한 양특이성 수율과 함께 94.6% ± 1.0%의 평균 양특이성 순도를 냈다. 약 70.78 mS/cm로부터 < 2.0 mS/cm로 전도도 감소가 달성되었다.
예 5: PSMAxCD28 양특이성 항체(BsAb5)의 정제.
BsAb5의 정제는 예 1에 기술된 공정에 따라 수행되었지만, 각각 표 9 및 10에 나타낸 친화성 분해 및 친화성 포획 단계들을 포함했다.
표 9: 친화성 분해 공정 단계들
Figure pct00009
표 10: 친화성 포획 공정 단계들
Figure pct00010
결과들: 다회 정제 실행은 BsAb5에 대해 92.4%의 바이러스 불활화 이후 여과를 통한 양특이성 수율과 함께 96.1% ± 0.9%의 평균 양특이성 순도를 냈다. 약 75.09 mS/cm로부터 < 2.0 mS/cm로 전도도 감소가 달성되었다.
예 6: CD22xCD28 양특이성 항체(BsAb6)의 정제.
BsAb6의 정제는 예 1에 기술된 공정에 따라 수행되었지만, 각각 표 11 및 12에 나타낸 친화성 분해 및 친화성 포획 단계들을 포함했다.
표 11: 친화성 분해 공정 단계들
Figure pct00011
표 12: 친화성 포획 공정 단계들
Figure pct00012
결과들: 다회 정제 실행은 BsAb6에 대해 92.8%의 바이러스 불활화 이후 여과를 통한 양특이성 수율과 함께 96.5% ± 0.7%의 평균 양특이성 순도를 냈다. 약 71.78 mS/cm로부터 < 2.0 mS/cm로 전도도 감소가 달성되었다.
예 7: UFDF와 비교해 친화성 탈염에 의해 생성된 산물의 품질 개선.
BsAb1(CD3xCD20)의 조성물에 존재하는 고분자량(high molecular weight, HMW) 종의 측정은 한외 여과/정용 여과(ultrafiltration/diafiltration, UFDF)를 사용하는 것보다 기존 친화성 칼럼에 정제된 이종이량체 산물을 재인가하는 것의 추가 이점을 입증한다. 아래 표 13에 나타낸 바와 같이, 정제된 양특이성 항체를 기존의 친화성 칼럼에 재인가하면 HMW 종을 0.88% 더 감소시킨 반면, UFDF를 사용하면 동일한 정제된 양특이성 항체의 HMW를 0.12% 증가시켰다.
표 13: 고 분자량 종의 변화
Figure pct00013
본 발명은 그 범위가 본원에 기술된 특정한 실시예에 의해 제한되지 않는다. 사실상, 본원에 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상세한 설명으로부터 당업자에게 명확해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.

Claims (43)

  1. 크로마토그래피 용출물로부터 성분을 제거하는 방법으로서,
    (a) 상기 성분이 크로마토그래피 칼럼에 인가된 제1 완충제에 존재하는 제1 크로마토그래피 단계를 수행하는 단계;
    (b) 상기 제1 크로마토그래피 단계로부터 중간 용출물을 수집하는 단계 - 상기 중간 용출물은 단백질 산물 및 상기 성분을 함유함 -;
    (c) 상기 중간 용출물을 상기 크로마토그래피 칼럼에 재인가하고, 상기 중간 용출물의 농도보다 낮은 농도로 상기 성분을 함유하는 제2 완충제를 이용해 상기 단백질 산물을 용출하는 단계;
    (d) 단계 (c)로부터의 상기 크로마토그래피 용출물을 수집하는 단계 - 상기 성분은 상기 중간 용출물의 농도보다 낮은 농도로 상기 크로마토그래피 용출물에 존재함 -; 및
    (e) 상기 크로마토그래피 용출물을 후속 공정 단계에 인가하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 성분은 상기 제2 완충제에 존재하지 않는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 성분은 염인 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 중간 용출물 중 상기 염의 농도는 50 mM을 초과하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 중간 용출물 중 상기 염의 농도는 ≥ 100 mM, ≥ 250 mM, 또는 ≥ 500 mM인 것인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 단계는 친화성 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피로부터 선택되는 것인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후속 공정 단계는 제2 크로마토그래피 단계인 것인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후속 공정 단계는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 상호반응 크로마토그래피, 또는 바이러스 불활화로부터 선택되는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 산물은 항체인 것인, 방법.
  10. 이종이량체 단백질을 정제하는 방법으로서,
    (a) 이종이량체 단백질 및 불순물의 혼합물을 단백질 결합 리간드를 함유하는 친화성 기질에 도입하는 단계 - 상기 이종이량체 단백질은 상기 단백질 결합 리간드에 대해 상이한 친화성을 갖는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하며, 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하고 적어도 하나의 불순물은 상기 단백질 결합 리간드에 결합하지 않음 -;
    (b) 불순물을 제거하기 위해 5 내지 9의 제1 pH 및 200 mM를 초과하는 염 농도를 포함하는 제1 세척 완충제를 이용해 상기 친화성 기질을 세척하는 단계;
    (c) 200 mM을 초과하는 농도의 염 및 4 내지 5의 제2 pH를 포함하는 제1 용출 완충제에서 상기 친화성 기질로부터 상기 이종이량체 단백질을 용출 및 수집하여 제1 용출물에서 정제된 이종이량체 단백질을 수득하는 단계;
    (d) 불순물을 제거하기 위해 4 미만의 제3 pH를 포함하는 제2 세척 완충제를 이용해 상기 친화성 기질을 세척하는 단계;
    (e) 상기 친화성 기질을 5 내지 9의 제4 pH로 평형화하는 단계;
    (f) 상기 제1 용출물을 pH 5 내지 9로 중화한 다음, 상기 제1 용출물을 상기 친화성 기질에 재인가하는 단계;
    (g) 100 mM 미만의 염을 포함하는 제3 세척 완충제를 이용해 상기 친화성 기질을 세척하는 단계; 및
    (h) 제2 용출물에서 상기 정제된 이종이량체 단백질을 용출 및 수집하는 단계 - 상기 제2 용출물은 100 mM 미만의 상기 염을 포함함 - 를 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 제3 세척 완충제는 50 mM 미만의 염을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 불순물은 상기 제1 폴리펩티드 및 상기 제2 폴리펩티드의 동종이량체 종을 포함하는 것인, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 결합 리간드는 단백질 A이고, 상기 친화성 기질은 기질에 부착된 상기 단백질 A의 리간드를 포함하는 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 단백질 A의 리간드는 Z-도메인 사량체를 포함하는 조작된 단백질 A, Y-도메인 사량체를 포함하는 조작된 단백질 A, 또는 D 및 E 도메인들이 없는 조작된 단백질 A인 것인, 방법.
  15. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 결합 리간드는 단백질 G이고, 상기 친화성 기질은 기질에 부착된 상기 단백질 G 리간드를 포함하는 것인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기질은 입자이고, 상기 친화성 기질은 25 ㎛ 내지 100 ㎛의 평균 직경을 포함하는 다수의 상기 입자을 포함하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 입자는 40 ㎛ 내지 60 ㎛의 평균 직경을 포함하는 것인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 입자는 45 ㎛ 내지 55 ㎛의 평균 직경을 포함하는 것인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 입자는 약 50 ㎛의 평균 직경을 포함하는 것인, 방법.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기재는 아가로스, 폴리(스티렌 디비닐벤젠), 폴리메타크릴레이트, 셀룰로오스, 제어된 다공성 유리, 및 구상 실리카 중 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  21. 제13항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 약 1100 Å의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는 것인, 방법.
  22. 제10항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 용출 완충제는 250 mM을 초과하는 농도의 염을 포함하는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 염 농도는 300 mM 초과 또는 400 mM 초과인 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 염 농도는 약 500 mM인 것인, 방법.
  25. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염은 (i) Cl-, Br-, I-, NO3 -, N(CH3)4 +, NH4 +, Cs+, Rb+, K+, Na+, H+, Ca2+, Mg2+, Al3+; (ii) Na+, H+, Ca2+, Mg2+ 또는 Al3+와 Cl-, Br-, I-, NO3 -, 또는 ClO4 -의 조합물, 또는 (iii) CaCl2, MgCl2 또는 NaCl을 함유하는 염으로부터 선택되는 것인, 방법.
  26. 제10항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 용출물은 50 mM 미만의 상기 염을 포함하는 것인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 제2 용출물은 10 mM 미만의 상기 염을 포함하는 것인, 방법.
  28. 제10항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정제된 이종이량체 단백질이 상기 제3 세척 완충제를 통해 상기 제2 용출물에서 용출 및 수집되는 것인, 방법.
  29. 제10항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 상기 단백질 결합 리간드에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 상기 단백질 결합 리간드에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  30. 제10항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 단백질 A에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  31. 제10항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 단백질 G에 결합할 수 있는 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제2 폴리펩티드는 단백질 G에 결합할 수 없는 CH3 도메인을 포함하는 것인, 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 자신의 CH3 도메인에 HY에서 RF로의 치환을 포함하는 것인, 방법.
  33. 제10항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 pH는 6 내지 8인 것인, 방법.
  34. 제10항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 pH는 4.0 내지 4.25인 것인, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 제2 pH는 4.10 ± 0.05인 것인, 방법.
  36. 제10항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 pH는 2.8 내지 3.5인 것인, 방법.
  37. 제10항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 pH는 6 내지 8인 것인, 방법.
  38. 제10항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (h) 후에 추가적인 크로마토그래피 단계 또는 바이러스 불활화 단계를 더 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 추가적인 크로마토그래피 단계 또는 바이러스 불활화 단계는 100 mM 미만의 염을 갖는 조건들 하에서 수행되는 것인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 추가적인 크로마토그래피 단계는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 교환 크로마토그래피이고, 50 mM 미만의 염을 갖는 조건들 하에서 수행되는 것인, 방법.
  42. 제10항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이량체 단백질은 양특이성 항원 결합 단백질인 것인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 양특이성 항원 결합 단백질은 양특이성 항체인 것인, 방법.
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