KR20160141879A - 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체 - Google Patents

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Abstract

CH3 도메인에서 다르게 변형된 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하며, 다른 변형은 CH3 변형에 대해 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이고, 변형 중 적어도 하나는 단백질 A와 같은 친화성 시약에 대해 이중특이성 항체에 대한 다른 친화도를 초래하고, 이중특이성 항체는 분열된 세포, 배지, 또는 단백질 A에 대한 친화도를 기반으로 한 항체들의 혼합물로부터 분리할 수 있는, 각각의 분리를 제공하는 이중특이성 항체가 제공된다.

Description

천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체{READILY ISOLATED BISPECIFIC ANTIBODIES WITH NATIVE IMMUNOGLOBULIN FORMAT}
본 발명은 중쇄, 즉, 적어도 하나의 아미노산에 의해 차이가 생기는 2개의 면역글로불린 중쇄의 헤테로다이머를 가지며, 면역글로불린 중쇄와 변형 또는 돌연변이된 면역글로불린의 다른 친화도를 기반으로 친화성 시약에 대해 항원-결합 단백질을 분리시키는 항원-결합 단백질 또는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 단백질 A에 IgG 영역의 다른 결합으로써 빨리 분리시키는, 단백질 A에 대해 다른 친화도를 가지는 IgG CH2 및 CH3 영역을 가지는 항원-결합 단백질(이중특이성 항체를 포함)에 관한 것이다.
항체들은 표적 항원에 대해 독특한 결합 특이성뿐만 아니라 항원-의존적인 메커니즘을 통해 면역계와 상호작용하는 능력을 전달하는 다기능성 분자이다. 암에 대해 현재 사용되는 다수의 생물학적 치료제는 표적 암 세포에서 일반적으로 과발현된 항원에 대해 지시된 단클론성 항체들이다. 이러한 항체들이 종양 세포들에 결합할 때, 그것들은 항체 의존성 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 촉발시킨다. 불행하게도, 암 세포들은 종종 이 정상 면역 반응을 억제하는 메커니즘을 발현시킨다.
최근에, 하나 이상의 항원 결합 특이성, 예를 들어, 이중특이성 항체를 가지는 항체-유사 치료제를 개발하기 위한 노력이 진행중이다. 암 치료의 경우에, 다중-특이적 포맷은, 예를 들어 분자를 종양 세포 항원에 대해 표적화하는 하나의 특이성, 면역계에서 정상적으로 이용가능하지 않은 반응을 촉발시키는 다른 특이성을 사용하는 가능성을 허용할 수 있었다. 또한 이중특이성 항체가 2개의 구성요소에 결합하고 합쳐질 때, 그것의 천연 리간드에 의해 정상적으로 활성화된 2-구성요소 헤테로다이머 수용체 시스템에 대한 대리 리간드로서 용도를 발견할 수 있다.
수많은 포맷들이 다중 결합 특이성을 가지는 분자들에 의해 얻어진 치료 기회들을 다루는 기술분야에서 개발되었다. 이상적으로, 이러한 분자들은 바람직한 생체내 특성, 예를 들어, 의도된 목적에 대해 적절한 약물동태학, 최소의 면역원성, 및 원한다면 통상적인 항체의 이펙터 작용을 만들고, 정제하고 소유하는데 용이한 제대로 거동하는 단백질이어야 한다.
이중특이성 항체(단일 세포에서 2개의 별개의 항체들을 발현시킴)를 만드는 가장 간단한 방법은, 각각의 중쇄가 호모- 및 헤테로다이머 둘 다를 형성하기 때문에 다수의 종이 생기게 하는 것이지만, 단지 헤테로다이머만 요망된다. 또한, 경쇄와 중쇄는 부적합하게 짝지을 수 있다. 이 문제들을 다른 방법으로 처리하도록 시도하는 포맷의 몇몇 예가 하기에서 설명된다.
이중특이성 T 세포 인게이저(Bispecific T cell Engager, BiTE) 분자에 대해 사용된 한 포맷(예를 들어, Wolf, E. et al. (2005) Drug Discovery Today 10:1237-1244) 참조)은 단일 사슬 가변 단편(scFv) 모듈을 기반으로 한다. 유연한 링커를 통해 융합된 항체의 경쇄와 중쇄 가변 영역을 구성하는 scFv는 일반적으로 적절하게 접힐 수 있고, 따라서 영역들은 동족항원을 결합할 수 있다. BiTE는 단일 사슬 상에서 세로 일렬로 다른 특이성의 두 scFv를 연결한다(도 1A 참조). 이 배치는 동일한 중쇄 가변 영역의 2 복제물을 가지는 분자의 생성을 방해한다. 게다가, 링커 배치는 각각의 경쇄 및 중쇄의 정확한 짝지음을 보장하도록 설계된다.
BiTE 포맷은 몇몇 단점을 가진다. 우선, scFv 분자들은 덩어리화하는 경향으로 악명높다. 그리고 평판에 의하면 scFv 링커의 면역원성이 낮지만, BiTE에 대해 항체를 생성하는 가능성이 제외될 수 없다. BiTE 포맷에서 Fc 부분의 부재는 또한 그것의 혈청 반감기를 매우 짧게 만들고, 이것은 빈번한 반복 투여 또는 펌프를 통한 지속적인 주입의 복잡화를 필요로 한다. 최종적으로, Fc의 부재는 또한 Fc-매개 이펙터 기능이 없음을 암시하는데, 이것은 일부 상황에서 유리할 수 있다.
제2 포맷(도 1B)은 마우스와 래트 단클론성 항체의 혼성체이고, 통상적인 단백질 A 친화도 크로마토그래피의 변형에 의존한다(예를 들어, Lindhofer, H. et al. (1995) J. Immunol. 155:219-225) 참조). 이 포맷에서, 마우스 IgG2a 및 래트 IgG2b 항체는 동일 세포 중에서 함께 만들어진다(예를 들어, 두 하이브리도마의 항체생산융합세포(quadroma)로서, 또는 유전자 조작된(engineered) CHO 세포에서). 각 항체의 경쇄가 바람직하게는 그것의 동일계통 종류의 중쇄와 결합되기 때문에, 항체의 단지 3개의 별개의 종: 2개의 모 항체, 및 Fc 부분을 통해 결합하는 각각 하나의 중쇄/경쇄 쌍을 포함하는 두 항체들의 헤테로다이머가 조립될 수 있다. 원하는 헤테로다이머는 이 혼합물로부터 용이하게 정제될 수 있는데, 단백질 A에서 그것의 결합 특성이 모 항체의 특성과 다르기 때문이다: 래트 IgG2b는 단백질 A에 결합하지 않는 반면, 마우스 IgG2a는 결합한다. 결과적으로, 마우스-래트 헤테로다이머는 단백질 A에 결합하지만, 마우스 IgG2a 호모다이머보다 더 높은 pH에서 용리하고, 이는 이중특이성 헤테로다이머의 선택적인 정제를 가능하게 한다. BiTE 포맷과 같이, 이 혼성체 포맷은 2개의 1가 항원 결합 자리를 가진다.
마우스/래트 혼성체의 단점은 그것이 비-인간이라는 점인데, 그것은 해로운 부작용을 가지고(예를 들어, "HAMA" 또는 "HARA" 반응), 및/또는 치료제를 중화할 수 있는 면역 반응을 환자에게서 유발할 가능성이 있다.
"노브-인투-홀(knobs-into-holes)" (도 1C)로서 언급되는 제3 포맷은 이중특이성 항체의 생성에 잠재적으로 유용한 선행기술로서 논의되었다(미국 특허 번호 7,183,076). 이 전략에서, 2 항체들의 Fc 부분은 유전자 조작되어 하나의 돌출된 "노브(knob)"를 제공하고, 나머지는 상보적인 "홀(hole)"을 제공한다. 동일 세포에서 만들어질 때, 유전자조작된 "노브"와 유전자조작된 "홀"의 결합에 의해 중쇄는 호모다이머보다 헤테로다이머를 우선적으로 형성하는 것으로 언급된다. 정확한 경-중쇄 짝지음의 문제는 다른 특이성을 가지지만 동일한 경쇄를 사용하는 항체들을 선택함으로써 처리된다.
이 포맷의 단점은 "노브-인투-홀" 전략이 상당한 양의 원치않는 호모다이머의 생성을 초래할 수 있고, 따라서 추가 정제 단계를 필요로 한다는 것이다. 이 어려움은 오염 종들이 다수의 그것의 특성들에서 요망되는 종들과 거의 동일하다는 사실에 의해 악화된다. 유전자 조작된 형태는 또한 잠재적으로 면역원성일 수 있는데, "노브" 및 "홀"을 만드는 돌연변이가 외래 서열을 도입하기 때문이다.
특히 치료 용도를 위해 상기 언급된 단점들의 일부 또는 모두를 최소화하는 이중특이성 항체 포맷에 대한 필요가 남아있다.
본 발명은 이중특이성 항원-결합 단백질에서 적어도 하나의 아미노산에 의해 차이가 생기는 2개의 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 영역 서열을 사용하는 것을 적어도 부분적으로 기반으로 한다. 적어도 하나의 아미노산 차이는 단백질을 분리하는 개선된 능력을 초래하는데, 차이가 친화성 약제에 결합하는 CH3 도메인 서열의 다른 능력을 야기하기 때문이다.
한 양태에서, 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 단백질이 제공되며, 제1 폴리펩티드는 N-말단 내지 C-말단, 제1 항원에 선택적으로 결합하는 제1 항원-결합 영역, 그 다음에 IgG1 (SEQ ID NO:1), IgG2 (SEQ ID NO:3), IgG4 (SEQ ID NO:5), 및 그것의 조합으로부터 선택된 인간 IgG의 제1 CH3 영역을 포함하는 불변 영역을 포함하고; 제2 폴리펩티드는 N-말단 내지 C-말단, 제2 항원에 선택적으로 결합하는 제2 항원-결합 영역, 그 다음에 IgG1, IgG2, IgG4, 및 그것의 조합으로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 영역을 포함하며, 제2 CH3 영역은 단백질 A에서 제2 CH3 도메인의 결합을 감소 또는 제거하는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의해 435R)을 포함한다. 다른 구체예에서, 제2 CH3 영역은 96F변형(IMGT; EU에 의해 436F)을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 제2 CH3 영역은 SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, 및 SEQ ID NO:6으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형은 인간 IgG1 (SEQ ID NO:2)로부터 나오고, D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I (IMGT; EU에 의해 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I)로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 인간 IgG2 (SEQ ID NO:4)로부터 나오고, N44S, K52N, 및 V82I(EU에 의해 IMGT; N384S, K392N, 및 V422I)로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 영역은 변형된 인간 IgG4 (SEQ ID NO:6)으로부터 나오고, Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, 및 V82I (EU에 의해 IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I)로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 추가로 포함한다.
한 구체예에서, CH3 도메인은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 및 인간 IgG4 중 2이상의 서열을 포함하는 키메라 도메인이다.
한 구체예에서 CH3 도메인은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 또는 인간 IgG4으로부터 나오고, 항원-결합 단백질은 CH1 도메인 및 CH2 도메인을 추가로 포함하며, CH1 도메인 및 CH2 도메인은 인간 IgG1 CH1 또는 CH2 도메인, 인간 IgG2 CH1 또는 CH2 도메인, 또는 키메라 인간/인간 IgG1/IgG2 또는 키메라 인간/인간 IgG1/IgG3 또는 키메라 인간/인간 IgG2/IgG3 도메인 또는 키메라 인간/인간 IgG1/IgG4 또는 키메라 IgG3/IgG4 또는 키메라 IgG2/IgG4 도메인으로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, 키메라 IgG1/IgG2, IgG1/IgG3, IgG2/IgG3, IgG1/IgG4, IgG3/IgG4, 및 IgG2/IgG4 도메인은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 면역글로불린 경쇄를 추가로 포함한다. 한 구체예에서, 면역글로불린 경쇄는 인간 람다 및 인간 카파 경쇄로부터 선택된다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 항원-결합 영역 각각은 적어도 하나의 CDR(complementarity determining region)을 포함하고, 다른 구체예에서, 적어도 2개의 CDR 각각은 3개의 CDR을 포함한다. 특정 구체예에서, CDR은 면역글로불린 중쇄로부터 나온다. 다른 특정 구체예에서, 중쇄는 인간 중쇄이다.
한 구체예에서, 제1 항원-결합 영역은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 제2 항원-결합 영역은 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 원숭이, 유인원 및 인간 도메인으로부터 독립적으로 선택된다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 인간 CDR, 마우스 CDR, 래트 CDR, 토끼 CDR, 원숭이 CDR, 유인원 CDR, 및 인간화된 CDR을 독립적으로 포함한다. 한 구체예에서, CDR은 인간이고, 체세포 돌연변이된다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 인간 골격 영역(FR)을 포함한다. 한 구체예에서, 인간 FR은 체세포 돌연변이된 인간 FR이다.
한 구체예에서, 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역은 관심의 항원에 대해 각각 항체 가변 영역을 포함하는 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어진다. 다른 구체예에서, 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역은 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 또는 유인원과 같은 비-인간 동물을 관심의 항원으로 면역화하고, 관심의 항원에 대해 특이적인 가변 영역을 암호화하는 항체 가변 영역 핵산 서열을 확인함으로써 얻어진다. 특정 구체예에서, 비-인간 동물은 하나 이상의 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 다른 특정 구체예에서, 하나 이상의 인간 면역글로불린 가변 영역 유전자는 내인성 면역글로불린 좌위에서 치환체로서, 또는 비-인간 동물의 게놈으로 무작위로 통합된 전이유전자(transgene)로서 비-인간 동물 염색체 외에서 존재한다. 한 구체예에서, 제1 및/또는 제2 항원-결합 영역은 하이브리도마 또는 항체생산융합세포로부터 얻어지고, 다른 구체예에서, 세포 선별(cell sorting)을 사용하여 면역화된 비-인간 동물의 면역 세포를 스크리닝하는 것으로부터 얻어진다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 이중특이성 항체이다. 한 구체예에서, 이중특이성 항체는 완전한 인간 이중특이성 항체이고, 독립적으로 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위에서 각 에피토프에 대한 친화도를 가진다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이다. 특정 구체예에서, 항원-결합 단백질은 비-천연 인간 T-세포 에피토프가 없다. 한 구체예에서, CH3 영역의 변형은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이다. 특정 구체예에서, CH3 영역의 변형은 비-천연 인간 T-세포 에피토프를 초래하지 않는다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 중쇄를 포함하며, 중쇄는 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이다. 한 구체예에서, 중쇄는 비-천연 T-세포 에피토프를 함유하지 않는 아미노산 서열을 가진다. 한 구체예에서, 중쇄는 아미노산 서열을 포함하는데, 이것의 단백질 분해는 인간에서 면역원성인 약 9개의 아미노산의 아미노산 서열을 형성할 수 없다. 특정 구체예에서, 인간은 항원-결합 단백질로 처리된 인간이다. 한 구체예에서, 중쇄는 아미노산 서열을 포함하는데, 이것의 단백질 분해는 인간에서 면역원성인 약 13 내지 약 17개의 아미노산의 아미노산 서열을 형성할 수 없다. 특정 구체예에서, 인간은 항원-결합 단백질로 처리된 인간이다.
한 양태에서, 본원에서 설명되는 바와 같은 CH2 및/또는 CH3를 포함하는 이중특이성 결합 단백질이 제공되며, 이중특이성 결합 단백질은 B 세포 상에서 항원을 특이적으로 인식하는 제1 결합 모이어티, 및 T 세포 상에서 항원을 특이적으로 인식하는 제2 결합 모이어티를 포함한다.
한 구체예에서, 결합 단백질은 이중특이성 항체이다. 특정 구체예에서, 이중특이성 항체는 인간 IgG1 중쇄 및 인간 IgG1△Adp 중쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 제1 결합 모이어티는 CD20을 특이적으로 인식하는 인간 중쇄 가변 도메인이다. 한 구체예에서, 제2 결합 모이어티는 CD3를 특이적으로 인식하는 인간 중쇄 가변 도메인이다. 한 구체예에서, 이중특이성 항체는 약 2.8-3.2 x 10-12 M, 또는 약 2.8-3.0 x 10-12 M의 Raji 사멸 분석에서 EC50을 나타내고, 방관자 세포 사멸 분석에서 단지 약 1-10%, 또는 1-5%의 방관자 사멸을 나타내며, 방관자 세포는 CD20 에피토프를 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, 방관자 세포는 293 세포이다. 다른 특정 구체예에서, 분석에서 방관자 세포 사멸은 약 10-8 M 내지 약 10-14 M의 이중특이성 항체의 농도에 걸쳐 측정된다.
한 양태에서, 이중특이성 항체를 만드는 방법이 제공되며, 다음을 포함한다: 제1 에피토프를 인식하는 제1 가변 도메인을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 얻는 단계, 제1 면역글로불린 중쇄는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형 불변 도메인, 또는 그것의 키메라 이소형 불변 도메인을 포함한다; 제2 에피토프를 인식하는 제2 가변 도메인을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 제2 핵산 서열을 얻는 단계, 제2 면역글로불린 중쇄는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형 불변 도메인, 또는 그것의 키메라 이소형 불변 도메인을 포함하며, 단백질 A에 결합을 근절 또는 감소시키는 그것의 CH3 도메인의 변형을 포함한다; 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄와 짝짓는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 제3 핵산 서열을 얻는 단계; 제1, 제2 및 제3 핵산 서열을 포유동물 세포에 도입하는 단계; 세포를 면역글로불린으로 발현시키는 단계, 및 단백질 A를 사용하여 면역글로불린을 분리하는 단계.
한 구체예에서, 세포는 바이러스 핵산 서열을 발현시키는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 망막세포로부터 선택된다(예를 들어, PERC.6™ 세포).
한 양태에서, 이중특이성 항원-결합 단백질은 항원에 결합하는 제1 특이성 및 수용체를 활성화하는 제2 특이성을 포함하여 제공되며, 이중특이성 항원-결합 단백질은 단백질 A-결합 결정소를 포함하는 제1 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 CH3 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 단백질 A-결합 결정소가 없는 제2 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 CH3 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, 제2 특이성은 수용체가 몰, 밀리몰, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 가지는 수용체와 결합하는 것을 활성화한다.
한 구체예에서, 제2 특이성은 G-단백질 커플링된 수용체, 수용체 티로신 키나아제, 인테그린, 및 톨-유사 수용체(toll-like receptor)로부터 선택되는 수용체에 결합한다.
한 구체예에서, 제2 특이성은 수용체와 접촉하고, 세린, 트레오닌, 또는 티로신의 포스포릴화를 책임지는 그것과 물리적으로 결합된 수용체 또는 서브유닛 또는 단백질을 야기하고; 뉴클레오티드의 고리화(예를 들어, cAMP, cADP, 또는 cGMP)를 야기하고; 포스파티딜이노시톨 또는 그것의 유도체(예를 들어, IP3 또는 PIP3)의 생성을 야기하고; 지질 제2 메신저(예를 들어, 디아실글리세롤, 세라마이드, 리소포스파티드산, 에이코사노이드)의 생성을 야기하고; 탈인산화를 야기하고(예를 들어, 포스파타아제 활성); 지질의 인산화를 야기하여 제2 메신저를 형성하고; 제2 메신저의 가수분해를 야기하고; 단백질 분해를 야기하고; 산화환원 신호전달을 야기하고; 세포소기관에(예를 들어, 핵에) 단백질의 전좌를 야기하고; (그 자체로) 응집하여 호모-를 형성하거나 또는 (다른 수용체와 함께) 응집하여 헤테로멀티머를 형성하는 수용체를 야기하고; 또는 막관통 채널의 열림 또는 닫힘을 야기한다.
한 양태에서, 이중특이성 항체를 만드는 방법이 제공되며, 하기를 포함한다: 항체생산융합세포로부터 관심의 이중특이성 항체를 분리하는 단계, 관심의 이중특이성 항체는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형인 제1 중쇄, 단백질 A에 결합을 근절 또는 감소시키는 그것의 CH3 도메인에서 변형을 포함하는 불변 도메인을 가지는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형인 제2 중쇄를 포함하며, 관심의 이중특이성 항체는 단백질 A를 사용하여 분리된다.
한 양태에서, 이중특이성 항체를 만드는 방법이 제공되며, 파쇄된 세포 또는 항체들의 혼합물로부터 다르게 변형된 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 CH3 도메인을 가지는 이중특이성 항체를 분리하는 단계를 포함하고, 다르게 변형된 CH3 도메인은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이고, 변형은 모노머가 단백질 A에 대해 다른 친화도를 가지는 헤테로다이머 중쇄가 있는 이중특이성 항체를 초래하고, 이중특이성 항체는 단백질 A를 사용하여 파쇄된 세포 또는 혼합물로부터 분리된다.
한 구체예에서, 이중특이성 항체는 단백질 A 친화성 지지체를 사용하여 분리되며, 이중특이성 항체는 약 3.9 내지 약 4.4, 약 4.0 내지 약 4.3, 약 4.1 내지 약 4.2, 또는 약 pH 4.2의 pH에서 용리한다. 한 구체예에서, 이중특이성 항체는 약 4, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 또는 4.5의 pH에서 용리한다.
한 구체예에서, 이중특이성 항체는 단백질 A 친화성 지지체 및 pH 구배 또는 단계를 사용하여 분리되며, pH 구배 또는 단계는 이온 변경제를 포함한다. 특정 구체예에서, 이온 변경제는 약 0.5 내지 약 1.0 몰의 농도에서 존재한다. 특정 구체예에서, 이온 변경제는 염이다. 한 구체예에서, 이온 변경제는 아세트산베릴륨, 아세트산리튬, 아세트산나트륨, 및 아세트산칼륨; 탄산수소나트륨 및 탄산수소칼륨; 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨 및 탄산세슘; 염화리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화세슘, 및 염화마그네슘; 플루오르화나트륨 및 플루오르화칼륨; 질산나트륨, 질산칼륨 및 질산칼슘; 인산나트륨 및 인산칼륨; 및 황산칼슘 및 황산마그네슘으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 이온 변경제는 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 할로겐화물 염이다. 특정 구체예에서, 이온 변경제는 염화나트륨이다.
한 양태에서, 결합 단백질을 Fc를 포함하며, Fc는 본원에서 설명되는 바와 같이 변형되는 제1 CH3 도메인 및 비변형 제2 CH3를 포함하여, 헤테로다이머 Fc를 형성하고, 다른 변형은 다른 변형이 없는 대응하는 결합 단백질보다 더 높은 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.2, 1.3, 또는 1.4 pH 단위(들)에서 단백질 A 친화성 물질로부터 용리하는 결합 단백질을 초래한다.
한 구체예에서, 다르게 변형하는 결합 단백질은 약 4.2의 pH에서 용리하는 반면, 비변형 결합 단백질은 약 3의 pH에서 용리한다. 한 구체예에서, 다르게 변형된 결합 단백질은 약 4.5의 pH에서 용리하는 반면, 비변형 결합 단백질은 약 3.5의 pH에서 용리한다. 한 구체예에서, 다르게 변형된 결합 단백질은 약 4의 pH에서 용리하는 반면, 변형된 결합 단백질은 약 2.8-3.5, 2.8-3.2, 또는 2.8-3의 pH에서 용리한다. 한 구체예에서, 다르게 변형된 결합 단백질은 약 4.2의 pH에서 용리하는 반면, 비변형 결합 단백질은 약 2.8의 pH에서 용리한다. 한 구체예에서, 다르게 변형된 결합 단백질은 약 4.4의 pH에서 용리하는 반면, 비변형 결합 단백질은 약 3.6의 pH에서 용리한다. 이 구체예에서, "비변형"은 CH3 도메인 둘 다에서 435 (EU 넘버링)에서 변형이 없거나, 또는 435 및 436 (EU 넘버링)에서 변형이 없는 것을 말한다.
본원에서 설명되는 임의의 구체예 및 양태는 달리 표시되거나 또는 문맥으로부터 명백하지 않다면 서로 함께 사용될 수 있다. 다른 구체예는 다음의 설명의 검토로부터 당업자에게 명백할 것이다.
도 1은 3개의 이중특이성 항체 포맷을 도시한다: (A) 이중특이성 T 세포 인게이저(BiTE); (B) 마우스-래트 혼성체; 및, (C) 통상의 경쇄를 갖는 노브-인투-홀.
도 2는 Fc△Adp 변형을 도시한다: (A) 박스표시의 Fc△Adp 변형을 나타내는 인간 IgG1 (SEQ ID NO:1) 및 IgG3 (SEQ ID NO:3)의 Fc 영역의 정렬; (B) Fc△Adp 이중특이성 항체의 도식적 표시.
도 3은 IgG3뿐만 아니라 △Adp 디펩티드 변형이 있는 IgG1, IgG2, 및 IgG4 및 △Adp 디펩티드 변형이 없는 IgG1, IgG2, 및 IgG4의 인간 CH3 도메인의 정렬(IMGT 엑손 넘버링 및 EU 넘버링을 사용)을 도시한다.
도 4는 단계 구배를 이용하는 용리 프로필을 나타내는, 이중특이성 항체의 분리를 위한 단백질 A 컬럼 추적을 나타낸다.
도 5는 도 4에서 나타낸 크로마토그래피 분리로부터 용리된 컬럼 분획의 IL4-Ra 및 IL-6Ra BIACORE™ 결합 프로필을 나타낸다. 분획 중의 항체들을 고정된 항-Fc 항체로 포획한 다음, 가용성 IL-4Ra 또는 IL-6Ra를 포획 항체들에 결합을 위해 분석하였다.
도 6은 Fc△Adp 이중특이성 항체(IL-6R△/IL-4R), Fc△Adp 호모다이머(IL-6R△/IL-6R△), 야생형 CH3 서열을 갖는 IgG1 항체(IL-4R/IL-4R), 및 대조군 단일특이성 항체의 약물 동력학 프로필을 나타낸다.
도 7은 Raji 세포 사멸 분석에서 CD20xCD3△Adp 이중특이성 항체의 효능을 도시한다.
도 8은 CD20xCD3△Adp 이중특이성 항체에 의한 방관자 세포(bystander cell)(293) 사멸 분석을 도시한다.
도 9는 다른 mFc 헤테로다이머를 사용하는 발현 실험에 대한 결과를 나타낸다. 패널 A: 호모다이머 mIgG2a 및 호모다이머 IgG2aPTTTK로부터 헤테로다이머 mIgG2a/mIgG2aPTTTK의 pH 분리의 웨스턴 블롯; 패널 B: 호모다이머 mIgG2a 및 호모다이머 IgG2aTTTK로부터 헤테로다이머 mIgG2a/mIgG2aTTTK의 pH 분리의 웨스턴 블롯; IP = 투입(input); FT = 플로우 스루(flow through); W2 = 제2 세척 (1x PBS pH 7.2); E1 = 제1 용리 (20 mM Na 시트레이트, 1 M NaCl pH 5.5); E2 = 제2 용리(20 mM Na 시트레이트, 1 M NaCl; 57% pH 5.5 + 43% pH 2.6); E3 = 제3 용리 (20 mM Na 시트레이트, 1 M NaCl pH 2.6).
도 10은 4:1의 IFNAR1 구성체:IFNAR2 구성체 비율을 사용하여 혼합된 이소형(예를 들어, mIgG2a 및 mIgG1)의 헤테로다이머의 형성 이상의 돌연변이 IgG2a의 헤테로다이머의 우선적인 형성을 도시한다. 레인 1: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG1; 레인 2: INFAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aTTT; 레인 3: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aTTTK; 레인 4: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aPTTTK; 레인 5: IFNAR1-IgG2a:IFNAR2-IgG2aRF.
본 발명의 특정 방법, 및 이러한 방법으로서 설명된 실험 조건에 제한되지 않고, 조건은 다를 수 있다. 또한 본 발명의 범주는 특허청구범위에 의해 정의되기 때문에, 본원에서 사용되는 전문용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 목적으로 이해되어야 하고, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 설명되는 것과 유사 또는 동일한 어떤 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료는 현재 설명된다. 언급된 모든 간행물은 참고로써 여기에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 이황화결합에 의해 서로-연결된 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 상보적 결정 영역(CDR)으로 칭해지는 과변이 영역으로 더 세분되고, 골격 영역(FR)로 칭해지는 더 보존된 영역들과 함께 배치될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 정렬된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3로서 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3로서 약칭될 수 있다). 용어 "고 친화성" 항체는 그것의 표적에서 적어도 10-9 M, 적어도 10-10 M; 적어도 10-11 M; 또는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어 BIACORE™ 또는 용해-친화도 ELISA에 의해 측정되는 바와 같이 적어도 10-12 M의 결합 친화도를 가지는 항체들을 말한다.
어구 "항원-결합 단백질"은 적어도 하나의 CDR을 가지는 단백질 및 선택적으로 항원을 인식할 수 있는, 즉 적어도 마이크로몰 범위에 있는 KD를 가지는 항원에 결합할 수 있는 것을 포함한다. 치료용 항원-결합 단백질(예를 들어, 치료용 항체들)은 나노몰 또는 피코몰 범위에 있는 KD를 빈번하게 요구한다. "항원-결합 단백질"은 또한 본원에서 설명되는 바와 같은 제1 및 제2 CH3를 포함하는 단백질 및 제1 단백질 또는 리간드 인식 도메인 및 제2 단백질 또는 리간드 인식 도메인을 포함하며, 제1 단백질 또는 리간드 인식 도메인 및 제2 단백질 또는 리간드 인식 도메인 각각은 독립적으로 동일한 단백질 또는 리간드를 인식하고, 또는 함께 동일한 단백질 또는 리간드를 인식하고, 또는 각각 독립적으로 다른 단백질 또는 리간드를 인식한다. 이러한 단백질의 한 예는 융합 단백질(헤테로- 또는 호모-) 다이머를 포함하는 면역부착소이며, 다이머의 폴리펩티드는 수용체 구성요소 또는 리간드 구성요소를 포함하는 융합 폴리펩티드이고, 리간드 구성요소는 수용체와 결합하는 아미노산 서열을 포함한다.
어구 "이중특이성 항체"는 2이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 2개의 다른 중쇄를 포함하는데, 각각의 중쇄는 2개의 다른 분자(예를 들어, 항원) 상에서 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원) 상에서 다른 에피토프와 특이적으로 결합한다. 이중특이성 항원이 2개의 다른 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있다면, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화도, 및 그 반대의 경우보다 더 낮은 적어도 10 내지 102 또는 103 또는 104일 것이다. 이중특이성 항체에 의해 인식된 에피토프는 동일 또는 다른 표적에 있을 수 있다(예를 들어, 동일 또는 다른 단백질). 이중특이성 항체는, 예를 들어 동일 항원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄를 합함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 동일 항원의 다른 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 다른 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열들은 면역글로불린 경쇄를 발현시키는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이성 항체는 2개의 중쇄를 가지는데 각각은 3개의 중쇄 CDR을 가지고, 이어서(N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 가지며, 면역글로불린 경쇄를 가지는데, 면역글로불린 경쇄는 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각각의 중쇄에 연결될 수 있고, 또는 각각의 중쇄에 연결될 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 하나 이상의 에피토프를 결합할 수 있거나, 또는 중쇄에 연결될 수 있고 하나 또는 둘 다의 에피토프에 중쇄 중 하나 또는 둘 다를 결합할 수 있다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현시키는데 적당한 임의의 세포이다. 세포는 원핵 및 진핵세포(단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포(예를 들어, E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염 곤충 세포, Trichoplusia ni 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 예를 들어, 하이브리도마 또는 항체생산융합세포와 같은 세포 융합의 세포들을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵세포이고, 다음의 세포들로부터 선택된다: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막세포, 베로, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, L cell, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수세포, 종양 세포, 및 앞서 언급한 세포로부터 유래된 셀라인. 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현시키는 망막세포를 포함한다(예를 들어, PER.C6™ 세포).
어구 "상보적 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하며, 이는 보통(즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역(예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)에서 2개의 골격 영역 사이에서 나타난다. CDR은, 예를 들어 생식세포 서열 또는 재배열된 서열 또는 재배열되지 않은 서열에 의해, 그리고 예를 들어, 천연 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. 일부 환경에서(예를 들어, CDR3에 대해), 예를 들어 서열의 스플라이싱 또는 접합의 결과로서(예를 들어, V-D-J 재조합으로 중쇄 CDR3을 형성), CDR은 연속적이지 않지만(예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) B 세포 핵산 서열에서 연속적인 2 이상의 서열에 의해 암호화될 수 있다.
어구 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체로부터 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하고, 달리 특정되지 않는다면 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 달리 특정되지 않는다면 중쇄 가변 도메인은 3개의 중쇄 CDR과 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 그것의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 다음의 가변 도메인(N-말단으로부터 C-말단), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 가진다. 중쇄의 기능적 단편은 항원을 특이적으로 인식할 수 있고(예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위에서 KD를 가지는 항원을 인식), 즉, 세포로부터 발현 및 분비될 수 있고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.
어구 "Fc-함유 단백질"은 항체, 이중특이성 항체, 면역부착소, 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 최소한의 기능적 부분을 포함하는 다른 결합 단백질을 포함한다. "기능적 부분"은 Fc 수용체와 결합할 수 있고(예를 들어, FcγR; 또는 FcRn, 즉, 신생아 Fc 수용체), 및/또는 상보체의 활성에 참여할 수 있는 CH2 및 CH3 영역에 관한 것이다. CH2 및 CH3 영역이 임의의 Fc 수용체와 결합할 수 없도록 하고, 또한 상보체를 활성화 시킬 수 없도록 하는 결실, 치환, 및/또는 삽입 또는 다른 변형을 함유한다면, CH2 및 CH3 영역은 기능적이지 않다.
Fc-함유 단백질은 면역글로불린 도메인의 변형들을 포함할 수 있으며, 변형은 결합 단백질의 하나 이상의 이펙터 기능에 영향을 미치는 것을 포함한다(예를 들어, FcγR 결합, FcRn 결합에 영향을 미치고 따라서 반감기, 및/또는 CDC 활성에 영향을 미치는 변형). 이러한 변형은, 제한되는 것은 아니지만, 면역글로불린 불변 영역의 EU 넘버링에 대해 하기의 변형 및 그것의 조합을 포함한다: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 및 439.
예를 들어, 제한하지 않고, 결합 단백질은 Fc-함유 단백질이고, (열거된 변형(들) 없이 동일한 Fc-함유 단백질과 비교하여) 향상된 혈청 반감기를 나타내고, 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들어, L 또는 F)에서 변형; 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T), 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T); 또는 428 및/또는 433 (예를 들어, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, H/F 또는 Y)에서 변형; 또는 250 및/또는 428에서 변형; 또는 307 또는 308 (예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서 변형을 가진다. 다른 예에서, 변형은 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및428L 변형(예를 들어, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형(예를 들어, 308F 또는 308P)를 포함할 수 있다.
어구 "이온 변경제"는 단백질 사이의 비-특이적(즉, 비-친화성) 이온 상호작용의 효과를 감소시키거나 또는 비-특이적 이온 상호작용을 방해하는 모이어티를 포함한다. "이온 변경제"는 예를 들어, I족과 II족 금속과 아세트산염, 중탄산염, 탄산염, 할로겐(예를 들어, 염소 또는 불소), 질산염, 인산염 또는 황산염의 염, 이온성 조합을 포함한다. "이온 변경제"의 비-제한적 예시 열거는 아세트산베릴륨, 아세트산리튬, 아세트산나트륨, 및 아세트산칼륨; 탄산수소나트륨 및 탄산수소칼륨; 탄산리튬, 탄산나트륨, 탄산칼륨 및 탄산세슘; 염화리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화세슘, 및 염화마그네슘; 플루오르화나트륨 및 플루오르화칼륨; 질산나트륨, 질산칼륨 및 질산칼슘; 인산나트륨 및 인산칼륨; 및 황산칼슘 및 황산마그네슘을 포함한다. "이온 변형제"는 pH 구배 또는 단계에 첨가 시, 또는 "이온성 변경제"에서 단백질 A 지지체의 평형화 및 pH 단계 또는 구배의 적용시, 이온성 상호작용에 영향을 미쳐서, 호모다이머 IgG와 헤테로다이머 IgG(예를 들어, 본원에서 설명되는 CH3 도메인의 하나 이상의 변형을 함유하는 야생형 IgG 및 동일한 IgG)의 용리 사이의 pH 단위 거리의 넓어짐을 초래하는 모이어티를 포함한다. "이온 변경제"의 적당한 농도는 최대 pH 거리가 주어진 pH 단계 또는 pH 구배에 도달될 때까지 "이온 변경제"의 농도를 증가시키면서 동일한 컬럼, pH 단계 또는 구배를 사용하는 그것의 농도에 의해 결정될 수 있다.
어구 "경쇄"는 임의의 유기체로부터 면역글로불린 경쇄 불변영역을 포함하고, 달리 특정되지 않는다면 인간 카파 및 람다 경쇄를 포함한다. 달리 특정되지 않는다면 경쇄 가변(VL) 도메인은 전형적으로 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 골격(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로 전장 경쇄는 아미노 말단으로부터 카르복실 말단까지 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 VL 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 본 발명와 함께 사용될 수 있는 경쇄는, 예를 들어 항원-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 또는 제2 항원 중 하나와 선택적으로 결합하지 않는 것을 포함한다. 적당한 경쇄는 존재하는 항체 라이브러리(습식 라이브러리 또는 인실리코)에서 가장 흔히 사용된 경쇄에 대해 스크리닝함으로써 확인될 수 있는 것을 포함하며, 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 도메인의 친화도 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않는다. 적당한 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 또는 둘 다와 결합할 수 있는 것을 포함한다.
어구 "마이크로몰 범위"는 1-999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도되고; 어구 "나노몰 범위"는 1-999 나노몰을 의미하는 것으로 의도되고; 어구 "피코몰 범위"는 1-999 피코몰을 의미하는 것으로 의도된다.
어구 "체세포 돌연변이된"은 종류 변환(class-switching)을 받은 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 기준을 포함하며, 종류 변환된 B 세포에서 면역글로불린 가변 영역의 핵산 서열은(예를 들어, 중쇄 가변 도메인 또는 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는 것), 예를 들어 종류 변환을 받지 않은 B세포와 종류 변환을 받은 B 세포 사이의 CDR 또는 골격 핵산 서열의 차이와 같이, 종류 변환 전 B 세포에서 핵산 서열과 동일하지 않다. "체세포 돌연변이된"은 친화도-성숙되지 않은 B 세포에서 대응하는 서열(즉, 생식세포 세포의 게놈 중의 서열)과 동일하지 않은 친화도-성숙된 B 세포로부터의 핵산 서열에 대한 기준을 포함한다. 어구 "체세포 돌연변이된"은 또한 관심의 항원에 B 세포의 노출 후 B 세포로부터 핵산 서열에 대한 기준을 포함하며, 핵산 서열은 관심의 항원에 B 세포의 노출 전 대응하는 핵산 서열과 다르다. 어구 "체세포 돌연변이된"은 동물, 예를 들어 항원 시험감염에 응하여, 인간 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 가지는 마우스에서 발생되고, 이러한 동물에서 선천적으로 작동하는 선택 과정을 초래하는 항체로부터의 서열을 말한다.
어구 "가변 도메인"은 N-말단으로부터 C-말단의 서열에서(달리 지시되지 않는다면), 다음의 아미노산 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄(원하는 대로 변형)의 아미노산 서열을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "가변 도메인"은 이중의 베타 시트 구조를 가지는 표준이 되는 도메인(VH 또는 VL)으로 폴딩될 수 있는 아미노산 서열을 포함하며, 베타 시트는 제1 베타 시트와 제2 베타 시트 사이의 이황화 결합에 의해 연결된다.
변형된 IgG CH3 영역을 가지는 이중특이성 항체들
본 발명자들은 인간 항체 구성요소와 함께 사용될 수 있는 선택적인 단백질 정제 계획을 통상의 경쇄 전략과 조합하는 새로운 포맷을 개발하였다.
이것은 이전부터 주목되었는데(Lindhofer, H. et al. (1995) J. Immunol. 155:219-225)), 인간 IgG3가 단백질 A에 결합하지 않고, 잠재적으로 마우스-래트 혼성체에 대해 사용된 것과 유사한 정제 전략에서 다른 3가지의 인간 IgG 하위분류 중 어떤 것과 함께 사용될 수 있기 때문이다. 그러나, 모든 4가지의 인간 IgG 하위분류의 서열이 매우 상동성이지만, 용이하게 IgG1, IgG2, 및 IgG4의 Fc 부분이 IgG3와 헤테로다이머를 형성하는 법은 알려져 있지 않았고; 단지 호모다이머의 우선적인 형성조차도 특정 환경하에서(예를 들어, 항체생산융합세포로부터의 분리) 요망되는 헤테로다이머의 전체 수율에 부정적인 영향을 가졌다. 추가적인 변형이 또한 IgG3의 힌지 영역과 다른 하위분류의 영역 사이의 차이점을 보상하는데 필요할 수 있다. 또한, 일부 환경에서, 이펙터 작용에서 잠재적인 충격 때문에 완전한 IgG3 Fc의 존재를 필요로 하지 않는 것이 바람직하다.
따라서 본 발명자들은 우연히 단백질 A 결합의 간단한 결정소를 이용하는 "최소의" 포맷을 고안하였다. 이것은 단백질 A에 결합하기 위한 IgG3의 불능이 단일 아미노산 잔기, Arg435 (EU 넘버링; IMGT에 의해 Arg95)에 의해 결정되고, 다른 IgG 하위분류에서 대응하는 위치는 히스티딘 잔기에 의해 점유된다는 것을 보고하였다(Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34)). 그러므로, IgG3 대신 His435가 Arg으로 돌연변이된 IgG1 서열을 사용하는 것이 가능하다. 따라서, IgG1에서 하나의 점 돌연변이는 새로운 정제 계획을 처리할 수 있는 다른 결합 친화도를 만들기에 충분해야 한다. 이 변형은 단백질 A에 결합하는 그것의 불능을 나타내는 IgG1△A로서 언급될 것이다(유사하게 IgG2△A 및 IgG4△A - 또는 더 일반적으로, Fc△A).
그러나, 특정된 점 돌연변이는 잠재적으로 면역원성일 수 있는 돌연변이를 가로지르는 새로운 펩티드 서열을 도입한다. 점 돌연변이는, 이론적으로 MHC 클래스 II 분자에 부하되고, T 세포에서 존재할 수 있고, 결과적으로 면역 반응을 일으킬 수 있다. 이 위험을 피하기 위해, 디펩티드 돌연변이, H435R/Y436F (EU 넘버링; IMGT에 의해 H95R/Y96F)가 사용될 수 있다. 변경 근처에서 결과 서열은 IgG3와 동일하고(도 2A 참조), 따라서 면역적으로 "보이지 않는" 것으로 기대되는데, T 세포에 대한 제공방식을 위해 이용가능한 비-천연의 짧은 펩티드가 아니기 때문이다. 이 이중 돌연변이체는 여전히 단백질 A와 결합하지 않는 것으로 보고되었다(Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34). 최종적으로, 디펩티드 돌연변이는 Fc 다이머 계면을 형성하는 임의의 잔기를 포함하지 않고, 따라서 헤테로다이머의 형성과 상호작용할 가능성이 없다. 이 디펩티드 돌연변이는 "IgG1△Adp" (및, 유사하게는 IgG2△Adp, IgG4△Adp, 및 Fc△Adp)로서 지정된다. IgG1, IgG2, 및 IgG4에서 디펩티드 변형의 배치는 IMGT 엑손 넘버링 및 EU 넘버링을 나타내는, hIgG3뿐만 아니라 야생형 인간 IgG CH3 도메인 서열을 나타낸 IgG1△Adp, IgG2△Adp, 및 IgG4△Adp을 의미하는 서열로 도 3에서 표시된다.
Fc△Adp 변형은 Fc 다이머 계면을 형성하는 것으로 믿어지는 임의의 잔기를 포함하지 않고, 따라서 Fc△Adp 변형은 헤테로다이머의 형성을 방해할 가능성이 없다. Fc△Adp이 매우 적기 때문에, 다른 유전자 조작된 Fc 형태에도 마찬가지로 포함될 수 있다. IgG2△Adp 및 IgG4△Adp는 각각의 후자와 연결된 이펙터 작용이 요망되는(또는 그것이 없는) 상황에서 유리할 수 있다.
요약해서, 상기 설명한 이중특이성 항체 포맷은 동일한 경쇄를 사용하는 다른 특이성의 2 항체를 포함하며, 그것들 중 하나의 Fc 영역은 Fc△Adp 포맷으로 변형된다(도 2B 참고). 그것의 배치는 천연 인간 항체의 배치이고, 따라서 낮은 응집 경향, 생체내 안정성, 최소의 면역원성, 항체와 유사한 생체 내 분포 특성, 양호한 약물동력학, 및 선택적으로 이펙터 작용을 포함하는 그것의 유리한 특성을 공유하여야 한다. 이러한 이중특이성 항체를 분리하는 방법은 실행에서 상대적으로 빠르고 단순하게 제공된다.
변형된 마우스 IgG CH 영역을 가지는 이중특이성 결합 단백질
본 발명자들은 CH3 도메인에서 하나 이상의 아미노산에 대해 헤테로다이머인 면역글로불린 중쇄(또는 그것의 기능성 CH2 및 CH3-함유 단편)를 포함하는 결합 단백질을 용이하게 분리하는 방법을 고안하였다. 마우스 IgG CH 도메인의 변형의 주의깊은 선택 및 특정 분리 기술의 적용은 변형을 함유하지 않는 호모다이머 및 헤테로다이머로부터 2가지의 다르게 변형된 마우스 CH 영역을 포함하는 결합 단백질을 용이하게 분리하는 능력을 부여한다.
247에서 프롤린, 252, 254, 및 256에서 트레오닌, 및 258에서 리신을 함유하는 마우스 IgG1은 단지 단백질 A와 약하게 결합한다. 그러나 마우스 IgG2a 및 IgG2b는 그 위치에서 다른 잔기들을 함유하고(IgG2b 위치 256 및 258은 제외), 마우스 IgG2a 및 2b는 단백질 A에 잘 결합한다. 중쇄에 대해 헤테로다이머인 항체를 만드는 방법에서 2개의 마우스 IgG의 CH 영역을 다르게 변형시키는 것은 이러한 항체에서 다른 단백질 A 결합 특성을 부여한다. 이런 방법으로, 다른 단백질 A 분리 계획은, IgG1의 호모다이머(단백질 A에 단지 매우 약하게 결합한다 해도) 또는 마우스 IgG2a의 호모다이머, 마우스 IgG2b의 호모다이머, 또는 IgG2a/IgG2b의 헤테로다이머이든 아니든, 임의의 마우스 IgG 호모다이머로부터 변형된 헤테로다이머의 용이한 분리를 허용하도록 고안되었다. 예를 들어, 2개의 다른 중쇄 가변 도메인을 가지지만 동일한 이소형, 예를 들어 IgG2a를 가지는 이중특이성 항체는 중쇄 서열을 사용하는 적당한 발현 시스템에서 발현될 수 있으며, IgG2a CH 영역 중 하나 만이 단백질 A 결합 결정소를 감소 또는 제거하기 위해 변형된다. 이 방법에서, IgG2a CH 영역 중 단지 하나는 단백질 A에 대해 실질적인 친화도를 나타낼 것이고, 비변형 IgG2a 및 변형 IgG2a의 다이머로부터 형성된 어떤 항체는 변형된 헤테로다이머로부터 용이하게 분리될 것이다.
다양한 구체예에서, 항체에서 Fc 다이머의 하나의 CH 영역이 변형된 CH 영역을 포함하는 반면, Fc 다이머의 나머지 CH는 그것들이 없다. 마우스 IgG CH 영역은 252T, 254T, 및 256T; 252T, 254T, 256T, 및 258K; 247P, 252T, 254T, 256T, 및 258K; 435R 및 436F; 252T, 254T, 256T, 435R, 및 436F; 252T, 254T, 256T, 258K, 435R, 및 436F; 24tP, 252T, 254T, 256T, 258K, 435R, 및 436F; 및 435R로 구성되는 군으로부터 선택되는 특정 위치(EU 넘버링)에서 특정 아미노산을 포함하도록 변형된다. 특정 구체예에서, 변형의 특정 기는 M252T, S254T, S256T; M252T, S254T, S256T, I258K; I247P, M252T, S254T, S256T, I258K; H435R, H436F; M252T, S254T, S256T, H435R, H436F; M252T, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; I247P, M252T, S254T, S256T, I258K, H435R, H436F; 및 H435R로 구성되는 군으로부터 선택되어 만들어진다.
헤테로다이머 마우스 IgG-기반 결합 단백질은 다양한 용도를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 그것들은 마우스 불변 도메인을 가지는 이중특이성 항체들을 분리하는 방법을 허용하며, 변형들은 하나 이상의 마우스 Fc 수용체에 항체의 결합을 방해하지 않거나 또는 실질적으로 방해하지 않아서, 항체는 예를 들어 ADCC 또는 CDC에 참여할 수 있고, 또는 동일 또는 다른 표적에서 2 이상의 에피토프와 결합할 수 있다.
한 양태에서, 결합 단백질을 분리하는 방법은 제1 마우스 IgG CH 영역 및 제2 마우스 IgG CH 영역을 포함하며, 제1 IgG CH 영역은 제1 마우스 IgG CH 영역의 단백질 A 결합 친화도를 감소 또는 제거하기 위해 변형되지만, 제2 마우스 IgG CH 영역은 그렇지 않고, 결합 단백질은 제1 에피토프에 결합하는 제1 결합 모이어티 및 제2 에피토프에 결합하는 제2 결합 모이어티를 포함한다.
한 구체예에서, 변형은 Fc 수용체에서 결합 단백질의 결합 친화도를 변경하지 않거나 또는 실질적으로 변경하지 않는다. 한 구체예에서, 결합 단백질은 결합 단백질의 Fc 수용체에 대한 친화도를 증가 또는 감소시키는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 변형이 없는 대응하는 결합 단백질과 비교하여, 변형은 천연 마우스 FcγR 수용체 및/또는 천연 마우스 FcRn을 포함하는 마우스에서 결합 단백질의 혈청 반감기를 변경하지 않거나 또는 실질적으로 변경하지 않는다.
한 구체예에서, 변형이 없는 대응하는 결합 단백질과 비교하여, 변형은 천연 마우스 고친화도 및 저친화도 FcγR 수용체 및/또는 FcRn 수용체의 치환을 포함하는 마우스에서 결합 단백질의 청 반감기를 변경하지 않거나 또는 실질적으로 변경하지 않는다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 에피토프는 다르고, 다른 세포 상 또는 다른 단백질 상에 있다. 한 구체예에서, 제1 에피토프 및 제2 에피토프는 다르고, 동일 세포 또는 동일 단백질 상에 있다.
한 구체예에서, Fc 수용체는 고친화도 Fc 수용체, 저친화도 Fc 수용체, 및 FcRn으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, Fc 수용체는 마우스 FcRn, 마우스 FcγR, 마우스 FcγRIIB, 마우스 FcγRIII, 마우스 FcγRIV, 및 그것의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, Fc 수용체는 인간 FcRn, 인간 FcγR, 인간 FcγRIIB, 인간 FcγRIIC, 인간 FcγRIIIB, 인간 FcγRIIIA, 인간 FcγRIIA, 및 그것의 조합 중 하나 이상으로부터 선택된다.
면역원성
본 발명의 많은 구체예 중 하나의 이점은 단백질 A에 다른 결합을 기반으로 용이하게 분리가능하고, 또한 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성인 이중특이성 항체를 만드는 변형(들)을 사용하는 능력이다. 이 특징은 이러한 구체예들을 인간 치료 용도를 위한 이중특이성 항체를 만들고, 예를 들어, 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성인 면역부착소를 만드는데 특히 유용하다(인간 결합 모이어티, 즉 인간 수용체 구성요소 및/또는 인간 리간드를 사용). 이 특징은 IgG1, IgG2, 및 IgG3의 H95R/Y96F (IMGT 넘버링) 변형이 있는 CH3 도메인, 및 다른 IgG 이소형의 야생형 서열을 반영하여 변형된 위치를 초래하는 추가 변형을 함유하는 CH3 도메인을 가지는 이중특이성 항체와 관련된다. 따라서, 변형이 특정 IgG 이소형과 사실상 관련되는 것이 발견되지 않았지만, 변형된 서열은 다른 IgG 이소형의 야생형과 국소적으로 동일하고, 변형은 면역원성 또는 실질적으로 면역원성이 될 것으로 기대되지 않는다. 또한 변형은 그것의 서열인 임의의 천연 서열과 국소적으로 동일하지 않을지라도 비-면역원성일 수 있고; 이러한 변형은 동일하게 유용하다. 따라서 비-면역원성이라면, 최소의 점 돌연변이 H95R (IMGT 넘버링)은 본 발명의 적당한 구체예가 된다.
따라서 이중특이성 항체는 그것의 중쇄 불변 도메인에 대해 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이지만, 친화성 시약(예를 들어 단백질 A)에 대해 중쇄 불변 도메인의 다른 친화도를 초래하는 변형을 포함하는 중쇄 불변 도메인의 하나 이상의 다른 변형을 함유한다. 변형은 본원에서 개시되는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, CH3 도메인에 대해 인간에서 비-면역원성이거나 또는 실질적으로 비-면역원성이며, 다르게 변형된 중쇄를 가지는 이중특이성 항체는 다음의 변형들 중 하나를 포함하는 CH3 도메인을 포함하는 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4이다(또는 다른 구체예에서, 본질적으로 다음의 변형들 중 하나로 구성된다): H95R, 또는 H95R 및 Y96F (IMGT 넘버링).
이중특이성 항체들은 인간에 대해 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성이 되는 것으로 기대되며, 인간 IgG1, IgG2, 및 IgG4 이소형태에 대한 내성은 어떤 상당한 정도로 파괴되지 않았다.
특히, Fc△Adp 변형은 면역적으로 "보이지 않는" 것으로 예상되는데, MHC 클래스 II 분자의 결합 그루브가 T 세포 수용체의 가변 루프에 의해 인식되는 주 결정소를 포함하는 9-mer를 수용하고, 따라서 임의의 천연 9-mer 하위서열이 없는 펩티드는 면역 반응을 유발할 가능성이 없기 때문이다. 그러나, 9-mer보다 긴 펩티드(보통 약 13- 내지 17mer)는 MHC 클래스 II에 의해 결합되고, 돌출 세그먼트는 잠재적으로 결합에 영향을 미칠 가능성이 있다. 따라서, 더 긴 비-천연 서열을 제거하는 (Fc△Adp 변형 이상의) 추가 변형은 면역원성에 대한 가능성을 추가로 감소시킬 수 있다. 한 특정 예는 변형 V422I (EU; IMGT 넘버링에 의해 V82I)이며, 이는 IgG1△Adp에서, 그리고 유사하게 한정된 IgG2△Adp의 43 잔기에서 14 내지 39의 최소의 비-천연 펩티드의 길이로 연장한다. 다른 예는 IgG4△Adp에서 변형 L445P (EU; IMGT 넘버링에 의해 L105P)이며, 이는 10 내지 14개의 잔기의 길이로 연장한다.
약물동력학
단백질 A에 대한 결합 자리는 신생아 Fc 수용체, FcRN에 대한 결합 자리와 중복되는데, 이것은 면역글로불린에 연장된 혈청 반감기를 부여하는 것을 초래하는 것으로 생각된다. 따라서 단백질 A 결합 자리의 부근의 변형은 본원에서 제안된 포맷이 IgG1, 2, 및 4의 혈청 반감기보다 더 짧은 혈청 반감기를 가질 수 있었다는 가능성을 만들며, 인간 IgG3는 다른 IgG 하위분류(약 21일)보다 더 짧은 혈청 반감기(약 7일)를 가지도록 주어진다. His435에 영향을 미치는 일부 Fc 돌연변이체는 FcRN에 결합하지 않고, 마우스에서 더 짧은 반감기를 가지는 것으로 나타났다. 그러나, 약물동력학 분석은 IgG1△A/IgG1 헤테로다이머의 혈청 반감기가 IgG1 호모다이머의 혈청반감기와 눈에띄게 다르지 않다는 것을 나타내었다(실시예 2 참조). 따라서, IgG1△Adp 돌연변이는 단백질 A 결합을 제거하는 한편, 여전히 IgG1의 더 긴 반감기를 보존하는 이점을 가진다.
따라서, 한 구체예에서, 이중특이성 항원-결합 단백질은 본원에서 설명한 바와 같은 CH3 도메인의 변형을 포함하도록 제공되며, 항원-결합 단백질은 CH3 도메인에서 변형이 없는 동일한 이중특이성 항원-결합 단백질과 동일한 약물동력학 프로필을 나타낸다. 한 구체예에서, 이중특이성 항체는 IgG1△A/IgG1 헤테로다이머 Fc를 포함하는 것으로 제공되며, 이중특이성 항체는 다른 것은 동일하지만 IgG3 CH3 도메인을 포함하는 이중특이성 항체보다 약 1.5-배, 약 2-배, 약 2.5-배, 또는 약 3 배 더 큰 혈청 반감기를 가진다. 한 구체예에서, 이중특이성 항체는 IgG1△A/IgG1 헤테로다이머 Fc를 포함하여 제공되며, 이중특이성 항체는 IgG1△A 변형이 없는 이중특이성 항체(즉, IgG1 호모다이머 이중특이성 항체)의 혈청 반감기와 거의 동일한 혈청 반감기를 나타낸다.
면역글로불린 중쇄
요망되는 특성들(예를 들어, 요망되는 특이성, 요망되는 친화도, 요망되는 기능성, 예를 들어, 차단, 비-차단, 억제, 활성화 등)을 가지는 이중특이성 항체를 만드는데 사용될 수 있는 면역글로불린 중쇄 가변 영역은 당업계에 알려진 임의의 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 요망되는 중쇄는 그 다음에 본원에서 설명되는 요망되는 중쇄 불변 영역을 가지는 구성체에서 가변 영역을 함유하는 핵산 서열을 클로닝함으로써 수행될 구성될 수 있다.
한 구체예에서, 제1 중쇄는 제1 항원으로 면역화된 제1 동물의 성숙 B 세포의 게놈으로부터 유래된 핵산에 의해 암호화되는 가변 영역을 포함하고, 제1 중쇄는 제1 항원을 특이적으로 인식한다. 특정 구체예에서, 제2 중쇄는 제2 항원으로 면역화된 제2 동물의 성숙 B 세포의 게놈으로부터 유래된 핵산에 의해 암호화되는 가변 영역을 포함하고, 제2 중쇄는 제2 항원을 특이적으로 인식한다.
한 구체예에서, 제1 동물 및/또는 제2 동물은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 유전적으로 변형된 동물이다. 한 구체예에서, 제1 동물 및/또는 제2 동물은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 인간 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 유전적으로 변형된 동물이다. 한 구체예에서, 제1 동물 및/또는 제2 동물은 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스이다.
면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열은 당업계에 알려진 임의의 다른 방법, 예를 들어 파지 디스플레이에 의해 얻어질 수 있고, 이에 의해 얻은 서열은 핵산 구성체를 만드는데 사용되어 임의의 적당한 중쇄, 예를 들어 본원에서 설명하는 바와 같은 변형된 CH3 도메인이 있는 중쇄를 암호화하는 핵산과 결합되고, 발현 구성체 중에 위치되고, 예를 들어 적당한 경쇄의 존재하에서 중쇄를 만들 수 있는 세포에 운반될 수 있다.
면역글로불린 경쇄
2개의 다른 에피토프(또는 2개의 다른 항원들)를 인식하는 2개의 중쇄를 포함하는 이중특이성 항체는 더 용이하게 분리되며, 그것들은 동일한 경쇄와 짝지을 수 있다(즉, 동일한 가변 및 불변 도메인을 가지는 경쇄). 다른 특이성의 2 중쇄와 짝지을 수 있지만 그것의 표적 항원과 중쇄 가변 도메인의 선택성 및/또는 친화도를 방해하지 않거나 실질적으로 방해하지 않는, 경쇄를 만들기 위한 다양한 방법이 당업계에 알려져 있다.
접근에서, 경쇄는 모든 경쇄 가변 도메인에 대한 사용 통계를 조사하고, 인간 항체에서 가장 빈번하게 사용된 경쇄를 확인하고, 다른 특이성의 2 중쇄를 가지는 경쇄를 짝지음으로써 선택될 수 있다.
다른 접근에서, 경쇄는 파지 디스플레이에서 경쇄 서열을 관찰하고, 가장 흔히 사용된 경쇄 가변영역을 라이브러리(예를 들어, 인간 경쇄 가변 서열을 포함하는 파지 디스플레이 라이브러리, 예를 들어 인간 ScFv 라이브러리)로부터 선택함으로써 선택될 수 있다.
다른 접근에서, 경쇄는 프로브로서 중쇄 둘 다의 중쇄 가변 서열을 사용하여 경쇄 가변 서열의 파지 디스플레이 라이브러리를 분석함으로써 선택될 수 있다. 중쇄 가변 서열과 결합하는 경쇄는 중쇄에 대해 경쇄로서 선택되고, 에피토프 둘 다에 대해 결합 및/또는 활성화를 허용한다.
다른 접근에서, 경쇄는 요망되는 중쇄와 알려진 경쇄를 합하고, 결합 특이성, 친화도, 및/또는 활성화 능력을 위한 결과 이중특이성 항체를 분석함으로써 선택될 수 있다.
어려움이 경쇄를 선택하기 위한 임의의 접근과 만난다는 점에서(예를 들어, 경쇄는 항원과 중쇄 중 하나 또는 둘 다의 결합을 방해하고, 또는 경쇄는 중쇄 중 하나 또는 둘 다와 만족스럽게 결합하지 못한다), 경쇄는 중쇄의 동족 경쇄와 함께 정렬될 수 있고, 변형은 두 중쇄의 동족 경쇄와 공통인 서열 특성들을 더 가깝게 매칭하는 경쇄에서 만들어진다. 면역원성의 기회가 최소로 될 필요가 있다면, 변형은 바람직하게는 알려진 인간 경쇄 서열에 존재하는 서열들을 야기하여서, 단백질 분해 처리는 면역원성의 가능성을 평가하기 위해 당업계에 알려진 변수 및 방법(인실리코 및 습식 분석)을 기반으로 한 T 세포 에피토프를 만들 수 없다.
항체 및 결합 단백질
본 조성물 및 방법은 인간 이중특이성 항체, 즉 인간 불변 및 가변 도메인을 포함하는 이중특이성 항체를 만드는데 특히 유용하다. 일부 구체예에서, 인간 항체들은 인간 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유래되고, 일부 구체예에서 (예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자 서열을 포함하는 동물에서 생성된) 체세포 돌연변이된 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 중쇄 가변 및 중쇄 불변 도메인을 가지는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 가변 및/또는 불변 영역은 인간 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 또는 예를 들어 CDR 및 특정 CDR3에서 재조합 및/또는 스플라이싱의 결과로서 암호화된 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 인간 항체들은 CDR 서열이 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 생식세포로부터 유래되고, 인간 골격 서열에 접합된 항체들을 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 그 항체들은 인간화된 또는 키메라 항체들로서 언급된다. 인간 항체들은 예를 들어 무작위 또는 자리-특이적 돌연변이로 시험관내에 도입된 돌연변이를 포함하지만, 돌연변이는 바람직하게는 인간에서 비-면역원성이다.
본 방법 및 조성물은 바람직하게는 인간에서 비-면역원성 또는 낮은 면역원성의 키메라 항체들을 만드는데 사용될 수 있다. 키메라 항체들은 중쇄 가변 영역 또는 골격 또는 CDR 또는 중쇄 불변 영역 또는 도메인 중 하나가 다른 종으로부터 나오는 항체들이다(예를 들어, 인간과 마우스, 또는 인간과 영장류). 일부 구체예에서, 키메라 항체들은 비-인간 기원의 중쇄 가변 영역(예를 들어, 마우스) 및 인간 기원의 중쇄 불변 영역을 가지는 항체들을 포함한다. 일부 구체예에서, 키메라 항체들은 인간 기원의 중쇄 가변 영역 및 비-인간(예를 들어, 마우스) 기원의 중쇄 불변 영역을 가지는 항체들을 포함한다. 다양한 구체예에서, 마우스 기원의 영역은 체세포 초돌연변이가 있거나 없는 마우스 면역글로불린 생식세포 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 동일하다. 키메라 항체들은 또한 인간 면역글로불린 생식세포 서열 및 비-인간(예를 들어, 마우스) 중쇄 또는 키메라 인간/비인간 중쇄와 동일한 또는 실질적으로 동일한 경쇄 불변 영역을 가지는 항체들을 포함한다. 키메라 항체들은 비-인간(예를 들어, 마우스) 면역글로불린 생식세포 서열 및 인간 또는 키메라 비인간/인간 중쇄와 동일 또는 실질적으로 동일한 경쇄 불변 도메인을 가지는 항체들을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 조성물 및 방법은 친화도-성숙된 항체를 만들기 위한 것이다. 일부 구체예에서, 친화도-성숙된 항체는 변형(들)이 없는 실질적으로 동일한 항체와 비교하여 그것의 표적 항원에 대한 항체의 더 높은 친화도(나노몰 또는 피코몰 범위에서 KD)를 초래하는 하나 이상의 CDR에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 친화도-성숙된 항체들은 예를 들어 CDR 및/또는 골격 영역의 무작위 또는 자리-지정 돌연변이에 이어서 친화도 스크리닝, VH 도메인 셔플링 등으로써 당업계에 알려진 임의의 적당한 방법에 의해 만들어질 수 있다.
일부 구체예에서, 항체는 중화 항체이다. 중화항체는 항원의 생물학적 활성을 중화, 억제 또는 방지할 수 있는 항체를 포함한다. 중화 항체는 항원에 결합 시, 생체 내 및 시험관 내 항원의 천연 표적 상에서 작용하는 항원의 능력을 방지 또는 감소시키는 것을 포함한다. 중화 항체의 예는 리간드가 수용체와 결합하는 것을 방지하는 생물학적 수용체의 단백질 리간드에 대한 항체, 수용체가 그것의 리간드와 결합하는 것을 방지하는 생물학적 수용체에 대한 항체를 포함하며, 항체가 없는 리간드 결합은 수용체가 세포 내 변화를 초래하도록 야기한다. 항체가 중화항체인지를 결정하는 것은, 일반적으로 항원의 생물학적 활성에서 항체의 효과가 측정되는 작용 분석을 수행하는 것을 수반한다.
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 항체 및 다른 결합 단백질의 다양한 용도에서 유용하다. 일부 유용한 용도의 간략한 설명이 본원에서 제공된다.
종양 항원 및 T-세포 항원에 대한 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 결합 단백질은 세포 상의 항원, 예를 들어 CD20을 표적으로 하고, 또한 T-세포 상의 항원, 예를 들어 CD3를 표적으로 하여 만들어질 수 있다. 이런 방법으로, 환자에서 관심의 세포(예를 들어, CD20 결합을 통해 림프종 환자에서 B 세포)뿐 아니라 환자의 T-세포를 표적화한다. 다양한 구체예에서 이종특이성 항체는 CD3와 결합시 T-세포를 활성화하도록 설계되고, 따라서 특이적인, 선택된 종양 세포에서 T-세포 활성화와 커플링한다.
동일 세포의 표면 상에서 결합 상대에 각각 지시된(즉, 각각 다른 표적으로 지시됨) 2개의 결합 모이어티를 포함하는 이중특이성 결합 단백질이 또한 만들어질 수 있다. 이 설계는 동일 세포의 표면상에서 표적들을 둘 다 발현시키는 특이적 세포 또는 세포 종류들을 표적으로 하기에 특히 적합하다. 표적들이 다른 세포에서 개별적으로 나타날 수도 있지만, 이 결합 단백질의 결합 모이어티는 각각의 결합 모이어티가 상대적으로 낮은 친화도를 가지는 그것의 표적과 결합하도록 선택된다(예를 들어, 낮은 마이크로몰, 또는 높은 마이크로몰 - 예를 들어, 100 나노몰 KD 이상, 예를 들어, 500, 600, 700, 800 나노몰). 이 방법에서, 연장된 표적 결합은 2개의 표적이 동일 세포에서 근접해 있는 상황에서만 선호된다.
동일 표적의 다른 에피토프에서 각각 동일 표적에 결합하는 두 개의 결합 모이어티를 포함하는 이종특이성 결합 단백질이 만들어질 수 있다. 이 설계는 결합 단백질이 있는 표적을 성공적으로 차단하는 확률을 최대화하는데 특히 적합하다. 예를 들어 막관통 채널 또는 세포 표면 수용체의 다수의 세포밖 루프는 동일한 이중특이성 결합 분자에 의해 표적화될 수 있다.
면역 억제를 초래하는 면역 신호의 부정적 조절자를 클러스터링하고 활성화하는 2개의 결합 모이어티를 포함하는 이중특이성 결합 단백질이 만들어질 수 있다. 표적들이 동일 세포 상에 있는 시스에서 리프레션(Repression)이 달성될 수 있고; 표적들이 다른 세포 상에 있는 트랜스에서 리프레션이 달성될 수 있다. 시스에서 리프레션은, 예를 들어 항-IgGRIIb 결합 모이어티 및 항-FelD1 결합 모이어티를 가지는 이중특이성 결합 단백질에 의해 달성될 수 있는데, IgGRIIb는 FelD1에 대한 면역 반응을 하향-조절하기 위해서 FelD1의 존재하에서만 클러스터링된다. 트랜스에서 리프레션은, 예를 들어 항-BTLA 결합 모이어티 및 관심의 조직-특이적 항원과 특이적으로 결합하는 결합 모이어티를 가지는 이중특이성 결합 단백질에 의해 달성될 수 있는데, 억제 BTLA 분자의 클러스터링은 잠재적으로 자가 면역 질환을 다루는 선택된 표적 조직에서만 일어난다.
복수의 구성요소 수용체를 활성화하는 이중특이성 결합 단백질이 만들어질 수 있다. 이 설계에서, 수용체 결합의 두 구성요소에 지시된 2개의 결합 모이어티는 수용체와 교차 결합하고, 수용체로부터의 신호전달을 활성화한다. 이것은, 예를 들어 IFNAR1과 결합하는 결합 모이어티 및 IFNAR2와 결합하는 결합 모이어티를 가지는 이중특이성 결합 단백질을 사용하여 행해질 수 있으며, 결합은 수용체와 교차 결합이다. 이러한 이중특이성 결합 단백질은 인터페론 치료에 대한 대안을 제공할 수 있다.
반투과성 장벽, 예를 들어 혈액-뇌 장벽을 가로질러서 결합 모이어티를 운반하는 이중특이성 결합 단백질이 만들어질 수 있다. 이 설계에서, 한 결합 모이어티는 특정의 선택적 장벽을 통과할 수 있는 표적과 결합할 수 있고; 다른 결합 모이어티는 치료적 활성이 있는 분자를 표적으로 하며, 치료 활성이 있는 표적 분자는 보통 장벽을 가로지를 수 없다. 이런 이중특이성 결합 단백질의 종류는 치료제가 다른 방법으로 도달하지 않는 조직에 대한 치료에 유용하다. 일부 예는 치료제를 장 또는 폐에 운반하기 위한 pIGR 수용체를 표적화하고, 또는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 치료제를 운반하기 위한 트랜스페린 수용체를 표적화하는 것을 포함한다.
특이적 세포 또는 세포 종류에 결합 모이어티를 운반하는 이중특이성 결합 단백질이 만들어질 수 있다. 이 설계에서, 한 결합 모이어티는 세포에 용이하게 내재된 세포 표면 단백질(예를 들어, 수용체)을 표적화한다. 다른 결합 모이어티는 세포내 단백질을 표적화하며, 세포내 단백질의 결합은 치료적 효과를 초래한다.
식세포 면역 세포의 표면 수용체 및 감염성 병원체(예를 들어, 효모 또는 박테리아)의 표면 분자와 결합하는 이중특이성 결합 단백질은 식세포 면역 세포의 부근에 감염성 병원체를 가져오고, 병원체의 식세포 작용을 용이하게 한다. 이러한 설계의 예는 CD64 또는 CD89 분자 및 또한 병원체를 표적화하는 이중특이성 항체이다.
이중특이성 결합 단백질은 한 결합 모이어티로서 항체 가변 영역을 가지고, 제2 결합 모이어티로서 비-Ig 모이어티를 가진다. 항체 가변 영역은 표적화를 달성하는 반면, 비-Ig 모이어티는 이펙터 또는 Fc와 연결된 독소이다. 이 방법에서, 리간드(예를 들어, 이펙터 또는 독소)는 항체 가변영역에 의해 결합되는 표적에 전달된다.
이중특이성 결합 단백질은 Ig 영역에 각각 결합하는 2개의 모이어티를 가지며(예를 들어, CH2 및 CH3 영역을 함유하는 Ig 서열), 임의의 두 단백질 모이어티는 Fc에 대해서 서로의 부근에 도입될 수 있다. 이 설계의 예는 트랩, 예를 들어, 호모- 또는 헤테로다이머 트랩 분자를 포함한다.
핵산
단클론성 항체들을 암호화하는 핵산 서열은 당업계에 공지된 임의의 적당한 방법에 의해 얻어질 수 있다. 단클론성 항체(및 그것의 핵산 서열)를 얻기 위한 적당한 방법의 예는, 예를 들어 하이브리도마 방법(예를 들어, Kohler et al. (1975) Nature 256:495-497 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(예를 들어, Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 참조)를 포함한다.
다양한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 유전적으로 변형된 동물 또는 유전자 이식 동물의 핵산 서열로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 영역은 인간 면역글로불린 미니로커스(minilocus)를 포함하는 동물로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 영역은 면역글로불린 서열을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 하나 이상의 염색체외 핵산을 포함하는 마우스로부터 유래된다. 다양한 구체예에서, 동물은 하나 이상의 재배열되지 않는 인간 면역글로불린 핵산 서열을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 동물은 인간 경쇄 가변영역 핵산 서열, 일부 구체예에서 인간 중쇄 가변 서열, 일부 구체예에서 중쇄와 경쇄 가변 서열을 둘 다 포함하고, 일부 구체예에서 인간 불변 영역 서열을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 핵산 서열은 내인성 마우스 중쇄 가변 유전자 절편 및 경쇄 가변 유전자 절편이 인간 중쇄 가변 유전자 절편 및 경쇄 가변 유전자 절편으로 치환된 마우스로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 핵산 서열은 이러한 동물의 나이브(naive) B 또는 T 세포로부터 유래된다. 다른 구체예에서, 핵산 서열은 관심의 항원으로 면역화된 동물의 B 또는 T 세포로부터 유래된다.
다양한 구체예에서, 핵산 서열은 그것들을, 예를 들어 퇴화 프라이머의 세트를 포함하는 프라이머로 증폭함으로써 세포로부터 유래되며, 하나 이상의 FR, 결합, 또는 불변 서열을 포함한다.
다양한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인은 관심의 항원으로 면역화된 동물의 핵산으로부터 유래된다. 예를 들어 비-인간 유전자이식 또는 유전적으로 변형된 동물은 관심의 항원으로 면역화되며(예를 들어, 동물을 항원 또는 항원을 함유하는 세포 또는 항원의 발현가능한 형태를 암호화하는 핵산에 노출), 동물이 면역반응을 받도록 하고, 면역 세포를 동물로부터 분리하고, 선택적으로 세포를 불멸화하고, 항원과의 반응성을 확인하기 위한 세포를 스크리닝하고 및/또는 항체에 대해 배치될 때 항원을 인식할 수 있는 면역글로불린 가변영역을 암호화하는 핵산 서열을 확인 및/또는 분리한다. 일부 구체예에서, 세포는 B 세포이다. 일부 구체예에서, 면역화된 동물의 B 세포는 하이브리도마를 만드는데 사용될 수 있고, 항원의 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 발현하는 B 세포가 확인되고, 에피토프를 인식하는 가변 영역 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열이 확인되고 및/또는 분리된다.
일부 구체예에서, 핵산은 인간, 비-인간 영장류(예를 들어, 침팬지와 같은 유인원), 원숭이(예를 들어, 시노모로고스(cynomologous) 또는 레소스(rhesus)), 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 당나귀, 염소, 양 등으로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 중쇄는 인간 세포로부터 유래된 서열을 포함한다. 예를 들어, 인간 태아 세포는 시험관내에서 항원에 노출되고, 적당한 숙주 동물에 위치된다(예를 들어, SCID 마우스).
일부 구체예에서, 핵산은 벡터를 사용하여 세포에 도입된다. 벡터는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 식물 바이러스, YAC, BAC, EBV-유래 에피좀을 포함한다.
일부 구체예에서, 핵산은 발현 벡터 또는 발현 구성체 중에서 존재한다. 일부 구체예에서, 발현 벡터 또는 구성체는 관심의 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유하여, 관심의 핵산 서열은 적당한 세포 내에서 적당한 조건 하에 발현될 수 있다. 발현 벡터 또는 구성체는 전사 또는 번역, 전사 정지 서열, 스플라이싱 서열, 전사-촉진 인트론, IRES 요소, 마커 유전자, 선택 서열, 재조합효소 인식 자리, 상동성 암(arm), 바이러스 서열, 오퍼레이터(예를 들어, 원핵세포 오퍼레이터) 등을 향상시키는 리더 서열, 인핸서, 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 발현 벡터는 유도성 발현을 허용하는 요소, 예를 들어 진핵 프로모터에 작동가능하게 연결된 원핵세포 오퍼레이터를 포함한다. 일부 구체예에서, 발현은 발현 인듀서의 첨가시 유발된다. 다른 구체예에서, 발현은 발현 억제제의 제거 시 유발된다. 일부 구체예에서, 발현은 온도 변화에 의해 유발된다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 중쇄 뉴클레오티드 서열은 동일한 벡터 상에 있다. 일부 구체예에서, 본원의 중쇄 핵산 서열 및 경쇄 핵산 서열은 동일한 벡터 상에 있다. 한 구체예에서, 두 중쇄 핵산 서열 및 경쇄 핵산 서열은 동일한 벡터 상에 있다.
일부 구체예에서, 핵산은 바이러스로부터 하나 이상의 핵산을 포함하는 세포 중에서 발현된다. 특정 구체예에서, 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, SV-40, 엡스테인-바르 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 바큘로바이러스, 코로나바이러스, 단순포진바이러스, 폴리오바이러스, 셈리키삼림열바이러스, 신드비스 바이러스 및 백시니아 바이러스로부터 선택된다.
숙주 세포는 관심의 핵산을 발현하도록 형질변환될 수 있는 세포이다. 다양한 구체예에서, 형질변환은 세포의 핵산 함량을 변화시키는 것을 포함하는데, 이는 외인성 핵산(예를 들어, 천연에서 세포 중에서 발견되지 않는 핵산, 또는 천연에서 세포 중에서 발견되는 핵산 서열과 대응하는 핵산의 하나 이상의 추가적인 복제물)을 함유한다. 세포의 핵산 함량은 당업계에 알려진 임의의 적당한 방법에 의해, 예를 들어 세포의 게놈에 핵산을 통합함으로써 또는 염색체 외 또는 게놈 외 형태로 세포 중에 그것을 위치시킴으로써 변화될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포의 핵산 함량은 세포가 일시적으로 관심의 핵산을 발현시키도록 변화될 수 있고, 또는 핵산 함량은 세포가 관심의 핵산을 안정하게 발현시키도록 변화될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포의 유전적 함량의 변화는 세포가 분할될 때 이어진다.
이중특이성 항원-결합 단백질의 분리
일단 적당한 세트의 변형이 본원의 정보를 기반으로 선택되었다면, 당업계에 알려진 방법을 사용하여 이중특이성 항원-결합 단백질을 분리하도록 시도되었다. 단지 공개된 방법을 적용하는 것은, 모든 상황에서 만족스러운 분리를 제공하지 않았다.
Lindhofer 등은 단백질 A (마우스 IgG)와 결합한 하나의 중쇄 및 (래트 IgG)가 아닌 하나의 중쇄를 가지는 헤테로다이머 중쇄를 가지는 이중특이성 항체를 만들었고, 마우스/마우스 및 래트/래트 다이머의 항체생산융합세포 혼합물로부터 래트/마우스 헤테로다이머 이중특이성 항체를 중성 내지 pH 5.8의 pH 단계 구배로 분리하여 헤테로다이머를 용리한 다음, 5.8 내지 3.5의 pH 단계로 마우스/마우스 호모다이머를 용리하였다. (Lindhofer et al. (1995) Preferential species-restricted heavy/light chain pairing in rat/mouse quadromas: Implications for a single-step purification of bispecific antibodies. J. Immunol. 155(1):219-225. 참조)
Lindhofer 접근은 2개의 IgG1 중쇄를 가지는 IgG1 헤테로다이머로부터 IgG1 호모다이머를 분리하는 것에 적용될 때 실패하였는데, 이는 IgG1 CH3 도메인 중 하나가 H435R/Y436F 디펩티드 변형을 함유하였다는 사실을 제외하고 동일하였다. 본 발명자들은 선형 pH 구배에서, 디펩티드-변형된 IgG1이 약 pH 3.9에서 용리된 반면, IgG1 호모다이머가 약 pH 3.7에서 용리되었다는 것을 발견하였다. 이 pH 차이는 Lindhofer 방법을 사용하여 호모다이머로부터 헤테로다이머의 만족스러운 분리를 달성하기에 불충분한 것으로 생각되었다. 이 차이는 예측가능한 방법으로 재생될 수 없었다.
크로마토그래피 거동의 변화는 특정 pH 단계 또는 구배를 유지하는데 필요로되는 버퍼 강도에 의해 원인이 되는 비교적 실질적인 이온 강도를 사용한 크로마토그래피 실행에서 관찰되었다. 그러나 유기 변경제(1-프로판올)를 첨가하는 것에 의해 만족스러운 분리는 수행되지 않았다. 대신, 다소 놀랍게도 일부 크로마토그래피 실행에 대해 호모다이머 IgG1 및 헤테로다이머 IgG1의 극적이고 예상치못하게 개선된 분리를 0.5 몰 내지 1.0 몰 이온 변경제(예를 들어, NaCl)의 첨가로 수행한다. 이온 변경제 첨가는 용리를 위한 pH 범위를 넓혀서(이온 변경제에 의해 1.2 pH 단위이지만, 이온 변경제가 없으면 0.2 pH), pH 단계 구배는 2종류를 성공적으로 분리할 수 있었다. 그러나 다른 실행에서, 만족스러운 분리는 단지 약 150 mM의 NaCl 농도로 달성되었다(실시예 4 참조). 만족스러운 분리가 달성될 수 있도록 보장하기 위해서, 한 구체예에서 이중특이성 항체-결합 단백질의 분리는 약 0.5 내지 약 1.0 몰 이온 변경제의 존재하에서 만들어진다.
따라서, 한 구체예에서, 본원에서 설명되는 변형을 포함하는 하나의 쇄를 가지는 헤테로다이머 IgG를 포함하는 이중특이성 항원-결합 단백질을 분리하는 방법은 이온 변경제의 존재하에서 pH 구배를 사용하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 이온 변경제는 IgG 호모다이머의 단백질 A 지지체로부터 용리와 본원에서 설명되는 IgG 헤테로다이머(즉, CH3 변형(들)) 사이의 pH 차이를 최대화하기에 충분한 농도에서 존재한다. 특정 구체예에서, 이온 변경제는 약 0.5 내지 약 1.0 몰의 농도에서 존재한다. 다른 특정 구체예에서, 이온 변경제는 약 0.15 내지 약 0.5 몰의 농도에서 존재한다.
한 구체예에서, 이온 변경제는 염이다. 한 구체예에서, 이온 변경제는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 및 할로겐의 염이다. 특정 구체예에서, 염은 알칼리금속 또는 알칼리 토금속의 염소염, 예를 들어, NaCl, KCl, LiCl, CaCl2, MgCl2이다. 특정 구체예에서, 염은 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0의 몰농도로 존재한다.
한 구체예에서, pH 구배는 약 pH 3.9 내지 약 pH 4.5, 다른 구체예에서, 약 pH 4.0 내지 약 pH 4.4., 및 다른 구체예에서 약 pH 4.1 내지 약 pH 4.3이다. 특정 구체예에서, 구배는 선형 구배이다.
한 구체예에서, pH 구배는 단계 구배이다. 한 구체예에서, 본 방법은 평형화된 단백질 A 컬럼(예를 들어, PBS 또는 다른 적당한 버퍼 또는 액체 중에서 평형화됨)에 약 pH 3.9, 약 pH 4.0, 약 pH 4.1, 약 pH 4.2, 약 pH 4.3, 또는 약 pH 4.4의 단계를 적용하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 단계는 약 pH 4.2이다.
한 구체예에서, 헤테로다이머 IgG CH3 도메인을 포함하는 이중특이성 항체는 비-헤테로다이머 IgG가 실질적으로 없는 하나 이상의 분획에서 단백질 A 지지체로부터 용리한다. 특정 구체예에서, 용리된 이중특이성 항체 분획(들)은 비-헤테로다이머 항체인 총 단백질의 약 1중량%, 0.5중량%, 또는 0.1중량% 미만을 포함한다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 조성물을 만들고 사용하는 방법을 당업자에게 설명하기 위한 목적이고, 본 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 사용한 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 보장하기 위한 노력이 있었지만, 일부 실험적 오류 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 지시되지 않는다면, 부분은 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨이고, 압력은 대기압 또는 대기압 근처이다.
실시예 1: 이중특이성 IL-4Ra/IL-6Ra 항원-결합 단백질
인간 IgG1 이소형의 2개의 알려진 항체, IL-4Ra에 대해 하나 및 IL-6Ra에 대해 하나는 단지 4개의 아미노산에 의해 차이가 있는 경쇄를 가진다는 것을 발견하였다. 공동-발현 실험은 항-IL-4Ra 항체의 경쇄가 IL-6Ra의 경쇄로 치환되고, 여전히 IL-4Ra에 높은 친화도를 유지하고, 따라서 항-IL-4Ra 중쇄 및 항-IL-6Ra 중쇄 및 동일한 경쇄를 사용하여 이중특이성 항체를 만들 수 있게 하는 것으로 나타났다. 따라서, IL-6Ra 항체의 중쇄는 Fc△Adp 형태로 변형시켰다(즉, IMGT 엑손 넘버링에 의한 CH3 디펩티드 변형 H95R/Y96F).
항-IL-6Ra 경쇄를 이어서 CHO 세포 중에서 항-IL4Ra/Fc 및 항-IL6Ra/Fc△Adp 중쇄와 함께 공동발현시켰고, 이 세포들로부터의 조정배지를 단백질 A 크로마토그래피 하였다. 호모-와 헤테로다이머의 혼합물을 함유하는 세포 상청액이 있는 단백질 A 컬럼을 장약한 후, 2가지 버퍼의 조합을 변화시킴으로써 만들어진 pH 단계 구배로 용리를 수행하여(A: 100 mM Na 시트레이트, 150mM NaCl, pH 6.0, 및 B: 100 mM Na 시트레이트, 150 mM NaCl, pH 3.0; 도 4 참조) pH 6.0, pH 4.2, 및 pH 3.0, 각각에서 3개의 상을 만들었다. 도 4에서, IL-4R은 항-IL-4Ra를 나타내고, IL-6R△은 항-IL-6Ra(IgG1△Adp)를 나타낸다. 표시된 컬럼 분획을 IL-6Ra 및 IL-4Ra 단백질과 결합에 대해 분석하였다(도 5). 단계 용리를 수행하여, pH 4.2에서 용리하는 하나의 피크 및 pH 3.0에서 제2 피크를 생기게 하였다(도 4). BIACORE™ 분석은 예상한 바와 같이 플로우-스루(flow-through) 물질이 가용성 IL-6Ra에 결합할 수 있지만, IL-4Ra에는 결합하지 않는다는 것을 나타내었다(도 5). pH 4.2 피크에 대응하는 분획을 헤테로다이머로 구성되는 대략 동일한 양의 IL-6Ra 및 IL-4Ra에 결합할 수 있었다. pH 3.0에서 용리하는 피크는 단지 IL-4Ra와 결합하지만, 기대된 항-IL-4Ra 호모다이머에 대응하는 IL-6Ra에는 결합하지 않는다. 이것은 헤테로다이머 이중특이성 항체가 간단한 pH 단계 구배로 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 효과적으로 분리될 수 있다는 것을 확립한다.
실시예 2: Fc△Adp 단백질의 약물동력학
Fc△Adp 변형이 헤테로다이머 Fc/Fc△Adp 함유 분자의 약물동력학에 영향을 미치는지 여부를 시험하기 위해서, 마우스를 상기 설명한 항-IL-4Ra/항-IL-6Ra의 정제된 헤테로다이머 종으로 주사하였고, 혈청 중의 인간 면역글로불린의 농도를 28일의 기간에 걸쳐 측정하였다(도 6; 표 1). 헤테로다이머의 혈청 반감기는 야생형과 유사한 약 10일이었다. 이는 Fc△Adp 변형이 혈청 반감기에서 검출가능한 효과를 가지지 않는다는 것을 확립한다.
약물동력학 (n = 5)

약물 		시험한 반감기
(D일)
(평균±표준편차)
IL-6RD/IL-4R 11.2 ±1.8
IL-6RD/IL-6RD 10.8 ±1.9
IL-4R/IL-4R 10.8 ±1.9
대조군 11.2 ±1.9
실시예 3: 이중특이성 CD20/CD3 항원-결합 단백질
알려진(활성화하는) 항-인간 CD3 항체의 경쇄와 함께 공동-발현될 때, 알려진 항-인간 CD20 항체의 중쇄는 여전히 CD20에 결합할 수 있다는 것을 발견하였다. 이어서 항-CD3 경쇄를 항-CD20/Fc 중쇄, 항-CD20/Fc 중쇄, 또는 중쇄 둘다와 함께 공동-발현하였다. 호모- 및 헤테로다이머의 결과의 혼합 모집단을 이어서 생분석에서 사용하여 CD20 발현 표적 세포를 사멸시키는 능력을 결정하였다(도 7). 간략하게, 2 x 107 인간 PBMC 세포를 72 시간 동안 6 x 107 CD3 x CD28 비드(Invitrogen)와 함께 활성화하였다. 이어서 IL-2 (R & D Systems)의 30 유닛을 첨가하였고, 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서 세포를 0.5 x 106/mL의 농도에서 분할하였고, 추가 30U IL-2를 첨가하였다. 이어서 세포를 추가 48시간동안 인큐베이팅하였고 생분석에서 사용하였다. 표적 세포(Raji)를 발현시키는 생분석 2 x 106/mL CD20의 날에 8uM calcein-AM (Invitrogen)으로 30분 동안 표지하였다. 세척한 표적 세포를 상청액을 함유하는 항체의 표시량과 함께 200마이크로리터의 총 부피로 표적:이펙터 세포(웰 당 220,000 총 세포)의 1:10 비율에서 활성화된 hPBMC 세포에 첨가하였다. 세포를 2시간 동안 인큐베이팅하였고 상청액을 수집하였고, 형광을 정량화하였다. 세포독성을 최대 형광에 대한 특이적 형광의 비율을 계산함으로써 측정하였다. CD20 항체 단독(항-CD3 경쇄를 사용)도, 항-CD3 항체도 표적 세포의 사멸을 유발할 수 없었고; 심지어 두 시약을 혼합해도 효과는 없었다. 그러나, 3가지 성분 모두를 공동-발현시켰을 때, 상당한 사멸을 관찰하였고, 효과가 헤테로다이머의 이중특이성 종에 기인한다는 것을 나타낸다. 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포 상청액 중의 이중특이성 항체의 추정량을 기반으로 이 효과에 대한 EC50은 약 15 pM이 되는 것으로 추정하였다.
실시예 4: 정제된 이중특이성 CD20/CD3 항원-결합 단백질에 의한 세포 사멸 특이성
실시예 3에서 설명한 바와 같은 트랜스펙션으로부터 CHO 세포 상청액을 용리를 위한 단계 구배를 이용하여 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 하였다. 단계 구배를 2개의 버퍼의 조합을 변화시킴으로써 만들어서(A: 20 mM Na 시트레이트, 1M NaCl, pH 5.2; B: 20 mM Na 시트레이트, 1M NaCl, pH 2.7) 각각 pH 5.2, pH 4.2, 및 pH 2.8에서 3 단계를 만들었다. 이어서 pH 4.2에서 피크 용리로부터 단백질을 실시예 3에서 설명한 바와 같은 세포 사멸 분석에서 사용하였다. 표적 세포 사멸을 3 pM의 EC50에서 관찰하였다(도 8). 추가적인 세포독성 분석을 수행하여 관찰한 사멸의 표적 특이성을 시험하였다. 이 실험에서, CD20 (Raji)을 발현시키는 또는 CD20 (293)이 없는 표지된 표적 세포를 활성화한 인간 PBMC로 인큐베이팅하였다. 각 표적 세포 종류를 단독으로 또는 다른 종류의 표지하지 않은 표적 세포와 조합하여 분석에 첨가하였다. 모든 경우에, CD20 발현 표적 세포를 3 pM의 EC50과 함께 특이적으로 사멸시킨 반면, CD20 네가티브 셀라인은 사멸시킬 수 없었다.
실시예 5: 다르게 변형된 hIgG2 Fc의 단백질 A 분리
다르게 변형된 헤테로다이머 인간 IgG2 Fc/△AdpFc 및 비변형 인간 호모다이머 IgG2 Fc/Fc를 우선 단백질 A 컬럼(rProtein A FF, GE)을 통해 결합-및-세척 처리로써 풍부하게 했다. hIgG2 Fc/Fc로부터 hIgG2 Fc/△AdpFc를 추가로 분리하기 위해, 단계-구배 용리를 다음과 같이 SMART™ 시스템(GE)을 사용하여 수행하였다. 용매 시스템은 용매 A(PBS, 1X), 용매 B (20 mM 시트르산나트륨 및 1 M NaCl, pH 5.5) 및 용매 C (20 mM 시트르산나트륨 및 1M NaCl, pH 2.5)로 구성된다. 용리는 처음 20분에 100% A 등용매용리로 시작한 다음 20분에 100% B로 빠르게 전환하였다. 33.5% C 및 66.5% B로 선형 구배를 다음 10분에 걸쳐 개시하였고; C의 33.5%의 농도를 제1 피크의 완전한 용리까지(Fc/△AdpFc) 20분 동안 유지하였다. 33.5 % C 내지 100% C의 선형 구배를 30분 동안 따랐다. 유속을 250마이크로리터/분을 유지하였고, 크로마토그램을 UV 검출기에 의해 280nm에서 검출하였다. hIgG2 Fc/△AdpFc는 pH 4.5에서 용리한 반면, hIgG2는 pH 3.5에서 용리하였다.
실시예 6: 다르게 변형된 hIgG4 Fc의 단백질 A 분리
다르게 변형된 헤테로다이머 인간 IgG4 (Fc/△AdpFc) 및 비변형 호모다이머 IgG4 (Fc/Fc)를 우선 단백질 A 컬럼 (rProtein A FF, GE)을 통해 결합-및-세척 처리에 의해 풍부하게 하였다. hIgG4 Fc/Fc로부터 hIgG4 Fc/△AdpFc을 추가로 분리하기 위해, 단계-구배 용리를 다음과 같이 SMART™ 시스템을 사용하여 수행하였다. 용매 시스템은 용매 A (PBS, 1X), 용매 B (20 mM 시트르산나트륨 및 1 M NaCl, pH 5.1) 및 용매 C (20 mM 시트르산나트륨 및 1M NaCl, pH 2.8)로 구성된다. 용리는 처음 20분에 100% A로 등용매용리에 의해 시작한 다음 20분에 100% B로 빠르게 전환하였다. 50% C 및 50% B로 선형 구배를 다음 10분에 걸쳐 개시하였고; C의 50%의 농도를 제1 피크의 완전한 용리까지(Fc/△AdpFc) 20분 동안 유지하였다. 유속을 250마이크로리터/분을 유지하였고, 크로마토그램을 UV 검출기에 의해 280nm에서 검출하였다. hIgG4 Fc/△dpFc는 pH 4에서 용리한 반면, 호모다이머는 pH 4 내지 pH 2.8의 구배 동안 용리하였다.
실시예 7: 다르게 변형된 hIgG1 CD3xCD20의 단백질 A 분리
다르게 변형된 헤테로다이머 항-hCD3xCD20 IgG1 (Fc/△AdpFc) 및 비변형 호모다이머 항-hCD20를 다음과 같이 1 mL rProtein AFF (GE Biosciences)에서 분리하였다. 용매 시스템은 버퍼 A1 (PBS 1X), 버퍼 A2 (20 mM 시트르산나트륨 및 1 M NaCl pH 5.1), 버퍼 B (20 mM 시트르산나트륨 및 1 M NaCl pH 2.8)이었다. 혼합한 샘플을 결합하였고 PBS 및 버퍼 A2로 세척하였다. 4.2의 pH를 얻기 위한 단계를 사용하고, 이중특이성 CD3*xCD20 IgG1 (Fc/△AdpFc)를 용리한 다음, pH 4.2 내지 pH 2.8의 선형 구배로 호모다이머 항-hCD20 IgG1을 용리하였다.
실시예 8: Fc 수용체로 변형된 CH3의 결합 친화도
다양한 인간 Fc 수용체에서 △Adp 변형(H435R 및 Y436F, EU 넘버링)을 가지는 인간 IgG1 이소형 이중특이성 항체의 결합 친화도를 Biacore™ 정상상태 평형상태 결합 분석에서 시험하였다.
간략하게, 아민-커플링된 항-펜타-his mAb (Qiagen)를 가지는 카르복시메틸화된 덱스트란(CM5) 칩을 인간 Fc 수용체의 다양한 구성체를 포획하기 위해 사용하였다. 다음의 his-태그된 Fc 수용체 엑토도메인을 다른 항-펜타-his-코팅된 CM5 칩의 표면에 결합하였다: FcγRI, FcγRIIA(R131 다형체), FcγRIIB, 및 FcγRIIIB (각각 R&D Systems으로부터 얻음); 및 RcγRIIA(H131 다형체), FcγRIIIA(V176 다형체), 및 RcγRIIIA(F176 다형체) (각각 Regeneron에서 만들어짐). 항체들을 고친화도 수용체 FcγR1 엑토도메인(25 nM, 50 nM, 및 100 nM)에 대해 3가지의 농도에서, 저친화도 FcγR 수용체 엑토도메인에 대해 5 마이크로몰 내지 39 나노몰에서 통과시켰고, 결합 및 해리 속도 상수(ka 및 kd) 값을 결정하였고, 항체에 대해 평형해리 상수(KD)를 계산하기 위해 사용하였다. 결합연구를 pH 7.2에서 HBS-T 버퍼를 사용하여 실온에서 수행하였고, KD는 대조군 항체 (hmAb), 항-CD20, 및 항-CD3△dp 변형, 및 CD20xCD3△dp 이중특이성 항체에 대해 결정하였다. 항-CD3△dp 항체에 대한 KD 값은 비변형 hIgG1 이소형 항체와 비교하여 임의의 Fc 수용체에서 결합에 유의한 차이가 없다는 것을 나타내었다(표 2).
hFcgR 엑토도메인에 hIgG Abs의 결합을 위한 K D (nM)
hFcR 인간 IgG1 호모다이머 인간 IgG1 DAdp

hmAb
CD20-hFc
CD3-hFc
△Adp 호모다이머		 이중특이성 CD20xCD3
△Adp 헤테로다이머
FcgR1 5.00 4.27 3.17 3.61
FcγRIIA(R131) 1,460 739 588 328
FcγRIIA(H131) 915 458 451 222
FcγRIIB 3,400 1,850 1,360 794
FcγRIIIA(V176) 810 430 218 248
FcγRIIIA(F176) 2,500 533 407 267
FcγRIIIB 3,700 1,170 906 520
실시예 9: hFcRn 마우스에서 이중특이성 hIgG1△Adp의 약물동력학
이중특이성 항-hCD3/hCD20 IgG1△Adp 항체 및 그것의 항체 관련 대조군(항-hCD3 IgG 및 항-hCD3 IgG△Adp 호모다이머)의 약물동력학 클리어런스 율을 야생형(WT) 마우스 및 마우스 FcRn의 hFcRn 유전자로 치환을 위한 마우스 동형접합성(hFcRn 마우스)에서 결정하였다. 야생형 및 hFcRn 마우스는 C57BL6 (75%) 및 129Sv (25%)를 함유하는 배경과 함께 품종간 교잡종(cross-bred) 균주로부터 나온다. 이소형의 IgG1 매칭된 대조군 항체를 받은 WT 마우스 중 한 코호트(cohort)의 경우를 제외하고, 코호트는 WT 또는 hFcRn 마우스 중에서 각각 4개를 함유하였다. 마우스는 이소형-매칭된(hIgG1) 대조군, 항-hCD3xCD20 IgG1△Adp 이중특이성, 항-hCD3 IgG1, 또는 항-hCD3 IgG1△Adp△ 호모다이머의 1mg/kg을 받았다. 모든 시험 항목을 피하로 투여하였다. 혈액을 0시간, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일, 및 30일에 수집하였다.
인간 항체들의 혈청 수준을 샌드위치 ELISA에 의해 결정하였다. 간략하게, 염소 다클론성 항-인간 IgG (Fc-특이적) 항체(Jackson ImmunoResearch)를 1 마이크로그램/mL의 농도에서 96-웰 플레이트 중에서 코팅하였고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 플레이트를 BSA로 차단한 후, 6-용량 연속 희석으로 혈청 샘플 및 12-용량 연속 희석에서 각 항체의 기준 표준을 플레이트에 첨가하였고, 실온에서 한 시간 동안 인큐베이팅하였다. 비결합 항체로 희석 후, 포획한 인간 항체들을 겨자무과산화효소(HRP) (Jackson ImmunoResearch)와 콘쥬게이트한 동일한 염소 다클론성 항-인간 IgG (Fc-특이적) 항체를 사용하여 검출하였고, 제조업자의 추천에 따라서 표준 비색분석 테트라메틸벤지딘(TMB)에 의해 개발하였다. 450 nm에서 흡광도를 플레이트 판독기에서 기록하였고, 혈청 샘플 중의 hIgG의 농도를 샘플 플레이트에서 만들어진 기준 표준 곡선을 사용하여 계산하였다.
시험한 30일의 기간에 걸쳐 4개의 IgG1 항체의 혈청 반감기에서 상당한 차이가 없음을 관찰하였다. 특히, △Adp 변형 및 야생형 IgG1 항체를 가지는 IgG1 항체 사에어서 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 야생형(mFcRn) 마우스 또는 인간화된 FcRn (hFcRn)를 가지는 마우스 중 하나에 의해 항체 사이에 관찰된 차이는 없었다. 예상한 바와 같이, hFcRn 마우스는 야생형 마우스보다 약간 더 빠른 클리어런스를 나타내었다. 결과를 표 3에 나타낸다.
마우스에서 피하 주입 후 평균 PK 모수추정
마우스
유전자형
항체
n 		C max
(mcg/mL)		 AUC
((hr)(mcg/mL))
mFcRn CD3xCD20 4 9.0±2.3 114.3±30.6
CD3 4 11.1±1.7 175.4±56.4
CD3DAdpDAdp 4 11.7±1.8 155.3±34.02
대조군 hIgG 3 15.1±3.01 162.5±27.02
hFcRn CD3xCD20 4 12.3±0.98 83.2±18.6
CD3 4 7.7±2.2 65.2±16.5
CD3DAdpDAdp 4 9.9±1.34 70.4±15.4
대조군 hIgG 4 16.1±2.7 131.3±20.4
실시예 10: 저-염 버퍼에서 대규모 배양물(large-scale culture) 분리
이중특이성 CD3xCD20△Adp 항체를 대규모 배양물로부터 본 발명에 따라서 분리하였다. 간략하게, 이중특이성 항-hCD3xCD20△Adp (CD3 중쇄에서 변형) 항체를 발현시키는 CHO-K1 셀라인을 11-리터 생반응기에서 배양하였다. 이중특이성 항체를 함유하는 세포는 약 8.25 x 106 세포/mL의 밀도로 성장하여, 약 250-350 mg 항체/L를 수득하였다. 대조적으로, 대조군 항-hCD3 항체는 약 100-150 mg/L를 수득하였다.
항체를 10mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl로 평형상태로 만든 MabSelect SuRe™ 수지(GE) (20 cm bed height, 1 cm ID) 상에서, pH 7.2에서 분리하였고, 19 g/L로 장약한 세포 배양물을 정제하였고, 컬럼을 3 컬럼 부피의 10 mM 인산나트륨, 0.5 M NaCl, pH 7.2로 세척한 다음, 2 컬럼 부피의 20 mM 인산나트륨, pH 7.2 (NaCl 없음)으로 세척하였다. 항체를 40 mM 아세테이트, pH 3.0으로 용리하였다.
단일특이성 항-CD30 항체를 pH 3.6에서 용리한 반면, 이중특이성 항-hCD3xCD20DAdp를 pH 4.4에서 용리하였다.
실시예 11: 약한 pH로 마우스 헤테로다이머의 선택적 단백질 A 용리
CHO-K1 세포를 야생형 또는 돌연변이체(TTTK 또는 PTTK) mIgG2a Fc와 융합된 인간 IFNAR1 (hIFNAR1) 및 인간 IFNAR2 (hIFNAR2) 세포밖 도메인에 대한 발현 구성체로 일시적으로 트랜스펙션하였다. hIFNAR1-mFc과 hIFNAR2-mFc 사이의 비율을 2개의 발현 플라스미드의 동일한 양으로 트랜스펙션한 세포에 의해 1:1에서 유지하였다. 배양 배지를 트랜스펙션 4일 후에 수집하였고, 0.2 mL NAb 단백질 A Plus™ 스핀 컬럼(Thermo Scientific/Pierce)을 사용하여 단백질 A 정제를 받게 하였다. 간략하게, 컬럼을 1x PBS, pH 7.2로 평형상태를 유지하였다. 1ml의 CHO-K1 배양물 배지를 실온에서 10분 동안 단백질 A 수지로 인큐베이팅하였다. 이어서 컬럼을 1x PBS, pH 7.2로 3회 세척하였다. 결합 단백질을 1M NaCl을 함유하는 20 mM 시트르산나트륨으로 용리하였다. pH를 감소시키는 0.4 mL의 용리 버퍼를 사용하여 3번의 용리를 수행하였다. 다른 분획의 단백질을 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다.
결과는 pH 구배 용리로, 야생형 mIgG2a의 호모다이머로부터 야생형의 헤테로다이머 및 성형돌연변이체 mIgG2a를 분리할 수 있다는 것을 나타낸다(도 9의 겔에서 분획 E1을 참조).
실시예 12: 이소형 헤테로다이머에 대한 mIgG2a 돌연변이체의 바람직한 헤테로다이머 형성
C-말단 마우스 Fc(mIgG2a 또는 mIgG1)를 가지는 인간형 I 인터페론 수용체(hIFNAR1 및 hIFNAR2)의 세포밖 도메인의 포유동물 발현을 위해 DNA 플라스미드를 구성하였다. mIgG2a 서열의 돌연변이를 자리-지정 돌연변이를 사용하여 도입하였다. 돌연변이체는 TTT = M252T, S254T, S256T; TTTK = M252T, S254T, S256T, I258K; PTTTK = I247P, M252T, S254T, S256T, I258K; RF = H435R, H436F이다. CHO-K1 세포를 발현 구성체로 일시적으로 트랜스펙션하였다. hIFNAR2-mFc (mIgG1 또는 돌연변이체 mIgG2a)보다 4배 큰 hIFNAR1-mFc 발현 플라스미드(hIFNAR1-mIgG2a)로 세포를 트랜스펙션함으로써, IFNAR1-mFc 및 IFNAR2-mFc 사이의 비율을 4:1에서 유지하였다. 배양물 배지를 트랜스펙션 4일 후에 수집하였고, mFc 단백질을 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다.
결과는 mIgG2a와 mIgG1 사이의 헤테로다이머 형성이 야생형 mIgG2a와 mIgG2a 돌연변이체 사이의 헤테로다이머 형성보다 훨씬 덜 효율적이라는 것을 나타낸다(도 10의 레인 1을 레인 2 내지 5와 비교하여). 4:1 IFNAR1 구성체:IFNAR2 구성체의 비율을 실험에서 과량의 야생형 IgG2a 구성체를 유지하기 위해 사용하였다.
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Claims (20)

  1. a. N-말단 내지 C-말단, 제1 에피토프에 선택적으로 결합하는 제1 에피토프-결합 영역, IgG1, IgG2 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제1 CH3 영역을 포함하는 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및
    b. N-말단 내지 C-말단, 제2 에피토프에 선택적으로 결합하는 제2 에피토프-결합 영역, IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택되는 인간 IgG의 제2 CH3 영역을 포함하며, 제2 CH3 영역은 단백질 A에 제2 CH3 도메인의 결합을 감소 또는 제거하는 변형을 포함하는 제2 폴리펩티드
    를 포함하는 헤테로다이머 이중특이성 항원-결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 인간 IgG 중쇄인 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  3. 제1항에 있어서, 면역글로불린 경쇄를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 면역글로불린 경쇄는 인간 면역글로불린 경쇄인 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  5. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 폴리펩티드는 각각의 인간 IgG1 중쇄인 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  6. 제1항에 있어서, 변형은 IMGT 엑손 넘버링 시스템에서 (a) 95R, 및 (b) 95R 및 96F, 또는 EU 넘버링 시스템에서 (a') 435R, 및 (b') 435R 및 436F로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  7. 제6항에 있어서, IMGT 엑손 넘버링 시스템에서 16E, 18M, 44S, 52N, 57M, 및 82I, 또는 EU 넘버링 시스템에서 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 및 422I로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 내지 5개의 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  8. 제6항에 있어서, 이중특이성 항체의 CH3 도메인은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성인 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 이중특이성 항체의 CH3 도메인은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성인 것을 특징으로 하는 이중특이성 단백질.
  10. 제1 에피토프를 인식하는 제1 가변 도메인을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 얻는 단계로서, 제1 면역글로불린 중쇄는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형 불변 도메인을 포함하는 것인 단계,
    b. 제2 에피토프를 인식하는 제2 가변 도메인을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄를 암호화하는 제2 핵산 서열을 얻는 단계로서, 제2 면역글로불린 중쇄는 단백질 A에 결합을 근절 또는 감소시키는 CH3 도메인에서 변형을 포함하는 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 이소형 불변 도메인을 포함하는 것인 단계;
    c. 제1 및 제2 면역글로불린 중쇄와 짝짓는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 제3 핵산 서열을 얻는 단계;
    d. 제1, 제2 및 제3 핵산 서열을 포유동물 세포에 도입하는 단계;
    e. 세포를 이중특이성 항체로 발현시키는 단계; 및
    f. 단백질 A와 결합하는 이중특이성 항체의 능력을 기반으로 이중특이성 항체를 분리하는 단계
    를 포함하는 이중특이성 항체의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 변형은 IMGT 엑손 넘버링 시스템에서 (a) 95R, 및 (b) 95R 및 96F, 또는 EU 넘버링 시스템에서 (a') 435R, 및 (b') 435R 및 436F로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, IMGT 엑손 넘버링 시스템에서 16E, 18M, 44S, 52N, 57M, 및 82I, 또는 EU 넘버링 시스템에서 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 및 422I로 구성되는 군으로부터 선택되는 1 내지 5개의 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 이중특이성 항체의 CH3 도메인은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 이중특이성 항체의 CH3 도메인은 인간에서 비-면역원성 또는 실질적으로 비-면역원성인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제10항에 있어서, 이중특이성 항체는 단백질 A를 포함하는 고체 지지체 상에서 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 고체 지지체는 단백질 A 친화성 컬럼을 포함하고, 이중특이성 항체는 pH 구배를 사용하여 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, pH 구배는 pH 3과 pH 5 사이에서 하나 이상의 pH 단계를 포함하는 단계 구배인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 파쇄된 세포 또는 항체들의 혼합물로부터 다르게 변형된 IgG1, IgG2, 또는 IgG4 CH3 도메인을 가지는 이중특이성 항체를 분리하는 단계를 포함하며, 다르게 변형된 CH3 도메인은 인간에서 비-면역원성이거나 또는 실질적으로 비-면역원성이고, 변형은 모노머가 단백질 A에 대해 다른 친화도를 가지는 헤테로다이머 중쇄 불변 영역이 있는 이중특이성 항체를 초래하고, 이중특이성 항체는 단백질 A에 대한 친화도에 기반하여 파쇄된 세포 또는 혼합물로부터 분리되는, 이중특이성 항체를 분리하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 헤테로다이머 중쇄 불변 영역의 한 모노머는 인간 IgG1이고, 헤테로다이머 중쇄 불변 영역의 다른 모노머는 IMGT 엑손 넘버링 시스템에서 (a) H95R, 및 (b) H95R 및 Y96F, 또는 EU 넘버링 시스템에서 (a') H435R, 및 (b') H435R 및 Y436F로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 포함하는 변형된 인간 IgG1인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 변형된 인간 IgG1은 IMGT 엑손 넘버링 시스템에서 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, 및 V82I, 또는 EU 넘버링 시스템에서 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I로 구성되는 군으로부터 선택되는 변형을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (481)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090137416A1 (en) 2001-01-16 2009-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating Cells Expressing Secreted Proteins
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
CN100480260C (zh) 2002-07-18 2009-04-22 克鲁塞尔荷兰公司 抗体混合物的重组生产
WO2004106375A1 (en) 2003-05-30 2004-12-09 Merus Biopharmaceuticals B.V. I.O. Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US11254748B2 (en) 2005-04-15 2022-02-22 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9284375B2 (en) 2005-04-15 2016-03-15 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
US9963510B2 (en) 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
ES2707152T3 (es) 2005-04-15 2019-04-02 Macrogenics Inc Diacuerpos covalentes y usos de los mismos
EP4342995A2 (en) 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
MX2010003450A (es) 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
KR102269708B1 (ko) 2008-04-11 2021-06-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
KR101747103B1 (ko) 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
BR112012004697B8 (pt) * 2009-09-01 2021-05-25 Genentech Inc método para purificar um polipeptídeo compreendendo uma região ch2/ch3
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
AU2010336277B2 (en) * 2009-12-25 2015-02-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Polypeptide modification method for purifying polypeptide multimers
ES2603559T5 (es) 2010-02-08 2021-02-22 Regeneron Pharma Cadena ligera común de ratón
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
EA201201435A1 (ru) * 2010-04-20 2013-04-30 Генмаб А/С ГЕТЕРОДИМЕРНЫЕ АНТИТЕЛО-Fc-СОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
DK3029066T3 (da) 2010-07-29 2019-05-20 Xencor Inc Antistoffer med modificerede isoelektriske punkter
KR102434557B1 (ko) 2010-08-02 2022-08-23 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Ｖｌ 도메인을 포함하는 결합 단백질을 생성하는 마우스
CN103154025B (zh) 2010-08-02 2015-07-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
MX352929B (es) 2010-11-05 2017-12-13 Zymeworks Inc DISEÑO DE ANTICUERPOS HETERODIMÉRICOS ESTABLES CON MUTACIONES EN EL DOMINIO Fc.
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون
AU2011337704B2 (en) 2010-11-30 2017-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
US11066483B2 (en) 2010-11-30 2021-07-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent
KR102147548B1 (ko) * 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
WO2012132067A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
TWI671315B (zh) 2011-03-28 2019-09-11 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
MX347818B (es) 2011-05-21 2017-05-15 Macrogenics Inc Dominios que enlazan suero desinmunizados y su uso para prolongar la vida media en suero.
CN103827300A (zh) * 2011-06-30 2014-05-28 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
SG10201606158TA (en) 2011-08-05 2016-09-29 Regeneron Pharma Humanized universal light chain mice
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
PT2627773T (pt) * 2011-10-17 2017-09-29 Regeneron Pharma Ratinhos de cadeia pesada de imunoglobulina restrita
LT2771364T (lt) 2011-10-27 2019-09-10 Genmab A/S Heterodimerinių baltymų gamyba
KR102398736B1 (ko) 2011-10-31 2022-05-16 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
DK2773671T3 (da) 2011-11-04 2021-11-15 Zymeworks Inc Udformning af stabilt heterodimert antistof med mutationer i fc-domænet
HUE038570T2 (hu) 2011-11-14 2018-10-29 Regeneron Pharma Készítmények és eljárások izomtömeg és izomerõ növelésére GDF8 és/vagy aktivin A specifikus antagonizálásával
HUE051644T2 (hu) 2011-11-18 2021-03-01 Regeneron Pharma Biológiailag lebomló bevonattal ellátott, terápiás fehérjét tartalmazó mikrorészecske orvosi alkalmazásra
CN113416256A (zh) 2011-11-30 2021-09-21 中外制药株式会社 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物
RS60499B1 (sr) * 2011-12-20 2020-08-31 Medimmune Llc Modifikovani polipeptidi za bispecifične skelete antitela
JP2015509962A (ja) 2012-03-02 2015-04-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素に対するヒト抗体
RU2683514C2 (ru) 2012-03-06 2019-03-28 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Мышь с общей легкой цепью
US9815909B2 (en) 2012-03-13 2017-11-14 Novimmune S.A. Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
US9301510B2 (en) 2012-03-16 2016-04-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that produce antigen-binding proteins with pH-dependent binding characteristics
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
KR102459666B1 (ko) 2012-03-16 2022-10-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 pH-민감성 면역글로불린 서열을 발현하는 비-사람 동물
EP2825036B1 (en) 2012-03-16 2018-05-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents for generating the same
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
NZ772318A (en) 2012-04-20 2023-06-30 Merus Nv Methods and means for the production of ig-like molecules
RU2014147741A (ru) 2012-04-27 2016-06-20 Байоатла Ллк. Модифицированные области антител и их применение
PL3597037T3 (pl) 2012-06-12 2021-10-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizowane zwierzęta inne niż ludzie z ograniczonymi loci łańcucha ciężkiego immunoglobuliny
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
WO2014006217A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
JO3462B1 (ar) 2012-08-22 2020-07-05 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية تجاه gfr?3 وطرق لاستخدامها
TWI717591B (zh) 2012-08-24 2021-02-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
JOP20200236A1 (ar) * 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
EP2900696A1 (en) 2012-09-25 2015-08-05 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
DK2900694T3 (en) * 2012-09-27 2018-11-19 Merus Nv BISPECIFIC IGG ANTIBODIES AS T-CELL ACTIVATORS
US9714291B2 (en) 2012-10-05 2017-07-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Heterodimer protein composition
CA2889951C (en) 2012-11-02 2023-04-18 Zymeworks Inc. Crystal structures of heterodimeric fc domains
CA2890575C (en) 2012-11-05 2021-11-09 Jumpei Enami Antibody and antibody composition production method
TWI675044B (zh) * 2012-11-14 2019-10-21 美商再生元醫藥公司 重組細胞表面捕捉蛋白質
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
JP6347490B2 (ja) 2012-11-28 2018-06-27 ザイムワークス，インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖−軽鎖対およびその使用
JP6433297B2 (ja) 2012-12-27 2018-12-05 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
KR20200134340A (ko) 2013-01-10 2020-12-01 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
WO2014110601A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9738722B2 (en) 2013-01-15 2017-08-22 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
EP3351095A1 (en) 2013-02-20 2018-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
US9487587B2 (en) 2013-03-05 2016-11-08 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells of a companion animal that express an activating receptor and cells that express B7-H3 and uses thereof
JP2016519568A (ja) 2013-03-13 2016-07-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 共通軽鎖のマウス
HUE044003T2 (hu) 2013-03-13 2019-09-30 Regeneron Pharma Korlátozott immunglobulin könnyûlánc-repertoárt expresszáló egerek
JP6285532B2 (ja) * 2013-03-14 2018-02-28 イー・エム・デイー・ミリポア・コーポレイシヨン タンパク質ａに基づくクロマトグラフィを使用するタンパク質純度を増加させる方法
US9908938B2 (en) 2013-03-14 2018-03-06 Macrogenics, Inc. Bispecific molecules that are immunoreactive with immune effector cells that express an activating receptor and an antigen expressed by a cell infected by a virus and uses thereof
CN105189548A (zh) 2013-03-14 2015-12-23 瑞泽恩制药公司 Grem1的人抗体
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
EP3421495A3 (en) 2013-03-15 2019-05-15 Xencor, Inc. Modulation of t cells with bispecific antibodies and fc fusions
KR102049990B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
KR20210130260A (ko) 2013-04-02 2021-10-29 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Ｆｃ영역 개변체
US11357866B2 (en) * 2013-04-03 2022-06-14 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Expression of HIV inhibitors by mesenchymal stem cells
RU2019108429A (ru) * 2013-04-29 2019-05-06 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифицированные асимметричные антитела, связывающие fc-рецептор, и способы их применения
ES2746136T3 (es) 2013-04-29 2020-03-04 Hoffmann La Roche Anticuerpos modificados de unión a FcRn humano y procedimientos de uso
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
US11384149B2 (en) 2013-08-09 2022-07-12 Macrogenics, Inc. Bi-specific monovalent Fc diabodies that are capable of binding CD32B and CD79b and uses thereof
UA116479C2 (uk) 2013-08-09 2018-03-26 Макродженікс, Інк. БІСПЕЦИФІЧНЕ МОНОВАЛЕНТНЕ Fc-ДІАТІЛО, ЯКЕ ОДНОЧАСНО ЗВ'ЯЗУЄ CD32B I CD79b, ТА ЙОГО ЗАСТОСУВАННЯ
EP2840091A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof
EP2839842A1 (en) 2013-08-23 2015-02-25 MacroGenics, Inc. Bi-specific monovalent diabodies that are capable of binding CD123 and CD3 and uses thereof
EP3041865A2 (en) * 2013-09-03 2016-07-13 NovImmune S.A. Readily isolated bispecific binding molecules with native format having mutated constant regions
CN104418947A (zh) * 2013-09-11 2015-03-18 香港大学 抗her2和抗-igf-ir的双特异性抗体及其用途
ES2962489T3 (es) 2013-09-18 2024-03-19 Regeneron Pharma Anticuerpos de cadena ligera diseñados genéticamente con histidina y animales no humanos modificados genéticamente para generar los mismos
JP6534615B2 (ja) * 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
AU2014343636A1 (en) 2013-11-04 2016-06-02 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
CA2931299C (en) 2013-11-20 2024-03-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aplnr modulators and uses thereof
JP6817064B2 (ja) 2013-11-27 2021-01-20 ザイムワークス，インコーポレイテッド Ｈｅｒ２を標的とする二重特異性抗原結合性コンストラクト
RS60443B1 (sr) 2013-12-17 2020-07-31 Genentech Inc Anti-cd3 antitela i postupci upotrebe
JP2017029001A (ja) * 2013-12-19 2017-02-09 国立研究開発法人産業技術総合研究所 プロテインｇの細胞膜外ドメインの新規な改変型タンパク質
CN110903398B (zh) 2014-01-15 2023-08-15 豪夫迈·罗氏有限公司 具有修饰的FCRN和保持的蛋白A结合性质的Fc区变体
KR20160104636A (ko) 2014-01-15 2016-09-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 단백질 Ａ-결합이 개선된 Ｆｃ-영역 변이체
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
EP3107565A4 (en) * 2014-02-21 2017-08-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods, compositions and kits for cell specific modulation of target antigens
IL301147A (en) 2014-02-28 2023-05-01 Merus Nv An antibody that binds to ErbB-2 and ErbB-3
US10844127B2 (en) 2014-02-28 2020-11-24 Merus N.V. Antibodies that bind EGFR and ErbB3
TWI701042B (zh) * 2014-03-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 用於腫瘤治療之方法及抗體組成物
KR102601491B1 (ko) 2014-03-21 2023-11-13 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
SG11201607015VA (en) 2014-03-21 2016-09-29 Regeneron Pharma V<sb>L</sb> ANTIGEN BINDING PROTEINS EXHIBITING DISTINCT BINDING CHARACTERISTICS
CR20160506A (es) 2014-03-28 2017-03-10 Xencor Inc Anticuerpos biespecíficos que se unen a cd38 y cd3
CA2943943C (en) 2014-04-07 2023-01-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Immunoactivating antigen-binding molecule
MX2016014434A (es) * 2014-05-13 2017-02-23 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union a antigeno redirigida a celulas t para celulas que tienen funcion de inmunosupresion.
JO3701B1 (ar) 2014-05-23 2021-01-31 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية - بروتين كورونا فيروس الشوكي
EP4026850A1 (en) 2014-05-28 2022-07-13 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
MA47849A (fr) 2014-05-28 2020-01-29 Agenus Inc Anticorps anti-gitr et leurs procédés d'utilisation
US10647768B2 (en) 2014-05-29 2020-05-12 Macrogenics, Inc. Multi-chain polypeptide-containing tri-specific binding molecules
AR101262A1 (es) * 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
TW201625690A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 抗－ｃｌｌ－１抗體及免疫結合物
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
SG11201702544WA (en) 2014-09-29 2017-04-27 Univ Duke Bispecific molecules comprising an hiv-1 envelope targeting arm
US11773166B2 (en) 2014-11-04 2023-10-03 Ichnos Sciences SA CD3/CD38 T cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins and methods of their production
MA40894A (fr) * 2014-11-04 2017-09-12 Glenmark Pharmaceuticals Sa Immunoglobulines hétéro-dimères reciblant des lymphocytes t cd3/cd38 et leurs procédés de production
MX2017005148A (es) * 2014-11-06 2017-08-08 Hoffmann La Roche Variantes de region fc con union del receptor fc neonatal (fcrn) modificado y metodos de uso.
MX2017005150A (es) * 2014-11-06 2017-08-08 Hoffmann La Roche Variantes de region fc con propiedades modificadas de union a receptor neonatal fc (fcrn) y proteina a.
CA2967820A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for tumor treatment using cd3xcd20 bispecific antibody
US11566082B2 (en) 2014-11-17 2023-01-31 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CA2968878A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd38
DK3223845T3 (da) 2014-11-26 2021-08-16 Xencor Inc Heterodimere antistoffer, der binder cd3 og cd20
ES2717308T3 (es) 2014-12-06 2019-06-20 Gemoab Monoclonals Gmbh Células madre pluri- o multi-potentes genéticamente modificadas y sus usos
TWI701258B (zh) 2014-12-19 2020-08-11 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
JP7211703B2 (ja) 2014-12-22 2023-01-24 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 抗ｍｅｒｔｋアゴニスト抗体及びその使用
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
CN107667120B (zh) 2015-03-17 2022-03-08 纪念斯隆-凯特林癌症中心 抗muc16抗体及其应用
CN107438622A (zh) 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
TWI804917B (zh) 2015-03-27 2023-06-11 美商再生元醫藥公司 偵測生物污染物之組成物及方法
CA2981312C (en) 2015-03-30 2023-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Heavy chain constant regions with reduced binding to fc gamma receptors
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
CA2982810A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors
US10520511B2 (en) 2015-05-12 2019-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multimeric protein purity determination
PL3303394T3 (pl) 2015-05-29 2020-11-16 Agenus Inc. Przeciwciała anty-ctla-4 i sposoby ich zastosowania
EP3307776A1 (en) 2015-06-15 2018-04-18 Numab Innovation AG Hetero-dimeric multi-specific antibody format
US10501545B2 (en) 2015-06-16 2019-12-10 Genentech, Inc. Anti-CLL-1 antibodies and methods of use
CA2990518A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Innate Pharma Multispecific nk engager proteins
AU2016289480C1 (en) 2015-07-06 2021-10-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
WO2017005649A1 (en) 2015-07-09 2017-01-12 Genmab A/S Bispecific and multispecific antibodies and method for isolation of such
EP3115376B1 (en) 2015-07-10 2018-09-05 Merus N.V. Human cd3 binding antibody
RS60141B1 (sr) 2015-07-10 2020-05-29 Genmab As Konjugati antitela specifičnog za axl i lekova za lečenje kancera
JOP20160154B1 (ar) 2015-07-31 2021-08-17 Regeneron Pharma أجسام ضادة مضاد لل psma، وجزيئات رابطة لمستضد ثنائي النوعية الذي يربط psma و cd3، واستخداماتها
TW202340452A (zh) 2015-08-04 2023-10-16 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
BR112017026543A2 (pt) * 2015-08-26 2018-08-14 Bison Therapeutics Inc plataforma de anticorpo multiespecífico e métodos relacionados
BR112018003186A2 (pt) 2015-09-01 2018-09-25 Agenus Inc. anticorpos anti-pd-1 e seus métodos de uso
AU2016334063B2 (en) 2015-10-08 2023-05-25 Zymeworks Bc Inc. Antigen-binding polypeptide constructs comprising kappa and lambda light chains and uses thereof
TWI756187B (zh) 2015-10-09 2022-03-01 美商再生元醫藥公司 抗ｌａｇ３抗體及其用途
LT3365373T (lt) 2015-10-23 2021-05-25 Merus N.V. Surišančios molekulės, kurios inhibuoja vėžio augimą
JP6998869B2 (ja) 2015-11-08 2022-02-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重特異性抗体のスクリーニング方法
EP3378488A4 (en) 2015-11-18 2019-10-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha METHOD FOR ENHANCING THE HUMORAL IMMUNE RESPONSE
WO2017086367A1 (ja) 2015-11-18 2017-05-26 中外製薬株式会社 免疫抑制機能を有する細胞に対するｔ細胞リダイレクト抗原結合分子を用いた併用療法
CN108699136B (zh) 2015-12-07 2022-03-18 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
SG11201803989WA (en) * 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
GB201602156D0 (en) * 2016-02-05 2016-03-23 Jones Philip C And Boku University Of Natural Resources And Life Sciences Heterodimers and purification thereof
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
AU2017238172A1 (en) 2016-03-21 2018-09-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
SG11201807885PA (en) * 2016-04-20 2018-10-30 Regeneron Pharma Compositions and methods for making antibodies based on use of expression-enhancing loci
US11530277B2 (en) 2016-04-20 2022-12-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for making antibodies based on use of an expression-enhancing locus
WO2017190079A1 (en) 2016-04-28 2017-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of making multispecific antigen-binding molecules
US10889615B2 (en) 2016-05-11 2021-01-12 Cytiva Bioprocess R&D Ab Mutated immunoglobulin-binding polypeptides
JP7106187B2 (ja) 2016-05-11 2022-07-26 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを保存する方法
US10703774B2 (en) 2016-09-30 2020-07-07 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
US10654887B2 (en) 2016-05-11 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Process R&D Ab Separation matrix
JP6987424B2 (ja) 2016-05-11 2022-01-05 サイティバ・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ 分離マトリックスを洗浄および／または消毒する方法
CN109071613A (zh) 2016-05-11 2018-12-21 通用电气医疗集团生物工艺研发股份公司 分离基质
US10730908B2 (en) 2016-05-11 2020-08-04 Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab Separation method
TWI786044B (zh) 2016-05-13 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 藉由投予ｐｄ-１抑制劑治療皮膚癌之方法
RU2021106817A (ru) 2016-05-20 2021-04-06 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк
CA3024508A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Agenus Inc. Anti-tim-3 antibodies and methods of use thereof
AU2017283470B2 (en) 2016-06-14 2024-03-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-C5 antibodies and uses thereof
WO2017218707A2 (en) 2016-06-14 2017-12-21 Xencor, Inc. Bispecific checkpoint inhibitor antibodies
CN116063545A (zh) 2016-06-28 2023-05-05 Xencor股份有限公司 结合生长抑素受体2的异源二聚抗体
KR20190039937A (ko) 2016-07-08 2019-04-16 스태튼 바이오테크놀로지 비.브이. 항-ApoC3 항체 및 이의 사용 방법
TW201815821A (zh) 2016-07-18 2018-05-01 美商再生元醫藥公司 抗茲卡病毒抗體及使用方法
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3037732A1 (en) 2016-09-23 2018-03-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
KR102418667B1 (ko) 2016-09-23 2022-07-12 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-muc16 (뮤신 16) 항체
MA46529A (fr) 2016-10-11 2019-08-21 Agenus Inc Anticorps anti-lag-3 et leurs procédés d'utilisation
EP3526241A1 (en) 2016-10-14 2019-08-21 Xencor, Inc. Il15/il15r heterodimeric fc-fusion proteins
JP7277363B2 (ja) 2016-11-01 2023-05-18 ジェンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変異体およびその使用
CA3042989A1 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Junho Chung Anti-family with sequence similarity 19, member a5 antibodies and method of use thereof
WO2018093821A1 (en) 2016-11-15 2018-05-24 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
JP6992068B2 (ja) 2016-12-07 2022-02-03 アジェナス インコーポレイテッド 抗ｃｔｌａ－４抗体およびそれらの使用方法
US20190322767A1 (en) 2016-12-23 2019-10-24 Innate Pharma Heterodimeric antigen binding proteins
TW202311284A (zh) 2017-01-03 2023-03-16 美商再生元醫藥公司 抗金黃色葡萄球菌溶血素ａ毒素之人類抗體
KR20190133160A (ko) 2017-02-07 2019-12-02 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항-gprc5d 항체 및 항-gprc5d 항체를 포함하는 분자
MA46814B2 (fr) 2017-02-10 2022-09-30 Regeneron Pharma Anticorps anti-lag3 radiomarqués pour imagerie immuno-pet
SG11201906961UA (en) 2017-02-10 2019-08-27 Genmab Bv Polypeptide variants and uses thereof
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
WO2018151841A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
CA3053774A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
JP7116736B2 (ja) 2017-03-02 2022-08-10 ノバルティス アーゲー 操作されたヘテロ二量体タンパク質
WO2018183182A1 (en) 2017-03-27 2018-10-04 Celgene Corporation Methods and compositions for reduction of immunogenicity
WO2018178396A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Genmab Holding B.V. Bispecific anti-cd37 antibodies, monoclonal anti-cd37 antibodies and methods of use thereof
WO2018182422A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Merus N.V. Erbb-2 and erbb3 binding bispecific antibodies for use in the treatment f cells that have an nrg1 fusion gene
US11603407B2 (en) 2017-04-06 2023-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Stable antibody formulation
CA3058477A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
KR102629972B1 (ko) 2017-04-13 2024-01-29 아게누스 인코포레이티드 항-cd137 항체 및 이의 사용 방법
CN110506056A (zh) 2017-04-21 2019-11-26 斯塔滕生物技术有限公司 抗apoc3抗体和其使用方法
PL3618863T3 (pl) 2017-05-01 2023-11-06 Agenus Inc. Przeciwciała anty- tigit i sposoby ich zastosowania
EP3630836A1 (en) 2017-05-31 2020-04-08 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
US11149094B2 (en) * 2017-06-05 2021-10-19 Janssen Biotech, Inc. Engineered multispecific antibodies and other multimeric proteins with asymmetrical CH2-CH3 region mutations
EP3635014B1 (en) 2017-06-05 2023-09-27 Numab Therapeutics AG Hetero-dimeric multi-specific antibody format targeting at least cd3 and hsa
CA3066569A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
MA49259A (fr) 2017-06-07 2020-04-15 Genmab Bv Anticorps thérapeutiques à base d'hexamères d'igg mutées
GB201709970D0 (en) 2017-06-22 2017-08-09 Kymab Ltd Bispecific antigen-binding molecules
WO2019006043A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. RECOMBINANT VIRAL VECTORS WITH MODIFIED TROPISM AND USES THEREOF FOR TARGETED INTRODUCTION OF GENETIC MATERIAL INTO HUMAN CELLS
US11696572B2 (en) 2017-06-27 2023-07-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ASGR1 locus
JP2020526584A (ja) 2017-06-28 2020-08-31 ザ ロックフェラー ユニバーシティー 抗ｍｅｒｔｋアゴニスト抗体−薬物コンジュゲートおよびその使用
AU2018290856A1 (en) 2017-06-28 2020-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-human papillomavirus (HPV) antigen-binding proteins and methods of use thereof
CN111132733A (zh) 2017-06-30 2020-05-08 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和抗原结合结构域的靶向异源二聚体Fc融合蛋白
US20190010531A1 (en) 2017-07-06 2019-01-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cell culture process for making a glycoprotein
EP3650547A4 (en) 2017-07-06 2021-03-10 Nitto Boseki Co., Ltd. MONOCLONAL ANTI-HUMAN IGG4 ANTIBODY AND HUMAN IGG4 ASSAY REAGENT USING THIS ANTIBODY
TW201919582A (zh) 2017-07-24 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 穩定化之抗體組合物及其製法
TWI799432B (zh) 2017-07-27 2023-04-21 美商再生元醫藥公司 抗ctla-4抗體及其用途
US20210206882A1 (en) * 2017-08-01 2021-07-08 Ab Studio Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
HUE058233T2 (hu) 2017-08-03 2022-07-28 Amgen Inc Interleukin-21-muteinek és kezelési eljárások
TW201910354A (zh) 2017-08-09 2019-03-16 荷蘭商美勒斯公司 結合表皮生長因子受體(EGFR)及cMET的抗體
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
SG11202001311VA (en) 2017-08-22 2020-03-30 Sanabio Llc Soluble interferon receptors and uses thereof
SG11202001499WA (en) 2017-09-08 2020-03-30 Amgen Inc Inhibitors of kras g12c and methods of using the same
CN111448212A (zh) * 2017-09-14 2020-07-24 戴纳立制药公司 抗trem2抗体及其使用方法
AU2018338790B2 (en) 2017-09-29 2022-09-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TTR locus and methods of use
MA50659A (fr) 2017-09-29 2020-08-05 Regeneron Pharma Molécules bispécifiques de liaison à l'antigène se liant à un antigène cible de staphylococcus et à un composant de complément, et leurs utilisations
CN111164101A (zh) 2017-10-04 2020-05-15 安进公司 甲状腺素视黄质运载蛋白免疫球蛋白融合体
JP7450535B2 (ja) 2017-10-20 2024-03-15 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 単一特異性抗体から多重特異性抗体を生成させるための方法
MX2020004100A (es) 2017-10-30 2020-07-24 Hoffmann La Roche Metodo para generacion in vivo de anticuerpos multiespecificos a partir de anticuerpos monoespecificos.
SG11202003980PA (en) 2017-10-31 2020-05-28 Staten Biotechnology B V Anti-apoc3 antibodies and methods of use thereof
EP3704153A2 (en) 2017-11-02 2020-09-09 Bayer Aktiengesellschaft Bispecific antibodies binding alk-1 and bmpr-2
WO2019090110A1 (en) * 2017-11-03 2019-05-09 Lentigen Technology, Inc. Compositions and methods for treating cancer with anti-ror1 immunotherapy
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11312770B2 (en) 2017-11-08 2022-04-26 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-PD-1 sequences
EP3713959A1 (en) 2017-11-21 2020-09-30 Innate Pharma Multispecific antigen binding proteins
AU2018375796A1 (en) 2017-11-30 2020-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TRKB locus
KR20200098528A (ko) 2017-12-13 2020-08-20 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-c5 항체 조합물 및 이의 용도
CA3086199A1 (en) 2017-12-19 2019-06-27 Xencor, Inc. Engineered il-2 fc fusion proteins
EP3728328A1 (en) 2017-12-22 2020-10-28 Argenx BVBA Bispecific antigen binding construct
SG11202004380QA (en) 2017-12-22 2020-06-29 Regeneron Pharma System and method for characterizing drug product impurities
CR20200330A (es) 2018-01-12 2020-12-23 Amgen Inc Anticuerpos anti-pd-1 y métodos de tratamiento
EP3743440A1 (en) 2018-01-24 2020-12-02 Genmab B.V. Polypeptide variants and uses thereof
SG11202006379UA (en) 2018-01-26 2020-07-29 Regeneron Pharma Human antibodies to influenza hemagglutinin
KR20200115485A (ko) 2018-01-31 2020-10-07 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 약물 생성물 불순물을 특성화하기 위한 시스템 및 방법
TWI825066B (zh) 2018-02-01 2023-12-11 美商再生元醫藥公司 治療性單株抗體之品質屬性的定量及模型化
TWI786265B (zh) 2018-02-02 2022-12-11 美商再生元醫藥公司 用於表徵蛋白質二聚合之系統及方法
AU2019218959A1 (en) 2018-02-08 2020-09-03 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
BR112020013426A2 (pt) 2018-02-28 2020-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. métodos para identificação de um vírus em uma amostra e para detecção de ácidos nucleicos virais em uma amostra de cultura de células
CN111787981A (zh) 2018-03-01 2020-10-16 瑞泽恩制药公司 改变身体组成的方法
US20210238280A1 (en) 2018-03-14 2021-08-05 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
EP3765516A2 (en) 2018-03-14 2021-01-20 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
IL307577A (en) 2018-03-19 2023-12-01 Regeneron Pharma In-house capillary electrophoresis tests and reagents
BR112020019026A2 (pt) 2018-03-24 2020-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Animal não humano geneticamente modificado, métodos para produzir o animal não humano geneticamente modificado, para geração de uma proteína de ligação a antígeno, para obtenção de um ácido nucleico, e, para obtenção de uma célula que expressa um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana e/ou um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina humana, método in vitro de produção de um domínio variável de imunoglobulina humana, ácido nucleico, célula hospedeira, célula isolada, e, domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
BR112020020604A2 (pt) 2018-04-11 2021-01-12 Inhibrx, Inc. Construções de polipeptídeo multiespecífico tendo ligação restrita de cd3 e métodos e usos relacionados
WO2019204655A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Tim-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and tim-3 antigen binding domains
KR20210010862A (ko) 2018-04-18 2021-01-28 젠코어 인코포레이티드 IL-15/IL-15Rα Fc-융합 단백질 및 PD-1 항원 결합 도메인을 함유하는 PD-1 표적화 이종이량체 융합 단백질 및 이의 용도
WO2019212965A1 (en) 2018-04-30 2019-11-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibodies, and bispecific antigen-binding molecules that bind her2 and/or aplp2, conjugates, and uses thereof
KR20210008380A (ko) 2018-05-03 2021-01-21 젠맵 비. 브이 항체 변이체 조합물 및 그의 용도
TW202016125A (zh) 2018-05-10 2020-05-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及調節蛋白質黏度之系統與方法
SG11202011232VA (en) 2018-05-17 2020-12-30 Regeneron Pharma Anti-cd63 antibodies, conjugates, and uses thereof
WO2019232484A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Compugen Ltd Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and methods of use
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
CA3104470A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-factor xii/xiia antibodies and uses thereof
TW202005985A (zh) 2018-06-21 2020-02-01 美商再生元醫藥公司 用雙特異性抗ＣＤ３ｘＭＵＣ１６抗體及抗ＰＤ－１抗體治療癌症的方法
JP2021528439A (ja) 2018-06-22 2021-10-21 ゲンマブ ホールディング ビー．ブイ． 抗ｃｄ３７抗体および抗ｃｄ２０抗体、組成物、ならびにそれらの使用方法
SG11202012713RA (en) 2018-06-22 2021-01-28 Genmab As Method for producing a controlled mixture of two or more different antibodies
US11873337B2 (en) 2018-06-26 2024-01-16 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to cell adhesion molecule 3
JP7397444B2 (ja) 2018-06-26 2023-12-13 協和キリン株式会社 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン－５に結合する抗体
WO2020003210A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Kangwon National University University-Industry Cooperation Foundation Anti-l1cam antibodies and uses thereof
DE202019005887U1 (de) 2018-07-03 2023-06-14 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR-Antikörpermoleküle und Verwendungen davon
TW202012926A (zh) 2018-07-13 2020-04-01 美商再生元醫藥公司 醣基化肽之偵測及定量
CN112513082A (zh) 2018-07-13 2021-03-16 根马布股份公司 Cd38抗体变体及其用途
EP3820890A1 (en) 2018-07-13 2021-05-19 Genmab A/S Trogocytosis-mediated therapy using cd38 antibodies
AU2019307928A1 (en) 2018-07-19 2021-02-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-BCMA x anti-CD3 antibodies and uses thereof
CN112789294A (zh) 2018-07-24 2021-05-11 印希比股份有限公司 含有受限cd3结合结构域和受体结合区的多特异性多肽构建体及其使用方法
BR112021002432A2 (pt) 2018-08-13 2021-05-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. seleção de proteína terapêutica em condições in vivo simuladas
AU2019320814A1 (en) 2018-08-17 2021-02-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for de novo protein sequencing
CA3109362A1 (en) 2018-08-17 2020-02-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method and chromatography system for determining amount and purity of a multimeric protein
EA202190601A1 (ru) 2018-08-23 2021-07-14 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. АНТИТЕЛА АНТИ-Fc ЭПСИЛОН-R1 АЛЬФА (FCER1A), БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ FCΕR1Α И CD3, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN112218877A (zh) 2018-08-27 2021-01-12 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
JP2021535361A (ja) 2018-08-30 2021-12-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質複合体を特徴づけるための方法
MX2021002190A (es) 2018-08-31 2021-05-14 Regeneron Pharma Estrategia de dosificacion que mitiga el sindrome de liberacion de citoquinas para los anticuerpos biespecificos cd3/cd20.
GB2576914A (en) 2018-09-06 2020-03-11 Kymab Ltd Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals
JP2022503959A (ja) 2018-10-03 2022-01-12 ゼンコア インコーポレイテッド Ｉｌ－１２ヘテロ二量体ｆｃ－融合タンパク質
CN112969503A (zh) 2018-10-03 2021-06-15 斯塔滕生物技术有限公司 对人类和食蟹猕猴apoc3具有特异性的抗体和其使用方法
KR20210116429A (ko) 2018-10-04 2021-09-27 젠맵 홀딩 비.브이. 이중특이적 항-cd37 항체를 포함하는 제약 조성물
WO2020076992A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. 5t4 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CN113166261A (zh) 2018-10-11 2021-07-23 印希比股份有限公司 B7h3单域抗体及其治疗性组合物
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
JP2022504822A (ja) 2018-10-11 2022-01-13 インヒブルクス インコーポレイテッド Ｄｌｌ３シングルドメイン抗体およびその治療用組成物
SG11202101037QA (en) 2018-10-23 2021-02-25 Regeneron Pharma Anti-npr1 antibodies and uses thereof
JP7439077B2 (ja) 2018-10-25 2024-02-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ウイルスカプシドタンパク質組成の分析方法
CA3100232A1 (en) * 2018-10-26 2020-04-30 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to cd38
CN113056676A (zh) 2018-10-31 2021-06-29 瑞泽恩制药公司 鉴定和定量蛋白质的方法和系统
JP2022512875A (ja) 2018-11-06 2022-02-07 ゲンマブ エー／エス 抗体製剤
EP3883961A1 (en) 2018-11-20 2021-09-29 Takeda Vaccines, Inc. Novel anti-zika virus antibodies and uses thereof
CN112867732A (zh) 2018-11-21 2021-05-28 瑞泽恩制药公司 抗葡萄球菌抗体和其用途
US11249089B2 (en) 2018-12-12 2022-02-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. System and method of analysis of a protein using liquid chromatography-mass spectrometry
US11782023B2 (en) * 2018-12-19 2023-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ce-western applications for antibody development
GB201820687D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Kymab Ltd Antagonists
EP4015538A1 (en) 2018-12-21 2022-06-22 Kymab Limited Fixaxfx bispecific antibody with common light chain
WO2020136564A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Sanofi Pseudofab-based multispecific binding proteins
AU2020208396A1 (en) 2019-01-16 2021-05-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying free thiols in proteins
KR20210122803A (ko) 2019-01-31 2021-10-12 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항체 전하 이질성의 고유 마이크로유체 ce-ms 분석
CN114126714A (zh) 2019-02-21 2022-03-01 马伦戈治疗公司 抗tcr抗体分子及其用途
CN114026122A (zh) 2019-02-21 2022-02-08 马伦戈治疗公司 结合t细胞相关癌细胞的多功能分子及其用途
JP2022521937A (ja) 2019-02-21 2022-04-13 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド ＮＫｐ３０に結合する抗体分子およびその使用
JP2022521750A (ja) 2019-02-21 2022-04-12 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド カルレティキュリンに結合する多機能性分子およびその使用
CA3130628A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cells and uses thereof to treat autoimmune disorders
US11242407B2 (en) 2019-02-26 2022-02-08 Inspirna, Inc. High-affinity anti-MERTK antibodies and uses thereof
EP3930850A1 (en) 2019-03-01 2022-01-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
SG11202108451VA (en) 2019-04-03 2021-09-29 Regeneron Pharma Methods and compositions for insertion of antibody coding sequences into a safe harbor locus
IL286905B1 (en) 2019-04-04 2024-02-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing the human coagulation factor 12 locus
MX2021012335A (es) 2019-04-10 2021-11-12 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos que se unen a ret y metodos de uso de los mismos.
MA55881A (fr) 2019-05-09 2022-03-16 Genmab Bv Schémas posologiques pour une combinaison d'anticorps anti-dr5 destinés à être utilisés dans le traitement du cancer
AU2020279380A1 (en) 2019-05-21 2021-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and quantitating host cell protein
JP2022534867A (ja) 2019-06-04 2022-08-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ベータスリップ変異を有するヒト化ｔｔｒ遺伝子座を含む非ヒト動物と使用方法
MA56117A (fr) 2019-06-05 2022-04-13 Regeneron Pharma Animaux non humains ayant un répertoire de chaînes légères lambda limité exprimé à partir du locus kappa et leurs utilisations
SG11202112462RA (en) 2019-06-11 2021-12-30 Regeneron Pharma Anti-pcrv antibodies that bind pcrv, compositions comprising anti-pcrv antibodies, and methods of use thereof
MX2021015087A (es) 2019-06-13 2022-01-18 Regeneron Pharma Metodos para eliminar componentes no deseados durante procesos cromatograficos de multiples etapas.
CA3140083A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of bispecific antigen-binding molecules that bind muc16 and cd3 in combination with 4-1bb co-stimulation
JP2022537019A (ja) 2019-06-21 2022-08-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｐｓｍａおよびｃｄ３に結合する二重特異性抗原結合分子の４－１ｂｂ共刺激と組み合わせての使用
CA3140208A1 (en) 2019-07-08 2021-01-14 Amgen Inc. Multispecific transthyretin immunoglobulin fusions
GB201910900D0 (en) * 2019-07-31 2019-09-11 Scancell Ltd Modified fc-regions to enhance functional affinity of antibodies and antigen binding fragments thereof
JP2022543669A (ja) 2019-08-08 2022-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 新規抗原結合分子フォーマット
KR20220044821A (ko) 2019-08-15 2022-04-11 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 세포 표적화를 위한 다중특이적 항원-결합 분자 및 이의 용도
PE20220299A1 (es) 2019-08-15 2022-03-07 Janssen Biotech Inc Materiales y metodos para fragmentos variables de cadena unica mejorados
CR20220076A (es) 2019-08-30 2022-06-24 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd96 y sus métodos de uso
WO2021086899A1 (en) 2019-10-28 2021-05-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-hemagglutinin antibodies and methods of use thereof
TW202134277A (zh) 2019-11-05 2021-09-16 美商再生元醫藥公司 Ｎ—端ｓｃＦｖ多特異性結合分子
JP2023500701A (ja) 2019-11-06 2023-01-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 抗体変種の組み合わせおよびその使用
WO2021108363A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr/cas-mediated upregulation of humanized ttr allele
AU2020394428A1 (en) 2019-11-25 2022-07-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous emulsions
JP2023504172A (ja) 2019-12-02 2023-02-01 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ペプチド－ｍｈｃ ｉｉタンパク質構築物およびそれらの使用
EP4069373A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating multiple myeloma with bispecific anti-bcma x anti-cd3 antibodies
MY193349A (en) 2019-12-06 2022-10-06 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
IL293742A (en) 2019-12-11 2022-08-01 Cilag Gmbh Int Multispecific binding molecules containing ltbr and edb binding sites and uses thereof
WO2021127487A2 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il2 agonists and methods of use thereof
IL293845A (en) 2019-12-26 2022-08-01 Abl Bio Inc A method for the purification of a biologically active peptide by using affinity chromatography of protein a
EP4084821A4 (en) 2020-01-03 2024-04-24 Marengo Therapeutics Inc CD33-BINDING MULTIFUNCTIONAL MOLECULES AND THEIR USES
MX2022008323A (es) 2020-01-08 2022-08-08 Regeneron Pharma Uso de aminoácidos para mejorar la señal en análisis del espectro de masas.
WO2021144457A1 (en) 2020-01-16 2021-07-22 Genmab A/S Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
IL294765B2 (en) 2020-01-21 2023-12-01 Regeneron Pharma Deglycosylation methods for electrophoresis of glycosylated proteins
JP2023511603A (ja) 2020-01-27 2023-03-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド タンパク質の翻訳後修飾のタンデム質量タグ多重化定量
US20210227812A1 (en) 2020-01-28 2021-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
IL294879A (en) 2020-01-29 2022-09-01 Inhibrx Inc Monodomain antibodies of cd28 and their multivalent and multispecific constructs
MX2022009356A (es) 2020-01-30 2022-12-13 Regeneron Pharma Plataforma para cromatografía líquida-espectrometría de masas nativa.
CA3166241A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Jikang WU High confidence compound identification by liquid chromatography-mass spectrometry
WO2021158883A1 (en) 2020-02-07 2021-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized klkb1 locus and methods of use
CN115362175A (zh) 2020-02-11 2022-11-18 瑞泽恩制药公司 抗acvr1抗体及其用途
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
WO2021195079A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ttr locus comprising a v30m mutation and methods of use
IL296428A (en) 2020-03-25 2022-11-01 Lilly Co Eli Multispecific binding proteins and methods for their development
US20230348616A1 (en) 2020-03-30 2023-11-02 Mie University Bispecific antibody
US11885779B2 (en) 2020-04-14 2024-01-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ultraviolet monitoring of chromatography performance by orthogonal partial least squares
EP4139363A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to t cell related cancer cells and uses thereof
WO2021228904A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Academisch Medisch Centrum Neutralizing antibodies binding to the spike protein of sars-cov-2 suitable for use in the treatment of covid-19, compositions comprising the same and uses thereof
CN115667290A (zh) 2020-05-12 2023-01-31 再生元制药公司 新型il10激动剂及其使用方法
EP4149976A1 (en) 2020-05-12 2023-03-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-glp1r antagonist antibodies and methods of use thereof
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
WO2021263146A2 (en) 2020-06-26 2021-12-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized ace2 locus
WO2022018294A1 (en) 2020-07-23 2022-01-27 Genmab B.V. A combination of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
MX2023002001A (es) 2020-08-18 2023-03-21 Cephalon Llc Anticuerpos anti-par-2 y metodos de uso de los mismos.
AU2021329378A1 (en) 2020-08-19 2023-03-23 Xencor, Inc. Anti-CD28 compositions
MX2023001734A (es) 2020-08-20 2023-03-31 Regeneron Pharma Métodos para prevenir y tratar la disfunción cardíaca y el covid-19 con antagonistas de activina a.
KR20230074144A (ko) 2020-08-26 2023-05-26 마렝고 테라퓨틱스, 인크. NKp30에 결합하는 항체 분자 및 이의 용도
EP4204458A1 (en) 2020-08-26 2023-07-05 Marengo Therapeutics, Inc. Methods of detecting trbc1 or trbc2
AU2021331075A1 (en) 2020-08-26 2023-04-06 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
KR20230058094A (ko) 2020-08-31 2023-05-02 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 세포 배양 성능을 개선하고 아스파라긴 서열 변이체를 완화하기 위한 아스파라긴 공급 전략
IL301137A (en) 2020-09-11 2023-05-01 Regeneron Pharma Identification and production of antigen-specific antibodies
CA3191839A1 (en) 2020-09-18 2022-03-24 David DILILLO Antigen-binding molecules that bind cd38 and/or cd28, and uses thereof
BR112023005742A2 (pt) 2020-10-02 2023-05-02 Genmab As Anticorpo, composição, composição farmacêutica, método para tratar uma doença, ácido nucléico, vetor de expressão, célula, método para produzir um anticorpo, kit de partes, e, anticorpo anti-idiotípico
EP4229086A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 UCB Biopharma SRL Binding molecules that multimerise cd45
US11866502B2 (en) 2020-10-22 2024-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-FGFR2 antibodies and methods of use thereof
CN117120477A (zh) 2020-11-10 2023-11-24 上海齐鲁制药研究中心有限公司 针对密蛋白18a2和cd3的双特异性抗体及其应用
AU2021385363A1 (en) 2020-11-25 2023-06-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Sustained release formulations using non-aqueous membrane emulsification
CN114539416A (zh) * 2020-11-26 2022-05-27 盛禾(中国)生物制药有限公司 一种双特异性抗体的层析纯化工艺
IL303675A (en) 2020-12-17 2023-08-01 Regeneron Pharma Production of protein thermal microgels
WO2022133239A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin proteins that bind to npr1 agonists
IL303371A (en) 2020-12-20 2023-08-01 Regeneron Pharma Methods for the identification of degraded disulfides in biocompounds
KR20230162775A (ko) * 2021-01-11 2023-11-28 아디맵 엘엘씨 우선적인 ch3 이량체화를 위해 조작된 변이체 ch3 도메인,이를 포함하는 다중-특이적 항체, 및 이의 제조 방법
EP4281542A1 (en) 2021-01-20 2023-11-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving protein titer in cell culture
JP2024506831A (ja) 2021-01-28 2024-02-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド サイトカイン放出症候群を治療するための組成物及び方法
TW202246314A (zh) 2021-01-28 2022-12-01 美商特蘭治療公司 抗棘狀醣蛋白抗體及其治療用途
JP2024508658A (ja) 2021-02-04 2024-02-28 ジェヌーヴ インク． 抗ｐｄ－１抗体及びその用途
WO2022184659A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Quadrucept Bio Limited Antibody domains & multimers
TW202246325A (zh) 2021-03-03 2022-12-01 美商再生元醫藥公司 用於定量及修飾蛋白質黏度之系統及方法
CN117157319A (zh) 2021-03-09 2023-12-01 Xencor股份有限公司 结合cd3和cldn6的异二聚抗体
WO2022192586A1 (en) 2021-03-10 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and gpc3
AU2022246048A1 (en) 2021-03-26 2023-08-31 Innate Pharma Multispecific proteins comprising an nkp46-binding site, a cancer antgienge binding site fused to a cytokine for nk cell engaging
IL305818A (en) 2021-03-29 2023-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Multispecific stable compound and its use
AR125255A1 (es) 2021-04-02 2023-06-28 Regeneron Pharma Métodos de predicción y modulación de la glicación de una proteína
WO2022212876A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Antibodies against cleaved cdcp1 and uses thereof
WO2022216993A2 (en) 2021-04-08 2022-10-13 Marengo Therapeutics, Inc. Multifuntional molecules binding to tcr and uses thereof
CA3217850A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Amgen Inc. Modulating product quality of asymmetric multispecific antibodies through the use of temperature
WO2022235628A1 (en) 2021-05-04 2022-11-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses
CN117597365A (zh) 2021-05-04 2024-02-23 再生元制药公司 多特异性fgf21受体激动剂及其应用
CN117412767A (zh) 2021-05-25 2024-01-16 雪绒花免疫公司 C-x-c基序趋化因子受体6（cxcr6）结合分子及其使用方法
EP4348234A1 (en) 2021-06-01 2024-04-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Micropchip capillary electrophoresis assays and reagents
AU2022288123A1 (en) 2021-06-09 2023-11-30 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp46, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
CN117529504A (zh) 2021-06-09 2024-02-06 先天制药公司 结合至cd20、nkp46、cd16并缀合至il-2的多特异性抗体
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
AU2022293999A1 (en) 2021-06-14 2023-11-30 argenx BV Anti-il-9 antibodies and methods of use thereof
IL310221A (en) 2021-07-19 2024-03-01 Regeneron Pharma IL12 receptor agonists and methods of using them
TW202322850A (zh) * 2021-08-05 2023-06-16 美商美國禮來大藥廠 抗體最佳化
AU2022331241A1 (en) 2021-08-16 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il27 receptor agonists and methods of use thereof
WO2023028612A2 (en) 2021-08-27 2023-03-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Anti-tslpr (crlf2) antibodies
US20230109496A1 (en) 2021-09-06 2023-04-06 Genmab B.V. Antibodies capable of binding to cd27, variants thereof and uses thereof
WO2023039457A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. A high-throughput and mass-spectrometry-based method for quantitating antibodies and other fc-containing proteins
CA3231899A1 (en) 2021-11-04 2023-05-11 Trevor Stitt Non-human animals comprising a modified cacng1 locus
US20230279153A1 (en) 2021-11-11 2023-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cd20-pd1 binding molecules and methods of use thereof
US20230235089A1 (en) 2021-11-24 2023-07-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for Treating Cancer with Bispecific Anti-CD3 x MUC16 Antibodies and Anti-CTLA-4 Antibodies
WO2023107957A1 (en) 2021-12-06 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antagonist anti-npr1 antibodies and methods of use thereof
WO2023108047A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutant myocilin disease model and uses thereof
WO2023122506A1 (en) 2021-12-20 2023-06-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising humanized ace2 and tmprss loci
US20230312718A1 (en) 2022-01-07 2023-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Methods of Treating Recurrent Ovarian Cancer with Bispecific Anti-MUC16 x Anti-CD3 Antibodies Alone or in Combination with Anti-PD-1 Antibodies
TW202337900A (zh) 2022-01-12 2023-10-01 美商再生元醫藥公司 改良使用親和層析的異二聚蛋白質自雜質之解析的方法
WO2023150798A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for defining optimal treatment timeframes in lysosomal disease
US20230257432A1 (en) 2022-02-11 2023-08-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for screening 4r tau targeting agents
WO2023164510A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-psma antibodies
US20240059786A1 (en) 2022-02-24 2024-02-22 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-trop2 antibodies
US20230340128A1 (en) 2022-02-24 2023-10-26 Xencor, Inc. Anti-cd28 x anti-msln antibodies
TW202400228A (zh) 2022-02-25 2024-01-01 美商再生元醫藥公司 減輕細胞激素釋放症候群的給藥方案
WO2023177772A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating recurrent epithelioid sarcoma with bispecific anti-muc16 x anti-cd3 antibodies alone or in combination with anti-pd-1 antibodies
WO2023196903A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific antigen-binding molecules that bind and cd3 and tumor associated antigens (taas) and uses thereof
US20230357446A1 (en) 2022-04-11 2023-11-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for universal tumor cell killing
WO2023212677A2 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification of tissue-specific extragenic safe harbors for gene therapy approaches
WO2023220603A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
WO2023220647A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific binding molecule proproteins and uses thereof
WO2023218046A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023218051A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Genmab A/S Binding agents capable of binding to cd27 in combination therapy
WO2023224912A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating metastatic castration-resistant prostate cancer with bispecific anti-psma x anti-cd3 antibodies alone or in combination with anti-pd-1 antibodies
US20230416396A1 (en) 2022-05-18 2023-12-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific antigen binding molecules that bind cd38 and 4-1bb, and uses thereof
US20230382969A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2023235848A1 (en) 2022-06-04 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2023240109A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific molecules for modulating t-cell activity, and uses thereof
WO2024020199A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity
US20240052051A1 (en) 2022-07-29 2024-02-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-tfr:payload fusions and methods of use thereof
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
WO2024030453A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating metastatic castration-resistant prostate cancer with bispecific anti-psma x anti-cd28 antibodies in combination with anti-pd-1 antibodies
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
WO2024056862A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Avidicure Ip B.V. Multispecific antigen binding proteins for tumor-targeting of nk cells and use thereof
WO2024073679A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Correction of hepatosteatosis in humanized liver animals through restoration of il6/il6r/gp130 signaling in human hepatocytes
WO2024081180A1 (en) 2022-10-10 2024-04-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing alloantibody levels in subjects in need of solid organ transplantation

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444878A (en) * 1981-12-21 1984-04-24 Boston Biomedical Research Institute, Inc. Bispecific antibody determinants
JPH09100296A (ja) * 1984-09-26 1997-04-15 Takeda Chem Ind Ltd 蛋白質の相互分離方法
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
GB8626413D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Gilliland L K Antibodies
CA2118508A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Elizabeth S. Ward Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5456909A (en) * 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
DE122009000068I2 (de) * 1994-06-03 2011-06-16 Ascenion Gmbh Verfahren zur Herstellung von heterologen bispezifischen Antikörpern
US5945311A (en) * 1994-06-03 1999-08-31 GSF--Forschungszentrumfur Umweltund Gesundheit Method for producing heterologous bi-specific antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JPH0987300A (ja) * 1995-07-14 1997-03-31 Takeda Chem Ind Ltd 雑種蛋白質およびその用途
ES2176574T3 (es) * 1996-09-03 2002-12-01 Gsf Forschungszentrum Umwelt Utilizacion de anticuerpos bi y triespecificos para la induccion de inmunidad tumoral.
ATE210682T1 (de) 1996-09-03 2001-12-15 Gsf Forschungszentrum Umwelt Zerstörung von kontaminierenden tumorzellen in stammzelltransplantaten mit bispezifischen antikörpern
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DE19725586C2 (de) 1997-06-17 1999-06-24 Gsf Forschungszentrum Umwelt Verfahren zur Herstellung von Zellpräparaten zur Immunisierung mittels heterologer intakter bispezifischer und/oder trispezifischer Antikörper
ES2212638T3 (es) 1998-09-25 2004-07-16 Lindhofer, Horst, Dr. Utilizacion de celulas tumorales en tiempo escalonado en combinacion con anticuerpos intactos para la inmunizacion.
CA2410551A1 (en) * 2000-06-30 2002-01-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw (Vib) Heterodimeric fusion proteins
US20030224000A1 (en) 2001-12-21 2003-12-04 Kokai-Kun John Fitzgerald Methods for blocking or alleviating staphylococcal nasal colonization by intranasal application of monoclonal antibodies
US7169903B2 (en) 2001-12-21 2007-01-30 Biosynexus Incorporated Multifunctional monoclonal antibodies directed to peptidoglycan of gram-positive bacteria
CN100480260C (zh) 2002-07-18 2009-04-22 克鲁塞尔荷兰公司 抗体混合物的重组生产
EP1545574B8 (en) * 2002-09-13 2014-09-24 Biogen Idec Inc. Method of purifying polypeptides by simulated moving bed chromatography
US7923538B2 (en) 2005-07-22 2011-04-12 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Recombinant antibody composition
JP5144499B2 (ja) * 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
AU2008207898B2 (en) 2007-01-23 2012-05-03 Xencor, Inc Optimized CD40 antibodies and methods of using the same
US9266967B2 (en) * 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
JO3672B1 (ar) * 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
KR101747103B1 (ko) * 2009-06-26 2017-06-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
SG176868A1 (en) 2012-02-28
US20100331527A1 (en) 2010-12-30
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AU2010265933B2 (en) 2015-05-14
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RU2647758C2 (ru) 2018-03-19
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