BRPI1015561A2 - anticorpos biespecíficos prontamente isolados com formato de imunoglobulina nativa - Google Patents

Abstract

PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO BIESPECÍFICA QUE É HETERODIMÉRICA COM RELAÇÃO À LIGAÇÃO À PROTEÍNA A, MÉTODOS PARA PRODUÇÃO E ISOLAMENTO DE UM ANTICORPO BIESPECÍFICO QUE É HETERODIMÉRICO COM RELAÇÃO À LIGAÇÃO À PROTEÍNA A. A presente invenção refere-se a um formato de anticorpo biespecífico que proporciona facilidade de isolamento que é proporcionado, compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina que são diferenciais são não imunogênicas ou substancialmente não imunogênicas com relação às modificações de CH3, e pelo menos uma modificações resulta em uma afinidade diferencial para o anticorpo biespecífico para um reagente em uma afinidade tal como Proteína A, e o anticorpo biespecífico é isolável de uma célula rompida, do meio, ou de uma mistura de anticorpos baseada na sua afinidade para Proteína A.

Description

í ' Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍNA

DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO BIESPECÍFICA QUE É HETERODIMÉRICA : COM RELAÇÃO À LIGAÇÃO À PROTEÍNA A, MÉTODOS PARA PRODU- ÇÃO E ISOLAMENTO DE UM ANTICORPO BIESPECÍFICO QUE É HE- —TERODIMÉRICO COM RELAÇÃO À LIGAÇÃO À PROTEÍNA A".

A presente invenção refere-se a proteínas de ligação de antíge- no ou anticorpos tendo heterodímeros de cadeias pesadas, isto é, duas ca- deias pesadas de imunoglobulina que diferem por pelo menos um aminoáci- do, que permite isolamento da proteína de ligação de antígeno baseado em uma afinidade diferencial de uma cadeia pesada de imunoglobulina e uma cadeia pesada de imunoglobulina modificada, ou que sofreu mutação em dire- ção a um reagente de afinidade. A invenção também se refere a proteínas de ligação de antígeno (incluindo anticorpos biespecíficos) que têm regiões de IgG CH2 e CH3 com afinidades diferentes com relação à Proteína A que permite rápido isolamento por ligação diferencial das regiões de IgG a Proteína A.

ANTECEDENTES Anticorpos são moléculas multifuncionais, que transportam uma especificidade de ligação única para um antígeno alvo, bem como a capaci- dade de interagir com o sistema imune, via mecanismos que são indepen- dentes do antígeno. Muitos terapêuticos biológicos atualmente utilizados pa- ra câncer são anticorpos monoclonais direcionados contra antígenos que são tipicamente sobre-expressos na célula de câncer alvo. Quando tais anti- corpos se ligam a células de tumor, eles podem disparar citotoxicidade celu- lar dependente do anticorpo (ADCC), ou citotoxicidade dependente do com- plemento (CDC). Infelizmente, as células cancerosas frequentemente de- senvolvem mecanismos para suprimir estas respostas imunes normais.

Nos anos recentes, esforços têm sido feitos para desenvolver te- rapêuticos similares à anticorpo que têm mais do que uma especificidade de ligação de antígeno, por exemplo, anticorpos biespecíficos. No caso de tera- piasde câncer, formatos multiespecíficos podem permitir a possibilidade de se usar, por exemplo, uma especificidade para ter como alvo a molécula a um antígeno de célula de tumor, a outra especificidade para disparar uma

+ ' resposta que não é normalmente disponível ao sistema imune. Anticorpos biespecíficos podem também encontrar uso como ligantes substitutos para sistemas receptores heterodiméricos de dois componentes que são normal- mente ativados por seu ligante natural quando ele se liga a e traz juntos am- boscomponentes.

Numerosos formatos foram desenvolvidos na técnica para de- terminar oportunidades terapêuticas proporcionadas pelas moléculas com especificidades de ligação múltipla. Idealmente, tais moléculas devem ser proteínas bem comportadas que são fáceis de produzir e purificar, e possu- em propriedades favoráveis in vivo, por exemplo, farmacocinéticas apropria- das para uma proposta pretendida, imunogenicidade mínima, e, se desejá- vel, funções efetuadoras de anticorpos funcionais.

" O modo mais correto de produção de um anticorpo biespecífico (expressando dois anticorpos distintos em uma célula única) ocorre em es- "15 pécies múltiplas, porque as respectivas cadeias pesadas formam ambos homo- e heterodímeros, mas somente os heterodímeros são desejados. Também, as cadeias leves e pesadas podem se emparelhar inapropriada- mente. Vários exemplos de formatos que tentam determinar estes problemas em modos diferentes são descritos abaixo.

Um formato, usado para moléculas Biespecífico T célula Enga- ger (BiTE) (vide, por exemplo, Wolf, E. et al. (2005) Drug Discovery Today 10:1237-1244)), é baseado em módulos de fragmento variável de cadeia simples (scFv). Um scFv consiste em regiões variáveis de cadeia leve e pe- sada de anticorpo fundidas, via um articulador flexível, que geralmente pode dobrar apropriadamente e, desse modo, que as regiões podem se ligar ao antígeno cognato. Um BiTE concatena dois scFv's de especificidades dife- rentes em tandem em uma cadeia simples (vide figura 1A). Esta configura- ção impossibilita a produção de moléculas com duas cópias da mesma regi- ão variável de cadeia pesada. Em adição, a configuração do articulador é designada para assegurar emparelhamento correto das respectivas cadeias pesadas e leves.

O formato de BiTE tem várias desvantagens. Primeiro, as molé-

' culas de scFv são notórias por sua tendência a se agregarem.

E embora a imunogenicidade de articuladores de scFv seja reputadamente baixa, a pos- sibilidade de geração de anticorpos contra um BiITE não pode ser descarta- da.

A ausência de uma porção Fc no formato de BIiTE também torna sua meia-vida de soro muito curta, e isto necessita da complicação de adminis- trações repetidas frequentes ou infusão contínua, via uma bomba.

Finalmen- te, a ausência de um Fc também implica na ausência de funções efetuado- ras mediadas por Fc, que podem ser benéficas em algumas circunstâncias.

Um segundo formato (figura 1B) é um híbrido de um anticorpo —monocional de camundongo e rato, e ocorre em uma modificação de croma- tografia de afinidade de Proteína A convencional (vide, por exemplo, Lindho- fer, H. et al. (1995) J.

Immunol. 155:219-225)). Neste formato, uma IgG2a - de camundongo e um anticorpo de IgG2b de rato são produzidos juntos na mesma célula (por exemplo, ou como uma fusão de quadroma de dois hibri- “15 domas,ouem células deCHO projetadas). Devido às cadeias leves de cada anticorpo associarem-se preferencialmente com as cadeias pesadas de suas espécies cognatas, somente três espécies distintas de anticorpo podem ser montadas: os dois anticorpos de origem, e um heterodímero dos dois anti- corpos compreendendo um par de cadeia pesada/leve de cada, associando- se, via suas porções de Fc.

O heterodímero desejado pode ser facilmente purificado a partir desta mistura porque suas propriedades de ligação a Pro- teína A são diferentes daquelas dos anticorpos de origem: IgG2b de rato não se liga a proteína A, onde o IgG2a de camundongo se liga.

Consequente- mente, o heterodímero de camundongo-rato se liga a Proteína A, mas elui a umpH mais alto do que o homodímero de IgG2a de camundongo, e isto tor- na a purificação seletiva do heterodímero biespecífico possível.

Como com o formato de BiTE, este formato híbrido tem dois locais de ligação de antígeno monovalente.

A desvantagem do híbrido camundongo/rato é que devido a ele —sernão humano, ele provavelmente provoca uma resposta imune no pacien- te, que pode ter efeitos colaterais nocivos (por exemplo, reações de "HAMA" ou "HARA"), e/ou neutraliza o terapêutico.

' Um terceiro formato, referido como "knobs-into-holes" (figura 1C), foi discutido na técnica anterior como potencialmente útil para a produ- ção de anticorpos biespecíficos (Patente dos Estados Unidos Nº 7.183.076).

Nesta estratégia, as porções Fc de dois anticorpos são projetadas para dar um"knob" projetante, e a outra um "hole" complementar. Quando produzidas na mesma célula, as cadeias pesadas são referidas para preferencialmente formem heterodímeros preferivelmente do que homodímeros, por associa- ção dos "knobs" projetados com os "holes" projetados. As emissões de em- parelhamento correto de cadeia leve-pesada são determinadas pela escolha de anticorpos que têm especificidades diferentes, mas empregam cadeias leves idênticas.

A desvantagem deste formato é que a estratégia de "knobs-into- - holes" pode resultar na produção de uma quantidade significante de homo- dímeros indesejáveis, desse modo, necessitando de etapas de purificação “15 adicionais. Esta dificuldade é exacerbada pelo fato que as espécies conta- minantes são quase idênticas às espécies desejadas em muitas de suas propriedades. As formas projetadas podem também potencialmente serem imunogênicas, porque as mutações que produzem os "knobs" e "holes" in- troduzem sequências estrangeiras.

Permanece uma necessidade de um formato de anticorpo bies- pecífico, em particular, para aplicações terapêuticas, que minimizam algu- mas ou todas das desvantagens mencionadas acima.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A figura 1 ilustra três formatos de anticorpo biespecíficos: (A) Engagerde célula T biespecífica (BITE); (B) Híbrido Camundongo-Rato; e, (C) Knobs-into-Holes com uma cadeia leve comum. A figura 2 ilustra a modificação de FCcAAdp: (A) Alinhamento de regiões Fc de I9G1 humana (SEQ ID NO:1) e I1gG3 (SEQ ID NO:3), mos- trando modificação de FCAAdp em caixa; (B) uma representação esquemáti- ca de um FCAAdp anticorpo biespecífico.

A figura 3 ilustra um alinhamento de Domínios de CH3 humanos

' (empregando numeração IMGT exon e numeração EU) de IgG1, IgG2, e IgG4, com e sem a modificação de dipeptídeo AAdp, bem como IgG3.

figura 4 mostra um traço de coluna de Proteína A para isolamen- to de anticorpos biespecíficos, mostrando um perfil de eluição utilizando um gradiente de etapa.

A figura 5 mostra perfil de ligação de IL4-Ra e IL-6Ra BIACO- REQ de frações de coluna eluídas a partir da separação cromatográfica mostrada na figura 4. Os anticorpos nas frações foram capturados com anti- corpos imobilizados anti-Fc, e, em seguida, IL-4Ra solúvel ou IL-68Ra foram ensaiados para ligação dos anticorpos capturados. figura 6 mostra um perfil farmacocinético de um FCAAdp anticor- po biespecífico (IL-B8RA/ILAR), um homodímero FcAAdp (IL-G6RA/IL-SGRA), - um anticorpo de I9gG1 com sequência de CH3 tipo selvagem (IL-4R/IL-4R), e um anticorpo mono-específico de controle. “5 A figura 7 ilustra a eficácia de um CD20xCD3AAdp anticorpo bi- específico em um ensaio de morte de célula Raji.

A figura 8 ilustra um ensaio de morte de célula circunstante (293) com o CD20xCD3AAdp anticorpo biespecífico.

A figura 9 mostra resultados para experimentos de expressão usando heterodímeros de mFc diferentes.

Painel A: Mancha de Western de separação de pH de mlgG2a/migG2aPTTTK heterodimérico de migG2a homodimérico e IgG2aPTTTK homodimérico; Painel B: Mancha de Western de separação de pH de migG2a/mlgG2aTTTK heterodimérico de mlgG2a homodimérico e IgG2aTTTK homodimérico; IP = admissão; FT = fluxo através; W2 = segun- da lavagem (1x PBS pH 7,2); E1 = primeira eluição (20 mM de citrato de Na, 1 M de NaCl pH 5,5); E2 = segunda eluição (20 mM de citrato de Na, 1 M de NaCl; 57% pH 5,5 + 43% pH 2,6); E3 = terceira eluição (20 mM de citrato de Na, 1 Mde NaCi pH 2,6).

A figura 10 ilustra formação preferencial de heterodímeros de IgG2a mutante sobre formação de heterodímeros de isotipos misturados (por exemplo, mlgG2a e IgG1), usando IFNAR1 construto:!FNAR2 proporção de

' construto de 4:1. Raia 1: IFNAR1-lIgG2a:IFNAR2-Ig9G1; Raia 2: INFAR1I- IgG2a:IFNAR2-IgG2aTTT; Raia 3: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-gG2aTTTK; Raia 4: IFNAR1-lgG2a:IFNAR2-I9G2aPTTTK; Raia 5: IFNAR1I-HgG2a:IFNAR2- IgG2aRF.

SUMÁRIO A invenção é baseada, pelo menos em parte, no emprego de duas sequências de domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglo- bulina que diferem por pelo menos um aminoácido em uma proteína de liga- ção de antígeno biespecífica. A pelo menos uma diferença de aminoácido resulta em uma capacidade aperfeiçoada de isolar a proteína, porque a dife- rença resulta em uma capacidade diferencial das sequências de domínio de CH3 se ligarem a um agente de afinidade. . Em um aspecto, uma proteína de ligação de antígeno é propor- cionada, compreendendo um primeiro e um segundo polipeptídeo, o primeiro “15 polipeptideo compreendendo, do N-terminal a C-terminal, uma primeira regi- ão de ligação de antígeno que seletivamente se liga a um primeiro antígeno, seguido por uma região constante que compreende uma primeira região de CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1 (SEQ ID NO:1), IgG2 (SEQ ID NO:3), IgG4 (SEQ ID NO:5), e uma combinaçãodos mesmos; e, um se- gundo polipeptídeo compreendendo, do N-terminal ao C-terminal, uma se- gunda região de ligação de antígeno que seletivamente se liga a um segun- do antígeno, seguido por uma região constante que compreende uma se- gunda região de CH3 de uma IgG humana selecionada de I9gG1, IgG2, IgGA4, e uma combinação destes, no qual a segunda região de CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a ligação do segundo domínio de CH3 à proteína A.

Em uma concretização, a segunda região de CH3 compreende uma modificação 95R (pela Numeração de IMGT exon; 435R pela Numera- ção de EU). Em outra concretização, a segunda região de CH3 compreende adicionalmente modificação 96F(IMGT; 436F por EU). Em concretizações específicas, a segunda região de CH3 é selecionada de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, e SEQ ID NO:6.

' Em uma concretização, a segunda região de CH3 é de uma I9G1 humana modificada (SEQ ID NO:2), e compreende adicionalmente modificação selecionada a partir do grupo consistindo em D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82! (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, eV422|porEU).

Em uma concretização, a segunda região de CH3 é de uma IgG2 humana modificada (SEQ ID NO:4), e compreende adicionalmente mo- dificação selecionada a partir do grupo consistindo em N44S, K52N, e V82! (IMGT; N384S, K392N, e V422| por EU).

Em uma concretização, a segunda região de CH3 é de uma IgG4 humana modificada (SEQ ID NO:6), e compreende adicionalmente modificação selecionada a partir do grupo consistindo em Q15R, N44S, , K52N, V57M, R69K, E79Q, e V821 (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E4190Q, e V422! por EU).

“As Em uma concretização, o domínio de CH3 é um domínio quimé- rico que compreende sequências de duas ou mais de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, e IgG4 humana.

Em uma concretização, o domínio de CH3 é de IgG1 humana, IgG2n humana, ou IgG4 humana, e a proteína de ligação de antígeno com- preende adicionalmente domínio de CH1 e um domínio de CH2, no qual o domínio de CH1 e o domínio de CH2 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em uma IgG1 humana CH1 ou domínio de CH2, uma IgG2 humana CH1 ou domínio de CH2, ou um humano quiméri- co/IgG1 humano/IgG2 ou um humano quimérico/I9G1 humana/I9gG3 ou um humano quimérico/I9G2 humana/domínio de IgG3 ou um humano quiméri- co/lgG1 humana/IgG4 ou uma IgG3/IgG4quimérico ou uma IgG2 quiméri- ca/domínio de I9gG4. Em uma concretização específica, a I9G1/I19G2 quiméri- ca, domínios de IgG1/I9G3, IgG2/19G3, IgG1/I9GA4, IgG3/Ig9G4, e IgG2/I9G4 são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos em um hu- mano.

Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno com- preende adicionalmente uma cadeia leve de imunoglobulina. Em uma con-

' cretização, a cadeia leve de imunoglobulina é selecionada de uma cadeia leve de lambda humana e kappa humana.

Em uma concretização, as primeira e segunda regiões de liga- ção de antígeno cada compreende pelo menos uma CDR, em outra concre- tização, pelo menos duas CDRs, em outra concretização, cada compreende três CDRs. Em uma concretização específica, as CDRs são de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Em outra concretização específica, a cadeia pe- sada é uma cadeia pesada humana.

Em uma concretização, a primeira região de ligação de antígeno compreende um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobu- lina, e a segunda região de ligação de antígeno compreende um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina.

- Em uma concretização, o primeiro e o segundo domínios variá- veis de cadeia pesada de imunoglobulina são independentemente selecio- “15 nados de um domínio de camundongo, rato, hamster, coelho, macaco, chimpanzé, e humano.

Em uma concretização, o primeiro e o segundo domínios variá- veis de cadeia pesada de imunoglobulina compreendem independentemente uma CDR humana, uma CDR de camundongo, uma CDR de rato, uma CDR de coelho, uma CDR de macaco, uma CDR de chimpanzé, e uma CDR hu- manizada. Em uma concretização, a CDR é humana e é somaticamente mutada.

Em uma concretização, o primeiro e o segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina compreendem uma região de estrutura humana (FR). Em uma concretização, a FR humana é uma FR humana so- maticamente mudada.

Em uma concretização, a primeira e/ou a segunda regiões de li- gação de antígeno são obtidas por classificação de uma biblioteca de fago compreendendo regiões variáveis de anticorpo para reatividade em direção aum antígeno de interesse. Em outra concretização, a primeira e/ou a se- gunda regiões de ligação de antígeno são obtidas por imunização de um animal não humano, tal como um camundongo, um rato, um coelho, um ma-

] caco, ou um chimpanzé com um antígeno de interesse, e identificação de uma sequência de ácido nucleico de região variável de anticorpo que codifi- ca uma região variável específica para o antígeno de interesse. Em uma concretização específica, o animal não humano compreende um ou mais genesde região variável de imunoglobulina humana. Em outra concretização específica, os um ou mais genes de região variável de imunogiobulina hu- mana estão presentes no animal não humano extracromossomonalmente, como uma substituição em um local de imunoglobulina endógena, ou um transgene aleatoriamente integrado no genoma do animal não humano. Em uma concretização, a primeira e/ou a segunda regiões de ligação de antíge- no são obtidas de um hibridoma ou um quadroma, em outra concretização de classificação de células imunes de um animal não humano humanizado E usando classificação de célula. Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno é um “15 anticorpo biespecífico. Em uma concretização, o anticorpo biespecífico é um anticorpo biespecífico totalmente humano e tem uma afinidade para cada epitopo, independentemente, na faixa de micromolar, nanomolar, ou picomo- lar.

Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno é não imunogênica ou substancialmente não imunogênica em um humano. Em uma concretização específica, a proteína de ligação de antígeno carece de um epitopo de célula T humana não nativa. Em uma concretização, a modifi- cação da região CH3 é não imunogênica ou substancialmente não imunogê- nica em um humano. Em uma concretização específica, a modificação da região CH3 não resulta em um epitopo de célula T humana não nativa.

Em uma concretização, a proteína de ligação de antígeno com- preende uma cadeia pesada, no qual a cadeia pesada é não imunogênica ou substancialmente não imunogênica em um humano. Em uma concretização, a cadeia pesada tem uma sequência de aminoácido que não contém um epitopo de célula T não nativa. Em uma concretização, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido cuja proteólise não pode formar uma sequência de aminoácido de cerca de 9 aminoácidos que é imunogêni-

' ca em um humano. Em uma concretização específica, o humano é um ser humano tratado com a proteína de ligação de antígeno. Em uma concretiza- ção, a cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido cuja pro- teólise não pode formar uma sequência de aminoácido de cerca de 13 a cer- cade17 aminoácidos que é imunogênica em um humano. Em uma concreti- zação específica, o humano é um ser humano tratado com a proteína de ligação de antígeno. Em um aspecto, uma proteína de ligação biespecífica compre- endendo uma modificação de CH2 e/ou CH3, conforme descrita aqui é pro- vida, no qual a proteína de ligação biespecífica compreende uma primeira porção de ligação que reconhece especificamente um antígeno em uma cé- lula B, e uma segunda porção de ligação que reconhece especificamente um . antígeno em uma célula T.

Em uma concretização, a proteína de ligação é um anticorpo bi- “15 específico. Em uma concretização específica, o anticorpo biespecífico com- preende uma IgG1 humana de cadeia pesada e uma IgGIAAdp humana de cadeia pesada. Em uma concretização, a primeira porção de ligação é um domínio variável de cadeia pesada humana que reconhece especificamente CD20. Em uma concretização, a segunda porção de ligação é um domínio variável de cadeia pesada humana que reconhece especificamente CD3. Em uma concretização, o anticorpo biespecífico exibe um EC50 em um ensaio de morte de Raji de cerca de 2,8-3,2 x 1CT'? M, ou cerca de 2,8-3,0 x 1fJ? M, e exibe não mais do que cerca de 1-10%, ou 1-5%, morte circunstante em um ensaio de morte de célula circunstante, no qual a célula circunstante —não compreende um epitopo de CD20. Em uma concretização específica, a célula circunstante é uma célula 293. Em outra concretização específica, a morte de célula circunstante no ensaio é medida através de uma concentra- ção de anticorpo biespecífico de cerca de 10º M a cerca de 10º M. Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo bi- específico é provido, compreendendo: obtenção de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina com- preendendo um primeiro domínio variável que reconhece um primeiro epito-

7 po, no qual a primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio constante de isotipo I9G1, IgG2, ou IgG4, ou um domínio constante de isotipo quimérico deste; obtenção de uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina com- preendendo um segundo domínio variável que reconhece um segundo epi- topo, no qual a segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende um domínio constante de isotipo IgG1, IgG2, ou IgG4, ou um domínio constante de isotipo quimérico deste, que compreende uma modificação em seu domí- nio de CH3 que erradica ou reduz ligação à Proteína A; obtenção de uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma imunoglobulina de cadeia leve que emparelha com a primeira e a segunda cadeia pesada de imunoglobulina; introdução da primeira, segunda e terceira sequências de - ácido nucleico em uma célula de mamífero; permissão da célula expressar uma imunoglobulina, e isolamento da imunoglobulina usando Proteína A. NE) Em uma concretização, a célula é selecionada de um CHO, COS, 293, HeLa, e uma célula retinal que expressa uma sequência de ácido nucleico viral (por exemplo, uma célula PERC.60).

Em um aspecto, uma proteína de ligação de antígeno biespecífi- ca é provida que compreende uma primeira especificidade que se liga a um antígeno e uma segunda especificidade que ativa um receptor, no qual a proteína de ligação de antígeno biespecífica compreende um primeiro poli- peptídeo compreendendo uma primeiro domínio de CH3 de IgG1, IgG2, ou IgG4 que compreende um Determinante de ligação de Proteína A, e um se- gundo polipeptídeo compreendendo um segundo domínio de CH3 de IgG1, I1gG3,oulgG4 que carece do determinante de ligação de Proteína A.

Em uma concretização, a segunda especificidade que ativa o re- ceptor que se liga ao receptor com uma Kp que está na faixa molar, milimo- lar, micromolar, nanomolar, ou picomolar.

Em uma concretização, a segunda especificidade se liga a um receptor selecionado de um Receptor acoplado à proteína-G, um receptor tirosina kinase, uma integrin, e um receptor similar à toll.

Em uma concretização, a segunda especificidade contata o re-

*.- ceptor e faz com que o receptor ou uma subunidade ou uma proteína asso- ciada fisicamente com esta empreenda fosforilação de uma serina, treonina, ou tirosina; causa ciclicização de um nucleotídeo (por exemplo, cAMP, CADP, ou cGMP); causa produção de uma fosfatidilinositol ou derivado deste (porexemplo, IP3 ou PIP3); causa produção de um mensageiro do segundo lipídeo (por exemplo, diacilclicerol, ceramida, ácido lisofosfatídico, um eico- sanoide); causa defosforilação (por exemplo, atividade de fosfatase); causa fosforilação de um lipídeo para formar um segundo mensageiro; causa hidró- lise de um segundo mensageiro; causa proteólise; causa sinalização redox; causa translocalização de uma proteína em uma organela celular (por e- xemplo, ao núcleo); faz com que o receptor agregue (com si próprio) para formar homo- ou (com outros receptores) para formar heteromultímeros; ou . causar a abertura ou fechamento de um canal de transmembrana.

Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo bi- “15 específico é provido, compreendendo:isolamento de um anticorpo biespeciífi- co de interesse de um quadroma, no qual o anticorpo biespecífico de inte- resse compreende uma primeira cadeia pesada que é um isotipo de IgG1, 19G2, ou IgG4, uma segunda cadeia pesada que é um isotipo de IgG1, IgG2, ou IgG4 tendo um domínio constante que compreende uma modificação em seu domínio de CH3 que erradica ou reduz ligação à Proteína A, no qual o anticorpo biespecífico de interesse é isolado usando Proteína A.

Em um aspecto, um método para produção de um anticorpo bi- específico é provido, compreendendo uma etapa de isolamento de uma célu- la rompida ou uma mistura de anticorpos a anticorpo biespecífico tendo do- mínios de CH3 IgG1, IgG2, ou IgG4 diferencialmente modificados, no qual os domínios de CH3 diferencialmente modificados são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos em um humano, e no qual a modifica- ção resulta em um anticorpo biespecífico com uma cadeia pesada heterodi- mérica cujos monômeros têm uma afinidade diferencial para Proteína A, e o anticorpo biespecífico é isolado a partir da célula rompida ou da mistura u- sando Proteína A.

Em uma concretização, o anticorpo biespecífico é isolado usan-

"E do um suporte de afinidade de Proteína A, no qual o anticorpo biespecífico elui a um pH entre cerca de 3,9 a cerca de 4,4, cerca de 4,0 a cerca de 4,3, cerca de 4,1 a cerca de 4,2, ou a cerca de pl 4,2. Em uma concretização, o anticorpo biespecífico elui a um pH de cerca de 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, ou 4,5.

Em uma concretização, o anticorpo biespecífico é isolado usan- do um Suporte de afinidade de Proteína A e um gradiente de pH ou etapa, no qual o gradiente de pH ou etapa inclui um modificador iônico. Em uma concretização específica, o modificador iônico está presente a uma concen- tração de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 molar. Em uma concretização especí- fica, o modificador iônico é um sal. Em uma concretização, o modificador iônico é selecionado a partir do grupo consistindo em sais de Oberílio, lítio, sódio, e potássio de acetato; bicarbonatos de sódio e potássio; carbonatos V de lítio, sódio, potássio e césio; cloretos de lítio, sódio, potássio, césio e magnésio; fluoretos de sódio e potássio; nitratos de sódio, potássio e cálcio; “15 fosfatos de sódio e potássio; e sulfatos de cálcio e magnésio. Em uma con- cretização específica, o modificador iônico é um sal de haleto de um metal alcalino ou metal alcalinoterroso. Em uma concretização específica, o modi- ficador iônico é cloreto de sódio.

Em um aspecto, uma proteína de ligação compreendendo um Fc,noqualo Fc compreende um primeiro domínio de CH3 que é modificado conforme descrito aqui, e um segundo domínio de CH3 que não é modifica- do, de modo a formar um Fc heterodimérico, no qual a modificação diferen- cial resulta na proteína de ligação que elui de um material de afinidade de proteína A a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,3, ou 1,4 unidade(s) de pH mais altas do que uma proteína de ligação correspondente que carece de modificação diferencial.

Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4,2, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 3. Em uma concretização, a proteina de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4,5, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 3,5. Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um

To. pH de cerca de 4, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 2,8-3,5, 2,8-3,2, ou 2,8-3. Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um pH de cerca de 4,2, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 2,8. Em uma concretização, a proteína de ligação diferencialmente modificada elui a um PH de cerca de 4,4, onde a proteína de ligação não modificada elui a um pH de cerca de 3,6. Nestas concretizações, "não modificada" se refere a falta de uma modificação em 435 (Numeração de EU), ou falta de uma modificação a 435 e 436 (Numeração de EU), ou ambos dos domínios de CH3.

Quaisquer das concretizações e aspectos aqui descritos podem ser usados em conjunto com um outro, a menos que, de outro modo, indica- do ou aparente do contexto. Outras concretizações tornar-se-ão aparentes . àqueles técnicos no assunto a partir de uma revisão da seguinte descrição.

DESCRIÇÃO DETALHADA “A5 Esta invenção não é limitada a métodos particulares, e condi- ções experimentais descritas, tanto que métodos e condições podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia aqui usada é para a proposta de descrever concretizações particulares somente, e não é preten- dida para ser limitante, visto que o escopo da presente invenção é definido pelasreivindicações.

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado conforme comumente com- preendido por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. Embo- ra quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descri- tos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, méto- dos e materiais particulares são agora descritos. Todas as publicações men- cionadas são, desse modo, incorporadas por referência.

O termo "anticorpo", conforme aqui usado, inclui moléculas de imunoglobulina compreendidas de quatro cadeias de polipeptídeo, duas ca- delas pesadas (H)e duas cadeias leves (L) interligadas por pontes de dissul- feto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável de cadeia pesa- da (abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia a. pesada.

A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de ca- deia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região constante de ca- deia leve.

A região constante de cadeia leve compreende um domínio, CL.

As regiões de VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas região de determinação de complemen- taridade (CDR), interespersas com regiões que são mais conservadas, de- nominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta destas três CDRs e quatro FRs, dispostas de amino-terminal a carboxi-terminal na se- guinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDRs de cadeia pesada podem ser abreviadas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; CDRs de cadeia leve podem ser abreviadas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3. O termo - anticorpo de "alta afinidade" se refere àqueles anticorpos tendo uma afinida- de de ligação a seu alvo de pelo menos 10º M, pelo menos 10º M; pelo “15 menos10*M;ou pelo menos 10? M, conforme medido por ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACOREO ou afinidade de solução

ELISA.

A frase "proteína de ligação de antígeno" inclui uma proteína tendo pelo menos uma CDR, e que é capaz de reconhecer seletivamente um antígeno, isto é, é capaz de se ligar a um antígeno com uma Kp que está pelo menos na faixa de micromolar.

Proteínas de ligação de antígeno tera- pêuticas (por exemplo, anticorpos terapêuticos) frequentemente requerem uma Kp que está na faixa de nanomolar ou na faixa de picomolar.

A "proteí- na de ligação de antígeno" também inclui uma proteína compreendendo um primeiro e um segundo domínio de CH3, conforme aqui descrito, e uma pri- meira proteína ou domínio de reconhecimento de ligante e uma segunda proteína ou domínio de reconhecimento de ligante, no qual a primeira proteí- na ou domínio de reconhecimento de ligante e a segunda proteína ou domí- nio de reconhecimento de ligante cada independentemente reconhece a mesma proteína ou ligante, ou juntas reconhecem a mesma proteína ou |i- gante, ou cada independentemente reconhece uma proteína ou ligante dife- rentes.

Um exemplo de tal proteína é uma imunoadesin, compreendendo um

. dímero de proteína de fusão (hetero- ou homo-) no qual os polipeptídeos do dímero são polipeptídeos de fusão que compreendem um componente de receptor ou um componente de ligante, no qual o componente de ligante compreende uma sequência de aminoácido que se liga a um receptor.

A frase "anticorpo biespecífico" inclui um anticorpo capaz de |li- gar seletivamente dois ou mais epitopos. Os anticorpos biespecíficos geral- mente compreendem duas cadeias pesadas diferentes, com cada cadeia pesada especificamente se ligando a um epitopo diferente — ou em duas moléculas diferentes (por exemplo, antígenos), ou na mesma molécula (por exemplo, nomesmo antígeno). Se um anticorpo biespecífico é capaz de ligar seletivamente dois epitopos diferentes (um primeiro epitopo e um segundo epitopo), a afinidade da primeira cadeia pesada ao primeiro epitopo geral- - mente será pelo menos uma a duas ou três ou quatro ordens de grandeza mais baixa do que a afinidade da primeira cadeia pesada para o segundo “15 epitopo, e vice-versa. Os epitopos reconhecidos pelo anticorpo biespecífico podem estar no mesmo ou em um alvo diferente (por exemplo, na mesma ou em uma proteína diferente). Os anticorpos biespecíficos podem ser produzi- dos, por exemplo, pela combinação de cadeias pesadas que reconhecem epitopos diferentes do mesmo antígeno. Por exemplo, sequências de ácido —nucleico que codificam sequências variáveis de cadeia pesada que reconhe- cem epitopos diferentes do mesmo antígeno, podem ser fundidas às se- quências de ácido nucleico que codificam regiões constantes de cadeia pe- sada diferentes, e tais sequências podem ser expressas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina. Um anticorpo biespecífico típi- cotem duas cadeias pesadas, cada uma tendo três CDRs de cadeia pesa- da, seguido por (N-terminal a C-terminal) um domínio de CH1, uma articula- ção, um domínio de CH2, e um domínio de CH3, e uma cadeia leve de imu- noglobulina que ou não confere especificidade de ligação de antígeno, mas que pode se associar com cada cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia pesada e que pode se ligar a um ou mais dos epitopos li- gados pelas regiões de ligação de antígeno de cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia pesada e capacita ligação a ou uma ou ambas

7 das cadeias pesadas a um ou ambos epitopos.

O termo "célula" inclui qualquer célula que é adequada para ex- pressar uma sequência de ácido nucleico recombinante. As células incluem aquelas de procariotes e eucariotes (célula simples ou célula múltipla), célu- las bacteriais (por exemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces Spp., etc.), células de micobactérias, células fungais, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), cé- lulas de planta, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inse- to infectadas por baculovírus, Trichoplusia ni, etc.), células de animal não humano, células humanas, ou fusões de célula tais como, por exemplo, hi- bridomas ou quadromas. Em algumas concretizações, a célula é uma célula de humano, macaco, chimpanzé, hamster, rato, ou camundongo. Em algu- - mas concretizações, a célula é eucariótica e é selecionada das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por “15 exemplo, COS-7), célula retinal, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, célula L, C127 célula, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, BRL 3A célula, célula HT1080, célula de mieloma, célula de tu- mor,e uma linha de célula derivada de uma célula antes mencionada. Em algumas concretizações, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula retinal que expressa um gene viral (por exemplo, uma célula PER.C60).

A frase "região de determinação de complementaridade", ou o termo "CDR," inclui uma sequência de aminoácido codificada por uma se- quência de ácido nucleico de um gene de imunoglobulina do organismo que normalmente (isto é, em um animal tipo selvagem) aparece entre duas regi- ões de estrutura em uma região variável de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada por, por exemplo, uma sequência de linha de germe ou uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B naive ou uma célula B matura,

na ou uma célula T. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma C- DR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências de linha de germe) que não são contíguas (por exem- plo, em uma sequência de ácido nucleico não rearranjada), mas são contí- guasem uma sequência de ácido nucleico de célula B, por exemplo, como o resultado de união ou conexão das sequências (por exemplo, recombinação de V-D-J para formar uma CDR3 de cadeia pesada).

A frase "cadeia pesada," ou "cadeia pesada de imunoglobulina" inclui uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobu- linade qualquer organismo, e, a menos do que de outro modo especificado, inclui um domínio variável de cadeia pesada. Os domínios variáveis de ca- deia pesada incluem três CDRs de cadeia pesada e quatro regiões de FR, a . menos que de outro modo especificado. Fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs, e combinações destes. Uma cadeia pesada * 15 típicatem em seguida ao domínio variável (de N-terminal a C-terminal), um domínio de CH1, uma articulação, um domínio de CH2, e um domínio de CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de reconhecer especificamente um antígeno (por exemplo, re- conhecimento do antígeno com uma Kp na faixa de micromolar, nanomolar, ou picomolar), que é capaz de expressar e secretar de uma célula, e que compreende pelo menos uma CDR.

A frase "proteína contendo Fc" inclui anticorpos, anticorpos bies- pecíficos, imunoadesinas, e outras proteínas de ligação que compreendem pelo menos uma porção funcional de uma região de CH2 e CH3 de imuno- —globulina. Uma "porção funcional" se refere a uma região de CH2 e CH3 que pode se ligar a um Fc receptor (por exemplo, um FcyR; ou um FcecRn, isto é, um Fc receptor neonatal), e/ou que pode participar na ativação de comple- mento. Se a região de CH2 e CH3 contém anulações, substituições e/ou in- serções, ou outras modificações que as tornam incapazes de ligarem qual- quer Fc receptor e também incapazes de ativar complemento, a região de CH2 e CH3 não é funcional.

As proteínas contendo Fc podem compreender modificações nos

EN. domínios de imunoglobulina, incluindo onde as modificações afetam uma ou mais função efetuadora da proteína de ligação (por exemplo, modificações que afetam ligação de FcyR, ligação de FcRn e, desse modo, meia-vida, e/ou atividade de CDC). Tais modificações incluem, mas não são limitadas a as seguintes modificações e combinações destes, com referência a Nu- meração de EU de uma região constante de imunoglobulina: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, —330,331,332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, e 439. ' Por exemplo, e não por meio de limitação, a proteína de ligação é uma proteína contendo Fc e exibe meia-vida de soro intensificada (con- “15 forme comparada com a mesma proteína contendo Fc sem a(s) modificação (ões) recitadas), e tem uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, LIY/FW ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, SIRIQ/E/D ou T); ou uma modifi- cação a 428 e/ou 433 (por exemplo, LIRISI/P/Q ou K) e/ou 434 (por exem- plo, HIFouY); ou uma modificação a 250 e/ou 428; ou uma modificação a 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em outro exemplo, a modifi- cação pode compreender um 428L (por exemplo, M428L) e 4348 (por e- xemplo, N434S) modificação; a 428L, 259I (por exemplo, V259]), e a 308F (por exemplo, V308F) modificação; um 433K (por exemplo, H433K) e um 434 (por exemplo, 434Y) modificação; um 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T, e 256E) modificação; um 250Q e 428L modificação (por exem- plo, T250Q e M428L); a 307 e/ou 308 modificação (por exemplo, 308F ou 308P).

A frase "modificador iônico" inclui porções que reduzem o efeito de, ouinterações iônicas de rompimento, não específicas (isto é, não afini- dade) entre proteínas. Os "modificadores iônicos" incluem, por exemplo, sais, combinações iônicas de metais de Grupo | e Grupo Il com acetato, bi-

so carbonato, carbonato, um halogênio (por exemplo, cloreto ou fluoreto), nitra- to, fosfato, ou sulfato.

Uma lista ilustrativa não limitativa de "modificadores iônicos" inclui sais de berílio, lítio, sódio, e potássio de acetato; bicarbonatos de sódio e potássio; carbonatos de lítio, sódio, potássio e césio; cloretos de lítio, sódio, potássio, césio e magnésio; fluoretos de sódio e potássio; nitratos de sódio, potássio e cálcio; fosfatos de sódio e potássio; e sulfatos de cálcio e magnésio.

Os "modificadores iônicos" incluem aquelas porções que afetam interações iônicas que, após adição a um gradiente ou etapa de pH, ou após equilíbrio de um suporte de Proteína A em um "modificador iônico" e aplica- çãode uma etapa ou gradiente de pH, resulta em uma ampliação de distân- cia de unidade de pH entre eluição de uma IgG homodimérica e uma IgG heterodimérica (por exemplo, uma IgG humana tipo selvagem e a mesma N IgG, mas suportando uma ou mais modificações de seu domínio de CH3, conforme aqui descrito). Uma concentração adequada de um "modificador “15 iônico" pode ser determinada por sua concentração empregando a mesma coluna, etapa e gradiente de pH, com concentração aumentada de "modifi- cador iônico" até que uma distância de pH máxima seja alcançada a uma dada etapa ou gradiente de pH.

A frase "cadeia leve" inclui uma sequência de região constante de cadeialeve de imunoglobulina de qualquer organismo, e, a menos que de outro modo especificado, inclui cadeias leves humanas kappa e lambda.

Os domínios variáveis cadeia leve (VL) tipicamente incluem três CDRs de ca- deia leve e quatro regiões de estrutura (FR), a menos que, de outro modo, especificado.

Geralmente, uma cadeia leve de comprimento total inclui, de amino terminal a carboxil terminal, a um domínio de VL que inclui FR1- CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, e um domínio constante de cadeia leve.

As cadeias leves que podem ser usadas com esta invenção incluem aque- las, por exemplo, que não se ligam seletivamente ou ao primeiro ou segundo antígeno seletivamente ligado pela proteína de ligação de antígeno.

Cadeias leves adequadas incluem aquelas que podem ser identificadas pela classifi- cação das cadeias leves mais comumente empregadas nas bibliotecas de anticorpo existentes (bibliotecas úmidas ou in silico), onde as cadeias leves

.-. não interferem substancialmente com a afinidade e/ou seletividade dos do- mínios de ligação de antígeno das proteínas de ligação de antígeno. As ca- deia leves adequadas incluem aquelas que podem se ligar a um ou ambos epitopos que são ligados pelas regiões de ligação de antígeno da proteína deligaçãode antígeno.

A frase "faixa micromolar" é pretendida significar 1-999 micromo- lar; a frase "faixa nanomolar" é pretendida significar 1-999 nanomolar; a fra- se "faixa picomolar" é pretendida significar 1-999 picomolar.

A frase "somaticamente mutada" inclui referência a uma se- —quência de ácido nucleico de uma célula B que suportou ligação de classe, no qual a sequência de ácido nucleico de uma região variável de imunoglo- bulina (por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada ou incluindo . uma CDR de cadeia pesada CDR ou sequência de FR) na célula B de liga- | ção de classe não é idêntica à sequência de ácido nucleico na célula B antes “15 daligaçãode classe, tal como, por exemplo, uma diferença em uma CDR ou sequência de ácido nucleico de estrutura entre uma célula B que não supor- tou ligação de classe e uma célula B que suporta ligação de classe. "Soma- ticamente mutado" inclui referência às sequências de ácido nucleico de célu- las B de afinidade maturada que não são idênticas às sequências corres- —pondentes em células B que não são de afinidade maturada (isto é, sequên- cias no genoma de células de linha de germe). A frase "somaticamente ma- tado" também inclui referência a uma sequência de ácido nucleico de uma célula B após exposição da célula B a um antígeno de interesse, no qual a sequência de ácido nucleico difere da sequência de ácido nucleico corres- —pondente antes da exposição da célula B ao antígeno de interesse. A frase "somaticamente mutado" se refere a sequências de anticorpos que foram geradas em um animal, por exemplo, um camundongo tendo região variável humana de sequências de ácido nucleico de imunoglobulina, em resposta a um desafio de antígeno, e que resulta dos processos de seleção inerente- mente operantes em tal animal.

A frase "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácido de uma cadeia leve ou cadeia pesada de imunoglobulina (modificada con-

7 forme desejado) que compreende as seguintes regiões de aminoácido, em sequência de N-terminal a C-terminal (a menos que, de outro modo, deseja- do): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FRA4. Um "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácido capaz de dobrar em um domínio canônico (VHouVWVL) tendo uma estrutura de beta folha dupla na qual as beta folhas são conectadas por ponte de dissulfeto entre um resíduo de uma primeira beta folha e uma segunda beta folha.

Anticorpos biespecíficos Com Regiões de CH3 de IgG Modi- ficadas Os inventores desenvolveram um novo formato que combina uma estratégia comum de cadeia leve com uma implementação de um es- quema de purificação seletiva de Proteína A que pode ser usado com com- . ponentes de anticorpo humano.

Foi previamente notado (Lindhofer, H. et a/. (1995) J.

Immunol. “15 155:219-225)) que devido a IgG3 humana não se ligar a Proteína A, ela po- de potencialmente ser usada junto com qualquer das outras três subclasses de IgG humana em uma estratégia de purificação similar a uma usada para híbridos de camundongo-rato.

Contudo, embora as sequências de todas as quatro subclasses de IgG humana sejam altamente homólogas, não é co- —nhecido agora como prontamente as porções de Fc de IgG1, IgG2, e IgG4 formarem heterodímeros com IgG3; mesmo meramente formação preferen- cial de homodímeros teria um impacto negativo nos rendimentos totais dos heterodímeros desejados sob certas circunstâncias (por exemplo, isolamen- to de quadromas). As modificações adicionais podem também serem neces- sárias para compensar a diferença entre a região de articulação de I9G3 e aquelas das outras subclasses.

Seria também preferível, em algumas cir- cunstâncias, não requerer a presença da IgG3 Fc total, devido ao impacto potencial nas funções efetuadoras.

Os inventores desenvolveram, portanto, um formato "mínimo" que explora um determinante fortuitamente simples de ligação de Proteína.

Foi reportado (Jendeberg, L et al. (1997) J.

Immunological Meth. 201:25-34)) que a inabilidade de IgG3 se ligar a Proteína A é determinada por um resí-

7 duo de aminoácido simples, Arg435 (Numeração de EU; Arg95 por IMGT), cuja posição correspondente na outra subclasse de IgG é ocupada por um resíduo de histidina. É, portanto, possível, ao invés de IgG3, usar uma se- quência de IgG1 em que His435 sofre mutação para Arg. Desse modo, uma mutação de ponto simples em IgG1 deve ser suficiente para criar as afinida- des de ligação diferentes receptivas a um novo esquema de purificação. Es- ta modificação será referida a um IgG1 AA, para denotar sua inabilidade de se ligar a Proteína A (e, similarmente, I9gG2AA e IgG4AA ou, mais geralmen- te, FCAA).

Contudo, a mutação de ponto especificada introduz uma nova sequência de peptídeo através da mutação, que pode potencialmente ser imunogênica. A mutação de ponto pode, na teoria, estar carregada em uma . molécula de classe Il de MHC e apresentada a células T, e, consequente- mente, induz uma resposta imune. Para evitar esta armadilha, uma mutação “15 de dipeptídeo, H435R/Y436F (Numeração de EU; H95R/Y96F por IMGT) pode ser usada. A sequência resultante na vizinhança da alteração é idênti- ca àquela de IgG3 (vide figura 2A), e seria, portanto, esperada ser imunolo- gicamente "invisível" porque existiria peptídeos curtos não nativos disponí- veis para apresentação a células T. Foi reportado que este mutante duplo ainda não se liga a Proteína A (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Inmunological Meth. 201:25-34). Finalmente, a mutação de dipeptídeo não inclui qualquer dos resíduos que formam a interface de dímero de Fc, de modo que é dife- rentemente para interferir com a formação de heterodímeros. Esta mutação de dipeptídeo é designada como "IgGIAAdp" (e, similarmente, IGgG2AAdp, —IgG4AAdp, e FCAAdp). A colocação da modificação de dipeptídeo em IgG1, IgG2, e IgG4 é indicada na figura 3 nas sequências denotadas IQgGIAAdp, IgG2AAdp, e IG4AAdp mostradas com sequências de domínio de CH3 de 1gG humana tipo selvagem, bem como hlgG3, mostrando Numeração de IMGT exon e Numeração de EU.

A modificação de FCAAdp não inclui qualquer dos resíduos acre- ditados formarem a Interface de dímero de Fc, de modo que a modificação de FcAAdp é diferentemente para interferir com a formação de heterodíme-

7. ros. Devido ao FCAAdp ser, desse modo, mínimo, ele pode similarmente ser incorporado nas outras formas de Fc projetadas também. IgG2AAdp e IgG4AAdp podem estar vantajosamente em situações em que as funções efetuadoras (ou falta destas), associadas com cada uma das anteriores, são desejadas.

Em resumo, o formato de anticorpo biespecífico descrito acima inclui dois anticorpos de especificidade diferente que usa a mesma cadeia leve, no qual a região Fc de um deles é modificada para o formato FCAAdp (vide figura 2B). Sua configuração é aquela de um anticorpo humano natural, edeve, portanto, compartilhar suas propriedades favoráveis, incluindo uma baixa propensidade a agregado, estabilidade in vivo, imunogenicidade míni- ma, propriedades de biodistribuição similares àquelas de anticorpos, boas . farmacocinéticas, e, opcionalmente, funções efetuadoras. Métodos para iso- lamento de tais anticorpos biespecíficos são proporcionados, que são relati- “15 vamenterápidos e simples na execução. Proteínas de ligação biespecíficas Com Regiões de CH de IgG de Ca- mundongo Modificadas Os inventores desenvolveram um método para isolar prontamen- te uma proteína de ligação compreendendo uma cadeia pesada de imuno- globulina (ou fragmento deste contendo CH2 e CH3 funcional) que é hetero- dimérica com relação a um ou mais aminoácidos no domínio de CH3. Uma seleção cuidadosa de modificações de um domínio de CH de IgG de ca mundongo e aplicação de uma tecnologia de separação particular conferem a capacidade de isolar rapidamente uma proteína de ligação compreenden- do duas diferencialmente modificadas regiões de CH de camundongo de homodímeros e de heterodímeros que não contêm as modificações.

A IgG1 de camundongo, que contém uma prolina em 247, uma treonina em 252, 254, e 256, e uma lisina em 258, se liga somente fraca- mente à proteína A. A IgG2a e IgG2b de camundongo, contudo, contém re- síduos diferentes naquelas posições (com a exceção de posições 256 e 258 de IgG2b), e IgG2a e 2b de camundongo se ligam bem à proteína A. Dife- rencialmente modificando as regiões de CH de duas IgGs de camundongo

7 em um método para produção de um anticorpo que é heterodimérico para cadeias pesadas conferiria uma característica de ligação de proteína A dife- rencial a tal anticorpo. Desse modo, um esquema de isolamento de proteína A diferencial é desenvolvido que permite pronta separação de um heterodí- mero modificado de qualguer homodímero de IgG de camundongo, se é um homodímero de IgG1 (que se ligaria somente muito fracamente, se no todo, à proteína A), ou um homodímero de IGg2A de camundongo, um homodíme- ro de IgG2b de camundongo, ou um heterodímero de IgG2a/I9G2b. Por e- xemplo, um anticorpo biespecífico tendo dois domínios variáveis de cadeias pesadas diferentes, mas o mesmo isotipo, por exemplo, IgG2a, pode ser expresso em um sistema de expressão adequado que emprega as sequên- cias de cadeia pesada, no qual somente uma das regiões de CH de IgG2a é modificada para reduzir ou eliminar um determinante de ligação de proteína A. Desse modo, somente uma das regiões de CH de IgG2a exibirá uma afi- “15 nidade substancial para proteína A, e qualquer anticorpo formado de um dí- mero de uma IgG2a não modificada e uma IgG2a modificada será pronta- mente isolado do heterodímero modificado.

Em várias concretizações, um anticorpo no qual uma região de CH simples de um dímero de Fc compreende a região de CH modificada, onde a outraCH do dímero de Fc carece do mesmo. A região de CH de IgG de camundongo é modificada para compreender aminoácidos particulares em posições particulares (Numeração de EU), selecionados a partir do grupo consistindo em: 252T, 254T, e 256T; 252T, 254T, 2567, e 258K; 247P, 2527, 254T, 2567, e 258K; 435R e 436F; 252T, 254T, 2567, 435R, e 436F; 2527, 254T, 2567, 258K, 435R, e 436F; 24tP, 252T, 254T, 2567, 258K, 435R, e 436F; e, 435R. Em uma concretização específica, um grupo particular de modificações é produzido, selecionado a partir dos grupos consistindo em: M252T, S254T, S2561T; M252T, S254T, S256T, 1258K; 1247P, M252T, S254T, S256T, 1258K; H435R, H436F; M252T, S254T, S2561, H435R, H436F; M252T, S254T, S2561, 1258K, H435R, H436F; 1247P, M252T, S254T, S256T, 1258K, H435R, H436F; e, H435R. Proteínas de ligação à base de IgG de camundongo heterodimé-

q. rica podem ser usadas para uma variedade de aplicações. Por exemplo, elas permitem um método de isolamento de anticorpos biespecíficos com domí- nios constantes de camundongo, no qual as modificações não interferem ou não interferem substancialmente com a ligação do anticorpo a um ou mais receptores de Fc de camundongo, tal que o anticorpo pode participar, por exemplo, no ADCC ou CDC, e também se ligar a dois ou mais epitopos no mesmo ou alvo diferente.

Em um aspecto, um método para isolamento de uma proteína de ligação compreendendo uma primeira região de CH de IgG de camundongo e uma segunda região de CH de IgG de camundongo, no qual a primeira região de CH de IgG é modificada (mas não a segunda região de CH de IgG), de modo a reduzir ou eliminar a afinidade de ligação da Proteína A da . primeira região de CH de IgG de camundongo, mas não a segunda região de CH de IgG de camundongo, e no qual a proteína de ligação compreende “15 uma primeira porção de ligação que se liga a um primeiro epitopo, e uma segunda porção de ligação que se liga a um segundo epitopo.

Em uma concretização, a modificação não altera ou não altera substancialmente a afinidade de ligação da proteína de ligação a um recep- tor Fc. Em uma concretização, a proteína de ligação compreende uma modi- ficação que aumenta ou diminui a afinidade para a proteína de ligação a um receptor Fc.

Em uma concretização, a modificação não altera ou não altera substancialmente a meia-vida de soro da proteína de ligação em um camun- dongo compreendendo receptores FcyR de camundongo nativo, e/ou um FcRn de camundongo nativo, conforme comparado com uma proteína de ligação correspondente que carece da modificação.

Em uma concretização, a modificação não altera ou não altera substancialmente a meia-vida de soro da proteína de ligação em um camun- dongo que compreende uma substituição de receptores FOYR de alta e bai- xa afinidade de camundongo nativo, e/ou um receptor de FcRn, conforme comparado com uma proteína de ligação correspondente que carece da mo- dificação.

1 Em uma concretização, o primeiro e o segundo epitopo são dife- rentes e estão em células diferentes, ou em proteínas diferentes.

Em uma concretização, o primeiro epitopo e o segundo epitopo são diferentes e estão na mesma célula ou na mesma proteína.

Em uma concretização, o receptor Fc é selecionado de um re- ceptor Fc de alta afinidade, um receptor Fc de baixa afinidade, e um FcRn.

Em uma concretização específica, o receptor Fc é selecionado de uma ou mais FcRn de camundongo, uma FcyR de camundongo, uma FcyRIIB de camundongo, uma FcyRill de camundongo, uma FcyRIV de camundongo, e uma combinação destas.

Em uma concretização específica, o receptor Fc é selecionado de uma ou mais de uma FcRn humana, uma FcyR humana, uma FCYRIIB humana, uma FeyRIIC humana, uma FCcyRNIB humana, uma

. FCyRIIIA humana, uma FecyRIIA humana, e uma combinação das mesmas.

Imunogenicidade

“As Uma vantagem de muitas concretizações da invenção é a capa- cidade de empregar a(s) modificação (ões) para produzir anticorpo biespecí- fico que é ambos prontamente isoláveis baseado na ligação diferencial à Proteína A, e é também não imunogênico ou substancialmente não imuno- gênico em um humano.

Esta característica torna tais concretizações particu- larmente úteis na produção de anticorpos biespecíficos para uso terapêutico ' humano, e na produção de imunoadesinas, por exemplo, que são não imu- nogênicas ou substancialmente não imunogênicas (empregando porções de ligação humanas, isto é, componentes de receptor humanos e/ou ligantes humanos). Esta característica é associada com anticorpos biespecíficos ten- do domínios de CH3 com as modificações H95R/Y96F (numeração IMGT) de IgG1, IgG2, e IgG3, e aqueles domínios de CH3 que contêm modifica- ções adicionais que resultam na posição sendo modificada refletindo uma sequência tipo selvagem de um isotipo de IgG diferente.

Desse modo, embo- ra a modificação não seja encontrada na natureza associada com o isotipo de lgG particular, a sequência modificada é localmente idêntica com uma sequência tipo selvagem de um isotipo de IgG diferente, e a modificação não é esperada ser imunogênica ou substancialmente imunogênica.

É também

» —, possível que uma modificação seja não imunogênica mesmo se sua se- quência seja não localmente idêntica a qualquer sequência nativa; tais modi- ficações seriam igualmente úteis. A mutação de ponto H95R mínima (nume- ração IMGT), se não imunogênica, seria, portanto, uma concretização ade- quadada invenção.

Desse modo, os anticorpos biespecíficos são proporcionados que são não imunogênicos ou substancialmente não imunogênicos em um humano, com relação a seus domínios constantes de cadeia pesada, mas, não obstante, suportam uma ou mais modificações diferenciais do domínio constante de cadeia pesada, incluindo uma modificação que resulta em uma afinidade diferencial dos domínios constantes de cadeia pesada com relação a um reagente de afinidade (por exemplo, Proteína A). As modificações - compreendem àquelas aqui reveladas. Em uma concretização específica, o anticorpo biespecífico que é não imunogênico ou substancialmente não imu- “15 nogênicoem um humano com relação a seu domínio de CH3, ainda tendo diferencialmente modificadas cadeias pesadas, é uma IgG1 humana, IgG2, ou IgG4 compreendendo um domínio de CH3 que compreende uma das se- guintes modificações (ou, em outra concretização, consiste essencialmente de uma das seguintes modificações): H95R, ou H95R e Y96F (numeração IMGT).

Os anticorpos biespecíficos são esperados serem não imunogê- nicos, ou substancialmente não imunogênicos, com relação a humanos em quem tolerância a I9G1 humana, IgG2, e isoformas IgG4 não foram ainda quebradas a qualquer grau significante.

Em particular, a modificação de FcAAdp é esperada ser imuno- logicamente "invisível" porque a ranhura de ligação de moléculas de classe || de MHC acomoda um 9-mer que compreende a determinante maior reco- nhecida por circuitos fechados variáveis do receptor de célula T, de modo que peptídeos que carecem de qualquer subsequência 9-mer nativa parece- ria diferentemente induzir uma resposta imune. Contudo, peptídeos mais longos do que 9-mers (usualmente cerca de 13 a 17 mer) são ligados pela classe Il de MHC, e é possível que segmentos que se projetam possam in-

. fluenciar potencialmente na ligação. Portanto, modificações adicionais (sobre a modificação de FCAAdp) que eliminam sequências nativas mais longas podem adicionalmente reduzir o potencial para imunogenicidade. Um exem- plo específico é a modificação V422! (EU; V82I pela numeração IMGT), que prolonga o comprimento do peptídeo não nativo mínimo de 14 para 39 resí- duos em IgG1 AAdp, e para 43 resíduos na IgG2AAdp analogamente defini- da. Outro exemplo é a modificação L445P (EU; L105P pela numeração IMGT) na IgG4AAdp, que prolonga o comprimento de 10 a 14 resíduos.

Farmacocinéticas O local de ligação para Proteína A se sobrepõe com o local de ligação para o receptor Fc neonatal, FCRN, que é pensado ser responsável por conferir uma meia-vida de soro prolongada para imunoglobulinas. As - modificações na vizinhança do local de ligação de proteína A, portanto, eleva a possibilidade que o formato aqui proposto pode ter uma meia-vida de soro “15 mais curta do que de IgG1, 2, e 4, dado que IgG3 humana tem uma meia- vida de soro mais curta (cerca de 7 dias) do que as outras subclasses de 1gG (cerca de 21 dias). Alguns mutantes de Fc que afetam His435 foram mostrados não se ligarem a FCRN, e têm uma meia-vida mais curta em ca- mundongos. Contudo, a análise farmacocinética mostrou que a meia-vida de sorodo!lgG1AA/I9G1 heterodímero não é apreciavelmente diferente daquela do IgG1 homodímero (vide Exemplo 2). Desse modo, a mutação IgGIAAdp tem a vantagem de ablação da ligação de Proteína A, enquanto ainda pre- serva a meia-vida mais longa de IgGl.

Consequentemente, em uma concretização, uma proteína de |li- gaçãode antígeno biespecífica é proporcionada que compreende uma modi- ficação de um domínio de CH3 conforme aqui descrito, no qual a proteína de ligação de antígeno revela um perfil farmacocinético equivalente à mesma proteína de ligação de antígeno biespecífica que carece da modificação no domínio de CH3. Em uma concretização, um anticorpo biespecífico é pro- —porcionado que compreende um IgG1AA/I9G1 heterodimérico Fc, no qual o anticorpo biespecífico tem uma meia-vida de soro que é cerca de 1,5-vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 2,5 vezes, ou cerca de 3 vezes mais alta do que

- um anticorpo biespecífico que é, de outro modo, idêntico, mas compreende um IgG3 domínio de CH3, ou que, de outro modo, idêntico, mas compreende pelo menos uma cadeia pesada de I9G3. Em uma concretização, um anti- corpo biespecífico é proporcionado compreendendo um IgG1AA/IgG1 hete- rodimérico Fc, no qual o anticorpo biespecífico exibe uma meia-vida de soro que é cerca de a mesma conforme aquela do anticorpo biespecífico sem a modificação de IGG1A4A (isto é, um anticorpo biespecífico de I9G1 homodi- mérico). Cadeias pesadas de imunoglobulina Regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina que po- dem ser usadas para gerar anticorpos biespecíficos com características de- sejadas (por exemplo, especificidades desejadas, afinidades desejadas, fun- W cionalidades desejadas, por exemplo, bloqueio, não bloqueio, inibição, ativa- ção, etc.) podem ser geradas usando-se qualquer método conhecido na téc- “15 nica As cadeias pesadas desejadas pode, em seguida, serem construídas por clonagem de sequências de ácido nucleico contendo as regiões variá- veis nos construtos tendo a região constante de cadeia pesada desejada conforme aqui descrita.

Em uma concretização, a primeira cadeia pesada compreende uma região variável que é codificada por um ácido nucleico que é derivado do genoma de uma célula B matura de um primeiro animal que foi imunizado com um primeiro antígeno, e a primeira cadeia pesada reconhece especifi- camente o primeiro antígeno.

Em uma concretização específica, a segunda cadeia pesada compreende uma região variável que é codificada por um ácido nucleico que é derivado do genoma de uma célula B matura de um segundo animal que foi imunizado com um segundo antígeno, e a segunda cadeia pesada reconhece especificamente o segundo antígeno.

Em uma concretização, o primeiro animal e/ou o segundo animal é um animal geneticamente modificado compreendendo uma região variável de cadeiapesada humana de imunoglobulina não-rearranjada.

Em uma con- cretização, o primeiro animal e/ou o segundo animal é um animal genetica- mente modificado compreendendo uma região variável de cadeia pesada

- humana de imunoglobulina não-rearranjada e uma região constante de imu- noglobulina humana. Em uma concretização, o primeiro animal e/ou o se- gundo animal é um camundongo geneticamente modificado que compreen- de uma região variável de cadeia pesada humana de imunoglobulina não- rearranjada.

Sequências de região variável de cadeia pesada de imunoglobu- lina podem ser obtidas por qualquer outro método conhecido na técnica, por exemplo, por revelação de fago, e sequências obtidas desse modo podem ser empregadas para produzir construtos de ácido nucleico a serem unidos aos ácidos nucleicos que codificam qualquer cadeia pesada adequada, por exemplo, cadeias pesadas com domínios de CH3 modificados conforme aqui descrito, e colocados em um construto de expressão e transferidos a uma . célula que é capaz de produzir a cadeia pesada, por exemplo, na presença de uma cadeia leve adequada. 2 ºA5 Cadeias leves de imunoglobulina Anticorpos biespecíficos compreendendo duas cadeias pesadas que reconhecem dois epitopos diferentes (ou dois antígenos diferentes) são mais facilmente isoladas onde elas podem se emparelhar com a mesma ca- deia leve (isto é, cadeia leves tendo domínios variáveis e constantes idênti- cos) Uma variedade de métodos é conhecida na técnica para geração de cadeias leves que podem se emparelhar com duas cadeias pesadas de es- pecificidade diferente, enquanto não interferem ou não substancialmente interferem com a seletividade e/ou afinidade do domínio variável de cadeia pesada com seu antígeno alvo.

Na abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada pela so- brevivência de estatísticas de uso para todos os domínios variáveis de ca- deia leve, identificando a cadeia leve mais frequentemente empregada em anticorpos humanos, e emparelhando aquela cadeia leve com as duas ca- deias pesadas de especificidade diferente.

Em outra abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada por observação das sequências de cadeia leve em uma biblioteca de revelação de fago (por exemplo, uma biblioteca de revelação de fago compreendendo

. região variável humana de sequências de cadeia leve, por exemplo, uma biblioteca ScFv humana) e selecionando a região variável de cadeia leve i mais comumente da biblioteca.

Em outra abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada pe- loensaiode uma biblioteca de revelação de fago de sequências variáveis de cadeia leve usando as sequências variáveis de cadeia pesada de ambas as cadeias pesadas como sondas. Uma cadeia leve que se associa com ambas sequências variáveis de cadeia pesada é selecionada como uma cadeia leve para as cadeias pesadas, e permite ligação e/ou ativação com relação a ambos os epitopos.

Em outra abordagem, uma cadeia leve pode ser selecionada pe- la combinação de cadeias leves conhecidas com cadeias pesadas deseja- . das e ensaiando o anticorpo biespecífico resultante para especificidade de ligação, afinidade, e/ou capacidade de ativação.

“As Para a extensão que uma dificuldade é encontrada em quais- quer abordagens para seleção de uma cadeia leve (por exemplo, a cadeia leve interfere com a ligação de uma ou ambas das cadeias pesadas com seu antígeno, ou a cadeia leve falha em se associar satisfatoriamente com uma ou ambas das cadeias pesadas), a cadeia leve pode ser alinhada com as cadeias leves cognatas de cadeias pesadas, e modificações são feitas na cadeia leve para se equiparar mais proximamente às características de se- quência comuns às cadeias leves cognatas de ambas cadeias pesadas. Se as chances de imunogenicidade necessitam serem minimizadas, as modifi- cações preferivelmente resultam em sequências que estão presentes em sequências de cadeia leve humanas conhecidas, tal que processamento pro- teolítico é diferentemente para gerar um epitopo de célula T baseado nos parâmetros e métodos conhecidos na técnica para avaliação da probabilida- de de imunogenicidade (isto é, in silico, bem como ensaios úmidos).

Anticorpos e Proteínas de ligação As composições e métodos são particularmente úteis na produ- ção de anticorpos humanos biespecíficos, isto é, anticorpos biespecíficos compreendendo domínios variáveis e constantes humanos. Em algumas

+ concretizações, os anticorpos humanos incluem aqueles tendo domínios va- riáveis de cadeia pesada e domínios constantes de cadeia pesada derivados de sequências de imunoglobulina de linha de germe humana, em algumas concretizações derivados de sequências de imunoglobulina humana somati- camente mutada (geradas, por exemplo, em um animal que compreende sequências de gene de imunoglobulina humana). Em algumas concretiza- ções, as regiões variáveis e/ou constantes humanas podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linha de germe humana, ou codificados como o resultado de recombinação e/ou união, por exemplo, nas CDRs e, em particular, CDR3. Os anticorpos huma- nos não são pretendidos incluir anticorpos em que sequências de CDR deri- vadas da linha de germe de outra espécie de mamífero, tal como camun- , dongo, foram enxertadas nas sequências de estrutura humana.

Aqueles an- ticorpos são referidos como anticorpos humanizados ou quiméricos.

Anticor- 7 15 pos humanos incluem aqueles compreendendo mutações, por exemplo, in- troduzidas in vitro por mutagênese aleatória ou específica de local, mas as mutações são preferivelmente não imunogênicas em um humano.

Os métodos e composições podem ser usados para produzir an- ticorpos quiméricos, preferivelmente não imunogênicos em um humano, ou de baixa imunogenicidade.

Anticorpos quiméricos são anticorpos em que uma de uma região variável de cadeia pesada, ou estrutura, ou CDR, ou re- gião constante de cadeia pesada, ou domínio, são de espécies diferentes (por exemplo, humano e camundongo, ou humano e primata). Em algumas concretizações, anticorpos quiméricos incluem anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada de origem não humana (por exemplo, camundon- go) e uma região constante de cadeia pesada de origem humana.

Em algu- mas concretizações, anticorpos quiméricos incluem anticorpos tendo uma região variável de cadeia pesada de origem humana e uma região constante de cadeia pesada de origem não humana (por exemplo, camundongo). Em várias concretizações, regiões de origem de camundongo são idênticas ou substancialmente idênticas a uma sequência de linha de germe de imuno- globulina de camundongo, com ou sem hipermutações somáticas.

Anticor-

. pos quiméricos também incluem anticorpos tendo uma região constante de cadeia leve que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência de É linha de germe de imunoglobulina humana e uma (por exemplo, camundon- go) cadeia pesada não humana ou quimérica humana/cadeia pesada não humana. Os anticorpos quiméricos incluem anticorpos tendo um domínio constante de cadeia leve que é idêntico ou substancialmente idêntico a uma (por exemplo, camundongo) sequência de linha de germe de imunoglobulina não humana e um quimérico humano ou não humano/cadeia pesada huma- na.

Em algumas concretizações, as composições e métodos são pa- ra produção de um anticorpo maturado de afinidade. Em algumas concreti- zações, um anticorpo maturado de afinidade compreende uma ou mais alte- . rações em uma ou mais CDRs que resultam em afinidade mais alta (por e- xemplo, Kp na faixa nanomolar ou picomolar) do anticorpo para seu antígeno * 15 alvo conforme comparado a um anticorpo substancialmente idêntica que ca- rece da(s) alteração (ões). Os anticorpos maturados de afinidades podem ser produzidos por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, por mutagênese aleatória ou direcionada de local de CDRs e/ou regiões de estrutura seguidas por classificação de afinidade, embaralhamen- tode domínio de VH, etc.

Em algumas concretizações, os anticorpos são anticorpos de neutralização.

Anticorpos de neutralização incluem anticorpos capazes de neu- tralizar, inibir ou prevenir uma atividade biológica de antígeno. Os anticorpos de neutralização incluem aqueles que, sob ligação a um antígeno, previnem ou reduzem a capacidade do antígeno agir em um alvo natural do antígeno in vivo e in vitro. Exemplos de anticorpos de neutralização incluem um anti- corpo para uma proteína ligante de um receptor biológico que previne o li- gante de se ligar ao receptor, ou um anticorpo a um receptor biológico que previne o receptor de se ligar a seu ligante, onde o ligante que se liga na ausência do anticorpo faz com que o receptor efetue uma mudança dentro de uma célula. A determinação se um anticorpo é um anticorpo de neutrali-

. zação geralmente determina a condução de um ensaio funcional no qual o efeito do anticorpo na atividade biológica do antígeno é medido. á Os métodos e composições da invenção são também úteis em uma variedade de aplicações a anticorpos e outras proteínas de ligação. Uma curta descrição de algumas aplicações úteis é provida aqui.

Proteínas de ligação biespecíficas que compreendem especifici- dade de ligação em direção a um antígeno de tumor e a um antígeno de cé- lula T podem ser produzidas, que têm como alvo um antígeno em uma célu- la, por exemplo, CD20, e também tem como alvo um antígeno em uma célu- laT, por exemplo, CD3. Desse modo, o anticorpo biespecífico tem como al- vo ambos uma célula de interesse em um paciente (por exemplo, célula B em um paciente com linfoma, via ligação de CD20), bem como uma célula T - do paciente. O anticorpo biespecífico, em várias concretizações, é designa- do de modo a ativar a célula T sob ligação de CD3, desse modo, acoplando “15 ativaçãode célulaT a uma célula de tumor selecionada específica.

As proteínas de ligação biespecíficas que compreendem duas porções de ligação que são cada direcionadas a um coparticipante de liga- ção (isto é, cada direcionado a um alvo diferente) na superfície da mesma célula, podem também serem produzidas. Este desenho é particularmente adequado para ter como alvo células específicas ou tipos de célula que ex- pressam ambos alvos na superfície da mesma célula. Embora alvos possam aparecer individualmente em outras células, as porções de ligação destas proteínas de ligação são selecionadas tal que a porção de ligação liga seu alvo com uma afinidade relativamente baixa (por exemplo, micromolar baixo, —oualtonanomolar-— por exemplo, sobre uma centena de nanomolar KD, por exemplo, 500, 600, 700, 800 nanomolar). Desse modo, a ligação de alvo prolongada é favorecida somente em situações onde os dois alvos estão em proximidade na mesma célula.

As proteínas de ligação biespecíficas que compreendem duas porções de ligação que ligam o mesmo alvo, cada em um epitopo diferente do mesmo alvo, podem ser produzidas. Este desenho é particularmente a- dequado para maximização da probabilidade de bloqueio bem sucedido de

- um alvo com proteína de ligação. Circuitos fechados extracelulares múltiplos, por exemplo, de um canal de transmembrana, ou um receptor de superfície | de célula, podem ser alvejados pela mesma molécula de ligação biespecífi- ca.

As proteínas de ligação biespecíficas que compreendem duas porções de ligação que agrupam e ativam reguladores negativos de sinaliza- ção imune para resultar em supressão imune podem ser produzidas. A re- pressão em cis pode ser alcançada onde os alvos estão na mesma célula; repressão em trans pode ser alcançada onde os alvos estão em células dife- rentes. A repressão em cis, por exemplo, pode ser alcançada com uma pro- teína de ligação biespecífica tendo uma porção de ligação de anti-lgGRIlb e uma porção de ligação de anti-FelD1, tal que o IGGRIIb é agrupado somente BR na presença de FelD1, de modo a regular descendentemente uma resposta imune para FelD1. A repressão em trans, por exemplo, pode ser alcançada “15 com uma proteína de ligação biespecífica tendo uma porção de ligação de anti-BTLA e uma porção de ligação que liga especificamente um antígeno de interesse específico, tal que o agrupamento da molécula de BTLA inibitória ocorre somente no tecido alvo selecionado, que determina potencialmente doenças autoimunes.

As proteínas de ligação biespecíficas que ativam receptores de multi-componentes podem ser produzidas. Neste desenho, duas porções de ligação direcionadas a dois componentes de uma ligação de receptor, reticu- lam o receptor, e ativam sinalização do receptor. Isto pode ser feito, por e- xemplo, usando uma proteína de ligação biespecífica com uma porção de ligação que liga IFNAR1 e uma porção de ligação que liga IFNAR2, onde a ligação reticula o receptor. Tal proteína de ligação biespecífica pode propor- cionar uma alternativa a tratamento de interferon.

As proteínas de ligação biespecíficas que transportam porções de ligação através de uma barreira semipermeável, por exemplo, a barreira sangue-cérebro, podem ser produzidas. Neste desenho, uma porção de |i- gação liga um alvo que pode transitar uma barreira seletiva particular; a ou- tra porção de ligação tem como alvo uma molécula com uma atividade tera-

- pêutica, no qual a molécula alvo com atividade terapêutica não pode nor- malmente atravessar a barreira. Este tipo de proteína de ligação biespecífica é útil para trazer terapêuticos a tecidos que o terapêutico, de outro modo, não alcançaria. Alguns exemplos incluem ter como alvo o plGR receptor pa- ra transportar um terapêutico no intestino ou pulmão, ou ter como alvo o re- ceptor de transferrin para transportar um terapêutico através da barreira sangue-cérebro. As proteína de ligação biespecíficas que transportam por- ções de ligação em células específicas ou tipos de célula podem ser produ- zidas. Neste desenho, uma porção de ligação tem como alvo uma proteína de superfície de célula (por exemplo, um receptor) que é prontamente inter- nalizada na célula. A outra porção de ligação tem como alvo uma proteína intracelular, onde ligação da proteína intracelular resulta em um efeito tera- ' pêutico. As proteínas de ligação biespecíficas que ligam um receptor de “15 superfície de uma célula imune fagocítica e uma molécula de superfície de uma patogenia infecciosa (por exemplo, uma levedura ou bactéria), para tra- zer a patogenia infecciosa na vizinhança de uma célula imune fagocítica pa- ra facilitar fagocitose da patogenia. Um exemplo de tal desenho seria um anticorpo biespecífico que tem como alvo uma molécula de CD64 ou CD89 e também uma patogenia.

As proteínas de ligação biespecíficas que têm uma região variá- vel de anticorpo como uma porção de ligação e uma porção de não ligação como uma segunda porção de ligação. A região variável de anticorpo alcan- ça o alvo, onde a porção de não ligação é um efetuador ou uma toxina ligada aumFc. Desse modo, o ligante (por exemplo, um efetuador ou toxina) é dis- tribuído para ao alvo ligado pela região variável de anticorpo.

As proteína de ligação biespecíficas que têm duas porções cada uma ligada a uma região lg (por exemplo, uma sequência de lg contendo um CH2 e Região CH3) tal que quaisquer duas porções de proteína podem ser trazidas entre si na vizinhança no contexto do Fc. Exemplos destes desenho incluem armadilhas, por exemplo, moléculas de armadilha homo- ou hetero- diméricas.

: Ácidos nucleicos As sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos mo- noclonais podem ser obtidas por qualquer método adequado conhecido na técnica.

Exemplos de métodos adequados para obtenção de anticorpos mo- —noclonais (e sua sequências de ácido nucleico) incluem, por exemplo, por um método de hibridoma (vide, por exemplo, Kohler et al. (1975) Nature 256:495497) ou uma biblioteca de anticorpo de fago (vide, por exemplo, vide Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628). Em várias concretizações, os domínios variáveis de cadeia pe- sada de imunoglobulina são derivados de sequências de ácido nucleico de um animal geneticamente modificado ou um animal transgênico.

Em algu- mas concretizações, as regiões são derivadas de um animal que compreen- . de um minilocal de imunoglobulina humana.

Em algumas concretizações, as regiões são derivadas de camundongos compreendendo um ou mais ácidos * 15 nucleicos extracromossomais que compreendem um ou mais ácidos nuclei- cos que codificam sequências de imunoglobulina.

Em várias concretizações, o animal pode ter uma ou mais sequências de ácido nucleico de imunoglobu- lina humana não-rearranjadas.

Em algumas concretizações, o animal com- preende sequências de ácido nucleico de região variável humana de cadeia leve, em algumas concretizações sequências variáveis de cadeia pesada humana, em algumas concretizações, ambas sequências variáveis de ca- deia leve e de cadeia pesada, e em algumas concretizações, compreende adicionalmente sequências humanas de região constante.

Em uma concreti- zação específica, as sequências de ácido nucleico são derivadas de um ca- —mundongo em cujos segmentos de gene variável de cadeia pesada de ca- mundongo endógeno e segmentos de gene variável de cadeia leve foram substituídos com segmentos de gene variável humana de cadeia pesada e segmentos de gene variável de cadeia leve.

Em algumas concretizações, as sequências de ácido nucleico são derivadas de células naive B ou células T de tal animal.

Em outras con- cretizações, as sequências de ácido nucleico são derivadas de células B ou T de um animal que foi imunizado com um antígeno de interesse.

, Em várias concretizações, as sequências de ácido nucleico são deri- vadas de células por amplificação das mesmas com prímeres, incluindo, por ] exemplo, conjuntos de prímeres degenerados, que compreendem uma ou mais FR, união, ou sequências constantes.

Em várias concretizações, os domínios variáveis de cadeia pe- sada de imunogiobulina são derivados de ácidos nucleicos de um animal que foi imunizado com um antígeno de interesse. Por exemplo, um animal não humano transgênico ou animal geneticamente modificado é imunizado com o antígeno de interesse (por, por exemplo, exposição do animal ao an- tígeno ou uma célula suportando o antígeno ou um ácido nucleico que codi- fica uma forma expressível do antígeno), permitindo que o animal suporte uma resposta imune, isolando as células imunes (por exemplo, célula B) do p animal, opcionalmente imortalizando as células, e classificando as células para identificar reatividade com o antígeno e/ou identificação e/ou isolamen- “15 tode sequências de ácido nucleico que codificam uma região variável de imunoglobulina que é capaz de reconhecer o antígeno quando colocado no contexto de um anticorpo. Em algumas concretizações, a célula é uma célula B. Em algumas concretizações, a célula B do animal imunizado é usada para produzir hibridoma, e uma célula B expressando um anticorpo que reconhe- ce especificamente um epitopo do antígeno é identificada e as sequências de ácido nucleico que codificam uma sequência de aminoácido de região variável que reconhece o epitopo são identificadas e/ou isoladas.

Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos são derivados de humanos, primatas não humanos (por exemplo, macacos tais como chimpanzés), macacos (por exemplo, cynomologous ou rhesus), roedores (por exemplo, camundongos, ratos, hamsters), burros, cabras, ovelhas, efc.

Em algumas concretizações, as cadeias pesadas compreendem sequências que são derivadas de células humanas. Por exemplo, células fetais humanas expostas in vitro a um antígeno e colocadas em um animal hospedeiro adequado (por exemplo, um camundongo SCID).

Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos são introduzi- dos em uma célula usando um vetor. Vetores incluem, por exemplo, plasmí-

* deos, cosmídeos, retrovírus, adenovírus, adeno-vírus associados, vírus de planta, YACs, BACs, epissomas derivados de EBV. Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos estão presen- tes em um vetor de expressão ou construto de expressão. Em algumas con- cretizações, o vetor de expressão ou construto é um vetor que contém um promotor operavelmente ligado à sequência de ácido nucleico de interesse tal que a sequência de ácido nucleico de interesse é capaz de ser expressa sob condições adequadas em uma célula adequada. Os vetores de expres- são ou construtos podem incluir sequências condutoras, intensificadores, elementos promotores que intensificam transcrição ou translação, sequên- cias de cessamento de transcrição, sequências de união, introns de intensifi- cação de transcrição, elementos de IRES, genes marcadores, sequências de . seleção, locais de reconhecimento de recombinase, braços de homologia, sequências virais, operadores (por exemplo, operadores procarióticos) efc. “15 Em algumas concretizações, os vetores de expressão compreendem ele- mentos que permitem expressão induzível, por exemplo, um operador proca- riótico operavelmente ligado a um promotor eucariótico. Em algumas concre- tizações, a expressão é induzida sob adição de um indutor de expressão. Em outras concretizações, a expressão é induzida sob remoção de um inibi- dorde expressão. Em algumas concretizações, a expressão é induzida por uma mudança de temperatura.

Em algumas concretizações, uma ou mais sequências de nucle- otídeo de cadeia pesada estão no mesmo vetor. Em algumas concretiza- ções, uma sequência de ácido nucleico de cadeia pesada e uma sequência de ácido nucleico de cadeia leve aqui estão no mesmo vetor. Em uma con- cretização, duas sequências de cadeia pesada de ácido nucleico e uma se- quência de ácido nucleico de cadeia leve estão no mesmo vetor.

Em algumas concretizações, os ácidos nucleicos são expressos em uma célula que compreende um ou mais ácidos nucleicos de um vírus.

Em concretizações específicas, o vírus é selecionado de adenovírus, adeno- vírus associado, SV40, vírus Epstein-Barr, um retrovírus, um lentivírus, ba- culovírus, coronavírus, vírus da herpes simplex, poliovírus, vírus de Semliki

. Forest, vírus Sindbis, e vírus de Vaccinia.

As células hospedeiras são células que podem ser transforma- das para expressar um ácido nucleico de interesse.

Em várias concretiza- ções, a transformação inclui mudança do teor de ácido nucleico de uma cé- lulatal que contém ácidos nucleicos exógenos (por exemplo, um ácido nu- cleico não encontrado na célula na natureza, ou uma ou mais cópias adicio- nais de um ácido nucleico correspondente a uma sequência de ácido nuclei- co encontrada na célula na natureza). O teor de ácido nucleico de uma célu- la pode ser mudado por qualquer método adequado conhecido na técnica, por exemplo, por integração do ácido nucleico no genoma da célula ou pela colocação do mesmo na célula uma forma extra-cromossomal ou extra- genômica.

Em algumas concretizações, o teor de ácido nucleico da célula . pode ser mudado tal que a célula transientemente expressa o ácido nucleico de interesse, ou o teor de ácido nucleico pode ser mudado tal que a célula “15 estavelmente expressa o ácido nucleico de interesse.

Em algumas concreti- zações, a mudança no teor genético da célula é herdada quando a célula se divide.

Isolamento da Proteína de ligação de antígeno biespecífica Uma vez que um conjunto adequado de modificações foi sele- cionado baseado na informação aqui, tentativas foram feitas para isolar a proteina de ligação de antígeno biespecífica usando métodos conhecidos na técnica.

Meramente aplicando-se o método publicado não, em toda circuns- tância, proporciona uma separação satisfatória.

Lindhofer et al. produziu um anticorpo biespecífico com uma ca- deia pesada heterodimérica tendo uma cadeia pesada que liga Proteína À (camundongo IgG) e uma cadeia pesada que não liga (rato IgG), e sucessi- vamente separa o anticorpo biespecífico heterodimérico de ra to/camundongo de uma mistura de dímeros de quadroma de camundon- go/camundongo e rato/camundongo com um gradiente de etapa de pH de neutroapH5,8 para eluir o heterodímero e em seguida uma etapa de a pH de 5,8 a 3,5 para eluir o homodímero camundongo/camundongo. (Vide Lin- dhofer et al. (1995). Emparelhamento preferencial de espécies restritas de cadeia pesada/leve em quadromas de rato/camundongo: Implicações para uma purificação de etapa única de anticorpos biespecíficos.

J.

Immunol. i 155(1):219-225). A abordagem de Lindhofer falha quando aplicada a separação deumigG1homodímero de um IgG1 heterodímero tendo duas IgG1 cadeias pesadas que eram idênticas, mas para o fato que um dos domínios de CH3 de IgG3 contém uma modificação de dipeptídeo de H435R/Y436F.

Os inven- tores verificaram que em um gradiente linear de pH, o dipeptídeo-modificado 1gG1 eluiu a cerca de pH 3,9, onde o IgG1 homodímero eluiu a cerca de pH 3,7. Estadiferença de pH foi, de fato, insuficiente para alcançar uma separa- ção satisfatória do heterodímero a partir do homodímero usando o método de Lindhofer.

A diferença não foi reprodutível em uma maneira prognostica- . da.

A variação no comportamento cromatográfico foi observada em “15 cursos cromatográficos que empregam uma resistência iônica relativamente substancial contribuída pela resistência do tampão necessária para manter a etapa ou gradiente de pH particular.

Mas separação satisfatória não foi al- cançada por adição de um modificador orgânico (1-propanol). Ao invés, um tanto surpreendentemente, para alguns cursos cromatográficos a adição de 0,5molara 41,0 molar de modificador iônico (por exemplo, NaCl) aperfeiçoa drasticamente e inesperadamente a separação de homodimérico IgG1 e he- terodimérico IgG1. A adição de modificador iônico amplia a faixa de pH para eluição (1,2 unidades de pH com modificador iônico, mas 0,2 unidade de pH sem modificador iônico) tal que um gradiente de etapa de pH pode bem su- cedidamente separar as duas espécies.

Em outros cursos, contudo, separa- ção satisfatória foi alcançada com concentração de NaCl de somente cerca de 150 mM (vide Exemplo 4). De modo a assegurar que separação satisfató- ria pode ser alcançada, em uma concretização, o isolamento da proteína de ligação de antígeno biespecífica é feito na presença de cerca de 0,5 a cerca de1,0molarde modificador iônico.

Consequentemente, em uma concretização, um método para separação de uma proteína de ligação de antígeno biespecífica compreen-

- dendo um heterodimérico IgG com uma cadeia compreendendo uma modifi- cação conforme aqui descrito, compreende uma etapa de empregar um gra- 1 diente de pH na presença de um modificador iônico.

Em uma concretização, o modificador iônico está presente a uma concentração suficiente para ma- ximizara diferença de pH entre eluição de um suporte de Proteína A de um 1gG homodímero e um IgG heterodímero conforme aqui descrito (isto é, com modificação (ões) de CH3). Em uma concretização específica, o modificador iônico está presente a uma concentração de cerca de 0,5 a cerca de 1,0 mo- lar.

Em outra concretização específica, o modificador iônico está presente a uma concentração de cerca de 0,15 a cerca de 0,5 molar.

Em uma concretização, o modificador iônico é um sal.

Em uma concretização, o modificador iônico é um sal de um metal alcalino ou um me- V tal alcalinoterroso e um halogênio.

Em uma concretização específica, o sal é um sal de cloreto de um metal alcalino ou um metal alcalinoterroso, por e- “15 xemplo, NaCl, KCI, LiCI, CaClz, MgClz.

Em uma concretização específica, o sal está presente a uma molaridade de cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou 1,0. Em uma concretização, o gradiente de pH é de cerca de pH 3,9 a cerca de pH 4,5, em outra concretização de cerca de pH 4,0 a cerca de pH 44,e, em outra concretização, cerca de pH 4,1 a cerca de pH 4,3. Em uma concretização — específica, o gradiente é um gradiente linear.

Em uma concretização, o gradiente de pH é um gradiente de etapa.

Em uma concretização, o método compreende aplicar uma coluna de Proteína A e- quilibrada (equilibrada, por exemplo, em PBS ou outro tampão adequado ou líquido) a uma etapa de cerca de pH 3,9, cerca de pH 4,0, cerca de pH 4,1, cerca de pH 4,2, cerca de pH 4,3, ou cerca de pH 4,4. Em uma concretiza- ção específica, a etapa é cerca de pH 4,2. Em uma concretização, o anticorpo biespecífico compreendendo o heterodimérico IgG domínio de CH3 elui do suporte de Proteína A em uma oumaisfrações substancialmente livres de IgG não heterodimérico.

Em uma concretização específica, a(s) fração (ões) eluída(s) de anticorpo biespeciífi- co compreende(m) menos do que cerca de 1%, 0,5%, ou 0,1% de proteína

- total por peso que é anticorpo não heterodimérico.

EXEMPLOS i Os seguintes exemplos são colocados de modo a descrever à- queles técnicos no assunto como produzir e usar os métodos e composições dainvenção,e não são pretendidos para limitar o escopo do o que os inven- tores relacionam como sua invenção. Esforços foram feitos para assegurar precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, tempe- ratura, etc.), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser conside- rados. A menos que de outro modo indicado, partes são partes por peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígra- dos, e pressão é em ou quase atmosférica. Exemplo 1: Proteína de ligação de antígeno Bi específica IL- . 4Ra/IL-6Ra Foi verificado que dois anticorpos conhecidos de isotipo de I9G1 * 15 humana, um contra IL4Ra e um contra |l -6Ra, têm cadeias leves que dife- rem por somente quatro aminoácidos. Os experimentos de co-expressão revelaram que a cadeia leve do anticorpo anti-IL-4Ra pode ser substituída com a cadeia leve a partir da IL-6Ra, e ainda mantém alta ligação de afini- dade a IL-4Ra, desse modo, tornando praticável produzir um anticorpo bies- pecífico usando a cadeia pesada anti-IL-4Ra e a cadeia pesada anti-IL-6Ra e a mesma cadeia leve. Consequentemente, a cadeia pesada do anticorpo IL-6Ra foi modificada para a forma FCcAAdp (isto é, modificação de dipeptí- deo de CH3 H95R/Y96F, por Numeração de IMGT exon). A cadeia leve anti-|IL-6Ra foi, em seguida, coexpressa com as cadeias pesadas anti-|IL4Ra/Fc e anti-|L6Ra/FcAAdp em células de CHO, e meio condicionado a partir destas células foi submetido a cromatografia de Proteína A. Após carregamento a coluna de Proteína A com sobrenadantes de célula contendo uma mistura de homo- e heterodímeros, a eluição foi rea- lizada com um gradiente de pH de etapa produzido por combinações varian- tesdedoistampões (A: 100 mM de citrato de Na, 150 mM de NaCl, pH 6,0, e B: 100 mM de Citrato de Na, 150 mM de NaCl, pH 3,0; vide figura 4) de modo a produzir três fases a pH 6,0, pH 4,2, e pH 3,0, respectivamente. Na

- figura 4, IL-AR denota anti-IL4Ra, e IL-SRA denota anti-IL-6Ra(IgGIAAdp). Frações de coluna indicadas foram ensaiadas para ligação a proteínas |L- ' 6Ra e ILARa (vide figura 5). Uma eluição de etapa foi feita, dando ocorrên- cia a um pico eluindo a pH 4,2, e um segundo pico a pH 3,0 (figura 4). À análisede BIACORE'"" mostrou que o material de fluxo através pode ligar IL-6Ra solúvel, mas não IL-4Ra, conforme esperado (figura 5). Frações cor- respondentes ao pico de pH 4,2 pode ligar aproximadamente quantidades iguais de IL-6Ra e IL4Ra, consistentes com o heterodímero.

O pico eluindo a pH 3,0 pode ligar somente IL-4Ra, e não IL-6Ra, correspondendo ao espe- rado anti-ll4Ra homodímero.

Isto estabelece que um anticorpo biespecífico heterodimérico pode ser efetivamente isolado usando Cromatografia de Pro- teína A, com um gradiente de etapa de pH simples. ' Exemplo 2: Farmacocinéticas de Proteínas FcEAAdp Para testar se a modificação de FcAAdp afeta as farmacocinéti- * 15 cas de um heterodimérico Fc/FCAAdp contendo molécula, camundongos foram injetados com espécies heterodiméricas purificadas de anti-ll- 4Ra/anti-IL-6Ra descritas acima, e concentrações de imunoglobulina huma- na em soro foram medidas por um período de 28 dias (figura 6; Tabela 1). À meia-vida de soro do heterodímero foi cerca de 10 dias, similar àquela do tipo selvagem.

Isto estabelece que as modificações de FcAAdp não tinha efeito detectável na meia-vida de soro. fármaco Meia-vida testada (Dias) (média. + s.d.) Exemplo 3: Proteína de ligação de antígeno Biespecífica de CD20/CD3 Foi verificado que a cadeia pesada de um anticorpo anti-humano

- de CD20 conhecido, quando coexpressa com a cadeia leve de um anticorpo anti-humano de CD3 (ativação), foi ainda capaz de ligar CD20. A cadeia leve anti-CD3 foi, em seguida, coexpressa com ou uma cadeia pesada anti- CD20/Fc, uma cadeia pesada anti-CD3/FcAAdp, ou ambas cadeias pesa- das. A população misturada resultante de homo- e heterodímeros foi, em seguida, usada em um bioensaio para determinar a capacidade de matar CD20 que expressa células alvos (figura 7). Brevemente, 2 x 107 células humanas de PBMC foram ativadas com 6 x 10” contas de CD3xCD28 (Invi- trogen) por 72 horas. Trinta unidades de I1-2 (R&D Systems) foram, em se- guida, adicionadas, e as células foram incubadas por um adicional de 24 horas. As células foram, em seguida, divididas a uma concentração de 0,5 x 10º/ml. e um adicional de 30U IL-2 adicionado. As células foram, em segui- BR da, incubadas um adicional de 48 horas, e usadas no bioensaio. No dia do bioensaio, 2 x 10º/mL de CD20 expressando células alvos (Raji) foram eti- 7 15 quetadas por 30 minutos com 8uM de calcein-AM (Invitrogen). As células alvos lavadas foram adicionadas às células ativadas de hPBMC à uma pro- porção de 1:10 de células efetuadoras alvos (220.000 células totais por po- ço) em 200 microlitros de volume total com a quantidade indicada de anti- corpo contendo sobrenadante. As células foram incubadas por 2 horas, e o sobrenadante coletado e fluorescência foi quantificada. A citotoxicidade foi medida pelo cálculo da proporção da fluorescência específica à fluorescên- cia máxima. Nem o anticorpo de CD20 sozinho (usando a cadeia leve anti- CD3), nem o anticorpo anti-CD3, podem provocar morte das células alvos; ainda mistura dos dois reagentes não tinha efeito. Contudo, quando todos os três componentes foram coexpressos, morte significante foi observada, indi- cando que o efeito foi devido às espécies biespecíficas heterodiméricas. Ba- seado na quantidade estimada de anticorpo biespecífico no sobrenadante de célula de CHO transientemente transfectada, o EC5o para este efeito foi es- timado para ser cerca de 15 pM.

Exemplo 4: Especificidade de Morte de Célula com Proteína de ligação de antígeno Purificada Biespecífica de CD20/CD3 Sobrenadantes de células de CHO de transfecções, conforme

- descrito no Exemplo 3, foram submetidos a cromatografia de afinidade de Proteína A, utilizando um gradiente de etapa para eluição. O gradiente de ] etapa foi produzido por combinações variantes de dois tampões (A: 20 mM de citrato de Na, 1M de NaCl, pH 5,2; B: 20 mM de citrato de Na, 1M de Na- Cl ,pH2,7)demodo a produzir três fases a pH 5,2, pH 4,2, e pH 2,8, respec- tivamente. A proteína a partir do pico eluindo a pH 4,2 foi, em seguida, usa- da em um ensaio de morte de célula conforme descrito no Exemplo 3. Morte de célula alvo foi observada a um ECso de 3 pM (figura 8). Um ensaio de ci- totoxicidade adicional foi realizado, que examinou a especificidade alvo da morte observada. Neste experimento, células alvos etiquetadas expressando CD20 (Raji), ou sem CD20 (293) foram incubadas PBMCs humanos ativa- dos. Cada tipo de célula alvo foi adicionado ao ensaio ou sozinho ou em .: combinação com células alvos não-etiquetadas do outro tipo. Em todos os casos as células alvos expressando CD20 foram mortas especificamente “15 comum ECs,de3pM, enquanto a linha de célula negativa de CD20 não foi morta.

Exemplo 5: Separação de Proteína A de uma hlgG2 Fc dife- rencialmente modificado IlgG2 Fc/nAdpFc diferencialmente modificados heterodiméricos humanos e uma lIgG2 Fc/Fc não modificada humana homodimérica foram primeiro enriquecidos por um processo liga-e-lava através de uma coluna de proteína A (rProteíina A FF, GE). Para separar adicionalmente hlgG2 Fc/AAdpFc de hlgG2 Fe/Fc, uma eluição de gradiente de etapa foi realizada usando um sistema SMART“ (GE) conforme segue. O sistema de solvente consistiu em solvente A (PBS, 1X), solvente B (20 mM de citrato de sódio e 1 M de NaCl, pH 5,5) e solvente C (20 mM de citrato de sódio e 1M de NaCl, PH 2,5). A eluição começou com uma eluição isocrática com 100% de A nos primeiros 20 min, seguido por uma ligação rápida a 100% de B a 20 min. Um gradiente linear a 33,5% C e 66,5% B foi, em seguida, iniciado sobre os pró- —ximos 10 min; a concentração de 33,5% de C foi mantida por 20 min até a eluição completa do primeiro pico (Fc/AAdpFc). Um gradiente linear de 33,5% C a 100% de C foi seguido por 30 min. A taxa de fluxo foi mantida

- 250 microlitros/min e os cromatogramas foram detectados a 280 nm por um detector de UV.

O hlgG2 Fc/AAdpFc eluiu a pH 4,5, onde o hlgG2 eluiu a pH i 3,5. Exemplo 6: Separação de Proteína A de um hlgG4 Fc Dife- rencialmente modificado lgG4 (Fc/AfdpFc) diferencialmente modificado heterodimérico humano e um IgG4 (Fc/Fc) não modificado homodimérico foram primeiro enriquecidos por um processo liga-e-lava através de uma coluna de proteína A (rProteina A FF, GE). Para separar adicionalmente hlgG4 Fc/AfdpFc de hlgG4 Fce/Fc, uma eluição de gradiente de etapa foi realizada usando um sistema SMART'Y (GE) conforme segue.

O sistema de solvente consistiu em solvente A (PBS, 1X), solvente B (20 mM de citrato de sódio e 1 M de . NaCl, pH 5,1) e solvente C (20 mM de citrato de sódio e 1M de NaCl, pH 2,8). A eluição começou com uma eluição isocrática com 100% de A nos "15 primeiros 20 min, seguido por uma ligação rápida a 100% de B a 20 min.

Um gradiente linear a 50% de C e 50% de B foi, em seguida, iniciado sobre os próximos 10 min; a concentração de 50% de C foi mantida por 20 min até a eluição completa do primeiro pico (Fc/AAdpFc). Um gradiente linear de 50 % de C a 100 % de C foi seguido por 30 min.

A taxa de fluxo foi mantida a 250 microlitros/min e os cromatogramas foram detectados a 280 nm por um de- tector de UV.

O hlgG4 Fc/AdpFc eluiu a cerca de pH 4 onde o homodímero eluiu durante um gradiente de cerca de pH 4 a pH 2,8. Exemplo 7; Separação de Proteína A de um hIigG1 CD3xCD20 Diferencialmente modificado Anti-hcD3xCD20 IgG1 (Fc/AldpFc) diferencialmente modificado heterodimérico e um anti-hCD20 não modificado homodimérico foram sepa- rados em um 1 ml de coluna de rProteína AFF (GE Biosciences) conforme segue.

O sistema de solvente foi tampão A1 (PBS 1X), tampão A2 (20 mM de citrato de sódio e 1 M de NaCl pH 5,1), tampão B (20 mM de citrato de sódioe1M de NaCl pH 2,68). A amostra misturada foi ligada e lavada em PBS e tampão A2. Uma etapa foi usada para alcançar um pH de 4,2, que eluiu CD3*xCD20 IgG1 (Fc/AAdpFc) biespecífico, em seguida um gradiente

- linear de pH 4,2 a pH 2,8 eluiu o anti-hCD20 IgGI homodimérico.

Exemplo 8: Afinidade de ligação de CH3s Modificados a Re- : ceptores Fc A afinidade de ligação de um anticorpo biespecífico de isotipo IlgG1 humano tendo a modificação AAdp (H435R e Y436F, Numeração de EU) a uma variedade de receptores de Fc humanos foi testada em um en- saio de ligação de equilíbrio de estado constante BiacoreÃ.

Brevemente, um chip de dextran carboximetilatado (CM5) tendo ' uma amina-acoplada anti-penta-his mAb (Qiagen) foi usado para capturar vários construtos de receptores Fc humanos.

Os seguintes ectodomínios de receptor Fc his-etiquetado foram ligados às superfícies de chips anti-penta- his-revestido CM5 diferentes: FcyRI, FCcyRIIA (polimorfo R131), FoyRIIB, e ' FCYRHIB (cada obtido de R&D Systems); e polimorfo RCyRIIA (H131), poli- morfo FcyRIIIA (V176), e RCYRIHA (PoLIMORFO F176) (cada produzido em "15 Regeneron). Anticorpos foram passados sobre a superfície em três concen- trações para o ectodomínio de receptor de alta afinidade FcyR1 (25 nM, 50 NM, e 100 nM), e em entre 5 micromolar a 39 nanomolar para os ectodomí- nios de receptor de baixa afinidade FcyR, e valores de constantes de taxa de associação e dissociação (k, e ka) foram determinados e usados para calcu- larconstantes de dissociação de equilíbrio (Kps) para os anticorpos.

Estudos de ligação foram realizados à temperatura ambiente usando tampão HBS-T a pH 7,2 Kps foram determinadas para um anticorpo de controle (hmAb), um anti-CD20, e modificação de anti-CD3Adp, e um anticorpo biespecífico CD20xCD3Adp.

Valores de Kp para o anticorpo anti-CD3Adp revelaram ne- —nhuma diferença significante na ligação a qualquer dos receptores de Fc testados conforme comparado com anticorpos de isotipo não modificados Tabela 2). hFeR pm [sm [a [Gm Ts |

Continuação... | : lFavrme = | 3700 | 117% | sw | 6520 | Exemplo 9: Farmacocinéticas de um higGIAAdp Biespeciífi- co em Camundongos hFcRn A taxa de folga de farmacocinética de anticorpo biespecífico anti- hCcD3/hCD20 IgG1 AAdp e seus anticorpo relacionado a controles (anti- hCD3 IgG e anti-hCD3 IgGAAdp homodímero) foram determinados em (WT) camundongos tipo selvagem e camundongos homozigotos por uma substitu- ição de camundongo FcRn com um gene de hFcRn (camundongos hFcRn). . Camundongos tipo selvagem e hFcRn foram de cepas geradas de cruza- mento com um antecedente contendo C57BL6 (75%) e 129Sv (25%). Os grupos contêm 4 cada de ou camundongos WT ou hFcRn, exceto no caso de um grupo de camundongos WT que recebe um anticorpo de controle e- quiparado isotipado em que o grupo contém 3 camundongos.

Os camun- dongos receberam 1 mg/kg de um controle equiparado de isotipo (hlgG1), 15 . ant-hCD3xCD20 IgGIAAdp biespecífico, anti-hCD3 IgG1, ou anti-hCD3 Ig- GIAAdp homodímero.

Todos os artigos testados foram administrados subcu- taneamente.

Sangrias foram coletadas a Oh, 6h, 1d, 2d, 3d, 4d, 7d, 10d, 14d, 21d, e 30d.

Os níveis de soro de anticorpos humanos foram determinados poruma ELISA intercalada.

Brevemente, um anticorpo de cabra policional anti-humano IgG (Fc-específico) (Jackson ImmunoResearch) foi revestido em placas de 96 poços a uma concentração de um micrograma/mL e incu- bado durante a noite a 4º C.

Após as placas serem bloqueadas com BSA, amostras de soro em diluições em série de seis doses e padrões de referên- ciados respectivos anticorpos em diluições de série de 12 doses foram adi- cionadas à placa e incubadas por uma hora à temperatura ambiente.

Após

- lavagem para remover anticorpo não ligado, anticorpos humanos capturados foram detectados usando o mesmo anticorpo de cabra policlonal anti- Ú humano IgG (Fc-específico) conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson ImmunoResearch), e desenvolvido por substrato de tetra- metilbenzidina (TMB) colorimétrico padrão de acordo com a recomendação do fabricante.

A absorvência a 450 nm foi registrada em uma leitora de pla- ca, e a concentração de hlgG em amostras de soro foi calculada usando a curva padrão de referência gerada na placa de amostra.

Nenhuma diferença significante foi observada na meia-vida de soro dos quatro anticorpos de IgG1 sobre o período testado de 30 dias.

Em particular, não existe diferença significante observada entre anticorpos de 1gG1 tendo a modificação de AAdp e anticorpos tipo selvagem de IgG1. Ne- . mhuma diferença entre os anticorpos foi observada com, ou camundongos tipo selvagem (mFcRn), ou camundongos tendo um FcRn humanizado (hF- 715 cRn). Conforme esperado, camundongos hFcRn exibiram uma folga leve- mente mais rápida do que camundongos tipo selvagem.

Os resultados são mostrados na Tabela 3. Tabela 3. Parâmetro de PK Médio Estimado após Injeção Subcutânea em Camundongos Genótipo do jAnticorpo *-Tnax AUC Camundongo (mcg/mL) ((hr)(meg/mL)) mFeRn lcpaaadpando | a | 117418 | 1553323402 | hFeRn lcoaxcDao —| 4 | 1232098 | 832+186 | Exemplo 10: Isolamento em Larga Escala em Baixo Tampão deSal

- Um anticorpo biespecífico CD3xCD20AAdp foi isolado de acordo com a invenção de uma cultura de larga escala.

Brevemente, uma linha de ' célula de CHO-KI expressando um anticorpo biespecífico anti- hCcD3xCD20AAdp (modificação na cadeia pesada de CD3) foi cultivada em um bioreator de 11 litros.

As células suportando o anticorpo biespecífico cresceram a uma densidade de cerca de 8,25 x 106 células/mL, produzindo cerca de 250-350 mg de anticorpo/L.

Em contraste, um anticorpo de controle anti-hCD3 produziu cerca de 100-150 mg/L.

O anticorpo foi isolado em uma resina MabSelect SuRe8 (GE) (20 cm de altura de leito, 1 cm de DI) equilibrada com 10 mM de fosfato de sódio, 0,5 M de NaCl, pH 7,2, cultura de célula clareada carregada a 19 g/L, e a coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de 10 mM de fosfato de só- : dio, 0,5 M de NaCl, pH 7,2, seguido por uma lavagem de 2 volumes de colu- na de 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,2 (no NaCl). O anticorpo foi eluído * 15 com40mM de acetato, pH 3,0. O anticorpo mono-específico anti-CD30 eluiu a pH 3,6, onde o biespecífico anti-hCD3xCD20DAdp eluiu a pH 4,4 Exemplo 11: Eluição Seletiva de Proteína A de Camundongo Heterodímeros com pH Selvagem Células de CHO-K1 foram transientemente transfectadas com construtos de expressão para domínio extracelular de IFNAR1 humano (hIFNARI) e IFNAR2 humano (MFNAR2) fundido com um tipo selvagem ou um mutante (TTTK ou PTTK) mlgG2a Fc.

A proporção entre hIFNAR1I-mFc e hlFNAR2-mFc foi mantida a 1:1 por transfecção de células com quantidades iguais de dois plasmídeos de expressão.

O meio de cultura foi coletado 4 dias após transfecção e submetido a purificação de Proteína A usando 0,2 ml de colunas de rotação de NAb Proteína A Plus& (Thermo Scienti- fic/Pierce). Brevemente, as colunas foram equilibradas com 1x PBS, pH 7,2. Um mi de meio de cultura de CHO-K1 foi incubado com a resina de Proteína A por10 minutos à temperatura ambiente.

As colunas foram, em seguida, lavadas três vezes com 1x PBS, pH 7,2. As proteínas ligadas foram eluídas com 20 mM de tampão de citrato de sódio contendo 1M de NaCl.

Três elui-

- ções foram efetuadas usando 0,4 mL de tampão de eluição com pH diminuí- do.

As proteínas nas frações diferentes foram detectadas por análise de Á mancha de Western.

Os resultados mostram que com eluição de gradiente de pH, é possível separar heterodímeros de tipo selvagem e mutante estrela mlgG2a de homodímeros de mlgG2a tipo selvagem (vide fração E1 em ambos géis da figura 9). Exemplo 12: Formação Preferencial de Heterodímero de Mu- tantes de mlgG2a sobre Heterodímeros de Isotipo Plasmídeos de DNA foram construídos para expressão de ma- miífero dos domínios extracelulares de receptores de interferon tipo | humano (hIFNARI e hiIFNAR2) com C-terminal camundongo Fc (mlgG2a ou mIgG1). : Mutações na sequência de mlgG2a foram introduzidas usando mutagênese direcionada de local.

Os mutantes são TTT = M252T, S254T, S256T; TTTK "15 =M252T,S254T, S256T, 1258K; PITTK = 1247P, M252T, S254T, S256T, 1258K; RF = H435R, H436F.

Células CHO-K1 foram transientemente trans- fectadas com os construtos de expressão.

A proporção entre IFNAR1-mFc e IFNAR2-mFc foi mantida a 4:1 por transfecção das células com 4 vezes mais plasmídeo de expressão de hiIFNAR1-mFc (hlFNAR1-migG2a) do que hiF- NAR2-mFc (mIlgG1 ou mutante mlgG2a). O meio de cultura foi coletado 4 dias após transfecção e mFc proteínas foram detectadas por análise de mancha de Western.

O resultado mostra que formação de heterodímero entre mlgG2a e mlgG1 é muito menos eficiente do que entre mlgG2a tipo selvagem e mu- tantes de mlgG2a (comparar raia 1 às raias 2 a 5 da figura 10). Uma propor- ção de 4:1 IFNAR1 construto:!FNAR2 construto foi usada para manter um excesso de construto de IgG2a tipo selvagem no experimento.

Claims (21)

1. REIVINDICAÇÕES : 1. Proteína de ligação de antígeno biespecífica que é heterodi- | mérica com relação à ligação à Proteína A, caracterizada pelo fato de que compreende: a. um primeiro polipeptídeo compreendendo, de N-terminal a C- terminal, uma primeira região de ligação de epitopo que se liga seletivamen- te a um primeiro epitopo, uma região constante de imunoglobulina que com- preende uma primeira região de CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1, IgG2, e IgGA4, em que a primeira região de CH3 liga-se a proteína A; e b. um segundo polipeptídeo compreendendo, de N-terminal a C- terminal, uma segunda região de ligação de epitopo que se liga seletivamen- te a um segundo epitopo, uma região constante de imunoglobulina que com- preende uma segunda região de CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1, IgG2, e IgG4, no qual a segunda região de CH3 compreende uma mo- dificação que reduz ou elimina à ligação da segunda região de CH3 à Prote- Ína A.
2. 2. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada pelo fato de que o primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo são cadeias pesadas de IgG humana.
3. 3. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma cadeia leve de imunoglobulina.
4. 4. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 3, carac- terizada pelo fato de que a cadeia leve de imunoglobulina é uma cadeia leve deimunoglobulinahumana.
5. 5. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada pelo fato de que os primeiro e segundo polipeptídeos são cada ca- deias pesadas de IgGl humana.
6. 6. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 1, carac- terizada pelo fato de que a modificação é selecionada a partir do grupo con- sistindo em (a) 95R, e (b) 95R e 96F no sistema de numeração IMGT exon, ou (a') 435R, e (b') 435R e 436F no Sistema de numeração EU.
7. Í 7. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 86, carac- : terizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma a cinco modifica- ções selecionadas a partir do grupo consistindo em 16E, 18M, 44S, 52N, 57M, e 821 no sistema de numeração IMGT exon, ou 356E, 358M, 3848, 392N,397M,e422|no sistema de numeração EU.
8. 8. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 6, carac- terizada pelo fato de que a região de CH3 do anticorpo biespecífico é não imunogênico ou substancialmente não imunogênico em um humano.
9. 9. Proteína biespecífica, de acordo com a reivindicação 7, carac- terizada pelo fato de que a região de CH3 do anticorpo biespecífico é não imunogênico ou substancialmente não imunogênico em um humano.
10. 10. Método para produção de um anticorpo biespecífico que é heterodimérico com relação à ligação à Proteína A, caracterizado pelo fato de que compreende: a. obtenção de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma primeira cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um primeiro domínio variável que reconhece um primeiro epitopo, no qual a primeira ca- deia pesada de imunoglobulina compreende uma primeira região de CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1, IgG2, e IgG4, em que a primeira re- giãodeCH3 liga-se a proteina A; b. obtenção de uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica uma segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo um segundo domínio variável que reconhece um segundo epitopo, no qual a segunda cadeia pesada de imunoglobulina compreende uma segunda região de CH3 de uma IgG humana selecionada de I9G1, IgG2, e IgG4, no qual a segunda região de CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina | a ligação do segunda região de CH3 à Proteína A; | c. obtenção de uma terceira sequência de ácido nucleico que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina que emparelha com a primeira e asegunda cadeia pesada de imunoglobulina; d. introdução das primeira, segunda e terceira sequências de á- cido nucleico em uma célula de mamífero;

    . 3/4 |) e. permitir que a célula expresse um anticorpo biespecífico; e, Ú f. isolamento do anticorpo biespecífico baseado na capacidade . do anticorpo biespecífico se ligar à Proteína A.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lofatode que a modificação é selecionada a partir do grupo consistindo em (a) 95R, e (b) 95R e 96F no sistema de numeração IMGT exon, ou (a') 435R, e (b') 435R e 436F no sistema de numeração EU.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que compreende adicionalmente uma a cinco modificações sele- cionadas a partir do grupo consistindo em 16E, 18M, 448, 52N, 57M, e 821 no sistema de numeração IMGT exon, ou 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, e 422! no sistema de numeração EU.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe- lo fato de que a região de CH3 do anticorpo biespecífico é não imunogênico ousubstancialmente não imunogênico em um humano.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe- lo fato de que a região de CH3 do anticorpo biespecífico é não imunogênico ou substancialmente não imunogênico em um humano.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pe- lofatode que o anticorpo biespecífico é isolado em um suporte sólido com- preendendo Proteína A.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pe- lo fato de que o suporte sólido compreende uma coluna de afinidade de Pro- teina A, e o anticorpo biespecífico é isolado empregando um gradiente de pH
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pe- lo fato de que o gradiente de pH é um gradiente de etapa compreendendo uma ou mais etapas de pH entre pH 3 e pH5.
18. 18. Método para isolamento de um anticorpo biespecífico que é — heterodimérico com relação à ligação à Proteína A, caracterizado pelo fato de que compreende: isolamento de uma célula rompida ou uma mistura de anticorpos

    : 4/4 ' de um anticorpo biespecífico compreendendo uma região constante de ca- i deia pesada tendo domínios de CH3 IgG1, IgG2, ou IgG4 diferencialmente modificados, no qual os domínios de CH3 IgG1, IgG2, ou IgG4 diferencialmen- temodificados compreendem uma primeira região de CH3 que liga-se a Pro- teina A e uma segunda região de CH3 compreendendo uma modificação que reduz ou elimina a ligação do segunda região de CH3 à Proteína A, no qual os domínios de CH3 diferencialmente modificados são não imunogênico ou substancialmente não imunogênico em um humano, e em que o anticorpo biespecífico é isolado a partir da célula rom- pida ou da mistura baseada em sua afinidade para Proteína A.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe- | lo fato de que um monômero da região constante de cadeia pesada é uma | IgG1 humana, e o outro monômero da região constante de cadeia pesada é uma lgG1 humana modificada compreendendo na segunda região de CH3 uma modificação selecionada a partir do grupo consistindo em (a) H95R, e (b) H95R e Y96F no sistema de numeração IMGT exon, ou (a') H435R, e (b") H435R e Y436F no sistema de numeração EU.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pe- lo fato de que a IgG1 humana modificada compreende adicionalmente na segunda região de CH3 uma modificação selecionada a partir do grupo con- sistindo em D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82! no sistema de nume- ração IMGT exon, ou D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422| no sistema de numeração EU.
21. 21. Invenção, em qualquer forma de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou de uso, ou de uso para preparar um medicamento, ou de com- posição, ou de kit englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.