TW202012926A - 醣基化肽之偵測及定量 - Google Patents

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艾夫拉漢 羅森伯格
標 沈
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美商再生元醫藥公司
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Abstract

一種對醣肽進行純化及/或分離且對其進行定量之方法。該方法包含使包括醣肽之樣品與親水性富集基材在容許該等醣肽結合於該親水性富集基材的條件下接觸。用含有甲酸銨及乙腈(ACN)之水溶液自親水性富集基材溶離醣肽，以產生經富集之醣肽樣品，可對該經富集之醣肽樣品進行分析以鑑別特定醣肽。

Description

醣基化肽之偵測及定量
本發明涉及生物醫藥，且係關於偵測及量化諸如治療性抗體及其片段之蛋白質活體內轉譯後的醣基化。
治療性單株抗體(mAb)為在哺乳動物細胞中產生之異質分子，其具有許多產物變異體，包含由轉譯後修飾(PTM)產生之變異體。N連接之醣基化為治療性抗體中之主要PTM。監管機構要求對N連接之聚醣結構進行表徵且對個別醣型進行量化，以界定藥品之品質、證明批次間之一致性，並確保對製造過程之控制。傳統上，抗體內N連接之聚醣係藉由酵素作用自該抗體釋放聚醣，繼而用螢光試劑標記來進行量化。另外，可藉由分析由胰蛋白酶消化抗體所產生的醣肽來在肽水準上表徵醣基化。然而，具有異質醣型之醣肽通常不容易藉由基於逆相之液相層析(RPLC)來分離，該RPLC傳統上用於肽定位(peptide mapping)。另外，線上質譜(MS)所誘發的醣肽中糖鏈的源內碎片化，可產生截短醣型的假訊號，其有礙於以MS對不同醣型之相對豐度來進行準確量化。
在一個態樣中，本發明提供一種對醣肽進行純化及/或分離之方法，其中該方法包括：(a)使包括醣肽之樣品與親水性富集基材在容許該等醣肽結合於該親水性富集基材的條件下接觸；(b)洗滌該親水性富集基材，以自該親水性富集基材移除非醣肽污染物；及(c)用含甲酸銨及乙腈(ACN)之水溶液自該親水性富集基材溶離該等醣肽，藉此產生經富集之醣肽樣品。視情況，該方法包含將經富集之醣肽樣品施用於分離管柱，及自該分離管柱溶離該等醣 肽。
在一些實施方案中，親水性富集基材包括固相萃取(SPE)層析基材。
在一些實施方案中，親水性富集基材包括基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑材料。
在一些實施方案中，含甲酸銨及ACN之水溶液在水中包括約100至400mM的甲酸銨及約2.5%至約10%的ACN。
在一些實施方案中，甲酸銨ACN溶液在水中包括200mM的甲酸銨及5%的ACN。
在一些實施方案中，親水性富集基材係以甲酸及ACN洗滌溶液進行洗滌，以移除非醣肽污染物，該洗滌溶液包括按體積計0.5%至約5%的甲酸及按體積計約85%至約95%的ACN，其餘為水。
在一些實施方案中，甲酸及ACN洗滌溶液包括按體積計1%的甲酸、9%的H2O、90%的ACN。
在一些實施方案中，分離管柱包括親水相互作用(HILIC)管柱。
在一些實施方案中，自分離管柱溶離醣肽進一步包括將醣肽分離至一個或多個級分中。
在一些實施方案中，將醣肽分離至一個或多個級分中包括將流動相梯度施用於分離管柱。
在一些實施方案中，流動相梯度為pH 4.5、10mM的甲酸銨，至含90% ACN及pH 4.5、10mM的甲酸銨，。
在一些實施方案中，流動相梯度為含0.05% TFA之H2O或含0.045% TFA之ACN。
在一些實施方案中，該方法進一步包含鑑別存在於一個或多個級分中之醣肽。
在一些實施方案中，該方法進一步包含鑑別與存在於一個或多個級分中之醣肽締合的聚醣。
在一些實施方案中，聚醣包括N-聚醣。
在一些實施方案中，醣肽係獲自單株抗體。
在一些實施方案中，單株抗體具有IgG1同型、IgG2同型、IgG3 同型、IgG4同型或混合之同型。
在一些實施方案中，該方法進一步包含用蛋白酶消化單株抗體。
在一些實施方案中，蛋白酶包括胰蛋白酶。
在一些實施方案中，該方法進一步包含對經溶離之醣肽執行質譜分析。
在一些實施方案中，該方法進一步包含在醣肽水準上對經溶離之醣肽進行醣基化概況分析。
在一些實施方案中，該方法進一步包含用含乙腈(ACN)之水溶液對親水性富集基材進行預洗滌。
在一些實施方案中，該方法進一步包含在與親水性富集基材接觸之前，在含ACN之水溶液中稀釋包括醣肽之樣品。
圖1顯示一示意性工作流程圖，其說明藉由液相層析與質譜聯用(LC/MS)來定量醣肽之當前標準方法。
圖2所示之表係顯示圖1之工作流程中所示之醣肽定量方法與對所釋放聚醣進行之定量比較的結果；亦即，一者係基於偵測醣肽，而另一者係基於偵測所釋放之聚醣。
圖3所示之質譜，係展示藉由醣肽及所釋放聚醣之方法所進行的醣型定量兩者間的差異(參見圖2)，可能係歸因於在醣肽分析中由MS對糖主鏈所造成的源內碎片化，其導致截短性聚醣假訊號(亦即G0F-GlcNAc及G1F-GlcNAc)的增加及主要聚醣(亦即，G0F及G1F)的減少。基於所釋放聚醣的方法係藉由結合至所釋放聚醣之標記其螢光來對醣型進行量化，而非藉由MS信號來量化。
圖4顯示如本文所揭示之醣肽定量方法的工作流程圖。
圖5顯示mAb1肽的HILIC-UV層析圖組，其顯示藉由兩種不同方法對獲自胰蛋白酶消化物之mAb1肽進行分離的結果。
圖6顯示圖5所示跡線其醣肽部分的特寫，其顯示方法#2的分離情況更佳、有更尖銳之峰及有更高的S/N比率。
圖7顯示mAb1醣肽對醣肽放大之HILIC-TIC層析圖組。如圖所 示，方法#2MS信號之S/N比率更高。
圖8A及8B顯示mAb1醣肽之MS1譜(M2+離子)。
圖9係展示一組跡線及表，其顯示藉由在HILIC管柱上進行之醣肽分離其醣型定量與所釋放聚醣之分析的比較結果。
圖10係展示一組跡線及表，其顯示乾燥肽消化物可有助於濃縮醣肽，但不影響聚醣之UV信號及相對PA%。
圖11係展示一組跡線，其說明藉由分別使用含0.05%及0.045% TFA之水及ACN(RP-LC肽定位流動相)來簡化流動相製備並改良峰積分而進行的改變。
圖12A、12B、12C及12D所示之一組質譜分析結果，其展示流動相變化不影響醣肽之MS信號(M2+離子)。
圖13係展示一組跡線，其顯示稀釋至80% ACN之mAb1醣肽的溶液穩定性。
圖14係展示一組跡線，其顯示有漏切(miss-cut)的醣肽其胰蛋白酶消化物係使藉由UV對醣肽所進行之定量複雜化。
圖15係展示一組跡線及表，其顯示在使用線上MS資料的情況下，EIC可用來找出各峰中之漏切醣肽的百分比，以幫助醣型的定量。
圖16係展示一組跡線及表，其顯示用胰蛋白酶對mAb2進行重新消化係移除漏切醣肽，以幫助醣型的定量。
圖17係展示一組跡線，其顯示甲酸銨係顯著改善醣肽自HILIC SPE之溶離情況。
圖18係展示一組跡線及表，其顯示乾燥或SPE淨化/乾燥不影響mAb1醣肽的定量。
圖19係展示一組跡線及表，其顯示藉由醣肽及所釋放之聚醣分析其類似的mAb3醣型定量結果。
圖20A及20B係展示一組跡線及表，其顯示藉由醣肽及所釋放之聚醣以還原及非還原mAb3胰蛋白酶消化物所進行之分析其類似的醣型定量結果。
圖21係展示一組跡線，其說明對具有及不具有海藻糖基化之IgG1及IgG4醣肽其分離比較結果。
圖22顯示一示意性工作流程圖，其說明包含本文所揭示方法的醣肽定量方法。
在描述本發明之前，應理解，本發明不限於所描述之特定方法及實驗條件，因為此類方法及條件可變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定實施方案之目的，並不旨在為限制性的，因為本發明之範疇將僅由所附申請專利範圍限制。任何實施方案或實施方案之特徵均可彼此組合，且此類組合明確地涵蓋於本發明之範疇內。
除非另外規定，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域中一般技術者通常所理解相同的含義。如本文所用，當用來指涉特定敍述之數值時，術語「約」意謂該值可在與所敍述之值相差不超過1%的範圍內變化。舉例而言，如本文所用，表述「約100」包含99及101及兩者之間的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
儘管可在本發明之實踐或測試中使用類似或等同於本文所描述之方法及材料的任何方法及材料，但現在描述較佳之方法及材料。本說明書中提及之所有專利、申請案及非專利出版物均以引用之方式將其整體併入本文中。
本文所用之縮寫
PTM：轉譯後修飾
RP-LC-MS/MS：逆相液相層析串聯質譜分析
mAb：單株抗體
IgG：免疫球蛋白G
LC：輕鏈
HC：重鏈
MS：質譜
SPE：固相萃取
HILIC：親水相互作用液相層析
UV：紫外線
TFA：三氟乙酸
ACN：乙腈
定義
如本文所用之術語「抗體」，旨在指稱包括以雙硫鍵互連之四個多肽鏈，即兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈的免疫球蛋白分子(亦即「完整抗體分子」)，以及其多聚體(例如IgM)或其抗原結合片段。各個重鏈包括重鏈可變區(「HCVR」或「VH」)及重鏈恆定區(包括結構域CH1、CH2及CH3)。在各種實施方案中，重鏈可為IgG同型。在一些情況下，重鏈係選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實施方案中，重鏈具有IgG1同型或IgG4同型，視情況包含IgG1/IgG2同型或IgG4/IgG2同型之嵌合式鉸鏈區。各個輕鏈包括輕鏈可變區(「LCVR」或「VL」)及輕鏈恆定區(CL)。VH及VL區可進一步細分成稱為互補決定區(CDR)之高度變異區，穿插有稱為構架區(FR)之較保守區。各個VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，其自胺基端至羧基端係按以下次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語「抗體」包含指涉任何同型或子類別之醣基化及非醣基化的免疫球蛋白兩者。術語「抗體」包含以重組手段所製備、表現、產生或分離之抗體分子，諸如自經轉染以表現抗體的宿主細胞中所分離的抗體。關於抗體結構之綜述參見Lefranc等人，用於免疫球蛋白及T細胞受體可變結構域及Ig超家族V樣結構域之IMGT獨特編號(IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains),27(1)《發育與比較免疫學(Dev.Comp.Immunol.)》55-77(2003)；及M.Potter，免疫球蛋白多樣性之結構相關性(Structural correlates of immunoglobulin diversity),2(1)《免疫學研究概況(Surv.Immunol.Res.)》27-42(1983)。
術語抗體亦涵蓋「雙特異性抗體」，其包含可結合至超過一個的不同表位(epitope)之雜四聚體免疫球蛋白。包含單個重鏈及單個輕鏈及六個CDR之雙特異性抗體的一半，係結合於一個抗原或表位，該抗體的另一半係結合於不同的抗原或表位。在一些情況下，雙特異性抗體可結合相同抗原，但結合在不同的表位或不重疊的表位。在一些情況下，雙特異性抗體之兩半均具有相同的輕鏈而同時保留雙重特異性。雙特異性抗體一般描述於美國專利申請公開案第2010/0331527號(2010年12月30日)中。
術語抗體(或「抗體片段」)之「抗原結合部分」，係指抗體中保留特異性結合於抗原能力的一個或多個片段。為術語抗體之「抗原結合部分」 所涵蓋的結合片段，其實例包含(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1結構域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，包括在鉸鏈區處藉由雙硫鍵橋所連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)Fd片段，由VH及CH1結構域組成；(iv)Fv片段，由抗體單臂之VL及VH結構域組成；(v)dAb片段(Ward等人(1989)《自然(Nature)》241：544-546)，由VH結構域組成；(vi)經分離之CDR及(vii)scFv，由Fv片段之兩個結構域VL及VH組成，該兩個結構域係藉由合成連接子接合，使其中VL及VH區形成配對，以形成單價分子之單鏈蛋白質。其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體，亦涵蓋於術語「抗體」下(參見例如Holliger等人(1993)90《美國國家科學院院刊(PNAS U.S.A.)》6444-6448；及Poljak等人(1994)2《結構(Structure)》1121-1123)。
此外，抗體及其抗原結合片段係可使用本領域中通常已知之標準重組DNA技術來獲得(參見Sambrook等人，1989)。
術語「人類抗體」旨在包含具有源自於人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類mAb可包含不是由人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體內體細胞突變而引入之突變)，例如在CDR中且特別是在CDR3中的胺基酸殘基。然而，如本文所用，術語「人類抗體」不旨在包含其中將源自於另一哺乳動物物種(例如小鼠)之生殖系的CDR序列移植至人類FR序列上的mAb。該術語包含在非人類哺乳動物中或在非人類哺乳動物之細胞中以重組方式所產生的抗體。該術語不旨在包含自人類個體分離或在人類個體中產生之抗體。
如本文所用之術語「醣肽/醣蛋白」為在其合成期間或之後，經共價鍵結之碳水化合物或聚醣修飾的肽/蛋白質。在某些實施方案中，醣肽係獲取自單株抗體，例如獲自單株抗體之蛋白酶消化物。
如本文所用之術語「聚醣」，為包括一個或多個糖單元之化合物，其通常包含葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)及N-乙醯基神經胺酸(NeuNAc)(Frank Kjeldsen等人，《分析化學(Anal.Chem.)》2003,75,2355-2361)。醣蛋白(諸如單株抗體)中之聚醣部分係為鑑別其功能或細胞位置之重要特徵。舉例而言，特異性單株抗體係經特定的聚醣部分所修飾。
術語「親水相互作用層析」或HILIC，旨在包含採用親水性固定相及疏水性有機流動相之方法，其中親水性化合物比疏水性化合物滯留更長時間。在某些實施方案中，該方法使用水混溶性(water-miscible)溶劑流動相。
如本文所用，術語「樣品」係指包括至少一種分析物分子(例如醣肽，諸如獲自單株抗體之醣肽)的分子混合物，其根據本發明之方法進行操縱，例如包含分離、分析、萃取、濃縮或概況分析。
如本文所用之術語「分析(analysis/analyzing)」可互換使用，且係指分離(separating)、偵測、分離(isolating)、純化、溶解、偵測及/或表徵所關注之分子(例如醣蛋白)的各種方法中之任一者。實例包含但不限於固相萃取、固相微型萃取、電泳、質譜分析，例如SPE HILIC，MALDI-MS或ESI、液相層析，例如高效液相層析，例如逆相、正相或尺寸排阻、離子對液相層析；液-液萃取，例如加速流體萃取、超臨界流體萃取、微波輔助萃取(microwave-assisted extraction)、膜萃取、索氏萃取(soxhlet extraction)；沈澱；澄清；電化學偵測；染色；元素分析；埃德蒙降解(Edmund degradation)；核磁共振；紅外光分析(infrared analysis)；流動注射分析；毛細管電層析；紫外線偵測以及其組合。
如本文所用，術語「概況分析」係指組合使用以提供樣品中醣肽之含量、組成或特徵比率的各種分析方法中之任一者。
如本文所用，「親水性富集基材」是在容許結合之條件(例如pH值，離子強度等)下優先結合親水性材料的層析材料。在一些實施方案中，親水性富集基材係用於SPE。
如本文所用，術語「層析表面」包含暴露於樣品或分析物中的表面。層析表面可經化學改質、官能化或活化，或具有微觀結構，例如孔隙。在某些實施方案中，層析表面可為疏水性、親水性(極性)或離子性的。在其他實施方案中，層析表面為全多孔的(fully porous)、表面多孔的或無孔的。
如本文所用，術語「層析核芯」包含以顆粒、整料或另一適合之結構形式形成本發明材料之內部部分的層析材料，包含但不限於有機材料，諸如二氧化矽。在某些態樣中，如本文所定義，層析核芯之表面係代表層析表面，或代表由層析表面所包覆之材料。層析表面材料可以可辨別出不連續或不同轉變之方式安置於層析核芯上或與層析核芯黏結或黏接，或可以與層析核芯之表 面摻合來產生材料漸變而無不連續內部芯表面之方式與層析核芯結合。在某些態樣中，層析表面之材料可與層析核芯之材料相同或不同，且可展現與層析核芯不同之物理或生理化學特性，包含但不限於孔隙體積、表面積、平均孔徑、碳含量或水解pH穩定性。
如本文所用，術語「親水性」描述具有對水之親和力、吸引水、吸附水或吸收水。
如本文所用，術語「疏水性」描述缺乏對水之親和力、排斥水、或未能吸附或吸收水。
「固相萃取」或「SPE」為通常與定量化學分析結合使用之層析技術，例如高效液相層析(HPLC)或氣相層析(GC)。SPE之目標為自含有不合需要之污染物的複雜樣品基質中分離目標分析物。經分離之目標分析物在與定量分析相容之溶液中進行回收。此種含有目標化合物之最終溶液可直接用於分析，或經蒸發而在體積更小之另一溶液中復原，其目的為進一步濃縮目標化合物，從而使其更適於偵測及量測。
如本文所用，「層析」係指分離混合物，例如含有醣肽之混合物的方法。其涉及使混合物通過固定相，該固定相使所關注之分子與混合物中之其他分子分離，且允許分離一種或多種所關注之分子。層析分離方法之實例包含毛細管作用層析，諸如紙層析、薄層層析(TLC)、管柱層析、快速蛋白質液相層析(FPLC)、奈米逆相液相層析、離子交換層析、凝膠層析，諸如凝膠過濾層析、尺寸排阻層析、親和層析、高效液相層析(HPLC)、親水相互作用液相層析(HILIC)及逆相高效液相層析(RP-HPLC)等。
如本文所用，「接觸」包含將至少兩種物質以溶液或固相聚集在一起，例如使層析材料之固定相與樣品接觸。
一般性描述
單株抗體(MAb)已成為用於癌症及其他慢性疾病之有效生物醫藥，此歸因於此等藥物針對靶抗原之特異性，例如，藉由激活免疫系統以殺死腫瘤細胞、阻斷腫瘤細胞增殖之信號轉導、將藥物攜帶至腫瘤細胞或作為輻射目標。免疫球蛋白之醣基化影響其生理化學特性及其細胞介導之效用功能(effector function)，諸如補體結合及活化。此等生物學功能可不僅依賴於N連接寡醣的存在或不存在，且亦依賴於該等寡醣之特定結構。此外，在生物醫藥 之製造中一般都會對抗體之N-醣基化進行表徵。特定言之，單株抗體之聚醣概況有時被定義為關鍵品質屬性，此係因為其可為功效、免疫原性及製造條件之量度。因此，聚醣分析之方法展現出高靈敏度而有助於詳細表徵，係至關重要。在治療性單株抗體之製造中，位點特異性的N-醣基化及對N-聚醣位點佔有率之評估，係為重要的。因此，需要有以高效率/高解析度來分離獲自單株抗體之醣肽的方法。所揭示之發明滿足該需要。
本文揭示一種用於醣肽分析及量化之新方法，其中固相萃取(SPE)與親水相互作用液相層析(HILIC)管柱聯用，以分離醣基化及非醣基化胰蛋白酶肽。在各種實施方案中，此等分離技術與紫外光(UV)偵測及線上質譜(MS)偵測聯用，以解明所述聚醣結構。在一些方法中，聚醣表徵係仰賴於由肽鏈所釋放出的聚醣，且隨後將該等聚醣與肽分開分析(參見例如圖1至3)。因為聚醣不適合用UV偵測，所以所釋放之聚醣通常用例如鄰胺基苯甲醯胺、鄰胺基苯甲酸或2-胺基吡啶之螢光團標籤標記，以進行螢光偵測，或用具有顯著鹼性之分子(例如普魯卡因醯胺)以便能夠進行MS偵測。然而，此聚醣分析方法僅給出對醣基化之廣泛評估。特定言之，關於聚醣之位點特異性資訊係因此工作流程需要進行釋放程序而丟失。相比之下，在所揭示之方法中，經分離之醣肽係基於在同一層析分離內之醣型結構差異來進行分離。此外，使用標準RP-LC方法未觀測到具有不同聚醣異構體的醣肽之分離(其係利用HILIC管柱)(參見例如圖1至3)。藉由最佳化HILIC樣品之製備條件，包含稀釋、真空乾燥及/或固相萃取(SPE)，本文係開發出一種能夠對來自於不同類型的肽定位樣品製劑之醣肽進行分析的工作流程(參見例如圖22)。如本文所揭示，發明人已證明，該方法及工作流程係適用於以UV偵測與線上MS偵測聯用，以在肽水準上鑑別抗體中的個別醣型及定量其相對的量(參見例如圖4及22)。
本文所揭示之方法包含對醣肽進行的純化及/或分離及/或分析，該醣肽例如係獲自單株抗體之醣肽，該單株抗體諸如係已用一種或多種蛋白酶消化之抗體。所揭示之方法係提供有所改善之分離及分析結果，並在該等聚醣與其抗體片段共價連接時仍能夠加以研究。此種針對胜肽之醣型分析，亦在生物醫藥的表徵中有所助益，其利用單個樣品即可進行逆相肽定位(例如胰蛋白酶消化物)及以HILIC為基礎的醣肽定位。此外，保留聚醣與肽/蛋白質之間的連接，有助於以醣肽之蛋白質組分為基礎所進行的UV和MS偵測，例如，移除 對所釋放之聚醣進行標記的必要性。
在某些實施方案中，該方法包含使包含醣肽之樣品與親水性富集基材，在容許及/或使該等醣肽結合於該親水性富集基材的條件下進行接觸。一旦將樣品加載至親水性富集基材上，可將一系列定製之洗滌及溶離溶液通過該親水性富集基材，以分離污染物與醣肽，且隨後收集該等醣肽以進一步分析。在一些實施方案中，洗滌親水性富集基材以自樣品中移除非醣肽污染物。因此，在很大程度上，醣肽係富集在親水性富集基材上，諸如在親水性富集基材之層析表面上。在某些實施方案中，親水性富集基材包括基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑材料。在某些實施方案中，親水性富集基材係經配置以用於固相萃取(SPE)。
經設計以用於SPE之裝置通常包含層析吸附劑(例如，親水性富集基材，例如基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑)，其允許使用者優先保留目標組分，在此情況下為醣肽。SPE裝置通常包含樣品保持儲集器、容納吸附劑之裝置，以及將離開該裝置之流體導引至適當收集容器中的流體管道或噴口。SPE裝置可為單孔形式，其便於製備少量樣品而言且具成本效益；或者，其可為多孔形式，其非常適合於同步製備大量樣品。多孔形式通常與機器人式流體分配系統一起使用。典型的多孔形式包含48孔、96孔及384孔標準盤的形式。流體通常係強制性的通過SPE裝置並進入收集容器中，其藉由使用專門設計之真空歧管在裝置上抽真空，或藉由使用離心力或重力來進行。離心力係藉由將SPE裝置與適合之收集盤一起放入專門設計用於預期目的之離心機中來產生。SPE裝置係以高容量來保留廣範圍之層析極性的目標化合物者為佳，其能夠在將樣品污染物洗滌成廢料時持續滯留目標化合物，且隨後能夠以儘可能小之溶離體積來溶離目標化合物，藉此最大化於SPE過程中所獲得之目標化合物的濃度。
根據所揭示之方法，有多種固相萃取裝置可使用。在一個實施方案中，SPE裝置係選自微型溶離盤、層析管柱、薄層盤、樣品淨化裝置、注射筒、微量滴定盤和層析準備裝置。
基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑材料(包含SPE材料)為本領域中已知的，並且可商業獲得，例如自沃特世公司(Waters Corporation)獲得，例如以GlycoWorks HILIC SPE盤之形式獲得(參見例如美國專利第6,723,236號、第7,052,611號及第7,192,525號)。在一些實施方案中，係藉由洗滌(例如預洗 滌步驟)來準備親水性富集基材，以用於樣品的添加。在一些實施方案中，在與醣肽樣品接觸之前係洗滌親水性富集基材。在一些實施方案中，用水(H2O)及/或ACN溶液(例如含ACN之水)來洗滌親水性富集基材，諸如用按體積計約60%至約95%的ACN溶液，例如按體積計約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的ACN溶液，其餘為水。
在各種實施方案中，親水性富集基材係與含有醣肽之樣品進行接觸以用於富集。關於樣品溶液，其係包含溶解於溶劑中之醣肽，在該溶劑中醣肽為可溶，且在該溶劑中醣肽會結合於親水性富集基材。較佳地，所述結合係為強力結合，其導致大部分醣肽的結合。在一些情況下，基本上所有醣肽均發生結合。在各種實施方案中，溶劑為水溶液，其通常含有緩衝劑、鹽及/或界面活性劑，以溶解並穩定醣狀。在一些實施方案中，醣肽樣品為按體積計含約60%至90%的ACN及10%至約40%水的溶液，並帶有約0.1%至約0.5% TFA，諸如含0.2% TFA及約80：20的ACN：水(v/v)。低pH值可用來維持肽在高度有機溶劑中之溶解度，例如pH值低於約6.5，諸如低於約6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或3.0之溶液。
隨後，洗滌親水性富集基材以移除污染物，其例如是不顯著結合於親水性富集基材之非醣基化肽。此類污染物係可丟棄。在一些實施方案中，用含酸及乙腈(ACN)之水(H2O)溶液來洗滌親水性富集基材，諸如用含甲酸及/或三氟乙酸(TFA)及乙腈(ACN)之水(H2O)溶液來洗滌。在某些實施方案中，含甲酸及ACN之水溶液包含按體積計約0.5%至約5%的甲酸及按體積計約85%至約95%的ACN，其餘為水，例如按體積計約0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%或5.0%甲酸及按體積計約80%、85%、90%或95%的ACN。在某些實施方案中，含TFA及ACN之水溶液包含按體積計約0.5%至約5%的TFA及按體積計約85%至約95%的ACN，其餘為水，例如按體積計約0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%或5.0%的TFA及按體積計約80%、85%、90%或95%的ACN。在某個實例中，洗滌溶液為按體積計1%的甲酸、9%H2O、90%的ACN之溶液。在某個實例中，洗滌溶液為按體積計1% TFA、9% H2O、90% ACN之溶液。
一旦污染物被移除，親水性富集基材係與溶離溶液接觸，以自該親水性富集基材溶離出醣肽。基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑具有弱鹼性的表 面及可進行陰離子交換。然而，自基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑回收醣肽的相對回收率及總回收率，可能對溶離條件特別敏感。，偏誤性回收或物種形成可能會對樣品製備程序造成問題。除了無法準確表示存在於樣品中之物種以外，其可代表方法並不穩健，且可能無法再現性地確定所獲得之相對豐度概況，尤其是對於回收率最差之物種。舉例來說，對於衍生化聚醣之回收而言，與作為本發明標的之醣肽相反，係推薦使用含乙酸銨之ACN作為溶離溶液。然而，在醣肽的情況下，含乙酸銨之ACN不能得到良好結果。因此，在某些實施方案中，係使用含甲酸銨及ACN之水溶液自基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑溶離出醣肽。在一些實施方案中，含甲酸銨及ACN之水溶液包含約100至400mM的甲酸銨及約2.5%至約10%的ACN，諸如約100mM甲酸銨、約150mM甲酸銨、約200mM甲酸銨、約250mM甲酸銨、約300mM甲酸銨、約350mM甲酸銨或約400mM甲酸銨及約2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%、8.5%、9.0%、9.5%或10.0%的ACN。在一個具體實例中，含甲酸銨及ACN之水溶液包含約200mM的甲酸銨及約5%的ACN。
一旦自親水性富集基材溶離出醣肽，可對所得到的經富集之醣肽樣品進行進一步分離及分析，例如層析及/或質譜分析。在實施方案中，經富集之醣肽樣品係施用於分離管柱，且隨後自該分離管柱溶離出來，例如使用流動相梯度以分離(resolve)個別醣肽物種。
在一些實施方案中，係使用溶劑梯度、分步溶離及/或多維溶離以自分離管柱溶離出及/或分離醣肽。梯度之使用為層析領域中眾所周知的。基本原理涉及將分析物吸附至分離管柱上，且隨後用脫附溶劑梯度(desorption solvent gradient)加以溶離。梯度係指改變溶劑之至少一種特徵，例如改變pH值、離子強度、極性或改變影響結合相互作用強度之某種試劑的濃度。
所用梯度可為漸進的，或可分步添加。在一個實施方案中，係使用兩種或兩種以上在一個或多個維度上有變化的脫附溶劑團。舉例而言，兩種或兩種以上的溶劑團之pH值、離子強度、疏水性等可彼此不同。可選擇會在對所結合醣肽之損失或損害最小的情況下移除非所需污染物的洗滌溶液(若有使用時)。洗滌溶液之特性可介於在樣品與脫附溶液之間。溶劑(例如溶離梯度中之溶劑)會選擇與醣肽及最終偵測方法相容者。一般而言，所用溶劑為已知之習知溶劑。在各種實施方案中，可自其中選擇出適合的溶劑包含氫氧化銨、 三乙胺、磷酸二銨、二氯甲烷、乙腈(具有或不具有少量鹼性或酸性改性劑)、甲醇(含有較大量之改性劑，例如乙酸或三乙胺，或水與甲醇或水與乙腈之混合物)、乙酸乙酯、氯仿、己烷、異丙醇、丙酮、鹼性緩衝液、高離子強度緩衝液、酸性緩衝液、強酸、強鹼、含酸/鹼之有機混合物、酸性或鹼性甲醇、四氫呋喃及水。
液相層析(包含HPLC)可用來分析此些結構，諸如醣肽。各種形式之液相層析可用於研究此等結構，包含陰離子交換層析、逆相HPLC、尺寸排阻層析、高效陰離子交換層析及正相(NP)層析，包含NP-HPLC(參見例如Alpert等人，《層析法雜誌A輯(J.Chromatogr.A)》676：191-202(1994))。親水相互作用層析(hydrophilic interaction chromatography，HILIC)為NP-HPLC之變化形式，其可用部分水性移動相來執行，從而容許對肽、碳水化合物、核酸及許多蛋白質進行正相分離。HILIC之溶離次序為極性最小至極性最大，與逆相HPLC中之次序相反。HPLC可例如在來自沃特世(例如，Waters 2695 Alliance HPLC系統)、安捷倫(Agilent)、珀金埃爾默(Perkin Elmer)、吉而遜(Gilson)等之HPLC系統上執行。
NP-HPLC(較佳係HILIC)為HPLC之尤佳形式，其可用於本文所描述之方法中。NP-HPLC係基於分析物與固定相(例如基材)之間的極性相互作用來分離分析物。極性分析物係締合至且滯留於極性固定相。吸附強度隨分析物極性的增加而增加，且極性分析物與極性固定相(相對於流動相)之間的相互作用係提高了溶離時間。在流動相中使用更高極性之溶劑將減少分析物之滯留時間，而更高疏水性之溶劑則傾向於增加滯留時間。
各種類型之基材可與NP-HPLC一起使用，例如用於管柱層析，包含二氧化矽、胺基、醯胺、纖維素、環糊精及聚苯乙烯基材。適用基材(例如可用於管柱層析中者)之實例包含：聚磺乙基天冬醯胺(例如來自PolyLC)；磺基甜菜鹼基材，例如ZIC®-HILIC(例如來自SeQuant)、POROS® HS(例如來自應用生物系統，Applied Biosystems)、POROS® S(例如來自應用生物系統)、聚羥乙基天冬醯胺(例如來自PolyLC)、Zorbax 300 SCX(例如來自安捷倫)、PolyGLYCOPLEX®(例如來自PolyLC)、醯胺-80(例如來自Tosohaas)、TSK GEL®醯胺-80(例如來自Tosohaas)、聚羥乙基A(例如來自PolyLC)、Glyco-Sep-N(例如來自Oxford GlycoSciences)及Atlantis HILIC(例如來自沃特世)。可用 於所揭示之方法中的管柱，包含利用以下一種或多種官能基團者：胺甲醯基、磺丙基、磺乙基(例如，聚(2-磺乙基天冬醯胺))、羥乙基(例如，聚(2-羥乙基天冬醯胺))及芳族磺酸基團。
所用流動相可包含具有和不具有離子配對劑之緩衝液，例如乙腈及水。離子配對劑包含甲酸鹽、乙酸鹽、TFA及鹽。可使用緩衝液之梯度，例如，若使用兩種緩衝液時，則在層析運行過程中第一緩衝液之濃度或百分比可減少，而第二緩衝液之濃度或百分比係為增加。舉例而言，在層析運行過程中，第一緩衝液之百分比可自約100%、約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約50%、約45%或約40%減少至約0%、約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40%。作為另一實例，在同一運行過程中，第二緩衝液之百分比可自約0%、約1%、約5%、約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%或約40%增加至約100%、約99%、約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約50%、約45%或約40%。視情況，第一及第二緩衝液之濃度或百分比可在層析運行結束時返回其起始值。作為一個實例，第一緩衝液之百分比可分五階段自85%變化至63%、至59%、至10%，至85%；而在相同步驟中，第二緩衝液之百分比自15%變化、至37%、至41%、至90%，至15%。百分比可以線性梯度或以非線性(例如階段式)方式逐漸變化。舉例而言，梯度可為多階段的，例如雙階段、三階段等。在較佳的實施方案中，本文所描述之方法係使用遞減之乙腈緩衝液梯度，其相當於在不使用離子配對劑的情況下增加流動相之極性。
在整個層析運行中，可將管柱溫度維持恆定，例如使用商售的管柱加熱器來維持。在一些實施方案中，管柱係維持在介於約18℃至約70℃，例如約30℃至約60℃、約40℃至約50℃之間的溫度下，例如維持在約20℃、約25℃、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、約65℃或約70℃下。較佳之溫度為約45℃。
流動相之流動速率可在約0至約100ml/min之間。為了分析的目的，流動速率通常在0至10ml/min的範圍內，對於製備型HPLC，可使用超過100ml/min之流動速率。舉例而言，流動速率可為約0.5、約1、約1.5、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5或約5ml/min。使用相同填料、相同長度但 較小直徑之管柱來代替的話需要降低流速，以便保持峰之滯留時間和解析度相同，如其在較寬直徑之管柱的情況下所見者。較佳地，係使用等效於在4.6×100mm，5μm管柱中約1ml/min之流動速率。
運行時間可在約15至約240分鐘之間，例如約20至約70分鐘、約30至約60分鐘、約40至約90分鐘、約50分鐘至約100分鐘、約60至約120分鐘、約50至約80分鐘。
可調節NP-HPLC以在奈米尺度上執行，例如使用內徑為約75μm之管柱(參見例如Wuhrer等人，《分析化學》76：833-838(2004)；Wuhrer等人，《國際質譜學雜誌(Internat.J.Mass.Spec.)》232：51-57(2004))。
在某些實施方案中，分離管柱為親水相互作用(HILIC)分離管柱，而隨後自該HILIC分離管柱溶離出醣肽，例如使用流動相梯度來分離個別醣肽物種，藉此純化及或分離樣品中之醣肽。在某些實例中，將溶離自HILIC之醣肽分離到一個或多個級分中。此類級分可用於後續分析，諸如MS分析。在某些實施方案中，該方法包含鑑別存在於一個或多個級分中之醣肽和/或聚醣。在某些實施方案中，聚醣為N-聚醣。在某些實施方案中，流動相梯度為pH 4.5、10mM的甲酸銨，至含90% ACN及pH 4.5、10mM的甲酸銨，。在某些實施方案中，流動相梯度為含0.1% TFA之H2O至含0.1% TFA之ACN。
所述醣肽係獲取自醣基化蛋白質，諸如單株抗體。醣基化單株抗體可藉由還原、酶促消化、變性、片段化、化學切割及其組合來加以製備。本文所揭示之方法可適用於任何抗體同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合的同型。
還原為在3維蛋白質(諸如單株抗體)中，將雙硫鍵還原為兩個硫醇。還原可藉由在存有還原劑(例如TCEP-HCl)的情況下進行加熱變性、添加界面活性劑，或添加變性劑(例如鹽酸脈，6M)來執行。酶促降解為用蛋白酶，例如用胰蛋白酶或無色桿菌蛋白酶I(Lys-C)來消化蛋白質。另外，醣蛋白可以藉由加熱或利用化學品或其組合來進行變性。片段化涉及以物理、生物或化學方法切割單一蛋白質或多個亞單元之蛋白質(例如單株抗體)的蛋白質部分。舉例而言，來自釀膿鏈球菌(S.pyogenes，IdeS)之免疫球蛋白降解酶常用於抗體亞單元片段化
在各種實施方案中，樣品中的抗體可在與親水性富集基材接觸之 前，藉由還原、酶促降解、變性或片段化來處理和製備。該方法提供了一種表徵蛋白質(例如，單株抗體(mAb)治療劑)之醣基化的新穎層析方法，其藉助於片段及肽水準的HILIC-UV-MS分析來進行。在某些實施方案中，可對任何中間步驟之樣品進行濃縮、脫鹽等。
在一些實施方案中，該方法進一步包括偵測醣肽，例如使用來自醣肽其肽部分的UV信號。此可對樣品之級分來進行，且允許選擇特定級分以進一步分析，例如質譜(MS)分析。因此，在其他實施方案中，偵測步驟包括質譜法或液相層析質譜法(LC-MS)。在使用質譜法來分析生物分子時，係將分子自液相或固相轉移至氣相及真空相。由於許多生物分子均很大且易碎(蛋白質為一個主要適例)，故將其轉移至真空相之兩種最有效方法為基質輔助雷射解吸電離(MALDI)或電噴霧電離(ESI)。使用此等方法及樣品製備所要求之態樣，為本領域中一般技術者已知者。一般而言，ESI較為靈敏，而MALDI較快。值得注意的是，一些肽在MALDI模式下的電離情況較之在ESI下為佳，而某些肽的情況則相反(《基因組技術(Genome Technology)》,6月220，第52頁)。本發明之萃取通道方法及裝置特別適合於製備MS分析之樣品，尤其生物分子樣品，諸如醣肽。本發明之一個重要優點為其允許製備可直接分析之富集樣品，而不需要中間處理步驟，例如濃縮或脫鹽。
ESI係藉由以下來執行：將樣品與揮發性酸及有機溶劑混合，且經由充有高電壓之導電針將其注入。將自針頭噴霧(或噴射)之帶電液滴導引至質譜儀中，且在其飛入時藉由加熱及真空來乾燥。在液滴乾燥之後，藉由電磁透鏡將剩餘帶電分子導引至質量偵測器中，且進行質量分析。在一個實施方案中，將經溶離之樣品直接自毛細管沈積至電噴霧噴嘴中，例如，毛細管充當樣品加載器。在另一個實施方案中，毛細管本身係充當萃取裝置和電噴霧噴嘴。
對於MALDI來說，分析物分子(例如蛋白質)係沈積在金屬靶上並與有機基質共結晶。樣品係經乾燥並插入質譜儀中，且通常經由飛行時間(TOF)偵測來進行分析。在一個實施方案中，經溶離之樣品係直接自毛細管沈積至金屬靶上，例如，毛細管本身充當樣品加載器。在一個實施方案中，經萃取之分析物係沈積在MALDI靶上，添加MALDI電離基質，且對樣品進行電離及例如藉由TOF偵測來分析。
在一些實施方案中，使用其他電離模式，例如ESI-MS、渦輪噴 霧電離質譜法、奈米噴霧電離質譜法、熱噴霧電離質譜法、聲波噴霧電離質譜法、SELDI-MS及MALDI-MS。一般而言，此等方法的優點在於其允許對樣品進行「及時」純化，且將其直接引入至電離環境中。值得注意的是，各種電離及偵測模式自身係限制了所用之脫附溶液的性質，且重要的是脫附溶液與兩者相容。舉例而言，許多應用中之樣品基質必須具有低離子強度，或存在於特定pH值範圍內等。在ESI中，樣品中之鹽可藉由降低電離或堵塞噴嘴來阻止偵測。此問題係藉由在低鹽中呈現分析物及/或藉由使用揮發性鹽來加以解決。在MALDI的情況下，分析物應處於與在靶上噴濺及所採用之電離基質相容的溶劑中。
實施例
以下實施例係提出以便向本領域中一般技術者完整揭示和描述如何製得及使用本發明之方法，且不旨在限制本發明人視作其發明之範疇。已努力確保關於所用數字(例如量、溫度等)的準確性，但是應考慮一些實驗誤差及偏差。除非另外指明，否則份數為重量份，分子量為平均分子量，溫度以攝氏度計，室溫為約25℃，且壓力為在大氣壓下或接近大氣壓。
實施例1：比較基於醣肽及所釋放聚醣的RPLC-UV-MS先前方法。
圖1為說明醣肽定量之當前方法的示意性工作流程圖。在變性、還原及烷基化之後，係使用胰蛋白酶來消化治療性抗體。藉由醣肽質量峰之峰強度(高度)來進行相對定量。所釋放聚醣方法係藉由與釋放之聚醣所結合的標記其螢光量來定量醣型，而非藉由MS信號來定量。圖2的表係顯示藉由釋放之聚醣(使用來自沃特世之螢光試劑RapiFluor-MS來進行標記)及醣肽所定量之各醣型其相對定量結果的比較。方法之間定量的主要差異，係顯示在第3、5、7及8列中。圖3之質譜係顯示藉由醣肽及所釋放聚醣方法進行之醣型定量之間的差異，很可能係由在醣肽分析中以MS對糖主鏈進行之源內碎片化所造成，其係增加截短型聚醣的假訊號(亦即G0F-GlcNAc及G1F-GlcNAc)並減少主要聚醣(亦即，G0F及G1F)。此結果顯示，在肽水準上進行聚醣分析需要新穎且經改良之方法。
實施例2：使用HILIC-UV-MS進行醣肽分析之新穎方法。
源自於治療性抗體的胜肽係藉由常規執行之還原或非還原肽定位方法來加以製備。隨後，消化物係在HILIC-UV-MS分析之前，將其最終稀釋 至80% ACN(v/v)。
LC系統：具有PDA(UV)偵測器之Waters ACQUITY I-Class UPLC®系統
MS系統：Waters XEVO G2-S QTof或Thermo Scientific Q Exactive Plus
管柱：Waters ACQUITY UPLC®聚醣BEH醯胺HILIC管柱
圖5為mAb1肽的HILIC-UV層析圖組，其顯示藉由兩種不同方法對獲自胰蛋白酶消化物之mAb1肽進行分離的結果。方法#1係使用甲酸銨，而方法#2係使用TFA。使用具有線上MS偵測之PDA偵測器，藉由UV來定量不同醣型之相對含量。圖6為圖5中所示跡線的醣肽部分的特寫，其顯示方法#2的分離結果更佳、其訊號更陡峭，且S/N比率更高。圖7為對醣肽部分放大的mAb1醣肽之HILIC-TIC層析圖組。如圖所示，方法#2的MS信號其S/N比率更高。圖8A及8B為mAb1醣肽的MS1譜(M2+離子)。聚醣之MS源內碎片化並非以UV所進行的醣型定量之因素。圖9之一組跡線及表，係顯示在HILIC管柱上進行之醣型分離與所釋放聚醣分析的比較。對於mAb1來說，醣肽及所釋放聚醣分析係被觀測到有類似的醣型定量結果。重要的是，在兩種方法之間在醣型定量上未觀測到有主要差異，係顯示HILIC管柱分離對於醣肽分析係為可行。另外，在兩種分析之間，總海藻糖基化及半乳糖基化的量為一致。截短型聚醣的假訊號不影響藉由HILIC-UV所進行之醣肽定量。此表明先前RPLC分析所觀測到之假訊號係歸因於由MS所誘導的聚醣源內碎片化。
稀釋的消化物可使用乾燥來濃縮：若消化物之濃度<0.5mg/mL，則可藉由真空乾燥來濃縮樣品，且將經乾燥之肽重新懸浮於含0.2% TFA之80：20 ACN：水(v/v)中，使其濃度達到0.5mg/mL或更高。需要有低pH值以維持肽在高度有機溶劑中之溶解度。圖10之一組跡線及表係顯示對肽進行乾燥有助於濃縮醣肽，且在使用不同樣品量(例如5至20μg，左上)的情況下係為一致，但不影響聚醣之UV信號(左下)及相對PA%(右表)。圖11之一組跡線係顯示要簡化流動相的製備且改善峰積分而進行的變化。流動相係自含0.1% TFA之水/ACN，變化至與用於肽定位相同之流動相緩衝液(分別為含0.05%及0.045% TFA之水及ACN)。圖12A、12B、12C及12D之一組質譜分析結果顯示，流動相的變化不影響醣肽MS信號(M2+離子)。圖13之一組跡線係展示稀釋至80% ACN的mAb1醣肽其溶液穩定性。
漏切醣肽的鑑別：圖14之一組跡線顯示具有漏切醣肽之消化物， 係使以UV對醣肽所進行之定量複雜化。圖15之一組跡線及表係顯示，在使用線上MS資料的情況下，萃取離子層析(EIC)可用來找出各峰中之漏切醣肽的百分比。來自線上MS偵測之EIC係用來計算各個共溶離峰中的漏切肽與常規胰蛋白酶醣肽之比率，且濾除因用於醣型定量之漏切所致的UV信號。另外，消化物係可以胰蛋白脢來重新消化，以將漏切物轉化成常規的胰蛋白酶醣肽。
對於重新消化，係使用以下方案：用3M Tris鹼使消化物之pH值上升至約8.0，添加1：5 E：S比率(w/w)之胰蛋白酶，在50℃下孵育1小時；且添加0.2% TFA(最終濃度)，且稀釋至80% ACN(最終濃度)來進行HILIC分析。圖16之一組跡線及表顯示用胰蛋白酶對mAb2進行重新消化，係消除了漏切醣肽對醣型定量的干擾。
經試劑污染之消化物可使用固相萃取來淨化且以乾燥來濃縮：若消化物之濃度<0.5mg/mL，則可藉由真空乾燥來對其進行濃縮，且將經乾燥之肽重新懸浮於含0.2% TFA之80：20 ACN：水(v/v)中，使其濃度達到0.5mg/mL或更高。需要有低pH值以維持肽在高度有機溶劑中之溶解度。
消化物可藉由固相萃取(SPE)來清除其中之鹽、試劑或洗滌劑，且隨後真空乾燥。
Waters GlycoWorks HILIC μElution盤(部件號186002780)：用水洗滌，隨後用80：15 ACN：水(v/v)來洗滌；添加肽消化物(稀釋至80% ACN，v/v)；用1：9：90甲酸：水：ACN(v/v)洗滌兩次；用200mM甲酸銨，5% can來溶離；真空乾燥經溶離之醣肽；且重新懸浮於含0.2% TFA之80：20 ACN：水(v/v)，使濃度達到0.5mg/mL或更高。
圖17之一組跡線顯示，甲酸銨係顯著改善醣肽自HILIC SPE之溶離結果。
圖18之一組跡線及表顯示，乾燥或SPE淨化/乾燥不影響mAb1醣肽的定量。
圖19之一組跡線及表顯示，醣肽及所釋放聚醣分析有類似的mAb3醣型定量結果。
圖20A及20B之一組跡線及表顯示，使用還原及非還原mAb3胰蛋白酶消化物進行之醣肽及所釋放聚醣分析，有類似的醣型定量結果。
圖21之一組跡線顯示，對具有及不具有海藻糖基化之IgG1及 IgG4醣肽之分離的比較結果。
本發明之範疇不受本文所描述之具體實施方案限制。實際上，除了本文所描述之彼等修改之外，本發明之各種修改對於本領域中技術人員而言將由前述描述及附圖而變得顯而易見。此類修改旨在處於隨附申請專利範圍之範疇內。

Claims (23)

  1. 一種分離醣肽之方法，其包括：
    使一包括醣肽之樣品與一親水性富集基材在容許該等醣肽結合於該親水性富集基材的條件下接觸；
    洗滌該親水性富集基材以自該親水性富集基材移除非醣肽污染物；
    用一含甲酸銨及乙腈(ACN)之水溶液自該親水性富集基材溶離該等醣肽，以產生一經富集之醣肽樣品；
    將該經富集之醣肽樣品施用於一分離管柱；及
    自該分離管柱溶離該等醣肽，藉此分離該樣品中之醣肽。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該親水性富集基材包括固相萃取(SPE)層析基材。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述的方法，其中該親水性富集基材包括一基於二氧化矽之胺基丙基吸附劑材料。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述的方法，其中該含甲酸銨及ACN之水溶液於水中包括約100至400mM的甲酸銨及約2.5%至約10%的ACN。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中甲酸銨ACN溶液於水中包括約200mM的甲酸銨及約5%的ACN。
  6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項所述的方法，其中該親水性富集基材係使用甲酸及ACN洗滌溶液進行洗滌以移除非醣肽污染物，該洗滌溶液包括按體積計約0.5%至約5%的甲酸及按體積計約85%至約95%的ACN，其餘為水。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該甲酸及ACN洗滌溶液包括按體積計約1%的甲酸、約9%的H 2O及約90%的ACN。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的方法，其中該分離管柱包括一親水相互作用(HILIC)管柱。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述的方法，其中自該分離管柱溶離該等醣肽進一步包括將該等醣肽分離至一個或多個級分中。
  10. 如申請專利範圍第9項至第11項中任一項所述的方法，其中將 該等醣肽分離至一個或多個級分中包括將一流動相梯度施用於該分離管柱。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中該流動相梯度包括pH 4.5、約10mM的甲酸銨，至pH 4.5、含約90%的ACN及10mM的甲酸銨，。
  12. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中該流動相梯度包括含約0.05% TFA之H 2O或含約0.045% TFA之ACN。
  13. 如申請專利範圍第9項至第12項中任一項所述的方法，其進一步包括鑑別存在於一個或多個該等級分中之該等醣肽。
  14. 如申請專利範圍第9項至第13項中任一項所述的方法，其進一步包括鑑別與存在於一個或多個該等級分中之該等醣肽締合的聚醣。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的方法，其中該聚醣包括N-聚醣。
  16. 如申請專利範圍第9項至第15項中任一項所述的方法，該等醣肽係獲自一單株抗體。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中該單株抗體具有IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型、IgG4同型或混合之同型。
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項所述的方法，其進一步包括用蛋白酶消化該單株抗體。
  19. 如申請專利範圍第18項所述的方法，其中該蛋白酶包括胰蛋白酶。
  20. 如申請專利範圍第1項至第19項中任一項所述的方法，其進一步包括對該等經溶離之醣肽執行質譜分析。
  21. 如申請專利範圍第1項至第20項中任一項所述的方法，其進一步包括在醣肽水準上對該等經溶離之醣肽進行醣基化概況分析。
  22. 如申請專利範圍第1項至第21項中任一項所述的方法，其進一步包括用含乙腈(ACN)之水溶液對該親水性富集基材進行預洗滌。
  23. 如申請專利範圍第1項至第22項中任一項所述的方法，其進一步包括在與該親水性富集基材接觸之前，在含ACN之水溶液中稀釋該包括醣肽之樣品。
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