BRPI1015561B1 - Anticorpo biespecífico que é heterodimérico com relação à ligação à proteína a e métodos para produção e isolamento do mesmo - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO BIESPECÍFICA QUE É HETERODIMÉRICA COM RELAÇÃO À LIGAÇÃO À PROTEÍNA A, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO E ISOLAMENTO DE UM ANTICORPO BIESPECÍFICO QUE É HETERODIMÉRICO COM RELAÇÃO À LIGAÇÃO À PROTEÍNA A. A presente invenção refere-se a um formato de anticorpo biespecífico que proporciona facilidade de isolamento que é proporcionado, compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina que são diferenciais são não imunogênicas ou substancialmente não imunogênicas com relação às modificações de CH3, e pelo menos uma modificações resulta em uma afinidade diferencial para o anticorpo biespecífico para um reagente em uma afinidade tal como Proteína A, e o anticorpo biespecífico é isolável de uma célula rompida, do meio, ou de uma mistura de anticorpos baseada na sua afinidade para Proteína A.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a proteínas de ligação de antígeno ou anticorpos tendo heterodímeros de cadeias pesadas, isto é, duas cadeias pesadas de imunoglobulina que diferem por pelo menos um aminoácido, que permite isolamento da proteína de ligação de antígeno baseado em uma afinidade diferencial de uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia pesada de imunoglobulina modificada, ou que sofreu mutação em direção a um reagente de afinidade. A invenção também se refere a proteínas de ligação de antígeno (incluindo anticorpos biespecíficos) que têm regiões de IgG CH2 e CH3 com afinidades diferentes com relação à Proteína A que permite rápido isolamento por ligação diferencial das regiões de IgG a Proteína A.

ANTECEDENTES

[0002] Anticorpos são moléculas multifuncionais, que transportam uma especificidade de ligação única para um antígeno alvo, bem como a capacidade de interagir com o sistema imune, via mecanismos que são independentes do antígeno. Muitos terapêuticos biológicos atualmente utilizados para câncer são anticorpos monoclonais direcionados contra antígenos que são tipicamente sobre-expressos na célula de câncer alvo. Quando tais anticorpos se ligam a células de tumor, eles podem disparar citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC), ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Infelizmente, as células cancerosas frequentemente desenvolvem mecanismos para suprimir estas respostas imunes normais.

[0003] Nos anos recentes, esforços têm sido feitos para desenvolver terapêuticos similares à anticorpo que têm mais do que uma especificidade de ligação de antígeno, por exemplo, anticorpos biespecíficos. No caso de terapias de câncer, formatos multiespecíficos podem permitir a possibilidade de se usar, por exemplo, uma especificidade para ter como alvo a molécula a um antígeno de célula de tumor, a outra especificidade para disparar uma resposta que não é normalmente disponível ao sistema imune. Anticorpos biespecíficos podem também encontrar uso como ligantes substitutos para sistemas receptores heterodiméricos de dois componentes que são normalmente ativados por seu ligante natural quando ele se liga a e traz juntos ambos componentes.

[0004] Numerosos formatos foram desenvolvidos na técnica para determinar oportunidades terapêuticas proporcionadas pelas moléculas com especificidades de ligação múltipla. Idealmente, tais moléculas devem ser proteínas bem comportadas que são fáceis de produzir e purificar, e possuem propriedades favoráveis in vivo, por exemplo, farmacocinéticas apropriadas para uma proposta pretendida, imunogenicidade mínima, e, se desejável, funções efetuadoras de anticorpos funcionais.

[0005] O modo mais correto de produção de um anticorpo biespecífico (expressando dois anticorpos distintos em uma célula única) ocorre em espécies múltiplas, porque as respectivas cadeias pesadas formam ambos homo- e heterodímeros, mas somente os heterodímeros são desejados. Também, as cadeias leves e pesadas podem se emparelhar inapropriadamente. Vários exemplos de formatos que tentam determinar estes problemas em modos diferentes são descritos abaixo.

[0006] Um formato, usado para moléculas Biespecífico T célula Engager (BiTE) (vide, por exemplo, Wolf, E. et al. (2005) Drug Discovery Today 10:1237-1244)), é baseado em módulos de fragmento variável de cadeia simples (scFv). Um scFv consiste em regiões variáveis de cadeia leve e pesada de anticorpo fundidas, via um articulador flexível, que geralmente pode dobrar apropriadamente e, desse modo, que as regiões podem se ligar ao antígeno cognato. Um BiTE concatena dois scFv's de especificidades diferentes em tandem em uma cadeia simples (vide figura 1A). Esta configuração impossibilita a produção de moléculas com duas cópias da mesma região variável de cadeia pesada. Em adição, a configuração do articulador é designada para assegurar emparelhamento correto das respectivas cadeias pesadas e leves.

[0007] O formato de BiTE tem várias desvantagens. Primeiro, as moléculas de scFv são notórias por sua tendência a se agregarem. E embora a imunogenicidade de articuladores de scFv seja reputadamente baixa, a possibilidade de geração de anticorpos contra um BiTE não pode ser descartada. A ausência de uma porção Fc no formato de BiTE também torna sua meia-vida de soro muito curta, e isto necessita da complicação de administrações repetidas frequentes ou infusão contínua, via uma bomba. Finalmente, a ausência de um Fc também implica na ausência de funções efetuadoras mediadas por Fc, que podem ser benéficas em algumas circunstâncias.

[0008] Um segundo formato (figura 1B) é um híbrido de um anticorpo monoclonal de camundongo e rato, e ocorre em uma modificação de cromatografia de afinidade de Proteína A convencional (vide, por exemplo, Lindhofer, H. et al. (1995) J. Immunol. 155:219225)). Neste formato, uma IgG2a de camundongo e um anticorpo de IgG2b de rato são produzidos juntos na mesma célula (por exemplo, ou como uma fusão de quadroma de dois hibridomas, ou em células de CHO projetadas). Devido às cadeias leves de cada anticorpo associarem-se preferencialmente com as cadeias pesadas de suas espécies cognatas, somente três espécies distintas de anticorpo podem ser montadas: os dois anticorpos de origem, e um heterodímero dos dois anticorpos compreendendo um par de cadeia pesada/leve de cada, associando-se, via suas porções de Fc. O heterodímero desejado pode ser facilmente purificado a partir desta mistura porque suas propriedades de ligação a Proteína A são diferentes daquelas dos anticorpos de origem: IgG2b de rato não se liga a proteína A, onde o IgG2a de camundongo se liga. Consequentemente, o heterodímero de camundongo-rato se liga a Proteína A, mas elui a um pH mais alto do que o homodímero de IgG2a de camundongo, e isto torna a purificação seletiva do heterodímero biespecífico possível. Como com o formato de BiTE, este formato híbrido tem dois locais de ligação de antígeno monovalente.

[0009] A desvantagem do híbrido camundongo/rato é que devido a ele ser não humano, ele provavelmente provoca uma resposta imune no paciente, que pode ter efeitos colaterais nocivos (por exemplo, reações de "HAMA" ou "HARA"), e/ou neutraliza o terapêutico.

[00010] Um terceiro formato, referido como "knobs-into-holes" (figura 1C), foi discutido na técnica anterior como potencialmente útil para a produção de anticorpos biespecíficos (Patente dos Estados Unidos N° 7.183.076). Nesta estratégia, as porções Fc de dois anticorpos são projetadas para dar um "knob" projetante, e a outra um "hole" complementar. Quando produzidas na mesma célula, as cadeias pesadas são referidas para preferencialmente formem heterodímeros preferivelmente do que homodímeros, por associação dos "knobs" projetados com os "holes" projetados. As emissões de emparelhamento correto de cadeia leve-pesada são determinadas pela escolha de anticorpos que têm especificidades diferentes, mas empregam cadeias leves idênticas.

[00011] A desvantagem deste formato é que a estratégia de "knobs- into-holes" pode resultar na produção de uma quantidade significante de homodímeros indesejáveis, desse modo, necessitando de etapas de purificação adicionais. Esta dificuldade é exacerbada pelo fato que as espécies contaminantes são quase idênticas às espécies desejadas em muitas de suas propriedades. As formas projetadas podem também potencialmente serem imunogênicas, porque as mutações que produzem os "knobs" e "holes" introduzem sequências estrangeiras.

[00012] Permanece uma necessidade de um formato de anticorpo biespecífico, em particular, para aplicações terapêuticas, que minimizam algumas ou todas das desvantagens mencionadas acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00013] A figura 1 ilustra três formatos de anticorpo biespecíficos: (A) Engager de célula T biespecífica (BiTE); (B) Híbrido Camundongo-Rato; e, (C) Knobs-into-Holes com uma cadeia leve comum.

[00014] A figura 2 ilustra a modificação de FcΔAdp: (A) Alinhamento de regiões Fc de IgG1 humana (SEQ ID NO:1) e IgG3 (SEQ ID NO:3), mostrando modificação de FcΔAdp em caixa; (B) uma representação esquemática de um FcΔAdp anticorpo biespecífico.

[00015] A figura 3 ilustra um alinhamento de Domínios de CH3 humanos (empregando numeração IMGT exon e numeração EU) de IgG1, IgG2, e IgG4, com e sem a modificação de dipeptídeo AAdp, bem como IgG3.

[00016] figura 4 mostra um traço de coluna de Proteína A para isolamento de anticorpos biespecíficos, mostrando um perfil de eluição utilizando um gradiente de etapa.

[00017] A figura 5 mostra perfil de ligação de IL4-Ra e IL-6Ra BIACORE® de frações de coluna eluídas a partir da separação cromatográfica mostrada na figura 4. Os anticorpos nas frações foram capturados com anticorpos imobilizados anti-Fc, e, em seguida, IL-4Ra solúvel ou IL-6Ra foram ensaiados para ligação dos anticorpos capturados.

[00018] figura 6 mostra um perfil farmacocinético de um FcΔAdp anticorpo biespecífico (IL-6RA/IL-4R), um homodímero FcΔAdp (IL- 6RA/IL-6RA), um anticorpo de IgG1 com sequência de CH3 tipo selvagem (IL-4R/IL-4R), e um anticorpo mono-específico de controle.

[00019] A figura 7 ilustra a eficácia de um CD20xCD3ΔAdp anticorpo biespecífico em um ensaio de morte de célula Raji.

[00020] A figura 8 ilustra um ensaio de morte de célula circunstante (293) com o CD20xCD3ΔAdp anticorpo biespecífico.

[00021] A figura 9 mostra resultados para experimentos de expressão usando heterodímeros de mFc diferentes.

[00022] Painel A: Mancha de Western de separação de pH de mlgG2a/mlgG2aPTTTK heterodimérico de mlgG2a homodimérico e lgG2aPTTTK homodimérico; Painel B: Mancha de Western de separação de pH de mlgG2a/mlgG2aTTTK heterodimérico de mlgG2a homodimérico e lgG2aTTTK homodimérico; IP = admissão; FT = fluxo através; W2 = segunda lavagem (1x PBS pH 7,2); E1 = primeira eluição (20 mM de citrato de Na, 1 M de NaCI pH 5,5); E2 = segunda eluição (20 mM de citrato de Na, 1 M de NaCl; 57% pH 5,5 + 43% pH 2,6); E3 = terceira eluição (20 mM de citrato de Na, 1 M de NaCl pH 2,6).

[00023] A figura 10 ilustra formação preferencial de heterodímeros de IgG2a mutante sobre formação de heterodímeros de isotipos misturados (por exemplo, mlgG2a e IgG1), usando IFNAR1 construto:IFNAR2 proporção de construto de 4:1. Raia 1: IFNAR1- lgG2a:IFNAR2-lgG1; Raia 2: INFAR1-lgG2a:IFNAR2-lgG2aTTT; Raia 3: IFNAR1-lgG2a:IFNAR2-lgG2aTTTK; Raia 4: IFNAR1-lgG2a:IFNAR2- lgG2aPTTTK; Raia 5: IFNAR1-lgG2a:IFNAR2-lgG2aRF.

SUMÁRIO

[00024] A invenção é baseada, pelo menos em parte, no emprego de duas sequências de domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina que diferem por pelo menos um aminoácido em uma proteína de ligação de antígeno biespecífica. A pelo menos uma diferença de aminoácido resulta em uma capacidade aperfeiçoada de isolar a proteína, porque a diferença resulta em uma capacidade diferencial das sequências de domínio de CH3 se ligarem a um agente de afinidade.

[00025] Em um aspecto, uma proteína de ligação de antígeno é proporcionada, compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo, o primeiro polipeptídeo compreendendo, do N-terminal a C-terminal, uma primeira região de ligação de antígeno que seletivamente se liga a um primeiro antígeno, seguido por uma região constante que compreende uma primeira região de CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1 (SEQ ID NO:1), IgG2 (SEQ ID NO:3), IgG4 (SEQ ID NO:5), e uma combinaçãodos mesmos; e, um segundo polipeptídeo compreendendo, do N-terminal ao C-terminal, uma segunda região de ligação de antígeno que seletivamente se liga a um segundo antígeno, seguido por uma região constante que compreende uma segunda região de CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1, IgG2, IgG4, e uma combinação destes, no qual a segunda região de CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a ligação do segundo domínio de CH3 à proteína A.

[00026] Em uma concretização, a segunda região de CH3 compreende uma modificação 95R (pela Numeração de IMGT exon; 435R pela Numeração de EU). Em outra concretização, a segunda região de CH3 compreende adicionalmente modificação 96F(IMGT; 436F por EU). Em concretizações específicas, a segunda região de CH3 é selecionada de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, e SEQ ID NO:6.

[00027] Em uma concretização, a segunda região de CH3 é de uma IgG1 humana modificada (SEQ ID NO:2), e compreende adicionalmente modificação selecionada a partir do grupo consistindo em D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I por EU).

[00028] Em uma concretização, a segunda região de CH3 é de uma lgG2 humana modificada (SEQ ID NO:4), e compreende adicionalmente modificação selecionada a partir do grupo consistindo em N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I por EU).

[00029] Em uma concretização, a segunda região de CH3 é de uma IgG4 humana modificada (SEQ ID NO:6), e compreende adicionalmente modificação selecionada a partir do grupo consistindo em Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I por EU).

[00030] Em uma concretização, o domínio de CH3 é um domínio quimérico que compreende sequências de duas ou mais de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, e IgG4 humana.

[00031] Em uma concretização, o domínio de CH3 é de IgG1 humana, IgG2n humana, ou IgG4 humana, e a proteína de ligação de antígeno compreende adicionalmente domínio de CH1 e um domínio de CH2, no qual o domínio de CH1 e o domínio de CH2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma IgG1 humana CH1 ou domínio de CH2, uma lgG2 humana CH1 ou domínio de CH2, ou um humano quimérico/IgG1 humano/lgG2 ou um humano quimérico/IgG1 humana/lgG3 ou um humano quimérico/IgG2 humana/domínio de IgG3 ou um humano quimérico/lgG1 humana/lgG4 ou uma IgG3/IgG4quimérico ou uma IgG2 quimérica/domínio de IgG4. Em uma concretização específica, a IgG1/lgG2 quimérica, domínios de IgG1/IgG3, IgG2/IgG3, IgG1/IgG4, IgG3/IgG4, e IgG2/IgG4 são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos em um humano.

[00032] Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno compreende adicionalmente uma cadeia leve de imunoglobulina. Em uma concretização, a cadeia leve de imunoglobulina é selecionada de uma cadeia leve de lambda humana e kappa humana.

[00033] Em uma concretização, as primeira e segunda regiões de ligação de antígeno cada compreende pelo menos uma CDR, em outra concretização, pelo menos duas CDRs, em outra concretização, cada compreende três CDRs. Em uma concretização específica, as CDRs são de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em outra concretização específica, a cadeia pesada é uma cadeia pesada humana.

[00034] Em uma concretização, a primeira região de ligação de antígeno compreende um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina, e a segunda região de ligação de antígeno compreende um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina.

[00035] Em uma concretização, o primeiro e o segundo domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina são independentemente selecionados de um domínio de camundongo, rato, hamster, coelho, macaco, chimpanzé, e humano.

[00036] Em uma concretização, o primeiro e o segundo domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina compreendem independentemente uma CDR humana, uma CDR de camundongo, uma CDR de rato, uma CDR de coelho, uma CDR de macaco, uma CDR de chimpanzé, e uma CDR humanizada. Em uma concretização, a CDR é humana e é somaticamente mutada.

[00037] Em uma concretização, o primeiro e o segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendem uma região de estrutura humana (FR). Em uma concretização, a FR humana é uma FR humana somaticamente mudada.

[00038] Em uma concretização, a primeira e/ou a segunda regiões de ligação de antígeno são obtidas por classificação de uma biblioteca de fago compreendendo regiões variáveis de anticorpo para reatividade em direção a um antígeno de interesse. Em outra concretização, a primeira e/ou a segunda regiões de ligação de antígeno são obtidas por imunização de um animal não humano, tal como um camundongo, um rato, um coelho, um macaco, ou um chimpanzé com um antígeno de interesse, e identificação de uma sequência de ácido nucleico de região variável de anticorpo que codifica uma região variável específica para o antígeno de interesse. Em uma concretização específica, o animal não humano compreende um ou mais genes de região variável de imunoglobulina humana. Em outra concretização específica, os um ou mais genes de região variável de imunoglobulina humana estão presentes no animal não humano extracromossomonalmente, como uma substituição em um local de imunoglobulina endógena, ou um transgene aleatoriamente integrado no genoma do animal não humano. Em uma concretização, a primeira e/ou a segunda regiões de ligação de antígeno são obtidas de um hibridoma ou um quadroma, em outra concretização de classificação de células imunes de um animal não humano humanizado usando classificação de célula.

[00039] Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno é um anticorpo biespecífico. Em uma concretização, o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico totalmente humano e tem uma afinidade para cada epítopo, independentemente, na faixa de micromolar, nanomolar, ou picomolar.

[00040] Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno é não imunogênica ou substancialmente não imunogênica em um humano. Em uma concretização específica, a proteína de ligação de antígeno carece de um epítopo de célula T humana não nativa. Em uma concretização, a modificação da região CH3 é não imunogênica ou substancialmente não imunogênica em um humano. Em uma concretização específica, a modificação da região CH3 não resulta em um epítopo de célula T humana não nativa.

[00041] Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno compreende uma cadeia pesada, no qual a cadeia pesada é não imunogênica ou substancialmente não imunogênica em um humano. Em uma concretização, a cadeia pesada tem uma sequência de aminoácido que não contém um epítopo de célula T não nativa. Em uma concretização, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido cuja proteólise não pode formar uma sequência de aminoácido de cerca de 9 aminoácidos que é imunogênica em um humano. Em uma concretização específica, o humano é um ser humano tratado com a proteína de ligação de antígeno. Em uma concretização, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido cuja proteólise não pode formar uma sequência de aminoácido de cerca de 13 a cerca de 17 aminoácidos que é imunogênica em um humano. Em uma concretização específica, o humano é um ser humano tratado com a proteína de ligação de antígeno.

[00042] Em um aspecto, uma proteína de ligação biespecífica compreendendo uma modificação de CH2 e/ou CH3, conforme descrita aqui é provida, no qual a proteína de ligação biespecífica compreende uma primeira porção de ligação que reconhece especificamente um antígeno em uma célula B, e uma segunda porção de ligação que reconhece especificamente um antígeno em uma célula T.

[00043] Em uma concretização, a proteína de ligação é um anticorpo biespecífico. Em uma concretização específica, o anticorpo biespecífico compreende uma IgG1 humana de cadeia pesada e uma IgGlAAdp humana de cadeia pesada. Em uma concretização, a primeira porção de ligação é um domínio variável de cadeia pesada humana que reconhece especificamente CD20. Em uma concretização, a segunda porção de ligação é um domínio variável de cadeia pesada humana que reconhece especificamente CD3. Em uma concretização, o anticorpo biespecífico exibe um EC50 em um ensaio de morte de Raji de cerca de 2,8-3,2 x 1CT12 M, ou cerca de 2,8-3,0 x 1fJ12 M, e exibe não mais do que cerca de 1-10%, ou 1-5%, morte circunstante em um ensaio de morte de célula circunstante, no qual a célula circunstante não compreende um epítopo de CD20. Em uma concretização específica, a célula circunstante é uma célula 293. Em outra concretização específica, a morte de célula circunstante no ensaio é medida através de uma concentração de anticorpo biespecífico de cerca de 10-8 M a cerca de 10-14 M.

[00044] Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo biespecífico é provido, compreendendo: obtenção de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um primeiro domínio variável que reconhece um primeiro epítopo, no qual a primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio constante de isotipo IgG1, IgG2, ou IgG4, ou um domínio constante de isotipo quimérico deste; obtenção de uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um segundo domínio variável que reconhece um segundo epítopo, no qual a segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio constante de isotipo IgG1, IgG2, ou IgG4, ou um domínio constante de isotipo quimérico deste, que compreende uma modificação em seu domínio de CH3 que erradica ou reduz ligação à Proteína A; obtenção de uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de cadeia leve que emparelha com a primeira e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina; introdução da primeira, segunda e terceira sequências de ácido nucleico em uma célula de mamífero; permissão da célula expressar uma imunoglobulina, e isolamento da imunoglobulina usando Proteína A.

[00045] Em uma concretização, a célula é selecionada de um CHO, COS, 293, HeLa, e uma célula retinal que expressa uma sequência de ácido nucleico viral (por exemplo, uma célula PERC.6).

[00046] Em um aspecto, uma proteína de ligação de antígeno biespecífica é provida que compreende uma primeira especificidade que se liga a um antígeno e uma segunda especificidade que ativa um receptor, no qual a proteína de ligação de antígeno biespecífica compreende um primeiro polipeptídeo compreendendo uma primeiro domínio de CH3 de IgG1, IgG2, ou IgG4 que compreende um Determinante de ligação de Proteína A, e um segundo polipeptídeo compreendendo um segundo domínio de CH3 de IgG1, IgG3, ou IgG4 que carece do determinante de ligação de Proteína A.

[00047] Em uma concretização, a segunda especificidade que ativa o receptor que se liga ao receptor com uma KD que está na faixa molar, milimolar, micromolar, nanomolar, ou picomolar.

[00048] Em uma concretização, a segunda especificidade se liga a um receptor selecionado de um Receptor acoplado à proteína-G, um receptor tirosina kinase, uma integrin, e um receptor similar à toll.

[00049] Em uma concretização, a segunda especificidade contata o receptor e faz com que o receptor ou uma subunidade ou uma proteína associada fisicamente com esta empreenda fosforilação de uma serina, treonina, ou tirosina; causa ciclicização de um nucleotídeo (por exemplo, cAMP, cADP, ou cGMP); causa produção de uma fosfatidilinositol ou derivado deste (por exemplo, IP3 ou PIP3); causa produção de um mensageiro do segundo lipídeo (por exemplo, diacilclicerol, ceramida, ácido lisofosfatídico, um eicosanoide); causa defosforilação (por exemplo, atividade de fosfatase); causa fosforilação de um lipídeo para formar um segundo mensageiro; causa hidrólise de um segundo mensageiro; causa proteólise; causa sinalização redox; causa translocalização de uma proteína em uma organela celular (por exemplo, ao núcleo); faz com que o receptor agregue (com si próprio) para formar homo- ou (com outros receptores) para formar heteromultímeros; ou causar a abertura ou fechamento de um canal de transmembrana.

[00050] Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo biespecífico é provido, compreendendo:isolamento de um anticorpo biespecífico de interesse de um quadroma, no qual o anticorpo biespecífico de interesse compreende uma primeira cadeia pesada que é um isotipo de IgG1, IgG2, ou IgG4, uma segunda cadeia pesada que é um isotipo de IgG1, IgG2, ou IgG4 tendo um domínio constante que compreende uma modificação em seu domínio de CH3 que erradica ou reduz ligação à Proteína A, no qual o anticorpo biespecífico de interesse é isolado usando Proteína A.

[00051] Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo biespecífico é provido, compreendendo uma etapa de isolamento de uma célula rompida ou uma mistura de anticorpos a anticorpo biespecífico tendo domínios de CH3 IgG1, IgG2, ou IgG4 diferencialmente modificados, no qual os domínios de CH3 diferencialmente modificados são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos em um humano, e no qual a modificação resulta em um anticorpo biespecífico com uma cadeia pesada heterodimérica cujos monômeros têm uma afinidade diferencial para Proteína A, e o anticorpo biespecífico é isolado a partir da célula rompida ou da mistura usando Proteína A.

[00052] Em uma concretização, o anticorpo biespecífico é isolado usando um suporte de afinidade de Proteína A, no qual o anticorpo biespecífico elui a um pH entre cerca de 3,9 a cerca de 4,4, cerca de 4,0 a cerca de 4,3, cerca de 4,1 a cerca de 4,2, ou a cerca de pH 4,2. Em uma concretização, o anticorpo biespecífico elui a um pH de cerca de 4, 4,1,4,2, 4,3, 4,4, ou 4,5.

[00053] Em uma concretização, o anticorpo biespecífico é isolado usando um Suporte de afinidade de Proteína A e um gradiente de pH ou etapa, no qual o gradiente de pH ou etapa inclui um modificador iônico. Em uma concretização específica, o modificador iônico está presente a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 molar. Em uma concretização específica, o modificador iônico é um sal. Em uma concretização, o modificador iônico é selecionado a partir do grupo consistindo em sais de 0berílio, lítio, sódio, e potássio de acetato; bicarbonatos de sódio e potássio; carbonatos de lítio, sódio, potássio e césio; cloretos de lítio, sódio, potássio, césio e magnésio; fluoretos de sódio e potássio; nitratos de sódio, potássio e cálcio; fosfatos de sódio e potássio; e sulfatos de cálcio e magnésio. Em uma concretização específica, o modificador iônico é um sal de haleto de um metal alcalino ou metal alcalinoterroso. Em uma concretização específica, o modificador iônico é cloreto de sódio.

[00054] Em um aspecto, uma proteína de ligação compreendendo um Fc, no qual o Fc compreende um primeiro domínio de CH3 que é modificado conforme descrito aqui, e um segundo domínio de CH3 que não é modificado, de modo a formar um Fc heterodimérico, no qual a modificação diferencial resulta na proteína de ligação que elui de um material de afinidade de proteína A a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,3, ou 1,4 unidade(s) de pH mais altas do que uma proteína de ligação correspondente que carece de modificação diferencial.

[00055] Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4,2, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 3. Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4,5, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 3,5. Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 2,8-3,5, 2,8-3,2, ou 2,8-3. Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4,2, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 2,8. Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4,4, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 3,6. Nestas concretizações, "não modificada" se refere a falta de uma modificação em 435 (Numeração de EU), ou falta de uma modificação a 435 e 436 (Numeração de EU), ou ambos dos domínios de CH3.

[00056] Quaisquer das concretizações e aspectos aqui descritos podem ser usados em conjunto com um outro, a menos que, de outro modo, indicado ou aparente do contexto. Outras concretizações tornar- se-ão aparentes àqueles técnicos no assunto a partir de uma revisão da seguinte descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00057] Esta invenção não é limitada a métodos particulares, e condições experimentais descritas, tanto que métodos e condições podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui usada é para a proposta de descrever concretizações particulares somente, e não é pretendida para ser limitante, visto que o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações.

[00058] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais particulares são agora descritos. Todas as publicações mencionadas são, desse modo, incorporadas por referência.

[00059] O termo "anticorpo", conforme aqui usado, inclui moléculas de imunoglobulina compreendidas de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por pontes de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões de VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas região de determinação de complementaridade (CDR), interespersas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta destas três CDRs e quatro FRs, dispostas de amino-terminal a carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDRs de cadeia pesada podem ser abreviadas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; CDRs de cadeia leve podem ser abreviadas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3. O termo anticorpo de "alta afinidade" se refere àqueles anticorpos tendo uma afinidade de ligação a seu alvo de pelo menos 10-9 M, pelo menos 10-10 M; pelo menos 10-11 M; ou pelo menos 10-12 M, conforme medido por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE® ou afinidade de solução ELISA.

[00060] A frase "proteína de ligação de antígeno" inclui uma proteína tendo pelo menos uma CDR, e que é capaz de reconhecer seletivamente um antígeno, isto é, é capaz de se ligar a um antígeno com uma KD que está pelo menos na faixa de micromolar. Proteínas de ligação de antígeno terapêuticas (por exemplo, anticorpos terapêuticos) frequentemente requerem uma KD que está na faixa de nanomolar ou na faixa de picomolar. A "proteína de ligação de antígeno" também inclui uma proteína compreendendo um primeiro e um segundo domínio de CH3, conforme aqui descrito, e uma primeira proteína ou domínio de reconhecimento de ligante e uma segunda proteína ou domínio de reconhecimento de ligante, no qual a primeira proteína ou domínio de reconhecimento de ligante e a segunda proteína ou domínio de reconhecimento de ligante cada independentemente reconhece a mesma proteína ou ligante, ou juntas reconhecem a mesma proteína ou ligante, ou cada independentemente reconhece uma proteína ou ligante diferentes. Um exemplo de tal proteína é uma imunoadesin, compreendendo um dímero de proteína de fusão (hetero- ou homo-) no qual os polipeptídeos do dímero são polipeptídeos de fusão que compreendem um componente de receptor ou um componente de ligante, no qual o componente de ligante compreende uma sequência de aminoácido que se liga a um receptor.

[00061] A frase "anticorpo biespecífico" inclui um anticorpo capaz de ligar seletivamente dois ou mais epítopos. Os anticorpos biespecíficos geralmente compreendem duas cadeias pesadas diferentes, com cada cadeia pesada especificamente se ligando a um epítopo diferente — ou em duas moléculas diferentes (por exemplo, antígenos), ou na mesma molécula (por exemplo, no mesmo antígeno). Se um anticorpo biespecífico é capaz de ligar seletivamente dois epítopos diferentes (um primeiro epítopo e um segundo epítopo), a afinidade da primeira cadeia pesada ao primeiro epítopo geralmente será pelo menos uma a duas ou três ou quatro ordens de grandeza mais baixa do que a afinidade da primeira cadeia pesada para o segundo epítopo, e vice-versa. Os epítopos reconhecidos pelo anticorpo biespecífico podem estar no mesmo ou em um alvo diferente (por exemplo, na mesma ou em uma proteína diferente). Os anticorpos biespecíficos podem ser produzidos, por exemplo, pela combinação de cadeias pesadas que reconhecem epítopos diferentes do mesmo antígeno. Por exemplo, sequências de ácido nucleico que codificam sequências variáveis de cadeia pesada que reconhecem epítopos diferentes do mesmo antígeno, podem ser fundidas às sequências de ácido nucleico que codificam regiões constantes de cadeia pesada diferentes, e tais sequências podem ser expressas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina. Um anticorpo biespecífico típico tem duas cadeias pesadas, cada uma tendo três CDRs de cadeia pesada, seguido por (N- terminal a C-terminal) um domínio de CH1, uma articulação, um domínio de CH2, e um domínio de CH3, e uma cadeia leve de imunoglobulina que ou não confere especificidade de ligação de antígeno, mas que pode se associar com cada cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia pesada e que pode se ligar a um ou mais dos epítopos ligados pelas regiões de ligação de antígeno de cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia pesada e capacita ligação a ou uma ou ambas das cadeias pesadas a um ou ambos epítopos.

[00062] O termo "célula" inclui qualquer célula que é adequada para expressar uma sequência de ácido nucleico recombinante. As células incluem aquelas de procariotes e eucariotes (célula simples ou célula múltipla), células bacteriais (porexemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactérias, células fungais, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células de planta, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas por baculovírus, Trichoplusia ni, etc.), células de animal não humano, células humanas, ou fusões de célula tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em algumas concretizações, a célula é uma célula de humano, macaco, chimpanzé, hamster, rato, ou camundongo. Em algumas concretizações, a célula é eucariótica e é selecionada das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula retinal, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, célula L, C127 célula, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, BRL 3A célula, célula HT1080, célula de mieloma, célula de tumor, e uma linha de célula derivada de uma célula antes mencionada. Em algumas concretizações, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula retinal que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C6).

[00063] A frase "região de determinação de complementaridade", ou o termo "CDR," inclui uma sequência de aminoácido codificada por uma sequência de ácido nucleico de um gene de imunoglobulina do organismo que normalmente (isto é, em um animal tipo selvagem) aparece entre duas regiões de estrutura em uma região variável de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina (porexemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada por, por exemplo, uma sequência de linha de germe ou uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B naive ou uma célula B matura, ou uma célula T. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma CDR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências de linha de germe) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácido nucleico não rearranjada), mas são contíguas em uma sequência de ácido nucleico de célula B, por exemplo, como o resultado de união ou conexão das sequências (por exemplo, recombinação de V-D-J para formar uma CDR3 de cadeia pesada).

[00064] A frase "cadeia pesada," ou "cadeia pesada de imunoglobulina" inclui uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer organismo, e, a menos do que de outro modo especificado, inclui um domínio variável de cadeia pesada. Os domínios variáveis de cadeia pesada incluem três CDRs de cadeia pesada e quatro regiões de FR, a menos que de outro modo especificado. Fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs, e combinações destes. Uma cadeia pesada típica tem em seguida ao domínio variável (de N-terminal a C-terminal), um domínio de CH1, uma articulação, um domínio de CH2, e um domínio de CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de reconhecer especificamente um antígeno (por exemplo, reconhecimento do antígeno com uma KD na faixa de micromolar, nanomolar, ou picomolar), que é capaz de expressar e secretar de uma célula, e que compreende pelo menos uma CDR.

[00065] A frase "proteína contendo Fc" inclui anticorpos, anticorpos biespecíficos, imunoadesinas, e outras proteínas de ligação que compreendem pelo menos uma porção funcional de uma região de CH2 e CH3 de imunoglobulina. Uma "porção funcional" se refere a uma região de CH2 e CH3 que pode se ligar a um Fc receptor (por exemplo, um FcyR; ou um FcRn, isto é, um Fc receptor neonatal), e/ou que pode participar na ativação de complemento. Se a região de CH2 e CH3 contém anulações, substituições e/ou inserções, ou outras modificações que as tornam incapazes de ligarem qualquer Fc receptor e também incapazes de ativar complemento, a região de CH2 e CH3 não é funcional.

[00066] As proteínas contendo Fc podem compreender modificações nos domínios de imunoglobulina, incluindo onde as modificações afetam uma ou mais função efetuadora da proteína de ligação (por exemplo, modificações que afetam ligação de FcyR, ligação de FcRn e, desse modo, meia-vida, e/ou atividade de CDC). Tais modificações incluem, mas não são limitadas a, as seguintes modificações e combinações destes, com referência a Numeração de EU de uma região constante de imunoglobulina: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, e 439.

[00067] Por exemplo, e não por meio de limitação, a proteína de ligação é uma proteína contendo Fc e exibe meia-vida de soro intensificada (conforme comparada com a mesma proteína contendo Fc sem a(s) modificação (ões) recitadas), e tem uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação a 428 e/ou 433 (por exemplo, L/R/SI/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação a 250 e/ou 428; ou uma modificação a 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em outro exemplo, a modificação pode compreender um 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, N434S) modificação; a 428L, 259I (por exemplo, V259I), e a 308F (por exemplo, V308F) modificação; um 433K (por exemplo, H433K) e um 434 (por exemplo, 434Y) modificação; um 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T, e 256E) modificação; um 250Q e 428L modificação (por exemplo, T250Q e M428L); a 307 e/ou 308 modificação (por exemplo, 308F ou 308P).

[00068] A frase "modificador iônico" inclui porções que reduzem o efeito de, ou interações iônicas de rompimento, não específicas (isto é, não afinidade) entre proteínas. Os "modificadores iônicos" incluem, por exemplo, sais, combinações iônicas de metais de Grupo I e Grupo II com acetato, bicarbonato, carbonato, um halogênio (por exemplo, cloreto ou fluoreto), nitrato, fosfato, ou sulfato. Uma lista ilustrativa não limitativa de "modificadores iônicos" inclui sais de berílio, lítio, sódio, e potássio de acetato; bicarbonatos de sódio e potássio; carbonatos de lítio, sódio, potássio e césio; cloretos de lítio, sódio, potássio, césio e magnésio; fluoretos de sódio e potássio; nitratos de sódio, potássio e cálcio; fosfatos de sódio e potássio; e sulfatos de cálcio e magnésio. Os "modificadores iônicos" incluem aquelas porções que afetam interações iônicas que, após adição a um gradiente ou etapa de pH, ou após equilíbrio de um suporte de Proteína A em um "modificador iônico" e aplicação de uma etapa ou gradiente de pH, resulta em uma ampliação de distância de unidade de pH entre eluição de uma IgG homodimérica e uma IgG heterodimérica (por exemplo, uma IgG humana tipo selvagem e a mesma IgG, mas suportando uma ou mais modificações de seu domínio de CH3, conforme aqui descrito). Uma concentração adequada de um "modificador iônico" pode ser determinada por sua concentração empregando a mesma coluna, etapa e gradiente de pH, com concentração aumentada de "modificador iônico" até que uma distância de pH máxima seja alcançada a uma dada etapa ou gradiente de pH.

[00069] A frase "cadeia leve" inclui uma sequência de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo, e, a menos que de outro modo especificado, inclui cadeias leves humanas kappa e lambda. Os domínios variáveis cadeia leve (VL) tipicamente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro regiões de estrutura (FR), a menos que, de outro modo, especificado. Geralmente, uma cadeia leve de comprimento total inclui, de amino terminal a carboxil terminal, a um domínio de VL que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, e um domínio constante de cadeia leve. As cadeias leves que podem ser usadas com esta invenção incluem aquelas, por exemplo, que não se ligam seletivamente ou ao primeiro ou segundo antígeno seletivamente ligado pela proteína de ligação de antígeno. Cadeias leves adequadas incluem aquelas que podem ser identificadas pela classificação das cadeias leves mais comumente empregadas nas bibliotecas de anticorpo existentes (bibliotecas úmidas ou in silico), onde as cadeias leves não interferem substancialmente com a afinidade e/ou seletividade dos domínios de ligação de antígeno das proteínas de ligação de antígeno. As cadeia leves adequadas incluem aquelas que podem se ligar a um ou ambos epítopos que são ligados pelas regiões de ligação de antígeno da proteína de ligação de antígeno.

[00070] A frase "faixa micromolar" é pretendida significar 1-999 micromolar; a frase "faixa nanomolar" é pretendida significar 1-999 nanomolar; a frase "faixa picomolar" é pretendida significar 1-999 picomolar.

[00071] A frase "somaticamente mutada" inclui referência a uma sequência de ácido nucleico de uma célula B que suportou ligação de classe, no qual a sequência de ácido nucleico de uma região variável de imunoglobulina (porexemplo, um domínio variável de cadeia pesada ou incluindo uma CDR de cadeia pesada CDR ou sequência de FR) na célula B de ligação de classe não é idêntica à sequência de ácido nucleico na célula B antes da ligação de classe, tal como, por exemplo, uma diferença em uma CDR ou sequência de ácido nucleico de estrutura entre uma célula B que não suportou ligação de classe e uma célula B que suporta ligação de classe. "Somaticamente mutado" inclui referência às sequências de ácido nucleico de células B de afinidade maturada que não são idênticas às sequências correspondentes em células B que não são de afinidade maturada (isto é, sequências no genoma de células de linha de germe). A frase "somaticamente matado" também inclui referência a uma sequência de ácido nucleico de uma célula B após exposição da célula B a um antígeno de interesse, no qual a sequência de ácido nucleico difere da sequência de ácido nucleico correspondente antes da exposição da célula B ao antígeno de interesse. A frase "somaticamente mutado" se refere a sequências de anticorpos que foram geradas em um animal, por exemplo, um camundongo tendo região variável humana de sequências de ácido nucleico de imunoglobulina, em resposta a um desafio de antígeno, e que resulta dos processos de seleção inerentemente operantes em tal animal.

[00072] A frase "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina (modificada conforme desejado) que compreende as seguintes regiões de aminoácido, em sequência de N-terminal a C-terminal (a menos que, de outro modo, desejado): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Um "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácido capaz de dobrar em um domínio canônico (VH ou VL) tendo uma estrutura de beta folha dupla na qual as beta folhas são conectadas por ponte de dissulfeto entre um resíduo de uma primeira beta folha e uma segunda beta folha.

Anticorpos biespecíficos Com Regiões de CH3 de IgG Modificadas

[00073] Os inventores desenvolveram um novo formato que combina uma estratégia comum de cadeia leve com uma implementação de um esquema de purificação seletiva de Proteína A que pode ser usado com componentes de anticorpo humano.

[00074] Foi previamente notado (Lindhofer, H. et al. (1995) J. Immunol. 155:219-225)) que devido a IgG3 humana não se ligar a Proteína A, ela pode potencialmente ser usada junto com qualquer das outras três subclasses de IgG humana em uma estratégia de purificação similar a uma usada para híbridos de camundongo-rato. Contudo, embora as sequências de todas as quatro subclasses de IgG humana sejam altamente homólogas, não é conhecido agora como prontamente as porções de Fc de IgG1, IgG2, e IgG4 formarem heterodímeros com IgG3; mesmo meramente formação preferencial de homodímeros teria um impacto negativo nos rendimentos totais dos heterodímeros desejados sob certas circunstâncias (por exemplo, isolamento de quadromas). As modificações adicionais podem também serem necessárias para compensar a diferença entre a região de articulação de IgG3 e aquelas das outras subclasses. Seria também preferível, em algumas circunstâncias, não requerer a presença da IgG3 Fc total, devido ao impacto potencial nas funções efetuadoras.

[00075] Os inventores desenvolveram, portanto, um formato "mínimo" que explora um determinante fortuitamente simples de ligação de Proteína. Foi reportado (Jendeberg, L et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34)) que a inabilidade de IgG3 se ligar a Proteína A é determinada por um resíduo de aminoácido simples, Arg435 (Numeração de EU; Arg95 por IMGT), cuja posição correspondente na outra subclasse de IgG é ocupada por um resíduo de histidina. É, portanto, possível, ao invés de IgG3, usar uma sequência de IgG1 em que His435 sofre mutação para Arg. Desse modo, uma mutação de ponto simples em IgG1 deve ser suficiente para criar as afinidades de ligação diferentes receptivas a um novo esquema de purificação. Esta modificação será referida a um IgG1 AA, para denotar sua inabilidade de se ligar a Proteína A (e, similarmente, IgG2AA e IgG4AA ou, mais geralmente, FcAA).

[00076] Contudo, a mutação de ponto especificada introduz uma nova sequência de peptídeo através da mutação, que pode potencialmente ser imunogênica. A mutação de ponto pode, na teoria, estar carregada em uma molécula de classe II de MHC e apresentada a células T, e, consequentemente, induz uma resposta imune. Para evitar esta armadilha, uma mutação de dipeptídeo, H435R/Y436F (Numeração de EU; H95R/Y96F por IMGT) pode ser usada. A sequência resultante na vizinhança da alteração é idêntica àquela de IgG3 (vide figura 2A), e seria, portanto, esperada ser imunologicamente "invisível" porque existiria peptídeos curtos não nativos disponíveis para apresentação a células T. Foi reportado que este mutante duplo ainda não se liga a Proteína A (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34). Finalmente, a mutação de dipeptídeo não inclui qualquer dos resíduos que formam a interface de dímero de Fc, de modo que é diferentemente para interferir com a formação de heterodímeros. Esta mutação de dipeptídeo é designada como "IgGlAAdp" (e, similarmente, lgG2AAdp, lgG4AAdp, e FcΔAdp). A colocação da modificação de dipeptídeo em IgG1, lgG2, e lgG4 é indicada na figura 3 nas sequências denotadas IgGlAAdp, IgG2AAdp, e IgG4AAdp mostradas com sequências de domínio de CH3 de IgG humana tipo selvagem, bem como hlgG3, mostrando Numeração de IMGT exon e Numeração de EU.

[00077] A modificação de FcΔAdp não inclui qualquer dos resíduos acreditados formarem a Interface de dímero de Fc, de modo que a modificação de FcΔAdp é diferentemente para interferir com a formação de heterodímeros. Devido ao FcΔAdp ser, desse modo, mínimo, ele pode similarmente ser incorporado nas outras formas de Fc projetadas também. IgG2AAdp e lgG4AAdp podem estar vantajosamente em situações em que as funções efetuadoras (ou falta destas), associadas com cada uma das anteriores, são desejadas.

[00078] Em resumo, o formato de anticorpo biespecífico descrito acima inclui dois anticorpos de especificidade diferente que usa a mesma cadeia leve, no qual a região Fc de um deles é modificada para o formato FcΔAdp (vide figura 2B). Sua configuração é aquela de um anticorpo humano natural, e deve, portanto, compartilhar suas propriedades favoráveis, incluindo uma baixa propensidade a agregado, estabilidade in vivo, imunogenicidade mínima, propriedades de biodistribuição similares àquelas de anticorpos, boas farmacocinéticas, e, opcionalmente, funções efetuadoras. Métodos para isolamento de tais anticorpos biespecíficos são proporcionados, que são relativamente rápidos e simples na execução.

Proteínas de ligação biespecíficas Com Regiões de CH de IgG de Camundongo Modificadas

[00079] Os inventores desenvolveram um método para isolar prontamente uma proteína de ligação compreendendo uma cadeia pesada de imunoglobulina (ou fragmento deste contendo CH2 e CH3 funcional) que é heterodimérica com relação a um ou mais aminoácidos no domínio de CH3. Uma seleção cuidadosa de modificações de um domínio de CH de IgG de camundongo e aplicação de uma tecnologia de separação particular conferem a capacidade de isolar rapidamente uma proteína de ligação compreendendo duas diferencialmente modificadas regiões de CH de camundongo de homodímeros e de heterodímeros que não contêm as modificações.

[00080] A IgG1 de camundongo, que contém uma prolina em 247, uma treonina em 252, 254, e 256, e uma lisina em 258, se liga somente fracamente à proteína A. A IgG2a e IgG2b de camundongo, contudo, contém resíduos diferentes naquelas posições (com a exceção de posições 256 e 258 de IgG2b), e IgG2a e 2b de camundongo se ligam bem à proteína A. Diferencialmente modificando as regiões de CH de duas IgGs de camundongo em um método para produção de um anticorpo que é heterodimérico para cadeias pesadas conferiria uma característica de ligação de proteína A diferencial a tal anticorpo. Desse modo, um esquema de isolamento de proteína A diferencial é desenvolvido que permite pronta separação de um heterodímero modificado de qualquer homodímero de IgG de camundongo, se é um homodímero de IgG1 (que se ligaria somente muito fracamente, se no todo, à proteína A), ou um homodímero de IGg2A de camundongo, um homodímero de IgG2b de camundongo, ou um heterodímero de lgG2a/lgG2b. Por exemplo, um anticorpo biespecífico tendo dois domínios variáveis de cadeias pesadas diferentes, mas o mesmo isotipo, por exemplo, IgG2a, pode ser expresso em um sistema de expressão adequado que emprega as sequências de cadeia pesada, no qual somente uma das regiões de CH de IgG2a é modificada para reduzir ou eliminar um determinante de ligação de proteína A. Desse modo, somente uma das regiões de CH de IgG2a exibirá uma afinidade substancial para proteína A, e qualquer anticorpo formado de um dímero de uma IgG2a não modificada e uma IgG2a modificada será prontamente isolado do heterodímero modificado.

[00081] Em várias concretizações, um anticorpo no qual uma região de CH simples de um dímero de Fc compreende a região de CH modificada, onde a outra CH do dímero de Fc carece do mesmo. A região de CH de IgG de camundongo é modificada para compreender aminoácidos particulares em posições particulares (Numeração de EU), selecionados a partir do grupo consistindo em: 252T, 254T, e 256T; 252T, 254T, 256T, e 258K; 247P, 252T, 254T, 256T, e 258K; 435R e 436F; 252T, 254T, 256T, 435R, e 436F; 252T, 254T, 256T, 258K, 435R, e 436F; 24tP, 252T, 254T, 256T, 258K, 435R, e 436F; e, 435R. Em uma concretização específica, um grupo particular de modificações é produzido, selecionado a partir dos grupos consistindo em: M252T, S254T, S256T; M252T, S254T, S256T, I258K; I247P, M252T, S254T, S256T, I258K; H435R, H436F; M252T, S254T, S256T, H435R, H436F; M252T, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; I247P, M252T, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; e, H435R.

[00082] Proteínas de ligação à base de IgG de camundongo heterodimérica podem ser usadas para uma variedade de aplicações. Por exemplo, elas permitem um método de isolamento de anticorpos biespecíficos com domínios constantes de camundongo, no qual as modificações não interferem ou não interferem substancialmente com a ligação do anticorpo a um ou mais receptores de Fc de camundongo, tal que o anticorpo pode participar, por exemplo, no ADCC ou CDC, e também se ligar a dois ou mais epítopos no mesmo ou alvo diferente.

[00083] Em um aspecto, um método para isolamento de uma proteína de ligação compreendendo uma primeira região de CH de IgG de camundongo e uma segunda região de CH de IgG de camundongo, no qual a primeira região de CH de IgG é modificada (mas não a segunda região de CH de IgG), de modo a reduzir ou eliminar a afinidade de ligação da Proteína A da primeira região de CH de IgG de camundongo, mas não a segunda região de CH de IgG de camundongo, e no qual a proteína de ligação compreende uma primeira porção de ligação que se liga a um primeiro epítopo, e uma segunda porção de ligação que se liga a um segundo epítopo.

[00084] Em uma concretização, a modificação não altera ou não altera substancialmente a afinidade de ligação da proteína de ligação a um receptor Fc. Em uma concretização, a proteína de ligação compreende uma modificação que aumenta ou diminui a afinidade para a proteína de ligação a um receptor Fc.

[00085] Em uma concretização, a modificação não altera ou não altera substancialmente a meia-vida de soro da proteína de ligação em um camundongo compreendendo receptores FcyR de camundongo nativo, e/ou um FcRn de camundongo nativo, conforme comparado com uma proteína de ligação correspondente que carece da modificação.

[00086] Em uma concretização, a modificação não altera ou não altera substancialmente a meia-vida de soro da proteína de ligação em um camundongo que compreende uma substituição de receptores FCYR de alta e baixa afinidade de camundongo nativo, e/ou um receptor de FcRn, conforme comparado com uma proteína de ligação correspondente que carece da modificação.

[00087] Em uma concretização, o primeiro e o segundo epítopo são diferentes e estão em células diferentes, ou em proteínas diferentes. Em uma concretização, o primeiro epítopo e o segundo epítopo são diferentes e estão na mesma célula ou na mesma proteína.

[00088] Em uma concretização, o receptor Fc é selecionado de um receptor Fc de alta afinidade, um receptor Fc de baixa afinidade, e um FcRn. Em uma concretização específica, o receptor Fc é selecionado de uma ou mais FcRn de camundongo, uma FcyR de camundongo, uma FcyRIIB de camundongo, uma FcyRIII de camundongo, uma FcyRIV de camundongo, e uma combinação destas. Em uma concretização específica, o receptor Fc é selecionado de uma ou mais de uma FcRn humana, uma FcyR humana, uma FCYRIIB humana, uma FcyRIIC humana, uma FcyRNIB humana, uma FcyRIIIA humana, uma FcyRIIA humana, e uma combinação das mesmas.

Imunogenicidade

[00089] Uma vantagem de muitas concretizações da invenção é a capacidade de empregar a(s) modificação (ões) para produzir anticorpo biespecífico que é ambos prontamente isoláveis baseado na ligação diferencial à Proteína A, e é também não imunogênico ou substancialmente não imunogênico em um humano. Esta característica torna tais concretizações particularmente úteis na produção de anticorpos biespecíficos para uso terapêutico humano, e na produção de imunoadesinas, por exemplo, que são não imunogênicas ou substancialmente não imunogênicas (empregando porções de ligação humanas, isto é, componentes de receptor humanos e/ou ligantes humanos). Esta característica é associada com anticorpos biespecíficos tendo domínios de CH3 com as modificações H95R/Y96F (numeração IMGT) de IgG1, IgG2, e IgG3, e aqueles domínios de CH3 que contêm modificações adicionais que resultam na posição sendo modificada refletindo uma sequência tipo selvagem de um isotipo de IgG diferente. Desse modo, embora a modificação não seja encontrada na natureza associada com o isotipo de IgG particular, a sequência modificada é localmente idêntica com uma sequência tipo selvagem de um isotipo de IgG diferente, e a modificação não é esperada ser imunogênica ou substancialmente imunogênica. É também possível que uma modificação seja não imunogênica mesmo se sua sequência seja não localmente idêntica a qualquer sequência nativa; tais modificações seriam igualmente úteis. A mutação de ponto H95R mínima (numeração IMGT), se não imunogênica, seria, portanto, uma concretização adequada da invenção.

[00090] Desse modo, os anticorpos biespecíficos são proporcionados que são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos em um humano, com relação a seus domínios constantes de cadeia pesada, mas, não obstante, suportam uma ou mais modificações diferenciais do domínio constante de cadeia pesada, incluindo uma modificação que resulta em uma afinidade diferencial dos domínios constantes de cadeia pesada com relação a um reagente de afinidade (por exemplo, Proteína A). As modificações compreendem àquelas aqui reveladas. Em uma concretização específica, o anticorpo biespecífico que é não imunogênico ou substancialmente não imunogênico em um humano com relação a seu domínio de CH3, ainda tendo diferencialmente modificadas cadeias pesadas, é uma IgG1 humana, IgG2, ou IgG4 compreendendo um domínio de CH3 que compreende uma das seguintes modificações (ou, em outra concretização, consiste essencialmente de uma das seguintes modificações): H95R, ou H95R e Y96F (numeração IMGT).

[00091] Os anticorpos biespecíficos são esperados serem não imunogênicos, ou substancialmente não imunogênicos, com relação a humanos em quem tolerância a IgG1 humana, IgG2, e isoformas IgG4 não foram ainda quebradas a qualquer grau significante.

[00092] Em particular, a modificação de FcΔAdp é esperada ser imunologicamente "invisível" porque a ranhura de ligação de moléculas de classe II de MHC acomoda um 9-mer que compreende a determinante maior reconhecida por circuitos fechados variáveis do receptor de célula T, de modo que peptídeos que carecem de qualquer subsequência 9-mer nativa pareceria diferentemente induzir uma resposta imune. Contudo, peptídeos mais longos do que 9-mers (usualmente cerca de 13 a 17 mer) são ligados pela classe II de MHC, e é possível que segmentos que se projetam possam influenciar potencialmente na ligação. Portanto, modificações adicionais (sobre a modificação de FcΔAdp) que eliminam sequências nativas mais longas podem adicionalmente reduzir o potencial para imunogenicidade. Um exemplo específico é a modificação V422I (EU; V82I pela numeração IMGT), que prolonga o comprimento do peptídeo não nativo mínimo de 14 para 39 resíduos em IgG1 AAdp, e para 43 resíduos na IgG2AAdp analogamente definida. Outro exemplo é a modificação L445P (EU; L105P pela numeração IMGT) na IgG4AAdp, que prolonga o comprimento de 10 a 14 resíduos.

Farmacocinéticas

[00093] O local de ligação para Proteína A se sobrepõe com o local de ligação para o receptor Fc neonatal, FcRN, que é pensado ser responsável por conferir uma meia-vida de soro prolongada para imunoglobulinas. As modificações na vizinhança do local de ligação de proteína A, portanto, eleva a possibilidade que o formato aqui proposto pode ter uma meia-vida de soro mais curta do que de IgG1,2, e 4, dado que IgG3 humana tem uma meia-vida de soro mais curta (cerca de 7 dias) do que as outras subclasses de IgG (cerca de 21 dias). Alguns mutantes de Fc que afetam His435 foram mostrados não se ligarem a FcRN, e têm uma meia-vida mais curta em camundongos. Contudo, a análise farmacocinética mostrou que a meia-vida de soro do IgG1ΔA/lgG1 heterodímero não é apreciavelmente diferente daquela do IgG1 homodímero (vide Exemplo 2). Desse modo, a mutação IgGlΔAdp tem a vantagem de ablação da ligação de Proteína A, enquanto ainda preserva a meia-vida mais longa de IgGl.

[00094] Consequentemente, em uma concretização, uma proteína de ligação de antígeno biespecífica é proporcionada que compreende uma modificação de um domínio de CH3 conforme aqui descrito, no qual a proteína de ligação de antígeno revela um perfil farmacocinético equivalente à mesma proteína de ligação de antígeno biespecífica que carece da modificação no domínio de CH3. Em uma concretização, um anticorpo biespecífico é proporcionado que compreende um IgG1ΔA/lgG1 heterodimérico Fc, no qual o anticorpo biespecífico tem uma meia-vida de soro que é cerca de 1,5-vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, ou cerca de 3 vezes mais alta do que um anticorpo biespecífico que é, de outro modo, idêntico, mas compreende um IgG3 domínio de CH3, ou que, de outro modo, idêntico, mas compreende pelo menos uma cadeia pesada de IgG3. Em uma concretização, um anticorpo biespecífico é proporcionado compreendendo um IgG1ΔA/IgG1 heterodimérico Fc, no qual o anticorpo biespecífico exibe uma meia-vida de soro que é cerca de a mesma conforme aquela do anticorpo biespecífico sem a modificação de IgGIΔA (isto é, um anticorpo biespecífico de IgG1 homodimérico).

Cadeias pesadas de imunoglobulina

[00095] Regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina que podem ser usadas para gerar anticorpos biespecíficos com características desejadas (por exemplo, especificidades desejadas, afinidades desejadas, funcionalidades desejadas, por exemplo, bloqueio, não bloqueio, inibição, ativação, etc.) podem ser geradas usando-se qualquer método conhecido na técnica. As cadeias pesadas desejadas pode, em seguida, serem construídas por clonagem de sequências de ácido nucleico contendo as regiões variáveis nos construtos tendo a região constante de cadeia pesada desejada conforme aqui descrita.

[00096] Em uma concretização, a primeira cadeia pesada compreende uma região variável que é codificada por um ácido nucleico que é derivado do genoma de uma célula B matura de um primeiro animal que foi imunizado com um primeiro antígeno, e a primeira cadeia pesada reconhece especificamente o primeiro antígeno. Em uma concretização específica, a segunda cadeia pesada compreende uma região variável que é codificada por um ácido nucleico que é derivado do genoma de uma célula B matura de um segundo animal que foi imunizado com um segundo antígeno, e a segunda cadeia pesada reconhece especificamente o segundo antígeno.

[00097] Em uma concretização, o primeiro animal e/ou o segundo animal é um animal geneticamente modificado compreendendo uma região variável de cadeia pesada humana de imunoglobulina não- rearranjada. Em uma concretização, o primeiro animal e/ou o segundo animal é um animal geneticamente modificado compreendendo uma região variável de cadeia pesada humana de imunoglobulina não- rearranjada e uma região constante de imunoglobulina humana. Em uma concretização, o primeiro animal e/ou o segundo animal é um camundongo geneticamente modificado que compreende uma região variável de cadeia pesada humana de imunoglobulina não-rearranjada.

[00098] Sequências de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina podem ser obtidas por qualquer outro método conhecido na técnica, por exemplo, por revelação de fago, e sequências obtidas desse modo podem ser empregadas para produzir construtos de ácido nucleico a serem unidos aos ácidos nucleicos que codificam qualquer cadeia pesada adequada, por exemplo, cadeias pesadas com domínios de CH3 modificados conforme aqui descrito, e colocados em um construto de expressão e transferidos a uma célula que é capaz de produzir a cadeia pesada, por exemplo, na presença de uma cadeia leve adequada.

Cadeias leves de imunoglobulina

[00099] Anticorpos biespecíficos compreendendo duas cadeias pesadas que reconhecem dois epítopos diferentes (ou dois antígenos diferentes) são mais facilmente isoladas onde elas podem se emparelhar com a mesma cadeia leve (isto é, cadeia leves tendo domínios variáveis e constantes idênticos). Uma variedade de métodos é conhecida na técnica para geração de cadeias leves que podem se emparelhar com duas cadeias pesadas de especificidade diferente, enquanto não interferem ou não substancialmente interferem com a seletividade e/ou afinidade do domínio variável de cadeia pesada com seu antígeno alvo.

[000100] Na abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada pela sobrevivência de estatísticas de uso para todos os domínios variáveis de cadeia leve, identificando a cadeia leve mais frequentemente empregada em anticorpos humanos, e emparelhando aquela cadeia leve com as duas cadeias pesadas de especificidade diferente.

[000101] Em outra abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada por observação das sequências de cadeia leve em uma biblioteca de revelação de fago (por exemplo, uma biblioteca de revelação de fago compreendendo região variável humana de sequências de cadeia leve, por exemplo, uma biblioteca ScFv humana) e selecionando a região variável de cadeia leve mais comumente da biblioteca.

[000102] Em outra abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada pelo ensaio de uma biblioteca de revelação de fago de sequências variáveis de cadeia leve usando as sequências variáveis de cadeia pesada de ambas as cadeias pesadas como sondas. Uma cadeia leve que se associa com ambas sequências variáveis de cadeia pesada é selecionada como uma cadeia leve para as cadeias pesadas, e permite ligação e/ou ativação com relação a ambos os epítopos.

[000103] Em outra abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada pela combinação de cadeias leves conhecidas com cadeias pesadas desejadas e ensaiando o anticorpo biespecífico resultante para especificidade de ligação, afinidade, e/ou capacidade de ativação.

[000104] Para a extensão que uma dificuldade é encontrada em quaisquer abordagens para seleção de uma cadeia leve (por exemplo, a cadeia leve interfere com a ligação de uma ou ambas das cadeias pesadas com seu antígeno, ou a cadeia leve falha em se associar satisfatoriamente com uma ou ambas das cadeias pesadas), a cadeia leve pode ser alinhada com as cadeias leves cognatas de cadeias pesadas, e modificações são feitas na cadeia leve para se equiparar mais proximamente às características de sequência comuns às cadeias leves cognatas de ambas cadeias pesadas. Se as chances de imunogenicidade necessitam serem minimizadas, as modificações preferivelmente resultam em sequências que estão presentes em sequências de cadeia leve humanas conhecidas, tal que processamento proteolítico é diferentemente para gerar um epítopo de célula T baseado nos parâmetros e métodos conhecidos na técnica para avaliação da probabilidade de imunogenicidade (isto é, in silico, bem como ensaios úmidos).

Anticorpos e Proteínas de ligação

[000105] As composições e métodos são particularmente úteis na produção de anticorpos humanos biespecíficos, isto é, anticorpos biespecíficos compreendendo domínios variáveis e constantes humanos. Em algumas concretizações, os anticorpos humanos incluem aqueles tendo domínios variáveis de cadeia pesada e domínios constantes de cadeia pesada derivados de sequências de imunoglobulina de linha de germe humana, em algumas concretizações derivados de sequências de imunoglobulina humana somaticamente mutada (geradas, por exemplo, em um animal que compreende sequências de gene de imunoglobulina humana). Em algumas concretizações, as regiões variáveis e/ou constantes humanas podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha de germe humana, ou codificados como o resultado de recombinação e/ou união, por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3. Os anticorpos humanos não são pretendidos incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linha de germe de outra espécie de mamífero, tal como camundongo, foram enxertadas nas sequências de estrutura humana. Aqueles anticorpos são referidos como anticorpos humanizados ou quiméricos. Anticorpos humanos incluem aqueles compreendendo mutações, por exemplo, introduzidas in vitro por mutagênese aleatória ou específica de local, mas as mutações são preferivelmente não imunogênicas em um humano.

[000106] Os métodos e composições podem ser usados para produzir anticorpos quiméricos, preferivelmente não imunogênicos em um humano, ou de baixa imunogenicidade. Anticorpos quiméricos são anticorpos em que uma de uma região variável de cadeia pesada, ou estrutura, ou CDR, ou região constante de cadeia pesada, ou domínio, são de espécies diferentes (por exemplo, humano e camundongo, ou humano e primata). Em algumas concretizações, anticorpos quiméricos incluem anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada de origem não humana (porexemplo, camundongo) e uma região constante de cadeia pesada de origem humana. Em algumas concretizações, anticorpos quiméricos incluem anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada de origem humana e uma região constante de cadeia pesada de origem não humana (por exemplo, camundongo). Em várias concretizações, regiões de origem de camundongo são idênticas ou substancialmente idênticas a uma sequência de linha de germe de imunoglobulina de camundongo, com ou sem hipermutações somáticas. Anticorpos quiméricos também incluem anticorpos tendo uma região constante de cadeia leve que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência de linha de germe de imunoglobulina humana e uma (por exemplo, camundongo) cadeia pesada não humana ou quimérica humana/cadeia pesada não humana. Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos tendo um domínio constante de cadeia leve que é idêntico ou substancialmente idêntico a uma (por exemplo, camundongo) sequência de linha de germe de imunoglobulina não humana e um quimérico humano ou não humano/cadeia pesada humana.

[000107] Em algumas concretizações, as composições e métodos são para produção de um anticorpo maturado de afinidade. Em algumas concretizações, um anticorpo maturado de afinidade compreende uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs que resultam em afinidade mais alta (por exemplo, KD na faixa nanomolar ou picomolar) do anticorpo para seu antígeno alvo conforme comparado a um anticorpo substancialmente idêntica que carece da(s) alteração (ões). Os anticorpos maturados de afinidades podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, por mutagênese aleatória ou direcionada de local de CDRs e/ou regiões de estrutura seguidas por classificação de afinidade, embaralhamento de domínio de VH, etc.

[000108] Em algumas concretizações, os anticorpos são anticorpos de neutralização.

[000109] Anticorpos de neutralização incluem anticorpos capazes de neutralizar, inibir ou prevenir uma atividade biológica de antígeno. Os anticorpos de neutralização incluem aqueles que, sob ligação a um antígeno, previnem ou reduzem a capacidade do antígeno agir em um alvo natural do antígeno in vivo e in vitro. Exemplos de anticorpos de neutralização incluem um anticorpo para uma proteína ligante de um receptor biológico que previne o ligante de se ligar ao receptor, ou um anticorpo a um receptor biológico que previne o receptor de se ligar a seu ligante, onde o ligante que se liga na ausência do anticorpo faz com que o receptor efetue uma mudança dentro de uma célula. A determinação se um anticorpo é um anticorpo de neutralização geralmente determina a condução de um ensaio funcional no qual o efeito do anticorpo na atividade biológica do antígeno é medido.

[000110] Os métodos e composições da invenção são também úteis em uma variedade de aplicações a anticorpos e outras proteínas de ligação. Uma curta descrição de algumas aplicações úteis é provida aqui.

[000111] Proteínas de ligação biespecíficas que compreendem especificidade de ligação em direção a um antígeno de tumor e a um antígeno de célula T podem ser produzidas, que têm como alvo um antígeno em uma célula, por exemplo, CD20, e também tem como alvo um antígeno em uma célula T, por exemplo, CD3. Desse modo, o anticorpo biespecífico tem como alvo ambos uma célula de interesse em um paciente (por exemplo, célula B em um paciente com linfoma, via ligação de CD20), bem como uma célula T do paciente. O anticorpo biespecífico, em várias concretizações, é designado de modo a ativar a célula T sob ligação de CD3, desse modo, acoplando ativação de célula T a uma célula de tumor selecionada específica.

[000112] As proteínas de ligação biespecíficas que compreendem duas porções de ligação que são cada direcionadas a um coparticipante de ligação (isto é, cada direcionado a um alvo diferente) na superfície da mesma célula, podem também serem produzidas. Este desenho é particularmente adequado para ter como alvo células específicas ou tipos de célula que expressam ambos alvos na superfície da mesma célula. Embora alvos possam aparecer individualmente em outras células, as porções de ligação destas proteínas de ligação são selecionadas tal que a porção de ligação liga seu alvo com uma afinidade relativamente baixa (por exemplo, micromolar baixo, ou alto nanomolar — por exemplo, sobre uma centena de nanomolar KD, por exemplo, 500, 600, 700, 800 nanomolar). Desse modo, a ligação de alvo prolongada é favorecida somente em situações onde os dois alvos estão em proximidade na mesma célula.

[000113] As proteínas de ligação biespecíficas que compreendem duas porções de ligação que ligam o mesmo alvo, cada em um epítopo diferente do mesmo alvo, podem ser produzidas. Este desenho é particularmente adequado para maximização da probabilidade de bloqueio bem sucedido de um alvo com proteína de ligação. Circuitos fechados extracelulares múltiplos, por exemplo, de um canal de transmembrana, ou um receptor de superfície de célula, podem ser alvejados pela mesma molécula de ligação biespecífica.

[000114] As proteínas de ligação biespecíficas que compreendem duas porções de ligação que agrupam e ativam reguladores negativos de sinalização imune para resultar em supressão imune podem ser produzidas. A repressão em cis pode ser alcançada onde os alvos estão na mesma célula; repressão em trans pode ser alcançada onde os alvos estão em células diferentes. A repressão em cis, por exemplo, pode ser alcançada com uma proteína de ligação biespecífica tendo uma porção de ligação de anti-lgGRIIb e uma porção de ligação de anti-FelD1, tal que o IgGRIIb é agrupado somente na presença de FelD1, de modo a regular descendentemente uma resposta imune para FelD1. A repressão em trans, por exemplo, pode ser alcançada com uma proteína de ligação biespecífica tendo uma porção de ligação de anti-BTLA e uma porção de ligação que liga especificamente um antígeno de interesse específico, tal que o agrupamento da molécula de BTLA inibitória ocorre somente no tecido alvo selecionado, que determina potencialmente doenças autoimunes.

[000115] As proteínas de ligação biespecíficas que ativam receptores de multi-componentes podem ser produzidas. Neste desenho, duas porções de ligação direcionadas a dois componentes de uma ligação de receptor, reticulam o receptor, e ativam sinalização do receptor. Isto pode ser feito, por exemplo, usando uma proteína de ligação biespecífica com uma porção de ligação que liga IFNAR1 e uma porção de ligação que liga IFNAR2, onde a ligação reticula o receptor. Tal proteína de ligação biespecífica pode proporcionar uma alternativa a tratamento de interferon.

[000116] As proteínas de ligação biespecíficas que transportam porções de ligação através de uma barreira semipermeável, por exemplo, a barreira sangue-cérebro, podem ser produzidas. Neste desenho, uma porção de ligação liga um alvo que pode transitar uma barreira seletiva particular; a outra porção de ligação tem como alvo uma molécula com uma atividade terapêutica, no qual a molécula alvo com atividade terapêutica não pode normalmente atravessar a barreira. Este tipo de proteína de ligação biespecífica é útil para trazer terapêuticos a tecidos que o terapêutico, de outro modo, não alcançaria. Alguns exemplos incluem ter como alvo o pIGR receptor para transportar um terapêutico no intestino ou pulmão, ou ter como alvo o receptor de transferrin para transportar um terapêutico através da barreira sangue- cérebro. As proteína de ligação biespecíficas que transportam porções de ligação em células específicas ou tipos de célula podem ser produzidas. Neste desenho, uma porção de ligação tem como alvo uma proteína de superfície de célula (por exemplo, um receptor) que é prontamente internalizada na célula. A outra porção de ligação tem como alvo uma proteína intracelular, onde ligação da proteína intracelular resulta em um efeito terapêutico.

[000117] As proteínas de ligação biespecíficas que ligam um receptor de superfície de uma célula imune fagocítica e uma molécula de superfície de uma patogenia infecciosa (por exemplo, uma levedura ou bactéria), para trazer a patogenia infecciosa na vizinhança de uma célula imune fagocítica para facilitar fagocitose da patogenia. Um exemplo de tal desenho seria um anticorpo biespecífico que tem como alvo uma molécula de CD64 ou CD89 e também uma patogenia.

[000118] As proteínas de ligação biespecíficas que têm uma região variável de anticorpo como uma porção de ligação e uma porção de não ligação como uma segunda porção de ligação. A região variável de anticorpo alcança o alvo, onde a porção de não ligação é um efetuador ou uma toxina ligada a um Fc. Desse modo, o ligante (por exemplo, um efetuador ou toxina) é distribuído para ao alvo ligado pela região variável de anticorpo.

[000119] As proteína de ligação biespecíficas que têm duas porções cada uma ligada a uma região Ig (por exemplo, uma sequência de Ig contendo um CH2 e Região CH3) tal que quaisquer duas porções de proteína podem ser trazidas entre si na vizinhança no contexto do Fc. Exemplos destes desenho incluem armadilhas, por exemplo, moléculas de armadilha homo- ou heterodiméricas.

Ácidos nucleicos

[000120] As sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos monoclonais podem ser obtidas por qualquer método adequado conhecido na técnica. Exemplos de métodos adequados para obtenção de anticorpos monoclonais (e sua sequências de ácido nucleico) incluem, por exemplo, por um método de hibridoma (vide, por exemplo, Kohler et al. (1975) Nature 256:495-497) ou uma biblioteca de anticorpo de fago (vide, por exemplo, vide Clackson et al. (1991) Nature 352:624628).

[000121] Em várias concretizações, os domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina são derivados de sequências de ácido nucleico de um animal geneticamente modificado ou um animal transgênico. Em algumas concretizações, as regiões são derivadas de um animal que compreende um minilocal de imunoglobulina humana. Em algumas concretizações, as regiões são derivadas de camundongos compreendendo um ou mais ácidos nucleicos extracromossomais que compreendem um ou mais ácidos nucleicos que codificam sequências de imunoglobulina. Em várias concretizações, o animal pode ter uma ou mais sequências de ácido nucleico de imunoglobulina humana não- rearranjadas. Em algumas concretizações, o animal compreende sequências de ácido nucleico de região variável humana de cadeia leve, em algumas concretizações sequências variáveis de cadeia pesada humana, em algumas concretizações, ambas sequências variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada, e em algumas concretizações, compreende adicionalmente sequências humanas de região constante. Em uma concretização específica, as sequências de ácido nucleico são derivadas de um camundongo em cujos segmentos de gene variável de cadeia pesada de camundongo endógeno e segmentos de gene variável de cadeia leve foram substituídos com segmentos de gene variável humana de cadeia pesada e segmentos de gene variável de cadeia leve.

[000122] Em algumas concretizações, as sequências de ácido nucleico são derivadas de células naive B ou células T de tal animal. Em outras concretizações, as sequências de ácido nucleico são derivadas de células B ou T de um animal que foi imunizado com um antígeno de interesse.

[000123] Em várias concretizações, as sequências de ácido nucleico são derivadas de células por amplificação das mesmas com prímeres, incluindo, por exemplo, conjuntos de prímeres degenerados, que compreendem uma ou mais FR, união, ou sequências constantes.

[000124] Em várias concretizações, os domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina são derivados de ácidos nucleicos de um animal que foi imunizado com um antígeno de interesse. Por exemplo, um animal não humano transgênico ou animal geneticamente modificado é imunizado com o antígeno de interesse (por, por exemplo, exposição do animal ao antígeno ou uma célula suportando o antígeno ou um ácido nucleico que codifica uma forma expressível do antígeno), permitindo que o animal suporte uma resposta imune, isolando as células imunes (por exemplo, célula B) do animal, opcionalmente imortalizando as células, e classificando as células para identificar reatividade com o antígeno e/ou identificação e/ou isolamento de sequências de ácido nucleico que codificam uma região variável de imunoglobulina que é capaz de reconhecer o antígeno quando colocado no contexto de um anticorpo. Em algumas concretizações, a célula é uma célula B. Em algumas concretizações, a célula B do animal imunizado é usada para produzir hibridoma, e uma célula B expressando um anticorpo que reconhece especificamente um epítopo do antígeno é identificada e as sequências de ácido nucleico que codificam uma sequência de aminoácido de região variável que reconhece o epítopo são identificadas e/ou isoladas.

[000125] Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos são derivados de humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos tais como chimpanzés), macacos (por exemplo, cynomologous ou rhesus), roedores (porexemplo, camundongos, ratos, hamsters), burros, cabras, ovelhas, etc.

[000126] Em algumas concretizações, as cadeias pesadas compreendem sequências que são derivadas de células humanas. Por exemplo, células fetais humanas expostas in vitro a um antígeno e colocadas em um animal hospedeiro adequado (por exemplo, um camundongo SCID).

[000127] Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos são introduzidos em uma célula usando um vetor. Vetores incluem, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, retrovírus, adenovírus, adeno-vírus associados, vírus de planta, YACs, BACs, epissomas derivados de EBV.

[000128] Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos estão presentes em um vetor de expressão ou construto de expressão. Em algumas concretizações, o vetor de expressão ou construto é um vetor que contém um promotor operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico de interesse tal que a sequência de ácido nucleico de interesse é capaz de ser expressa sob condições adequadas em uma célula adequada. Os vetores de expressão ou construtos podem incluir sequências condutoras, intensificadores, elementos promotores que intensificam transcrição ou translação, sequências de cessamento de transcrição, sequências de união, introns de intensificação de transcrição, elementos de IRES, genes marcadores, sequências de seleção, locais de reconhecimento de recombinase, braços de homologia, sequências virais, operadores (por exemplo, operadores procarióticos) etc. Em algumas concretizações, os vetores de expressão compreendem elementos que permitem expressão induzível, por exemplo, um operador procariótico operavelmente ligado a um promotor eucariótico. Em algumas concretizações, a expressão é induzida sob adição de um indutor de expressão. Em outras concretizações, a expressão é induzida sob remoção de um inibidor de expressão. Em algumas concretizações, a expressão é induzida por uma mudança de temperatura.

[000129] Em algumas concretizações, uma ou mais sequências de nucleotídeo de cadeia pesada estão no mesmo vetor. Em algumas concretizações, uma sequência de ácido nucleico de cadeia pesada e uma sequência de ácido nucleico de cadeia leve aqui estão no mesmo vetor. Em uma concretização, duas sequências de cadeia pesada de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico de cadeia leve estão no mesmo vetor.

[000130] Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos são expressos em uma célula que compreende um ou mais ácidos nucleicos de um vírus. Em concretizações específicas, o vírus é selecionado de adenovírus, adeno-vírus associado, SV-40, vírus Epstein-Barr, um retrovírus, um lentivírus, baculovírus, coronavírus, vírus da herpes simplex, poliovírus, vírus de Semliki Forest, vírus Sindbis, e vírus de Vaccinia.

[000131] As células hospedeiras são células que podem ser transformadas para expressar um ácido nucleico de interesse. Em várias concretizações, a transformação inclui mudança do teor de ácido nucleico de uma célula tal que contém ácidos nucleicos exógenos (por exemplo, um ácido nucleico não encontrado na célula na natureza, ou uma ou mais cópias adicionais de um ácido nucleico correspondente a uma sequência de ácido nucleico encontrada na célula na natureza). O teor de ácido nucleico de uma célula pode ser mudado por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, por integração do ácido nucleico no genoma da célula ou pela colocação do mesmo na célula uma forma extra-cromossomal ou extra-genômica. Em algumas concretizações, o teor de ácido nucleico da célula pode ser mudado tal que a célula transientemente expressa o ácido nucleico de interesse, ou o teor de ácido nucleico pode ser mudado tal que a célula estavelmente expressa o ácido nucleico de interesse. Em algumas concretizações, a mudança no teor genético da célula é herdada quando a célula se divide.

Isolamento da Proteína de ligação de antígeno biespecífica

[000132] Uma vez que um conjunto adequado de modificações foi selecionado baseado na informação aqui, tentativas foram feitas para isolar a proteína de ligação de antígeno biespecífica usando métodos conhecidos na técnica. Meramente aplicando-se o método publicado não, em toda circunstância, proporciona uma separação satisfatória.

[000133] Lindhofer et al. produziu um anticorpo biespecífico com uma cadeia pesada heterodimérica tendo uma cadeia pesada que liga Proteína A (camundongo IgG) e uma cadeia pesada que não liga (rato IgG), e sucessivamente separa o anticorpo biespecífico heterodimérico de rato/camundongo de uma mistura de dímeros de quadroma de camundongo/camundongo e rato/camundongo com um gradiente de etapa de pH de neutro a pH 5,8 para eluir o heterodímero e em seguida uma etapa de a pH de 5,8 a 3,5 para eluir o homodímero camundongo/camundongo. (Vide Lindhofer et al. (1995). Emparelhamento preferencial de espécies restritas de cadeia pesada/leve em quadromas de rato/camundongo: Implicações para uma purificação de etapa única de anticorpos biespecíficos. J. Immunol. 155(1):219-225).

[000134] A abordagem de Lindhofer falha quando aplicada a separação de um IgG1 homodímero de um IgG1 heterodímero tendo duas IgG1 cadeias pesadas que eram idênticas, mas para o fato que um dos domínios de CH3 de IgG3 contém uma modificação de dipeptídeo de H435R/Y436F. Os inventores verificaram que em um gradiente linear de pH, o dipeptídeo-modificado IgG1 eluiu a cerca de pH 3,9, onde o IgG1 homodímero eluiu a cerca de pH 3,7. Esta diferença de pH foi, de fato, insuficiente para alcançar uma separação satisfatória do heterodímero a partir do homodímero usando o método de Lindhofer. A diferença não foi reprodutível em uma maneira prognosticada.

[000135] A variação no comportamento cromatográfico foi observada em cursos cromatográficos que empregam uma resistência iônica relativamente substancial contribuída pela resistência do tampão necessária para manter a etapa ou gradiente de pH particular. Mas separação satisfatória não foi alcançada por adição de um modificador orgânico (1-propanol). Ao invés, um tanto surpreendentemente, para alguns cursos cromatográficos a adição de 0,5 molar a 1,0 molar de modificador iônico (por exemplo, NaCI) aperfeiçoa drasticamente e inesperadamente a separação de homodimérico lgG1 e heterodimérico lgG1. A adição de modificador iônico amplia a faixa de pH para eluição (1,2 unidades de pH com modificador iônico, mas 0,2 unidade de pH sem modificador iônico) tal que um gradiente de etapa de pH pode bem sucedidamente separar as duas espécies. Em outros cursos, contudo, separação satisfatória foi alcançada com concentração de NaCl de somente cerca de 150 mM (vide Exemplo 4). De modo a assegurar que separação satisfatória pode ser alcançada, em uma concretização, o isolamento da proteína de ligação de antígeno biespecífica é feito na presença de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 molar de modificador iônico.

[000136] Consequentemente, em uma concretização, um método para separação de uma proteína de ligação de antígeno biespecífica compreendendo um heterodimérico IgG com uma cadeia compreendendo uma modificação conforme aqui descrito, compreende uma etapa de empregar um gradiente de pH na presença de um modificador iônico. Em uma concretização, o modificador iônico está presente a uma concentração suficiente para maximizar a diferença de pH entre eluição de um suporte de Proteína A de um IgG homodímero e um IgG heterodímero conforme aqui descrito (isto é, com modificação (ões) de CH3). Em uma concretização específica, o modificador iônico está presente a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 molar. Em outra concretização específica, o modificador iônico está presente a uma concentração de cerca de 0,15 a cerca de 0,5 molar.

[000137] Em uma concretização, o modificador iônico é um sal. Em uma concretização, o modificador iônico é um sal de um metal alcalino ou um metal alcalinoterroso e um halogênio. Em uma concretização específica, o sal é um sal de cloreto de um metal alcalino ou um metal alcalinoterroso, por exemplo, NaCl, KCl, LiCl, CaCh, MgCh. Em uma concretização específica, o sal está presente a uma molaridade de cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou 1,0.

[000138] Em uma concretização, o gradiente de pH é de cerca de pH 3,9 a cerca de pH 4,5, em outra concretização de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 4,4., e, em outra concretização, cerca de pH 4,1 a cerca de pH 4,3. Em uma concretização específica, o gradiente é um gradiente linear. Em uma concretização, o gradiente de pH é um gradiente de etapa. Em uma concretização, o método compreende aplicar uma coluna de Proteína A equilibrada (equilibrada, por exemplo, em PBS ou outro tampão adequado ou líquido) a uma etapa de cerca de pH 3,9, cerca de pH 4,0, cerca de pH 4,1, cerca de pH 4,2, cerca de pH 4,3, ou cerca de pH 4,4. Em uma concretização específica, a etapa é cerca de pH 4,2.

[000139] Em uma concretização, o anticorpo biespecífico compreendendo o heterodimérico IgG domínio de CH3 elui do suporte de Proteína A em uma ou mais frações substancialmente livres de IgG não heterodimérico. Em uma concretização específica, a(s) fração (ões) eluída(s) de anticorpo biespecífico compreende(m) menos do que cerca de 1%, 0,5%, ou 0,1% de proteína total por peso que é anticorpo não heterodimérico.

EXEMPLOS

[000140] Os seguintes exemplos são colocados de modo a descrever àqueles técnicos no assunto como produzir e usar os métodos e composições da invenção, e não são pretendidos para limitar o escopo do o que os inventores relacionam como sua invenção. Esforços foram feitos para assegurar precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. A menos que de outro modo indicado, partes são partes por peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados, e pressão é em ou quase atmosférica.

Exemplo 1: Proteína de ligação de antígeno Bi específica IL-4Ra/IL- 6Ra

[000141] Foi verificado que dois anticorpos conhecidos de isotipo de IgG1 humana, um contra IL-4Ra e um contra ll_-6Ra, têm cadeias leves que diferem por somente quatro aminoácidos. Os experimentos de co- expressão revelaram que a cadeia leve do anticorpo anti-IL-4Ra pode ser substituída com a cadeia leve a partir da IL-6Ra, e ainda mantém alta ligação de afinidade a IL-4Ra, desse modo, tornando praticável produzir um anticorpo biespecífico usando a cadeia pesada anti-IL-4Ra e a cadeia pesada anti-IL-6Ra e a mesma cadeia leve. Consequentemente, a cadeia pesada do anticorpo IL-6Ra foi modificada para a forma FcΔAdp (isto é, modificação de dipeptídeo de CH3 H95R/Y96F, por Numeração de IMGT exon).

[000142] A cadeia leve anti-IL-6Ra foi, em seguida, coexpressa com as cadeias pesadas anti-IL4Ra/Fc e anti-IL6Ra/FcΔAdp em células de CHO, e meio condicionado a partir destas células foi submetido a cromatografia de Proteína A. Após carregamento a coluna de Proteína A com sobrenadantes de célula contendo uma mistura de homo- e heterodímeros, a eluição foi realizada com um gradiente de pH de etapa produzido por combinações variantes de dois tampões (A: 100 mM de citrato de Na, 150 mM de NaCl, pH 6,0, e B: 100 mM de Citrato de Na, 150 mM de NaCI, pH 3,0; vide figura 4) de modo a produzir três fases a pH 6,0, pH 4,2, e pH 3,0, respectivamente. Na figura 4, IL-4R denota anti- IL-4Ra, e IL-6RA denota anti-IL-6Ra(lgGlΔAdp). Frações de coluna indicadas foram ensaiadas para ligação a proteínas IL-6Ra e IL-4Ra (vide figura 5). Uma eluição de etapa foi feita, dando ocorrência a um pico eluindo a pH 4,2, e um segundo pico a pH 3,0 (figura 4). A análise de BIACORE™ mostrou que o material de fluxo através pode ligar IL-6Ra solúvel, mas não IL-4Ra, conforme esperado (figura 5). Frações correspondentes ao pico de pH 4,2 pode ligar aproximadamente quantidades iguais de IL-6Ra e IL-4Ra, consistentes com o heterodímero. O pico eluindo a pH 3,0 pode ligar somente IL-4Ra, e não IL-6Ra, correspondendo ao esperado anti-IL-4Ra homodímero. Isto estabelece que um anticorpo biespecífico heterodimérico pode ser efetivamente isolado usando Cromatografia de Proteína A, com um gradiente de etapa de pH simples.

Exemplo 2: Farmacocinéticas de Proteínas FcΔAdp

[000143] Para testar se a modificação de FcΔAdp afeta as farmacocinéticas de um heterodimérico Fc/FcΔAdp contendo molécula, camundongos foram injetados com espécies heterodiméricas purificadas de anti-IL-4Ra/anti-IL-6Ra descritas acima, e concentrações de imunoglobulina humana em soro foram medidas por um período de 28 dias (figura 6; Tabela 1). A meia-vida de soro do heterodímero foi cerca de 10 dias, similar àquela do tipo selvagem. Isto estabelece que as modificações de FcΔAdp não tinha efeito detectável na meia-vida de soro.

Exemplo 3: Proteína de ligação de antígeno Biespecífica de CD20/CD3

[000144] Foi verificado que a cadeia pesada de um anticorpo anti- humano de CD20 conhecido, quando coexpressa com a cadeia leve de um anticorpo anti-humano de CD3 (ativação), foi ainda capaz de ligar CD20. A cadeia leve anti-CD3 foi, em seguida, coexpressa com ou uma cadeia pesada anti-CD20/Fc, uma cadeia pesada anti-CD3/FcΔAdp, ou ambas cadeias pesadas. A população misturada resultante de homo- e heterodímeros foi, em seguida, usada em um bioensaio para determinar a capacidade de matar CD20 que expressa células alvos (figura 7). Brevemente, 2 x 107 células humanas de PBMC foram ativadas com 6 x 107 contas de CD3xCD28 (Invitrogen) por 72 horas. Trinta unidades de IL-2 (R&D Systems) foram, em seguida, adicionadas, e as células foram incubadas por um adicional de 24 horas. As células foram, em seguida, divididas a uma concentração de 0,5 x 106/ml_ e um adicional de 30U IL- 2 adicionado. As células foram, em seguida, incubadas um adicional de 48 horas, e usadas no bioensaio. No dia do bioensaio, 2 x 106/mL de CD20 expressando células alvos (Raji) foram etiquetadas por 30 minutos com 8uM de calcein-AM (Invitrogen). As células alvos lavadas foram adicionadas às células ativadas de hPBMC à uma proporção de 1:10 de células efetuadoras alvos (220.000 células totais por poço) em 200 microlitros de volume total com a quantidade indicada de anticorpo contendo sobrenadante. As células foram incubadas por 2 horas, e o sobrenadante coletado e fluorescência foi quantificada. A citotoxicidade foi medida pelo cálculo da proporção da fluorescência específica à fluorescência máxima. Nem o anticorpo de CD20 sozinho (usando a cadeia leve anti-CD3), nem o anticorpo anti-CD3, podem provocar morte das células alvos; ainda mistura dos dois reagentes não tinha efeito. Contudo, quando todos os três componentes foram coexpressos, morte significante foi observada, indicando que o efeito foi devido às espécies biespecíficas heterodiméricas. Baseado na quantidade estimada de anticorpo biespecífico no sobrenadante de célula de CHO transientemente transfectada, o EC50 para este efeito foi estimado para ser cerca de 15 pM.

Exemplo 4: Especificidade de Morte de Célula com Proteína de ligação de antígeno Purificada Biespecífica de CD20/CD3

[000145] Sobrenadantes de células de CHO de transfecções, conforme descrito no Exemplo 3, foram submetidos a cromatografia de afinidade de Proteína A, utilizando um gradiente de etapa para eluição. O gradiente de etapa foi produzido por combinações variantes de dois tampões (A: 20 mM de citrato de Na, 1M de NaCl, pH 5,2; B: 20 mM de citrato de Na, 1M de NaCl, pH 2,7) de modo a produzir três fases a pH 5,2, pH 4,2, e pH 2,8, respectivamente. A proteína a partir do pico eluindo a pH 4,2 foi, em seguida, usada em um ensaio de morte de célula conforme descrito no Exemplo 3. Morte de célula alvo foi observada a um EC50 de 3 pM (figura 8). Um ensaio de citotoxicidade adicional foi realizado, que examinou a especificidade alvo da morte observada. Neste experimento, células alvos etiquetadas expressando CD20 (Raji), ou sem CD20 (293) foram incubadas PBMCs humanos ativados. Cada tipo de célula alvo foi adicionado ao ensaio ou sozinho ou em combinação com células alvos não-etiquetadas do outro tipo. Em todos os casos as células alvos expressando CD20 foram mortas especificamente com um EC50 de 3 pM, enquanto a linha de célula negativa de CD20 não foi morta.

Exemplo 5: Separação de Proteína A de uma hlgG2 Fc diferencialmente modificado

[000146] lgG2 Fc/ΔAdpFc diferencialmente modificados heterodiméricos humanos e uma IgG2 Fc/Fc não modificada humana homodimérica foram primeiro enriquecidos por um processo liga-e-lava através de uma coluna de proteína A (rProteína A FF, GE). Para separar adicionalmente hlgG2 Fc/ΔAdpFc de hlgG2 Fc/Fc, uma eluição de gradiente de etapa foi realizada usando um sistema SMART™ (GE) conforme segue. O sistema de solvente consistiu em solvente A (PBS, 1X), solvente B (20 mM de citrato de sódio e 1 M de NaCl, pH 5,5) e solvente C (20 mM de citrato de sódio e 1M de NaCl, pH 2,5). A eluição começou com uma eluição isocrática com 100% de A nos primeiros 20 min, seguido por uma ligação rápida a 100% de B a 20 min. Um gradiente linear a 33,5% C e 66,5% B foi, em seguida, iniciado sobre os próximos 10 min; a concentração de 33,5% de C foi mantida por 20 min até a eluição completa do primeiro pico (Fc/ΔAdpFc). Um gradiente linear de 33,5% C a 100% de C foi seguido por 30 min. A taxa de fluxo foi mantida 250 microlitros/min e os cromatogramas foram detectados a 280 nm por um detector de UV. O hlgG2 Fc/ΔAdpFc eluiu a pH 4,5, onde o hlgG2 eluiu a pH 3,5.

Exemplo 6: Separação de Proteína A de um hlgG4 Fc Diferencialmente modificado

[000147] IgG4 (Fc/AΔdpFc) diferencialmente modificado heterodimérico humano e um lgG4 (Fc/Fc) não modificado homodimérico foram primeiro enriquecidos por um processo liga-e-lava através de uma coluna de proteína A (rProteína A FF, GE). Para separar adicionalmente hlgG4 Fc/AΔdpFc de hlgG4 Fc/Fc, uma eluição de gradiente de etapa foi realizada usando um sistema SMART™ (GE) conforme segue. O sistema de solvente consistiu em solvente A (PBS, 1X), solvente B (20 mM de citrato de sódio e 1 M de NaCI, pH 5,1) e solvente C (20 mM de citrato de sódio e 1M de NaCl, pH 2,8). A eluição começou com uma eluição isocrática com 100% de A nos primeiros 20 min, seguido por uma ligação rápida a 100% de B a 20 min. Um gradiente linear a 50% de C e 50% de B foi, em seguida, iniciado sobre os próximos 10 min; a concentração de 50% de C foi mantida por 20 min até a eluição completa do primeiro pico (Fc/AΔdpFc). Um gradiente linear de 50 % de C a 100 % de C foi seguido por 30 min. A taxa de fluxo foi mantida a 250 microlitros/min e os cromatogramas foram detectados a 280 nm por um detector de UV. O hlgG4 Fc/AdpFc eluiu a cerca de pH 4 onde o homodímero eluiu durante um gradiente de cerca de pH 4 a pH 2,8.

Exemplo 7; Separação de Proteína A de um hlgG1 CD3xCD20 Diferencialmente modificado

[000148] Anti-hCD3xCD20 IgG1 (Fc/AΔdpFc) diferencialmente modificado heterodimérico e um anti-hCD20 não modificado homodimérico foram separados em um 1 ml_ de coluna de rProteína AFF (GE Biosciences) conforme segue. O sistema de solvente foi tampão A1 (PBS 1X), tampão A2 (20 mM de citrato de sódio e 1 M de NaCl pH 5,1), tampão B (20 mM de citrato de sódio e 1 M de NaCl pH 2,8). A amostra misturada foi ligada e lavada em PBS e tampão A2. Uma etapa foi usada para alcançar um pH de 4,2, que eluiu CD3*xCD20 IgG1 (Fc/AΔdpFc) biespecífico, em seguida um gradiente linear de pH 4,2 a pH 2,8 eluiu o anti-hCD20 IgGl homodimérico.

Exemplo 8: Afinidade de ligação de CH3s Modificados a Receptores Fc

[000149] A afinidade de ligação de um anticorpo biespecífico de isotipo IgG1 humano tendo a modificação ΔAdp (H435R e Y436F, Numeração de EU) a uma variedade de receptores de Fc humanos foi testada em um ensaio de ligação de equilíbrio de estado constante BiacoreΔ.

[000150] Brevemente, um chip de dextran carboximetilatado (CM5) tendo uma amina-acoplada anti-penta-his mAb (Qiagen) foi usado para capturar vários construtos de receptores Fc humanos. Os seguintes ectodomínios de receptor Fc his-etiquetado foram ligados às superfícies de chips anti-penta-his-revestido CM5 diferentes: FcyRI, FcyRIIA (polimorfo R131), FcyRIIB, e FCYRHIB (cada obtido de R&D Systems); e polimorfo RcyRIIA (H131), polimorfo FcyRIIIA (V176), e RCYRIHA (POLIMORFO F176) (cada produzido em Regeneron). Anticorpos foram passados sobre a superfície em três concentrações para o ectodomínio de receptor de alta afinidade FcyR1 (25 nM, 50 nM, e 100 nM), e em entre 5 micromolar a 39 nanomolar para os ectodomínios de receptor de baixa afinidade FcyR, e valores de constantes de taxa de associação e dissociação (ka e kd) foram determinados e usados para calcular constantes de dissociação de equilíbrio (KDS) para os anticorpos. Estudos de ligação foram realizados à temperatura ambiente usando tampão HBS-T a pH 7,2 KDS foram determinadas para um anticorpo de controle (hmAb), um anti-CD20, e modificação de anti-CD3Adp, e um anticorpo biespecífico CD20xCD3Adp. Valores de KD para o anticorpo anti-CD3Adp revelaram nenhuma diferença significante na ligação a qualquer dos receptores de Fc testados conforme comparado com anticorpos de isotipo não modificados (Tabela 2).

Exemplo 9: Farmacocinéticas de um hlgGIAAdp Biespecífico em Camundongos hFcRn

[000151] A taxa de folga de farmacocinética de anticorpo biespecífico anti-hCD3/hCD20 IgG1 AΔdp e seus anticorpo relacionado a controles (anti-hCD3 IgG e anti-hCD3 IgGΔAdp homodímero) foram determinados em (WT) camundongos tipo selvagem e camundongos homozigotos por uma substituição de camundongo FcRn com um gene de hFcRn (camundongos hFcRn). Camundongos tipo selvagem e hFcRn foram de cepas geradas de cruzamento com um antecedente contendo C57BL6 (75%) e 129Sv (25%). Os grupos contêm 4 cada de ou camundongos WT ou hFcRn, exceto no caso de um grupo de camundongos WT que recebe um anticorpo de controle equiparado isotipado em que o grupo contém 3 camundongos. Os camundongos receberam 1 mg/kg de um controle equiparado de isotipo (hlgG1), anti-hCD3xCD20 IgGlAAdp biespecífico, anti-hCD3 lgG1, ou anti-hCD3 IgGlAAdp homodímero. Todos os artigos testados foram administrados subcutaneamente. Sangrias foram coletadas a 0h, 6h, 1d, 2d, 3d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d, e 30d.

[000152] Os níveis de soro de anticorpos humanos foram determinados por uma ELISA intercalada. Brevemente, um anticorpo de cabra policlonal anti-humano IgG (Fc-específico) (Jackson ImmunoResearch) foi revestido em placas de 96 poços a uma concentração de um micrograma/mL e incubado durante a noite a 4° C. Após as placas serem bloqueadas com BSA, amostras de soro em diluições em série de seis doses e padrões de referência dos respectivos anticorpos em diluições de série de 12 doses foram adicionadas à placa e incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Após lavagem para remover anticorpo não ligado, anticorpos humanos capturados foram detectados usando o mesmo anticorpo de cabra policlonal anti-humano IgG (Fc-específico) conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson ImmunoResearch), e desenvolvido por substrato de tetrametilbenzidina (TMB) colorimétrico padrão de acordo com a recomendação do fabricante. A absorvência a 450 nm foi registrada em uma leitora de placa, e a concentração de hlgG em amostras de soro foi calculada usando a curva padrão de referência gerada na placa de amostra.

[000153] Nenhuma diferença significante foi observada na meia-vida de soro dos quatro anticorpos de IgG1 sobre o período testado de 30 dias. Em particular, não existe diferença significante observada entre anticorpos de IgG1 tendo a modificação de AΔdp e anticorpos tipo selvagem de IgG1. Nemhuma diferença entre os anticorpos foi observada com, ou camundongos tipo selvagem (mFcRn), ou camundongos tendo um FcRn humanizado (hFcRn). Conforme esperado, camundongos hFcRn exibiram uma folga levemente mais rápida do que camundongos tipo selvagem. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Exemplo 10: Isolamento em Larga Escala em Baixo Tampão de Sal

[000154] Um anticorpo biespecífico CD3xCD20AAdp foi isolado de acordo com a invenção de uma cultura de larga escala. Brevemente, uma linha de célula de CHO-K1 expressando um anticorpo biespecífico anti-hCD3xCD20AAdp (modificação na cadeia pesada de CD3) foi cultivada em um bioreator de 11 litros. As células suportando o anticorpo biespecífico cresceram a uma densidade de cerca de 8,25 x 106 células/mL, produzindo cerca de 250-350 mg de anticorpo/L. Em contraste, um anticorpo de controle anti-hCD3 produziu cerca de 100150 mg/L.

[000155] O anticorpo foi isolado em uma resina MabSelect SuRe® (GE) (20 cm de altura de leito, 1 cm de DI) equilibrada com 10 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, pH 7,2, cultura de célula clareada carregada a 19 g/L, e a coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de 10 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, pH 7,2, seguido por uma lavagem de 2 volumes de coluna de 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,2 (no NaCl). O anticorpo foi eluído com 40 mM de acetato, pH 3,0.

[000156] O anticorpo mono-específico anti-CD30 eluiu a pH 3,6, onde o biespecífico anti-hCD3xCD20DAdp eluiu a pH 4,4

Exemplo 11: Eluição Seletiva de Proteína A de Camundongo Heterodímeros com pH Selvagem

[000157] Células de CHO-K1 foram transientemente transfectadas com construtos de expressão para domínio extracelular de IFNAR1 humano (hlFNARI) e IFNAR2 humano (MFNAR2) fundido com um tipo selvagem ou um mutante (TTTK ou PTTK) mlgG2a Fc. A proporção entre hlFNAR1-mFc e hlFNAR2-mFc foi mantida a 1:1 por transfecção de células com quantidades iguais de dois plasmídeos de expressão. O meio de cultura foi coletado 4 dias após transfecção e submetido a purificação de Proteína A usando 0,2 ml_ de colunas de rotação de NAb Proteína A Plus® (Thermo Scientific/Pierce). Brevemente, as colunas foram equilibradas com 1x PBS, pH 7,2. Um ml de meio de cultura de CHO-K1 foi incubado com a resina de Proteína A por 10 minutos à temperatura ambiente. As colunas foram, em seguida, lavadas três vezes com 1x PBS, pH 7,2. As proteínas ligadas foram eluídas com 20 mM de tampão de citrato de sódio contendo 1M de NaCl. Três eluições foram efetuadas usando 0,4 mL de tampão de eluição com pH diminuído. As proteínas nas frações diferentes foram detectadas por análise de mancha de Western.

[000158] Os resultados mostram que com eluição de gradiente de pH, é possível separar heterodímeros de tipo selvagem e mutante estrela mlgG2a de homodímeros de mlgG2a tipo selvagem (vide fração E1 em ambos géis da figura 9).

Exemplo 12: Formação Preferencial de Heterodímero de Mutantes de mlgG2a sobre Heterodímeros de Isotipo

[000159] Plasmídeos de DNA foram construídos para expressão de mamífero dos domínios extracelulares de receptores de interferon tipo I humano (hlFNARI e hlFNAR2) com C-terminal camundongo Fc (mlgG2a ou mlgG1). Mutações na sequência de mlgG2a foram introduzidas usando mutagênese direcionada de local. Os mutantes são TTT = M252T, S254T, S256T; TTTK = M252T, S254T, S256T, I258K; PTTTK = I247P, M252T, S254T, S256T, I258K; RF = H435R, H436F. Células CHO-K1 foram transientemente transfectadas com os construtos de expressão. A proporção entre IFNAR1-mFc e IFNAR2-mFc foi mantida a 4:1 por transfecção das células com 4 vezes mais plasmídeo de expressão de hlFNAR1-mFc (hlFNAR1-mlgG2a) do que hiFNAR2-mFc (mlgG1 ou mutante mlgG2a). O meio de cultura foi coletado 4 dias após transfecção e mFc proteínas foram detectadas por análise de mancha de Western.

[000160] O resultado mostra que formação de heterodímero entre mlgG2a e mlgG1 é muito menos eficiente do que entre mlgG2a tipo selvagem e mutantes de mlgG2a (comparar raia 1 às raias 2 a 5 da figura 10). Uma proporção de 4:1 IFNAR1 construto:IFNAR2 construto foi usada para manter um excesso de construto de IgG2a tipo selvagem no experimento.

Claims (23)

1. Anticorpo biespecífico, que é heterodimérico com relação à ligação à Proteína A, caracterizado pelo fato de que compreende: a. uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo, de N-terminal a C-terminal, uma primeira região de ligação de epítopo que se liga seletivamente a um primeiro epítopo, e uma região constante de imunoglobulina que compreende uma primeira região de CH3 de uma IgG humana selecionada de lgG1, lgG2, e lgG4, pareada com uma cadeia leve de imunoglobulina, sendo que a primeira região de CH3 compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1, 3 e 5; e b. uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo, de N-terminal a C-terminal, uma segunda região de ligação de epítopo que se liga seletivamente a um segundo epítopo, e uma região constante de imunoglobulina que compreende uma segunda região de CH3 de uma IgG humana selecionada de lgG1, lgG2, e lgG4, pareada com uma cadeia leve de imunoglobulina, sendo que a segunda região de CH3 compreende uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4 e 6.

2. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira cadeia pesada de imunoglobulina e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina são cadeias pesadas de IgG humana.

3. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada uma da primeira cadeia pesada de imunoglobulina e da segunda cadeia pesada de imunoglobulina é pareada com uma cadeia leve de imunoglobulina comum.

4. Anticorpo biespecífico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve de imunoglobulina comum é uma cadeia leve de imunoglobulina humana.

5. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo polipeptídeos são cada, cadeias pesadas de IgG1 humana.

6. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundo polipeptídeos são cada, cadeias pesadas de IgG4 humana.

7. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda região de CH3 do anticorpo biespecífico é não imunogênica ou substancialmente não imunogênica em um humano.

8. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a primeira região de CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e a segunda região de CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

9. Anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que a primeira região de CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e a segunda região CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6.

10. Método para produção de um anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obtenção de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um primeiro domínio variável que reconhece um primeiro epítopo, no qual a primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio constante de isotipo lgG1, lgG2, ou lgG4 que compreende uma primeira região de CH3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 1,3 e 5; b. obtenção de uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um segundo domínio variável que reconhece um segundo epítopo, em que a segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio constante de isotipo lgG1, lgG2, ou lgG4, que compreende uma segunda região de CH3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nos: 2, 4 e 6; c. obtenção de uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina que emparelha com a primeira cadeia pesada de imunoglobulina e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina; d. introdução das primeira, segunda e terceira sequências de ácido nucleico em uma célula de mamífero; e. permitir que a célula expresse um anticorpo biespecífico; e, f. isolamento do anticorpo biespecífico baseado na capacidade do anticorpo biespecífico se ligar à Proteína A.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a segunda região de CH3 do anticorpo biespecífico é não imunogênico ou substancialmente não imunogênico em um humano.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a primeira região de CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e a segunda região de CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que a primeira região de CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 e a segunda região de CH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo biespecífico é isolado em um suporte sólido compreendendo Proteína A.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido compreende uma coluna de afinidade de Proteína A, e o anticorpo biespecífico é isolado empregando um gradiente de pH.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o gradiente de pH é um gradiente de etapa compreendendo uma ou mais etapas de pH entre pH 3 e pH 5.

17. Método para isolamento de um anticorpo biespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende: isolamento de uma célula rompida ou uma mistura de anticorpos de um anticorpo biespecífico tendo domínios de CH3 lgG1, lgG2, ou lgG4 diferencialmente modificados, em que os domínios de CH3 diferencialmente modificados são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos em um humano, e em que as modificações resultam em um anticorpo biespecífico com uma região constante de cadeia pesada heterodimérica cujos monômeros têm uma afinidade diferencial para Proteína A, e o anticorpo biespecífico é isolado a partir da célula rompida ou da mistura baseada em sua afinidade para Proteína A, sendo que o primeiro monômero da região constante de cadeia pesada heterodimérica compreende um primeiro domínio de CH3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 1,3 e 5, e o segundo monômero da região constante de cadeia pesada heterodimérica compreendendo um segundo domínio de CH3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nos: 2, 4 e 6.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o método compreende o isolamento do anticorpo biespecífico usando um suporte de afinidade de Proteína A e empregando um gradiente de pH na presença de um modificador iônico a uma concentração de 0,15 M a 1,0 M; em que o modificador iônico é um sal de cloreto de um metal alcalino ou um metal alcalinoterroso; em que o anticorpo biespecífico compreende duas cadeias pesadas que reconhecem dois epítopos diferentes ou dois antígenos diferentes e duas cadeias leves que têm domínios constantes e variáveis idênticos, em que o domínio CH3 de uma das cadeias pesadas é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, e SEQ ID NO: 5 e o domínio CH3 da segunda cadeia pesada é selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, e SEQ ID NO: 6.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o domínio CH3 de uma das cadeias pesadas é SEQ ID NO: 1 e o domínio CH3 da segunda cadeia pesada é SEQ ID NO: 2.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o domínio CH3 de uma das cadeias pesadas é SEQ ID NO: 5 e o domínio CH3 da segunda cadeia pesada é SEQ ID NO: 6.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizado pelo fato de que o modificador iônico é NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, ou MgCl2.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pelo fato de que o modificador iônico está presente em uma concentração de 0,15 M a 0,5 M ou a uma concentração de 0,5 M a 1 M.

23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de que o gradiente de pH é de pH 3,9 a pH 4,5, ou de pH 4,0 a pH 4,4, ou de pH 4,1 a pH 4,3, opcionalmente em que o gradiente é um gradiente linear.