BR112021000520A2 - Detecção e quantificação de péptidos glicosilados - Google Patents
Detecção e quantificação de péptidos glicosilados Download PDFInfo
- Publication number
- BR112021000520A2 BR112021000520A2 BR112021000520-0A BR112021000520A BR112021000520A2 BR 112021000520 A2 BR112021000520 A2 BR 112021000520A2 BR 112021000520 A BR112021000520 A BR 112021000520A BR 112021000520 A2 BR112021000520 A2 BR 112021000520A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- glycopeptides
- acn
- hydrophilic
- sample
- glycopeptide
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title description 33
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title description 31
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 21
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 18
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims abstract description 154
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims abstract description 154
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 94
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 54
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 claims abstract description 52
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 228
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 41
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 40
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 36
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 35
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 33
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 33
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- -1 aminopropyl Chemical group 0.000 claims description 18
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 14
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 12
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 7
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- FESBVLZDDCQLFY-UHFFFAOYSA-N sete Chemical compound [Te]=[Se] FESBVLZDDCQLFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 38
- VVAUMULFPDPRCF-UHFFFAOYSA-N azanium;acetonitrile;formate Chemical compound [NH4+].CC#N.[O-]C=O VVAUMULFPDPRCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 42
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 19
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 14
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 9
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 239000011162 core material Substances 0.000 description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 7
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000004305 normal phase HPLC Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 5
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 101100075829 Caenorhabditis elegans mab-3 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N anthranilic acid Chemical compound NC1=CC=CC=C1C(O)=O RWZYAGGXGHYGMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000033581 fucosylation Effects 0.000 description 3
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 3
- ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 2-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=CC=N1 ICSNLGPSRYBMBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 2
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 2
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 2
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000010363 phase shift Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229940126622 therapeutic monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- BWBDAEIIXBEFSS-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) n-[2-[2-(diethylamino)ethylcarbamoyl]quinolin-6-yl]carbamate Chemical compound C1=CC2=NC(C(=O)NCCN(CC)CC)=CC=C2C=C1NC(=O)ON1C(=O)CCC1=O BWBDAEIIXBEFSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N (2s)-2-aminobutanediamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DSLBDPPHINVUID-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000005696 Diammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241001082241 Lythrum hyssopifolia Species 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000002045 capillary electrochromatography Methods 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035418 detection of UV Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000388 diammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019838 diammonium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N formic acid;hydrate Chemical compound O.OC=O HQVFCQRVQFYGRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004188 ion pair liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000409 membrane extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000874 microwave-assisted extraction Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 238000004816 paper chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000244 procainamide Drugs 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 description 1
- 125000000542 sulfonic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001920 surface-enhanced laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/30—Partition chromatography
- B01D15/305—Hydrophilic interaction chromatography [HILIC]
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
- B01D15/424—Elution mode
- B01D15/426—Specific type of solvent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
- G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
A presente invenção refere-se a um método de purificação e/ou separação de glicopeptídeos e quantificação dos mesmos. O método inclui o contato de uma amostra compreendendo glicopeptídeos a um substrato de enriquecimento hidrófilo sob condições que permitem que os glicopeptídeos se liguem ao substrato de enriquecimento hidrófilo. Os glicopeptídeos são eluídos do substrato de enriquecimento hidrófilo com formiato de amônio e acetonitrila (ACN) em solução aquosa para criar uma amostra de glicopeptídeo enriquecida, que pode ser submetida à análise para identificar glicopeptídeos específicos.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DETEC- ÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DE PEPTÍDEOS GLICOSILADOS".
[0001] A presente invenção refere-se a biofarmacêuticos e se re- fere à detecção e quantificação de glicosilação pós-tradução in vivo de proteínas, tais como anticorpos terapêuticos e fragmentos dos mes- mos.
[0002] Os anticorpos monoclonais terapêuticos (mAbs) são molécu- las heterogêneas produzidas em células de mamíferos com muitas va- riantes do produto, incluindo variantes resultantes de modificações pós- tradução (PTMs). A glicosilação ligada a N é o principal PTM em anti- corpos terapêuticos. A caracterização de estruturas de glicano ligado a N e a quantificação de glicoformas individuais são exigidas pelas agên- cias regulatórias para definir a qualidade da droga, demonstrar consis- tência lote a lote e garantir o controle do processo de fabricação. Tradi- cionalmente, os glicanos ligados a N dentro dos anticorpos são quanti- ficados pela liberação enzimática dos glicanos do anticorpo, seguido de marcação com reagentes fluorescentes. Alternativamente, a glicosila- ção pode ser caracterizada no nível do peptídeo por meio da análise dos glicopeptídeos gerados a partir de uma digestão tríptica de um an- ticorpo. No entanto, os glicopeptídeos que possuem glicoformas hetero- gêneas muitas vezes não são bem separados por cromatografia líquida de fase reversa (RPLC), que é tradicionalmente usada para mapea- mento de peptídeos. Além disso, a fragmentação in-source induzida por espectrometria de massa online (MS) da cadeia de açúcar em glicopep- tídeos pode produzir artefatos de glicoformas truncados, que compro- metem a quantificação precisa da abundância relativa das diferentes gli- coformas usando MS.
[0003] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de purificação e / ou separação de glicopeptídeos, em que o método com- preende: (a) contatar uma amostra compreendendo glicopeptídeos com um substrato de enriquecimento hidrofílico sob condições que permitem que os glicopeptídeos se liguem ao substrato de enriquecimento hidro- fílico; (b) lavar o substrato de enriquecimento hidrofílico para remover contaminantes não glicopeptídicos do substrato de enriquecimento hi- drofílico; e (c) eluir os glicopeptídeos do substrato de enriquecimento hidrofílico com um formiato de amônio e acetonitrila (ACN) em solução de água, criando assim uma amostra de glicopeptídeo enriquecida. Op- cionalmente, o método inclui aplicar a amostra de glicopeptídeo enri- quecido a uma coluna de separação e eluir os glicopeptídeos da coluna de separação.
[0004] Em algumas modalidades, o substrato de enriquecimento hi- drofílico compreende um substrato de cromatografia de extração em fase sólida (SPE).
[0005] Em algumas modalidades, o substrato de enriquecimento hi- drofílico compreende um material absorvente de aminopropil à base de sílica.
[0006] Em algumas modalidades, o formiato de amônio e ACN em solução de água compreende cerca de 100-400 mM formiato de amônio e cerca de 2,5% a cerca de 10% de ACN em água.
[0007] Em algumas modalidades, a solução de formiato de amônio ACN compreende formiato de amônio 200 mM e 5% de ACN em água.
[0008] Em algumas modalidades, o substrato de enriquecimento hi- drofílico é lavado com um ácido fórmico e solução de lavagem de ACN compreendendo 0,5% a cerca de 5% de ácido fórmico em volume e cerca de 85% a cerca de 95% de ACN em volume com o restante água para remover contaminantes não glicopeptídicos.
[0009] Em algumas modalidades, o ácido fórmico e a solução de lavagem de ACN compreendem 1% de ácido fórmico, 9% de H2O, 90% de ACN por volume.
[0010] Em algumas modalidades, a coluna de separação compre- ende uma coluna de interação hidrofílica (HILIC).
[0011] Em algumas modalidades, a eluição do glicopeptídeo da co- luna de separação compreende ainda separar os glicopeptídeos em uma ou mais frações.
[0012] Em algumas modalidades, a separação dos glicopeptídeos em uma ou mais frações compreende aplicar um gradiente de fase mó- vel à coluna de separação.
[0013] Em algumas modalidades, o gradiente de fase móvel é for- miato de amônio 10 mM, pH 4,5 a 90% ACN com formiato de amônio MM, pH 4,5.
[0014] Em algumas modalidades, o gradiente de fase móvel é 0,05% TFA em H2O ou 0,045% TFA em ACN.
[0015] Em algumas modalidades, o método inclui ainda identificar os glicopeptídeos presentes em uma ou mais das frações.
[0016] Em algumas modalidades, o método inclui ainda identificar um glicano associado aos glicopeptídeos presentes em uma ou mais das frações.
[0017] Em algumas modalidades, o glicano compreende um N-gli- cano.
[0018] Em algumas modalidades, os glicopeptídeos são obtidos a partir de um anticorpo monoclonal.
[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal é do iso- tipo I9G1, IgG2, IgG3, IgG4 ou isotipo misto.
[0020] Em algumas modalidades, o método inclui ainda digerir o an- ticorpo monoclonal com uma protease.
[0021] Em algumas modalidades, a protease compreende tripsina.
[0022] Em algumas modalidades, o método inclui ainda realizar análise espectrométrica de massa nos glicopeptídeos eluídos.
[0023] Em algumas modalidades, o método inclui ainda o perfil de glicosilação em um nível de glicopeptídeo dos glicopeptídeos eluídos.
[0024] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a pré-lava- gem do substrato de enriquecimento hidrofílico com uma solução de acetonitrila (ACN) em água.
[0025] Em algumas modalidades, o método inclui ainda diluir uma amostra compreendendo glicopeptídeos em um ACN em solução de água antes do contato com o substrato de enriquecimento hidrofílico.
[0026] A Figura 1 mostra um diagrama de fluxo de trabalho esque- mático que ilustra os métodos padrão atuais de quantificação de glico- peptídeos por cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa (LC / MS).
[0027] A Figura 2 mostra uma tabela que mostra os resultados do método de quantificação de glicopeptídeo mostrado no fluxo de trabalho da Figura 1, em comparação com a quantificação de glicanos liberados; ou seja, um baseado na detecção de glicopeptídeos e o outro baseado na detecção de glicano liberado.
[0028] A Figura 3 mostra um espectro de massa que demonstra que as discrepâncias entre as quantificações de glicoforma por glicopeptí- deo e métodos de glicano liberado (ver Figura 2) são provavelmente devido à fragmentação na fonte da espinha dorsal do açúcar por MS na análise de glicopeptídeo, causando um aumento de artefatos de glicano truncados (ou seja, GOF-GICNAc e G1F-GICNAc) e uma diminuição do glicano principal (ou seja, GOF e G1F). O método do glicano liberado quantifica as glicoformas por fluorescência do marcador ligado ao gli- cano liberado, não pelo sinal de MS.
[0029] A Figura 4 mostra um diagrama de fluxo de trabalho para métodos de quantificação de glicopeptídeo conforme divulgado neste documento.
[0030] A Figura 5 mostra um conjunto de cromatogramas HILIC-UV de peptídeos mAb1 mostrando os resultados de uma separação de pep- tídeos mAb1 obtidos por digestão tríptica por dois métodos diferentes.
[0031] A Figura 6 mostra uma vista aproximada da porção de glico- peptídeo do traço mostrado na Figura 5 demonstrando que o método tt2 teve melhor separação, picos mais nítidos e maior razão S/N.
[0032] A Figura 7 mostra um conjunto de cromatogramas HILIC-TIC de glicopeptídeos mAb1 ampliando os glicopeptídeos. Como mostrado, o Método *2 teve maior razão S/N de sinal MS.
[0033] As Figuras 8A e 8B mostram espectros de MS1 de glicopep- tídeos de mAb1 (íons M?**).
[0034] A Figura 9 mostra um conjunto de traços e uma tabela que mostra uma comparação de quantificação de glicoforma por separação de glicopeptídeo em uma coluna HILIC com análise de glicano liberado.
[0035] A Figura 10 mostra um conjunto de traços e uma tabela que demonstra que a digestão de peptídeos de secagem pode ajudar a con- centrar glicopeptídeos, mas não afetou o sinal de UV e a % PA relativa de glicanos.
[0036] A Figura 11 mostra um conjunto de traços que ilustram as mu- danças feitas para simplificar as preparações da fase móvel e melhorar a integração do pico usando 0,05% e 0,045% de TFA em água e ACN, res- pectivamente (fase móvel de mapeamento de peptídeo RP-LC).
[0037] As Figuras 12A, 12B, 12C e 12D mostram um conjunto de resultados de espectros de massa demonstrando que a mudança de fase móvel não teve impacto no sinal de MS de glicopeptídeos (íons M?* ).
[0038] A Figura 13 mostra um conjunto de traços que demonstram a estabilidade da solução de glicopeptídeos mAb1 diluídos a 80% ACN.
[0039] A Figura 14 mostra um conjunto de traços demonstrando que a digestão tríptica com glicopeptídeos de corte incorreto complicam a quantificação de glicopeptídeos por UV.
[0040] A Figura 15 mostra um conjunto de traços e uma tabela que demonstra que, com dados de MS online, o EIC pode ser usado para encontrar a porcentagem de glicopeptídeos de corte incorreto em cada pico para ajudar na quantificação de glicoforma.
[0041] A Figura 16 mostra um conjunto de traços e uma tabela que demonstra que a redigestão de mAb2 com tripsina removeu glicopeptí- deos de corte incorreto para ajudar na quantificação de glicoforma.
[0042] A Figura 17 mostra um conjunto de traços demonstrando que o formiato de amônio melhorou significativamente a eluição de glicopep- tídeos de HILIC SPE.
[0043] A Figura 18 mostra um conjunto de traços e uma tabela que demonstra que a secagem ou limpeza / secagem SPE não teve efeito na quantificação do glicopeptídeo mAb1.
[0044] A Figura 19 mostra um conjunto de traços e uma tabela que demonstra quantificações de glicoforma de mAb3 semelhantes por gli- copeptídeo e análises de glicano liberado.
[0045] As Figuras 20A e 20B mostram um conjunto de traços e uma tabela que demonstra quantificações de glicoforma semelhantes usando digestão tríptica de mAb3 reduzida e não reduzida por glicopep- tídeo e análises de glicano liberado.
[0046] A Figura 21 mostra um conjunto de traços que ilustra uma comparação da separação de glicopeptídeos I9G1 e IgG4, com e sem fucosilação.
[0047] A Figura 22 mostra um diagrama de fluxo de trabalho esque- mático que ilustra métodos de quantificação de glicopeptídeo que in- cluem os métodos aqui divulgados.
[0048] Antes da presente invenção ser descrita, deve-se entender que esta invenção não está limitada a métodos particulares e condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Também deve-se entender que a terminologia usada neste do- cumento tem a finalidade de descrever modalidades específicas apenas e não pretende limitar o escopo da presente invenção, o qual será limi- tado somente pelas reivindicações anexas. Quaisquer modalidades ou características das modalidades podem ser combinadas umas com as outras, e tais combinações são expressamente englobadas no escopo da presente invenção.
[0049] A menos que definido de outra forma, todos os termos técni- cos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado conforme co- mumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção pertence. Como utilizado neste documento, o termo "cerca de", quando utilizado em referência a um valor numérico particular recitado, significa que o valor pode variar do valor indicado em não mais que 1%. Por exemplo, como utilizado neste documento, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
[0050] Embora quaisquer métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prá- tica ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as patentes, pedidos de patente e publica- ções não patenteadas mencionadas neste relatório descritivo são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Abreviações utilizadas neste documento PTMs: Modificações pós-translacionais RP-LC-MS/MS: Espectrometria de massa em tandem de cromatografia líquida de fase reversa MAb: anticorpo monoclonal IgG: imunoglobulina G
LC: cadeia leve HC: cadeia pesada MS: espectrometria de massa SPE: extração de fase sólida HILIC: cromatografia líquida de interação hidrofílica UV: ultravioleta TFA: ácido trifluoroacético ACN: acetonitrila Definições
[0051] O termo "anticorpo", como utilizado neste documento, pre- tende se referir a moléculas de imunoglobulina constituídas por quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por ligações dissulfeto (ou seja, "moléculas completas de anticorpo"), bem como multímeros das mesmas (por exemplo IgM) ou fragmentos de ligação ao antígeno das mesmas. Cada cadeia pe- sada é constituída por uma região variável da cadeia pesada (“HCVR” ou “VW") e uma região constante da cadeia pesada (compreendida pelos domínios CH1, CH2 e Cx3). Em várias modalidades, a cadeia pesada pode ser um isótipo IgG. Em alguns casos, a cadeia pesada é selecio- nada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em algumas modalidades, a cadeia pesada é do isótipo I9G1 ou IgG4, opcionalmente incluindo uma região de dobradiça quimérica do isótipo I9gG1 / IgG2 ou IgG4 / I9gG2. Cada cadeia leve é composta por uma região variável da cadeia leve (“LCVR ou “VI”) e uma região constante da cadeia leve (C.1). As regiões Vu e V.
podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, desig- nadas regiões que determinam complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estrutu- rais (FR). Cada Vu e V. é composto por três CDRs e quatro FRs, dis- postas a partir do terminal amino para o terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. O termo "anticorpo"
inclui referência a imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isótipo ou subclasse. O termo "anticorpo" inclui moléculas de anticorpo preparadas, expressas, criadas ou isoladas por meios recom- binantes, tais como anticorpos isolados de uma célula hospedeira trans- fectada para expressar o anticorpo. Para uma revisão sobre a estrutura do anticorpo, consulte Lefranc et al., IMGT unique numbering for immu- noglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V- like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); e M. Pot- ter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immu- nol. Res. 27-42 (1983).
[0052] O termo anticorpo também abrange "anticorpo biespecífico", que inclui uma imunoglobulina heterotetramérica que pode se ligar a mais de um epítopo diferente. Metade do anticorpo biespecífico, que inclui uma única cadeia pesada e uma única cadeia leve e seis CDRs, se liga a um antígeno ou epítopo, e a outra metade do anticorpo se liga a um antígeno ou epítopo diferente. Em alguns casos, o anticorpo bies- pecífico pode se ligar ao mesmo antígeno, mas em diferentes epítopos ou epítopos não sobrepostos. Em alguns casos, ambas as metades do anticorpo biespecífico têm cadeias leves idênticas, mantendo a especi- ficidade dupla. Os anticorpos biespecíficos são descritos geralmente na Pub. do Pedido de Patente U.S. 2010/0331527 (30 de dezembro de 2010).
[0053] O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo (ou "fragmento de anticorpo"), refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um an- tígeno. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos pelo termo "por- ção de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreen- dendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), que consiste em um domínio VH, (vi) uma CDR isolada e (vii) um scFv, que consiste nos dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, unidos por um ligante sintético para formar uma única ca- deia de proteína na qual as regiões VL e VH emparelham para formar moléculas monovalentes. Outras formas de anticorpos de cadeia única, como diacorpos, também estão abrangidas pelo termo "anticorpo" (ver, por exemplo, Holliger et al. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; e Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123).
[0054] Além disso, os anticorpos e fragmentos de ligação ao antí- geno dos mesmos podem ser obtidos usando técnicas de DNA recom- binante padrão comumente conhecidas na técnica (ver Sambrook et al., 1989).
[0055] O termo "anticorpo humano" pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imuno- globulina da linhagem germinativa humana. Os mAbs humanos da in- venção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por se- quências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou especí- fica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e, em particular, em CDR3. No entanto, o termo "anticorpo hu- mano", como utilizado neste documento, não pretende incluir mAbs nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinal de outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo) foram enxertadas em sequências FR humanas. O termo inclui anticorpos produzidos por via recombinante em um mamífero não humano ou em células de um ma- mífero não humano. O termo não se destina a incluir anticorpos isolados ou gerados em um sujeito humano.
[0056] O termo como utilizado neste documento, "glicopeptídeo / glicoproteína" é um peptídeo / proteína modificado, durante ou após sua síntese, com carboidratos covalentemente ligados ou glicano. Em certas modalidades, um glicopeptídeo é obtido a partir de um anticorpo mono- clonal, por exemplo, a partir de uma digestão por protease de um anti- corpo monoclonal.
[0057] O termo conforme usado neste documento, "glicano" é um composto que compreende uma ou mais unidades de açúcar que co- mumente incluem glicose (Glc), galactose (Gal), manose (Man), fucose (Fuc), N-acetilgalactosamina (GalNAc), N-acetilglucosamina (GICNAc) e ácido N-acetilneuramínico (NeuNAc) (Frank Kjeldsen, et al. Anal. Chem. 2003, 75, 2355-2361). A fração glicano na glicoproteína, como um anti- corpo monoclonal, é um personagem importante para identificar sua fun- ção ou localização celular. Por exemplo, um anticorpo monoclonal es- pecífico é modificado com uma fração de glicano específica.
[0058] O termo "cromatografia de interação hidrofílica" ou HILIC se destina a incluir um processo que emprega uma fase estacionária hidro- fílica e uma fase móvel orgânica hidrofóbica na qual os compostos hi- drofílicos são retidos por mais tempo do que os compostos hidrofóbicos. Em certas modalidades, o processo utiliza uma fase móvel solvente mis- cível em água.
[0059] O termo "amostra", como utilizado neste documento, refere- se a uma mistura de moléculas que compreende pelo menos uma mo- lécula de analito, por exemplo, glicopeptídeo, tal como obtido a partir de um anticorpo monoclonal, que é submetido à manipulação de acordo com os métodos do invenção, incluindo, por exemplo, separação, aná- lise, extração, concentração ou perfilamento.
[0060] Os termos "análise" ou "analisar", como utilizados neste do- cumento, são usados indistintamente e referem-se a qualquer um dos vários métodos de separação, detecção, isolamento, purificação, solu- bilização, detecção e / ou caracterização de moléculas de interesse (por exemplo, glicoproteína). Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, extração em fase sólida, microextração em fase sólida, eletroforese, espectrometria de massa, por exemplo, SPE HILIC, MALDI-MS ou ES, cromatografia líquida, por exemplo, alto desempenho, por exemplo, fase reversa, fase normal ou exclusão de tamanho, cromatografia líquida de par iônico, extração líquido-líquido, por exemplo, extração de fluido ace- lerada, extração de fluido supercrítico, extração assistida por micro-on- das, extração de membrana, extração de soxhlet, precipitação, clarifica- ção, detecção eletroquímica, coloração, análise elementar, degradação de Edmund, ressonância magnética nuclear, análise de infravermelho, análise de injeção de fluxo, eletrocromatografia capilar, detecção ultra- violeta e combinações dos mesmos.
[0061] O termo "perfilagem", como utilizado neste documento, re- fere-se a qualquer um dos vários métodos de análise que são usados em combinação para fornecer o conteúdo, a composição ou razão ca- racterística de glicopeptídeos em uma amostra.
[0062] Um "substrato de enriquecimento hidrofílico", como utilizado neste documento, é um material cromatográfico que se liga preferenci- almente a materiais hidrofílicos sob condições que permitem a ligação, por exemplo pH, resistência iônica, etc. Em algumas modalidades, um substrato de enriquecimento hidrofílico é usado para SPE.
[0063] O termo "superfície cromatográfica", como utilizado neste documento, inclui uma superfície que é exposta a uma amostra ou ana- litos. Uma superfície cromatográfica pode ser quimicamente modificada, funcionalizada ou ativada ou ter uma microestrutura, por exemplo, um poro. Em certas modalidades, a superfície cromatográfica pode ser hi- drofóbica, hidrofílica (polar) ou iônica. Em outras modalidades, a super- fície cromatográfica é totalmente porosa, superficialmente porosa ou não porosa.
[0064] O termo "núcleo cromatográfico", como utilizado neste docu- mento, inclui um material cromatográfico, incluindo, mas não se limi- tando a um material orgânico, como sílica, na forma de uma partícula, um monólito ou outra estrutura adequada que forma uma porção interna do materiais da invenção. Em certos aspectos, a superfície do núcleo cromatográfico representa a superfície cromatográfica ou representa um material encerrado por uma superfície cromatográfica, conforme de- finido neste documento. O material da superfície cromatográfica pode ser disposto ou ligado ou recozido ao núcleo cromatográfico de tal forma que uma transição discreta ou distinta seja discernível ou pode ser |li- gado ao núcleo cromatográfico de modo a se misturar com a superfície do núcleo cromatográfico resultando em uma gradação de materiais e nenhuma superfície interna discreta do núcleo. Em certos aspectos, o material da superfície cromatográfica pode ser o mesmo ou diferente do material do núcleo cromatográfico e pode exibir diferentes propriedades físicas ou físico-químicas do núcleo cromatográfico, incluindo, mas não se limitando a, volume de poro, área de superfície, diâmetro médio dos poros, teor de carbono ou estabilidade do pH hidrolítico.
[0065] O termo "hidrofílico", como utilizado neste documento, des- creve ter uma afinidade por, atrair, adsorver ou absorver água.
[0066] O termo "hidrofóbico", como utilizado neste documento, des- creve a falta de afinidade, repele ou falha em adsorver ou absorver água.
[0067] “Extração em fase sólida” ou “SPE” é uma técnica cromato- gráfica frequentemente usada em conjunto com a análise química quan- titativa, por exemplo, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) ou cromatografia gasosa (GC). O objetivo do SPE é isolar analitos alvo de uma matriz de amostra complexa contendo contaminantes indeseja-
dos. Os analitos alvo isolados são recuperados em uma solução com- patível com análises quantitativas. Esta solução final contendo o com- posto alvo pode ser usada diretamente para análise ou evaporada e re- constituída em outra solução de menor volume com o objetivo de con- centrar ainda mais o composto alvo, tornando-o mais passível de detec- ção e medição.
[0068] "Cromatografia", como utilizado neste documento, refere-se ao processo de separação de uma mistura, por exemplo, uma mistura contendo glicopeptídeos. Envolve a passagem de uma mistura por uma fase estacionária, que separa as moléculas de interesse de outras mo- léculas na mistura e permite que uma ou mais moléculas de interesse sejam isoladas. Exemplos de métodos de separação cromatográfica in- cluem cromatografia de ação capilar, tal como cromatografia de papel, cromatografia de camada fina (TLC), cromatografia em coluna, croma- tografia líquida de proteína rápida (FPLC), cromatografia líquida de fase nano-reversa, cromatografia de troca iônica, cromatografia em gel, tais como cromatografia de filtração em gel, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de afinidade, cromatografia líquida de alta efici- ência (HPLC), cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC) e cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (RP-HPLC), en- tre outras.
[0069] "Contato", como utilizado neste documento, inclui reunir pelo menos duas substâncias em solução ou fase sólida, por exemplo, con- tatar uma fase estacionária de um material de cromatografia com uma amostra. Descrição Geral
[0070] Os anticorpos monoclonais (MAbs) surgiram como biofarma- cêuticos eficazes para o câncer e outras doenças crônicas devido à es- pecificidade desses medicamentos para antígenos alvo, por exemplo,
ativando o sistema imunológico para matar células tumorais, bloque- ando a transdução de sinal de células tumorais para proliferar, transpor- tar drogas para células tumorais ou como alvos de radiação. A glicosi- lação de imunoglobulinas influencia tanto suas propriedades físico-qui- micas quanto suas funções efetoras mediadas por células, como ligação e ativação do complemento. Estas funções biológicas podem ser de- pendentes não apenas da presença ou ausência de oligossacarídeos ligados a N, mas também da estrutura específica dos oligossacarídeos. Além disso, a N-glicosilação de anticorpos é rotineiramente caracteri- zada na fabricação de biofarmacêuticos. Em particular, o perfil de gli- cano de um anticorpo monoclional às vezes é definido como um atributo de qualidade crítico, uma vez que pode ser uma medida de eficácia, imunogenicidade e condições de fabricação. Portanto, é importante que as abordagens para análise de glicano exibam alta sensibilidade para facilitar a caracterização detalhada. Na fabricação de anticorpos mono- clonais terapêuticos, a N-glicosilação específica de sítio e a avaliação da ocupação do sítio de N-glicano são importantes. Assim, existe uma necessidade de métodos de alta eficiência / alta resolução para separar glicopeptídeos obtidos a partir de anticorpos monoclonais. A invenção divulgada atende a essa necessidade.
[0071] É divulgado aqui um novo método para análise e quantifica- ção de glicopeptídeos em que uma extração de fase sólida (SPE) é aco- plada a uma coluna de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HI- LIC) para separar peptídeos trípticos glicosilados e não glicosilados. Em várias modalidades, essas técnicas de separação são acopladas à de- tecção ultravioleta (UV) e detecção de espectrometria de massa (MS) online para elucidar as estruturas de glicano. Em alguns métodos, a ca- racterização de glicano depende da liberação de glicanos de cadeias de peptídeos e, em seguida, analisá-los separadamente dos peptídeos (ver, por exemplo, Figuras 1-3). Como os glicanos não são adequados para detecção de UV, os glicanos liberados são frequentemente marca- dos com uma etiqueta de fluoróforo, por exemplo, antranilamida, ácido antranílico ou 2-aminopiridina, para detecção de fluorescência ou uma molécula, por exemplo, procainamida, com basicidade significativa de modo a permitir a detecção de MS. No entanto, esta abordagem para análise de glicano fornece apenas uma avaliação global da glicosilação. Em particular, as informações específicas de sítio sobre glicanos são perdidas devido a esse fluxo de trabalho depender de um procedimento de liberação. Em contraste, no método divulgado, os glicopeptídeos iso- lados são separados com base nas diferenças na estrutura da glico- forma dentro da mesma separação cromatográfica. Além disso, a sepa- ração de glicopeptídeos com diferentes isômeros de glicano, que foi al- cançada usando a coluna HILIC, não foi observada usando métodos RP-LC padrão (ver, por exemplo, Figuras 1-3). Ao otimizar as condições de preparação da amostra para HILIC, incluindo diluição, secagem a vácuo e / ou extração em fase sólida (SPE), foi desenvolvido um fluxo de trabalho que permite a análise de glicopeptídeos de diferentes tipos de preparações de amostra de mapeamento de peptídeo (ver, por exemplo, Figura 22 ) Conforme divulgado neste documento, os invento- res demonstraram que o método e o fluxo de trabalho são adequados para a identificação e quantificação dos níveis relativos de glicoformas individuais em um anticorpo no nível do peptídeo usando detecção de UV acoplada com detecção de MS online (ver, por exemplo, Figuras 4 e 22).
[0072] Os métodos aqui divulgados incluem purificação e / ou sepa- ração e / ou análise de glicopeptídeos, por exemplo, glicopeptídeos ob- tidos de um anticorpo monoclonal, como um anticorpo que foi digerido com uma ou mais proteases. Os métodos divulgados fornecem resulta- dos melhorados de separação e análise e a capacidade de estudar gli-
canos enquanto eles ainda estão covalentemente ligados a seus frag- mentos de anticorpo. Esta análise de nível de peptídeo de glicoformas também fornece o benefício na caracterização biofarmacêutica em que uma única amostra pode ser utilizada para mapeamento de peptídeo de fase reversa, por exemplo, digestão de tripsina e mapeamento de glico- peptídeo baseado em HILIC. Além disso, a preservação da ligação entre O glicano e o peptídeo / proteína facilita a detecção de UV e MS com base no componente proteico do glicopeptídeo, por exemplo, remo- vendo a necessidade de rotular glicanos livres.
[0073] Em certas modalidades, os métodos incluem o contato de uma amostra que inclui glicopeptídeos com um substrato de enriqueci- mento hidrofílico sob condições que permitem e / ou fazem com que os glicopeptídeos se liguem ao substrato de enriquecimento hidrofílico. Uma vez que a amostra é carregada no substrato de enriquecimento hidrofílico, uma série de soluções de lavagem e eluição personalizadas podem ser passadas sobre o substrato de enriquecimento hidrofílico para separar contaminantes de glicopeptídeos e, em seguida, coletar os glicopeptídeos para análise posterior. Em algumas modalidades, o substrato de enriquecimento hidrofílico é lavado para remover contami- nantes não glicopeptídicos da amostra. Assim, em um grau significativo, os glicopeptídeos são enriquecidos no substrato de enriquecimento hi- drofílico, como na superfície cromatográfica do substrato de enriqueci- mento hidrofílico. Em certas modalidades, um substrato de enriqueci- mento hidrofílico compreende um material absorvente de aminopropil à base de sílica. Em certas modalidades, o substrato de enriquecimento hidrofílico é configurado para extração em fase sólida (SPE).
[0074] Dispositivos projetados para SPE normalmente incluem um sorvente cromatográfico (por exemplo, um substrato de enriquecimento hidrofílico, como um sorvente de aminopropil à base de sílica) que per- mite ao usuário reter preferencialmente componentes alvo, neste caso,
glicopeptídeos. Os dispositivos SPE incluem tipicamente um reservató- rio de retenção de amostra, um meio para conter o sorvente e um con- duto de fluido ou bico para direcionar os fluidos que saem do dispositivo para recipientes de coleta adequados. O dispositivo SPE pode estar em um formato de poço único, que é conveniente e econômico para prepa- rar um pequeno número de amostras, ou um formato de múltiplos poços, que é bem adequado para preparar um grande número de amostras em paralelo. Os formatos de múltiplos poços são comumente usados com sistemas de distribuição de fluido robótico. Os formatos típicos de múl- tiplos poços incluem formatos de placa padrão de 48, 96 e 384 poços. Os fluidos são normalmente forçados através do dispositivo SPE para os recipientes de coleta, seja puxando um vácuo através do dispositivo com um coletor de vácuo especialmente projetado ou usando a força centrífuga ou gravitacional. A força centrífuga é gerada colocando o dis- positivo SPE, junto com uma bandeja de coleta adequada, em uma cen- trífuga projetada especificamente para a finalidade pretendida. É vanta- joso para um dispositivo SPE ter uma alta capacidade para reter com- postos alvo de uma ampla faixa de polaridades cromatográficas, ser ca- paz de manter a retenção do composto alvo conforme os contaminantes da amostra são lavados para o lixo e, então, fornecer a capacidade de eluir os compostos alvo em um volume de eluição tão pequeno quanto possível, maximizando assim o grau de concentração de composto alvo obtido durante SPE.
[0075] Uma variedade de dispositivos de extração de fase sólida pode ser usada de acordo com os métodos divulgados. Em uma moda- lidade, o dispositivo SPE é selecionado do grupo que consiste em pla- cas de microeluição, colunas cromatográficas, placas de camada fina, dispositivos de limpeza de amostra, cartuchos de injeção, placas de mi- crotitulação e dispositivos preparatórios cromatográficos.
[0076] Os materiais adsorventes de aminopropil à base de sílica,
incluindo materiais SPE, são conhecidos na técnica e podem ser obtidos comercialmente, por exemplo, da Waters Corporation, tal como na forma de uma placa GlycoWorks HILIC SPE (ver, por exemplo, Patentes U.S. 6.723.236, 7.052.611 e 7.192.525). Em algumas modalidades, o substrato de enriquecimento hidrofílico é preparado para a adição da amostra por lavagem, por exemplo, uma etapa de pré-lavagem. Em al- gumas modalidades, o substrato de enriquecimento hidrofílico é lavado antes do contato com a amostra de glicopeptídeo. Em algumas modali- dades, o substrato de enriquecimento hidrofílico é lavado com água (H2O) e / ou uma solução de ACN (por exemplo, ACN em água), como uma solução de cerca de 60% a cerca de 95% de ACN em volume, por exemplo, cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de solução de ACN por volume, com o restante de água.
[0077] Em várias modalidades, o substrato de enriquecimento hi- drofílico é colocado em contato com uma amostra contendo glicopeptí- deo para enriquecimento. No que diz respeito à solução de amostra, ela incluirá os glicopeptídeos dissolvidos em um solvente no qual os glico- peptídeos são solúveis e no qual os glicopeptídeos se ligarão ao subs- trato de enriquecimento hidrofílico. De preferência, a ligação é forte, re- sultando na ligação de uma porção substancial dos glicopeptídeos. Em alguns casos, substancialmente todos os glicopeptídeos serão ligados. Em várias modalidades, o solvente é uma solução aquosa, tipicamente contendo um tampão, sal e / ou tensoativos para solubilizar e estabilizar os glicopeptídeos. Em algumas modalidades, a amostra de glicopeptí- deo é uma solução de cerca de 60% ACN a 90% ACN e 10% a cerca de 40% de água com cerca de 0,1% a cerca de 0,5% de TFA em volume, tal como cerca de 80:20 ACN:Água (v / v) com 0,2% de TFA. Um pH baixo pode ser usado para manter a solubilidade do peptídeo em sol- vente altamente orgânico, por exemplo uma solução com um pH abaixo de cerca de 6,5, tal como abaixo de cerca de 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0,
3,5 ou 3,0.
[0078] O substrato de enriquecimento hidrofílico é então lavado para remover contaminantes, como peptídeos não glicosilados que não se ligam significativamente ao substrato de enriquecimento hidrofílico. Esses contaminantes podem ser descartados. Em algumas modalida- des, o substrato de enriquecimento hidrofílico é lavado com uma solu- ção de ácido e acetonitrila (ACN) em água (H2O), como ácido fórmico e / ou ácido trifluoroacético (TFA) e acetonitrila (ACN) em solução de água (H2O). Em certas modalidades, o ácido fórmico e a solução de ACN em água incluem cerca de 0,5% a cerca de 5% de ácido fórmico em volume e cerca de 85% a cerca de 95% de ACN em volume com o restante de água, por exemplo cerca de 0,5%, 1,0%, 1,5%, 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5% ou 5,0% de ácido fórmico em volume e cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de ACN em volume. Em certas modalidades, o TFA e O ACN em solução de água inclui cerca de 0,5% a cerca de 5% de TFA em volume e cerca de 85% a cerca de 95% de ACN em volume com o restante de água, por exemplo cerca de 0,5%, 1,0%, 1,5% 2,0%, 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5% ou 5,0% de TFA em volume e cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de ACN em volume. Em um determinado exemplo, a solução de lavagem é uma solução de 1% de ácido fórmico, 9% de H2O, e 90% de ACN por volume. Em um certo exemplo, a solução de lavagem é uma solução de 1% de TFA, 9% de H2O, 90% de ACN por volume.
[0079] Uma vez que os contaminantes foram removidos, o substrato de enriquecimento hidrofílico é colocado em contato com uma solução de eluição para eluir os glicopeptídeos do substrato de enriquecimento hidrofílico. O sorvente de aminopropil baseado em sílica possui uma su- perfície fracamente básica e potencial para troca aniônica. No entanto, a recuperação relativa e total de glicopeptídeos de um sorvente de ami- nopropil à base de sílica pode ser particularmente sensível às condições de eluição. A recuperação tendenciosa, ou especiação, pode ser pro- blemática para um procedimento de preparação de amostra. Além de não fornecer uma representação precisa das espécies presentes na amostra, pode ser indicativo de um método que não é robusto e que os perfis de abundância relativa obtidos podem não ser determinados de forma reprodutível, particularmente no que diz respeito às espécies mais pobremente recuperadas. Por exemplo, para a recuperação de glicanos derivatizados, em oposição aos glicopeptídeos que são o assunto desta divulgação, é recomendado que o acetato de amônio em ACN seja usado como a solução de eluição. No entanto, no caso dos glicopeptí- deos, o acetato de amônio no ACN não dá um bom resultado. Assim, em certas modalidades, os glicopeptídeos são eluídos do sorbente de aminopropil à base de sílica com um formiato de amônio e ACN em so- lução de água. Em algumas modalidades, o formiato de amônio e ACN em solução de água incluem cerca de 100-400 mM formiato de amônio e cerca de 2,5 a cerca de 10% ACN, tal como cerca de 100 mM formiato de amônio, cerca de 150 mM formiato de amônio, cerca de 200 mM formiato de amônio, cerca de 250 mM formiato de amônio, cerca de 300 mM formiato de amônio, cerca de 350 mM formiato de amônio ou cerca de 400 mM formiato de amônio e cerca de 2,5%, 3,0%, 3,5%, 4,0%, 4,5%, 5,0%, 5,5%, 6,0% 6,5%, 7,0%, 7,5%, 8,0%, 8,5%, 9,0%, 9,5% ou 10,0%, ACN. Em um exemplo específico, o formiato de amônio e ACN em solução aquosa inclui cerca de 200 mM de formiato de amônio e cerca de 5% de ACN.
[0080] Uma vez que os glicopeptídeos são eluídos do substrato de enriquecimento hidrofílico, a amostra de glicopeptídeo enriquecido re- sultante pode ser submetida à separação e análise adicionais, por exemplo cromatografia e / ou análise de espectrometria de massa. Em modalidades, a amostra de glicopeptídeo enriquecida é aplicada a uma coluna de separação e subsequentemente eluída da coluna de separa- ção, por exemplo, usando um gradiente de fase móvel para resolver as espécies individuais de glicopeptídeos.
[0081] Em algumas modalidades, gradientes de solvente, eluições de etapas e / ou eluição multidimensional são realizadas para eluir e / ou separar os glicopeptídeos da coluna de separação. O uso de gradi- entes é bem conhecido na técnica da cromatografia. O princípio básico envolve a adsorção de um analito à coluna de separação e a eluição com um gradiente de solvente de dessorção. O gradiente se refere à mudança de pelo menos uma característica do solvente, por exemplo, mudança no pH, resistência iônica, polaridade ou a concentração de algum agente que influencia a resistência da interação de ligação.
[0082] Os gradientes usados podem ser graduais ou adicionados em etapas. Em uma modalidade, são empregados dois ou mais bolus de solvente de dessorção variando em uma ou mais dimensões. Por exemplo, os dois ou mais bolus podem variar em pH, resistência iônica, hidrofobicidade ou semelhantes. Uma solução de lavagem, se usada, pode ser selecionada de modo a remover contaminantes não desejados com perda ou dano mínimo aos glicopeptídeos ligados. As propriedades da solução de lavagem podem ser intermediárias entre as da amostra e as soluções de dessorção. Os solventes, por exemplo em um gradiente de eluição, são escolhidos para serem compatíveis com os glicopeptí- deos e o método de detecção final. Geralmente, os solventes usados são solventes convencionais conhecidos. Em várias modalidades, os solventes a partir dos quais um solvente adequado pode ser selecio- nado incluem hidróxido de amônio, trietilamina, fosfato de diamônio, clo- reto de metileno, acetonitrila (com ou sem pequenas quantidades de modificadores básicos ou acídicos), metanol (contendo maior quanti- dade de modificador, por exemplo, ácido acético ou trietilamina, ou mis- turas de água com metanol ou acetonitrila), acetato de etil, clorofórmio,
hexano, isopropanol, acetona, tampão alcalino, tampão de alta resistên- cia iônica, tampão acídico, ácidos fortes, bases fortes, misturas orgâni- cas com ácidos / bases, metanol acídico ou básico, tetra-hidrofurano e água.
[0083] A cromatografia líquida, incluindo HPLC, pode ser usada para analisar estruturas, como glicopeptídeos. Várias formas de croma- tografia líquida podem ser usadas para estudar essas estruturas, inclu- indo cromatografia de troca aniônica, HPLC de fase reversa, cromato- grafia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca aniônica de alto desempenho e cromatografia de fase normal (NP), incluindo NP-HPLC (ver, por exemplo, Alpert et al., J. Chromatogr. A 676:191-202 (1994)). A cromatografia de interação hidrofílica (HILIC) é uma variante do NP- HPLC que pode ser realizada com fases móveis parcialmente aquosas, permitindo a separação de fase normal de peptídeos, carboidratos, áci- dos nucleicos e muitas proteínas. A ordem de eluição para HILIC é do menos polar para o mais polar, o oposto daquele em HPLC de fase re- versa. HPLC pode ser realizada, por exemplo, em um sistema de HPLC da Waters (por exemplo, sistema de HPLC Waters 2695 Alliance), Agi- lent, Perkin Elmer, Gilson, etc.
[0084] NP-HPLC, de preferência HILIC, é uma forma particular- mente útil de HPLC que pode ser usada nos métodos aqui descritos. NP-HPLC separa analitos com base nas interações polares entre os analitos e a fase estacionária (por exemplo, substrato). O analito polar associa-se e é retido pela fase estacionária polar. As resistências de adsorção aumentam com o aumento da polaridade do analito, e a inte- ração entre o analito polar e a fase estacionária polar (em relação à fase móvel) aumenta o tempo de eluição. O uso de solventes mais polares na fase móvel diminuirá o tempo de retenção dos analitos, enquanto os solventes mais hidrofóbicos tendem a aumentar os tempos de retenção.
[0085] Vários tipos de substratos podem ser usados com NP-HPLC,
por exemplo, para cromatografia em coluna, incluindo substratos de sí- lica, amino, amida, celulose, ciclodextrina e poliestireno. Exemplos de substratos úteis, por exemplo, que podem ser usados em cromatografia em coluna, incluem: polissulfoetil aspartamida (por exemplo, de PolyLC), um substrato de sulfobetaína, por exemplo, ZIC&-HILIC (por exemplo, de SeQuant), POROSQO HS (por exemplo, de Applied Biosys- tems), POROSO S (por exemplo, da Applied Biosystems), Poli-hidroetil aspartamida (por exemplo, da PolyLC), Zorbax 300 SCX (por exemplo, da Agilent), PolyWGLYCOPLEXO (por exemplo, da PolyLC), Amida-80 (por exemplo, da Tosohaas), TSK GELO Amide-80 (por exemplo, de Tosohaas), Poli-hidroxietil A (por exemplo, de PolyLC), Glyco-Sep-N (por exemplo, de Oxford GlycoSciences) e Atlantis HILIC (por exemplo, de Waters). As colunas que podem ser usadas nos métodos divulgados incluem colunas que utilizam um ou mais dos seguintes grupos funcio- nais: grupos carbamoil, grupos sulfopropil, grupos sulfoetil (por exem- plo, poli (2-sulfoetil aspartamida)), grupos hidroxietil (por exemplo, poli (2-hidroxietil aspartamida)) e grupos de ácido sulfônico aromático.
[0086] A fase móvel usada pode incluir tampões com e sem agentes de emparelhamento de íons, por exemplo, acetonitrila e água. Os agen- tes de emparelhamento iônico incluem formato, acetato, TFA e sais. Os gradientes dos tampões podem ser usados, por exemplo, se dois tam- pões são usados, a concentração ou porcentagem do primeiro tampão pode diminuir enquanto a concentração ou porcentagem do segundo tampão aumenta ao longo da execução da cromatografia. Por exemplo, a porcentagem do primeiro tampão pode diminuir de cerca de 100%, cerca de 99%, cerca de 95%, cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 45% ou cerca de 40% a cerca de 0%, cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de
25%, cerca de 30%, cerca de 35% , ou cerca de 40% ao longo da exe- cução da cromatografia. Como outro exemplo, a porcentagem do se- gundo tampão pode aumentar de cerca de 0%, cerca de 1%, cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de 35% ou cerca de 40% a cerca de 100%, cerca de 99%, cerca de 95%, cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 50%, cerca de 45 %, ou cerca de 40% ao longo da mesma execução. Opcio- nalmente, a concentração ou porcentagem do primeiro e do segundo tampão pode retornar aos seus valores iniciais no final da execução da cromatografia. Como exemplo, a porcentagem do primeiro tampão pode mudar em cinco etapas de 85% a 63% a 59% a 10% a 85%; enquanto a porcentagem do segundo tampão nas mesmas etapas muda de 15% para 37% para 41% para 90% para 15%. As porcentagens podem mu- dar gradualmente como um gradiente linear ou de forma não linear (por exemplo, passo a passo). Por exemplo, o gradiente pode ser multifásico, por exemplo, bifásico, trifásico, etc. Em modalidades preferidas, os mé- todos aqui descritos usam um gradiente de tampão de acetonitrila de- crescente que corresponde ao aumento da polaridade da fase móvel sem o uso de agentes de emparelhamento de íons.
[0087] A temperatura da coluna pode ser mantida a uma tempera- tura constante ao longo de toda a execução da cromatografia, por exem- plo, usando um aquecedor de coluna comercial. Em algumas modalida- des, a coluna é mantida a uma temperatura entre cerca de 18ºC a cerca de 70ºC, por exemplo, cerca de 30ºC a cerca de 60ºC, cerca de 40ºC a cerca de 50ºC, por exemplo, a cerca de 20ºC, cerca de 25ºC, cerca de 30ºC, cerca de 35ºC, cerca de 40ºC, cerca de 45ºC, cerca de 50ºC, cerca de 55ºC, cerca de 60ºC, cerca de 65ºC ou cerca de 70ºC. Uma temperatura preferida é cerca de 45ºC.
[0088] A taxa de fluxo da fase móvel pode estar entre cerca de 0 a cerca de 100 ml / min. Para fins analíticos, as taxas de fluxo variam normalmente de O a 10 ml / min, para HPLC preparativa, taxas de fluxo superiores a 100 ml / min podem ser usadas. Por exemplo, a taxa de fluxo pode ser cerca de 0,5, cerca de 1, cerca de 1,5, cerca de 2, cerca de 2,5, cerca de 3, cerca de 3,5, cerca de 4, cerca de 4,5 ou cerca de 5 ml / min. Substituir uma coluna com o mesmo empacotamento, o mesmo comprimento, mas um diâmetro menor requer uma redução na taxa de fluxo a fim de reter o mesmo tempo de retenção e resolução para picos vistos com uma coluna de diâmetro maior. De preferência, uma taxa de fluxo equivalente a cerca de 1 ml / min em uma coluna de 4,6 x 100 mm, um é usada.
[0089] O tempo de execução pode ser entre cerca de 15 a cerca de 240 minutos, por exemplo, cerca de 20 a cerca de 70 min, cerca de 30 a cerca de 60 min, cerca de 40 a cerca de 90 min, cerca de 50 min a cerca de 100 min, cerca de 60 a cerca de 120 min, cerca de 50 a cerca de 80 min.
[0090] O NP-HPLC pode ser ajustado para ser realizado em uma nanoescala, por exemplo, usando colunas com um diâmetro interno de cerca de 75 um (ver, por exemplo, Wuhrer et al., Anal. Chem. 76:833- 838 (2004); Wuhrer et al., Internat. J. Mass. Spec. 232:51-57 (2004)).
[0091] Em certas modalidades, a coluna de separação é uma co- luna de separação de interação hidrofílica (HILIC) e os glicopeptídeos são subsequentemente eluídos da coluna de separação de HILIC, por exemplo, usando um gradiente de fase móvel para resolver as espécies individuais de glicopeptídeos, purificando e ou separando glicopeptí- deos na amostra. Em certos exemplos, os glicopeptídeos eluídos do HlI- LIC são separados em uma ou mais frações. Essas frações podem ser usadas para análises subsequentes, como a análise de MS. Em certas modalidades, os métodos incluem identificar glicopeptídeos e / ou gli- cano presentes em uma ou mais das frações. Em certas modalidades,
o glicano é um N-glicano. Em certas modalidades, o gradiente de fase móvel é formiato de amônio 10 mM, pH 4,5 a 90% ACN com formiato de amônio 10 mM, pH 4,5. Em certas modalidades, o gradiente de fase móvel é 0,1% de TFA em H2O para ser 0,1% de TFA em ACN.
[0092] O glicopeptídeo é obtido a partir de proteína glicosilada, como um anticorpo monoclonal. O anticorpo monocional glicosilado pode ser preparado por redução, digestão enzimática, desnaturação, fragmentação, clivagem química e uma combinação dos mesmos. Os métodos aqui divulgados são aplicáveis a qualquer isótipo de anticorpo, como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou de isótipo misto.
[0093] A redução é para reduzir as ligações dissulfeto em dois tióis em uma proteína tridimensional, como o anticorpo monoclional. A redu- ção pode ser realizada por desnaturação por calor, adição de um tenso- ativo ou adição de um agente desnaturante, por exemplo, guanidina HCI (6M), na presença de um agente redutor, por exemplo, TCEP-HCI. À degradação enzimática é a digestão da proteína com uma protease, por exemplo, tripsina ou Achromobacter protease | (Lys-C). Além disso, a glicoproteína pode ser desnaturada por calor ou produtos químicos, ou uma combinação dos mesmos. A fragmentação envolve a clivagem de porções de proteína de uma proteína de subunidade única ou múltipla, como um anticorpo monoclonal, com métodos físicos, biológicos ou quíi- micos. Por exemplo, uma enzima degradante de imunoglobulina de S. pyogenes (IdeS) é comumente usada para fragmentação de subuni- dade de anticorpo.
[0094] Em várias modalidades, um anticorpo em uma amostra pode ser tratado e preparado por redução, degradação enzimática, desnatu- ração ou fragmentação antes do contato com o substrato de enriqueci- mento hidrofílico. Os métodos fornecem um novo método cromatográ- fico para caracterizar a glicosilação de proteínas, por exemplo, terapêu-
tica de anticorpos monoclonais (mAb), por meio de fragmentos e análi- ses de HILIC-UV-MS em nível de peptídeo.Em certas modalidades, as amostras em qualquer etapa intermediária podem ser concentradas, dessalinizadas ou semelhantes.
[0095] Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda detectar glicopeptídeo, por exemplo, usando o sinal de UV da porção de peptídeo do glicopeptídeo. Isso pode ser feito para frações de uma amostra e permite a seleção de frações específicas para análise poste- rior, por exemplo, análise de espectrometria de massa (MS). Assim, em outras modalidades, a etapa de detecção compreende espectroscopia de massa ou cromatografia líquida-espectroscopia de massa (LC-MS). Na aplicação da espectrometria de massa para a análise de biomolécu- las, as moléculas são transferidas da fase líquida ou sólida para a fase gasosa e para a fase de vácuo. Uma vez que muitas biomoléculas são grandes e frágeis (as proteínas são um excelente exemplo), dois dos métodos mais eficazes para sua transferência para a fase de vácuo são a ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI) ou ioni- zação por eletropulverização (ESI). Aspectos do uso desses métodos e requisitos de preparação de amostra são conhecidos por aqueles ver- sados na técnica. Em geral, ESI| é mais sensível, enquanto MALDI é mais rápido. Significativamente, alguns peptídeos ionizam melhor no modo MALDI do que ESI e vice-versa (Genome Technology, junho de 220, pág. 52). Os métodos e dispositivos do canal de extração da pre- sente invenção são particularmente adequados para preparar amostras para análise de MS, especialmente amostras de biomoléculas, tais como glicopeptídeos. Uma vantagem importante da invenção é que ela permite a preparação de uma amostra enriquecida que pode ser anali- sada diretamente, sem a necessidade de etapas de processo interme- diárias, por exemplo, concentração ou dessalinização.
[0096] O ESI é realizado misturando a amostra com ácido volátil e solvente orgânico e infundindo-a por meio de uma agulha condutora car- regada com alta voltagem. As gotículas carregadas que são pulveriza- das (ou ejetadas) da ponta da agulha são direcionadas para o espectrô- metro de massa e secam pelo calor e vácuo à medida que voam. Depois que as gotas secam, as moléculas carregadas restantes são direciona- das por lentes eletromagnéticas para o detector de massa e a massa analisada. Em uma modalidade, a amostra eluída é depositada direta- mente do capilar em um bocal de eletropulverização, por exemplo, o capilar funciona como o carregador de amostra. Em outra modalidade, o próprio capilar funciona como dispositivo de extração e bico de eletro- pulverização.
[0097] Para MALDI, as moléculas de analito (por exemplo, proteí- nas) são depositadas em alvos de metal e cocristalizadas com uma ma- triz orgânica. As amostras são secas e inseridas no espectrômetro de massa e, normalmente, analisadas por meio da detecção de tempo de voo (TOF). Em uma modalidade, a amostra eluída é depositada direta- mente do capilar no alvo de metal, por exemplo, o próprio capilar funci- ona como o carregador de amostra. Em uma modalidade, o analito ex- traído é depositado em um alvo MALDI, uma matriz de ionização MALDI é adicionada e a amostra é ionizada e analisada, por exemplo, por de- tecção de TOF.
[0098] Em algumas modalidades, outros modos de ionização são usados, por exemplo, ESI-MS, espectrometria de massa de ionização de turbopulverização, espectrometria de massa de ionização de nano- pulverização, espectrometria de massa de ionização de termopulveriza- ção, espectrometria de massa de ionização de spray sônico, SELDI-MS e MALDI-MS. Em geral, uma vantagem desses métodos é que eles per- mitem a purificação “just-in-time” da amostra e a introdução direta no ambiente ionizante. É importante notar que os vários modos de ioniza- ção e detecção apresentam suas próprias restrições sobre a natureza da solução de dessorção usada, e é importante que a solução de des- sorção seja compatível com ambos. Por exemplo, a matriz de amostra em muitas aplicações deve ter baixa resistência iônica ou residir em uma faixa de pH particular, etc. No ESI, o sal na amostra pode impedir a detecção, diminuindo a ionização ou entupindo o bico. Este problema é resolvido apresentando o analito em baixo teor de sal e / ou pelo uso de um sal volátil. No caso de MALD, o analito deve estar em um sol- vente compatível com a mancha no alvo e com a matriz de ionização empregada.
[0099] Os seguintes exemplos são apresentados de modo a prover aos versados na técnica uma divulgação e descrição completas de como preparar e utilizar os métodos da invenção e não se destinam a limitar o âmbito do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços têm sido feitos para garantir a precisão com respeito a núme- ros usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros e desvios experimentais devem ser considerados. A menos que indicado de outra forma, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é em graus centígrados, a temperatura ambiente é de cerca de 25ºC, e a pressão é atmosférica ou próxima. Exemplo 1: Comparação de métodos anteriores com base em RPLC-UV-MS de glicopeptídeos e glicano liberado.
[00100] A Figura 1 é um diagrama de fluxo de trabalho esquemático que ilustra os métodos atuais de quantificação de glicopeptídeos. O an- ticorpo terapêutico foi digerido com tripsina após ser desnaturado, redu- zido e alquilado. A quantificação relativa foi feita pela intensidade do pico (altura) dos picos de massa do glicopeptídeo. O método do glicano liberado quantifica as glicoformas por fluorescência do marcador ligado ao glicano liberado, não pelo sinal de MS. A Figura 2 é uma tabela que mostra uma comparação da quantificação relativa de cada glicoforma quantificada por glicanos liberados (marcados com um reagente fluores- cente, RapiFluor-MS da Waters) e glicopeptídeos. As principais diferen- ças nas quantificações entre os métodos são mostradas nas linhas 3, 5, 7e8.A Figura 3 é um espectro de massa que demonstra que as dis- crepâncias entre as quantificações de glicoforma por glicopeptídeo e métodos de glicano liberado são provavelmente devido à fragmentação na fonte da espinha dorsal do açúcar por MS na análise de glicopeptí- deo, causando um aumento de artefatos de glicano truncados (ou seja, GOF-GICNAc e G1F-GICcNAc) e uma diminuição do glicano principal (ou seja, GOF e G1F). Este resultado demonstra que métodos novos e apri- morados são necessários para a análise de glicano no nível de peptí- deo. Exemplo 2: Novos métodos de análise de glicopeptídeo usando HI- LIC-UV-MS.
[00101] Os peptídeos de anticorpos terapêuticos foram preparados por métodos de mapeamento de peptídeos reduzidos ou não reduzidos realizados de rotina. As digestões foram então diluídas para 80% ACN final (v / v) antes da análise HILIC-UV-MS.
[00102] LC System: Waters ACQUITY |-Class UPLCº System com Detector PDA (UV)
[00103] MS System: Waters XEVO G2-S QTof ou Thermo Scientific Q Exactive Plus
[00104] “Column: Coluna Glycan BEH Amida HILIC. Waters AC- QUITY UPLCº
[00105] A Figura 5 é um conjunto de cromatogramas HILIC-UV de peptídeos mAb1 mostrando os resultados de uma separação de peptí- deos mAb1 obtidos por digestão tríptica por dois métodos diferentes. O método *1 usa formiato de amônio, enquanto o método *%2 usa TFA. Os níveis relativos de diferentes glicoformas foram quantificados por UV usando detector PDA com detecção online de MS. A Figura 6 é uma vista aproximada da porção de glicopeptídeo do traço mostrado na Fi- gura 5 demonstrando que o método *%2 teve melhor separação, picos mais nítidos e maior razão S/N. A Figura 7 é um conjunto de cromato- gramas HILIC-TIC de glicopeptídeos mAb1 ampliando a porção glico- peptídica. Como mostrado, o Método tf2 teve maior razão S/N de sinal MS. As Figuras 8A e 8B são espectros de MS1 de glicopeptídeos mAb1 (íons M?* ). A fragmentação de glicanos na fonte de MS não foi um fator na quantificação de glicoforma por UV. A Figura 9 é um conjunto de traços e uma tabela que mostra uma comparação da separação de gli- copeptídeos em uma coluna HILIC com a análise de glicano liberado. Quantificações de glicoforma semelhantes por glicopeptídeo e análises de glicano liberado foram observadas para mAb1. É importante notar que não foram observadas diferenças importantes nas quantificações de glicoforma entre os dois métodos, demonstrando que a separação em coluna HILIC era viável para a análise de glicopeptídeos. Além disso, os níveis de fucosilação total e galactosilação foram consistentes entre as duas análises. Artefatos de glicano truncados não afetam a quantificação de glicopeptídeo por HILIC-UV. Isso sugere que os arte- fatos observados pela análise RPLC anterior foram devidos à fragmen- tação na fonte de glicanos induzida por MS.
[00106] A digestão diluída pode ser concentrada com secagem: Se uma digestão tiver uma concentração de <0,5 mg/mL, a amostra pode ser concentrada por secagem a vácuo e ressuspensão dos peptí- deos secos em 80:20 ACN: Água (v/v) com 0,2% de TFA a 0,5 mg / mL ou acima. O pH baixo é necessário para manter a solubilidade do pep- tídeo em solvente altamente orgânico. A Figura 10 é um conjunto de traços e uma tabela que demonstra que os peptídeos de secagem aju- daram a concentrar os peptídeos e é consistente usando diferentes quantidades de amostra (por exemplo, 5-20 ug, parte superior es- querda), mas não afetou o sinal UV (parte inferior esquerda) e a % rela- tiva PA (tabela da direita) de glicanos. A Figura 11 é um conjunto de traços que mostra as alterações feitas para simplificar os preparativos da fase móvel e melhorar a integração de pico. A fase móvel mudou de 0,1% de TFA em água / ACN para os mesmos tampões de fase móvel usados para mapeamento de peptídeos (0,05% e 0,045% de TFA em água e ACN, respectivamente). As Figuras 12A, 12B, 12C e 12D são um conjunto de resultados de espectros de massa mostrando que a mu- dança de fase móvel não teve impacto no sinal de MS de glicopeptídeos (íons M?* ). A Figura 13 é um conjunto de traços que demonstram a estabilidade da solução de glicopeptídeos mAb1 diluídos em 80% ACN.
[00107] Identificação de glicopeptídeos de corte incorreto: A Fi- gura 14 é um conjunto de vestígios que mostra que as digestões com glicopeptídeos de corte incorreto complicam a quantificação de glico- peptídeos por UV. A Figura 15 é um conjunto de traços e uma tabela que demonstra que, com dados de MS online, a cromatografia de íons de extração (EIC) pode ser usada para encontrar a porcentagem de gli- copeptídeos de corte incorreto em cada pico. EIC da detecção de MS online foi usado para calcular a razão de peptídeo(s) de corte incorreto para glicopeptídeo(s) tríptico(s) regular em cada pico de coeluição e para filtrar o sinal de UV devido a cortes incorretos para quantificação de glicoforma. Alternativamente, a digestão pode ser redigerida com tripsina para converter cortes incorretos em glicopeptídeos trípticos re- gulares.
[00108] Para a redigestão, o seguinte protocolo foi usado: aumentar o pH da digestão para — 8,0 com base Tris 3 M; adicionar razão E:S 1:5 (p/p) de tripsina, incubar a 50ºC por 1 hora; e adicionar 0,2% de TFA (final) e diluir para 80% ACN (final) para análise de HILIC. A Figura 16 é um conjunto de traços e uma tabela que demonstra que a redigestão de mAb2 com tripsina removeu glicopeptídeos de corte incorreto para interferir na quantificação de glicoforma.
[00109] Digestões contaminadas com reagentes podem ser lim- pas com extração de fase sólida e concentradas com secagem: Se uma digestão tiver uma concentração de <0,5 mg/mL, pode ser concen- trada por secagem a vácuo e ressuspensão dos peptídeos secos em 80:20 ACN: Água (v/v) com 0,2% de TFA a 0,5 mg / mL ou acima. O pH baixo é necessário para manter a solubilidade do peptídeo em solvente altamente orgânico.
[00110] A digestão pode ser limpa de sais, reagentes ou detergentes por extração em fase sólida (SPE) e depois seca a vácuo.
[00111] Waters GlycoWorks HILIC yuElution Plate (Parte No. 186002780): lavar com água, depois 80:15 ACN:água (v/v); adicionar o peptídeo digerido (diluído para 80% ACN, v/v); lavar duas vezes com 1:9:90 ácido fórmico água:ACN (v/v); eluir com formiato de amônio 200 MM, 5% ACN; glicopeptídeos eluídos a seco a vácuo; e ressuspender em 80:20 ACN:água (v/v) com 0,2% de TFA a 0,5 mg/mL.
[00112] A Figura 17 é um conjunto de traços demonstrando que o formiato de amônio melhora significativamente a eluição de glicopeptí- deos de HILIC SPE.
[00113] A Figura 18 é um conjunto de traços e uma tabela que de- monstra que a secagem ou limpeza / secagem SPE não tem efeito na quantificação do glicopeptídeo mAb1.
[00114] A Figura 19 é um conjunto de traços e uma tabela que de- monstra quantificações de glicoforma de mAb3 semelhantes por glico- peptídeo e análises de glicano liberado.
[00115] As Figuras 20A e 20B são um conjunto de traços e uma ta- bela que demonstra quantificações de glicoforma semelhantes usando digestão tríptica de mAb3 reduzida e não reduzida por glicopeptídeo e análises de glicano liberado.
[00116] A Figura 21 é um conjunto de traços que mostra uma com- paração da separação de glicopeptídeos IgG1 e IgG4, com e sem fuco- silação.
[00117] Apresente invenção não deve ser limitada no seu âmbito pe- las modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção, além das descritas aqui, ficarão evidentes para os versa- dos na técnica a partir da descrição anterior e das figuras anexas. Tais modificações pretendem ser abrangidas pelo escopo das reivindicações anexas.
Claims (23)
1. Método de separação de glicopeptídeos, caracterizado pelo fato de que compreende: contato de uma amostra compreendendo glicopeptídeos a um substrato de enriquecimento hidrófilo sob condições que permitem que os glicopeptídeos se liguem ao substrato de enriquecimento hidró- filo; lavagem do substrato de enriquecimento hidrófilo para remo- ver contaminantes não glicopeptídeos do substrato de enriquecimento hidrófilo; eluição dos glicopeptídeos do substrato de enriquecimento hidrófilo com formiato de amônio e acetonitrila (ACN) em solução aquosa para criar uma amostra de glicopeptídeo enriquecida; aplicação da amostra de glicopeptídeo enriquecida a uma coluna de separação; e eluição dos glicopeptídeos da coluna de separação, por meio disto separando os glicopeptídeos na amostra.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de enriquecimento hidrófilo compreende um substrato de cromatografia de extração de fase sólida (SPE).
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteri- zado pelo fato de que o substrato de enriquecimento hidrófilo compre- ende um material sorvente de aminopropil à base de sílica.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o formiato de amônio e o ACN em solução aquosa compreendem cerca de 100-400 mM de formiato de amônio e cerca de 2,5% a cerca de 10% de ACN em água.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a solução de ACN formiato de amônio compreende cerca de 200 mM de formiato de amônio e cerca de 5% de ACN em água.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a5, caracterizado pelo fato de que o substrato de enriquecimento hi- drófilo é lavado com uma solução de ácido fórmico e de lavagem de ACN compreendendo cerca de 0,5% a cerca de 5% de ácido fórmico em volume e cerca de 85% a cerca de 95% de ACN em volume com a água restante para remover os contaminantes não glicopeptídeos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a solução de lavagem de ácido fórmico e de ACN com- preende cerca de 1% de ácido fórmico, cerca de 9% de H20 e cerca de 90% de ACN por volume.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a coluna de separação compre- ende uma coluna de interação hidrofílica (HLIC).
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que eluir os glicopeptídeos da coluna de separação compreende ainda separar os glicopeptídeos em uma ou mais frações.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a59, caracterizado pelo fato de que a separação dos glicopeptídeos em uma ou mais frações compreende a aplicação de um gradiente de fase móvel à coluna de separação.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gradiente de fase móvel compreende cerca de 10 mM de formiato de amônio, pH 4,5 a cerca de 90% de ACN com formiato de amônio a 10 mM, pH 4,5.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o gradiente de fase móvel compreende cerca de 0,05% de TFA em H20 ou cerca de 0,045% de TFA em ACN.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
9 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a identificação dos glicopeptídeos presentes em uma ou mais das frações.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a identificação de um glicano associado com os glicopeptídeos presentes em uma ou mais das frações.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o glicano compreende um N-glicano.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que os glicopeptídeos são obtidos a partir de um anticorpo monoclonal.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclional é de isótipo I9gG1, IgG2, 1gG3, IgG4 ou isótipo mista.
18. Método, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, carac- terizado pelo fato de que compreende ainda a digestão do anticorpo monoclonal com uma protease.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a protease compreende tripsina.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a realização da análise espectrométrica de massa sobre os glicopeptídeos eluídos.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o perfil de glicosilação a um nível glicopeptídeo dos glicopeptídeos eluídos.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pré-lavagem do substrato de enriquecimento hidrófilo com acetonitrila (ACN) em so- lução aquosa.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a diluição da amostra compreendendo glicopeptídeos em uma solução de ACN em água antes do contato com o substrato de enriquecimento hidrófilo.
PN & ns as: E + Es ê E ês 3 Õ Ss TZ 8 > E si SL 8 é EE de ã “aetes pon = W3 8 No Bs É —= 8 Ee E Ss =23 Eos S 2 É ã Ss 8 o SETE oii 2º Lua S BS S 8 TÊ Se 8 s Santas & eta “ di =? | = ; 38 n&os s E si = Só Ss Poe = sz 28 48 i 8 s 8 ; Si = ; ê Í Ss % o - i Ê a Bo o : — uu í = s: + = ; o si | 88 ; i| es 8 ii TTETTITS | BB ii sas dsas DE = i «costs ; = e = 8 Iosonêêêêêêêêênn ong se Se 18 - =E 8 1-8 Ss BS a7 -— 2 s ? SR o — Ss s ê $ Es E 3 É SE Ss Ts 3 25 dg Ts z 8 FR o Es 85 Es : : dy =D 3 S a * z E 8é & EEE e É SES43Ao — ds = o q =
= o sz ajio om 3 = 3 ZPTIPTIAZ o s E OS OD] s mM im=(O ê 3º 83 NS ES oa |) $ O s/l o mm eos — SEE TESS SRS E SE x sis ss SIiSis| No gia ã à ETA:
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862697547P | 2018-07-13 | 2018-07-13 | |
| US62/697,547 | 2018-07-13 | ||
| PCT/US2019/041541 WO2020014572A1 (en) | 2018-07-13 | 2019-07-12 | Detection and quantification of glycosylated peptides |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR112021000520A2 true BR112021000520A2 (pt) | 2021-04-06 |
Family
ID=67544336
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR112021000520-0A BR112021000520A2 (pt) | 2018-07-13 | 2019-07-12 | Detecção e quantificação de péptidos glicosilados |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11807665B2 (pt) |
| EP (2) | EP3821256B1 (pt) |
| JP (2) | JP7412407B2 (pt) |
| KR (1) | KR20210030401A (pt) |
| CN (2) | CN112513640B (pt) |
| AR (1) | AR115779A1 (pt) |
| AU (1) | AU2019301736A1 (pt) |
| BR (1) | BR112021000520A2 (pt) |
| CA (1) | CA3105821A1 (pt) |
| EA (1) | EA202190263A1 (pt) |
| IL (1) | IL279975A (pt) |
| MX (1) | MX2021000445A (pt) |
| SG (1) | SG11202100219WA (pt) |
| TW (1) | TW202012926A (pt) |
| WO (1) | WO2020014572A1 (pt) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113150062B (zh) * | 2021-03-01 | 2022-09-16 | 复旦大学 | 一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法 |
| WO2022234412A1 (en) | 2021-05-03 | 2022-11-10 | Lupin Limited | A process for purification of fc-fusion proteins |
| CN113237944B (zh) * | 2021-05-27 | 2022-08-26 | 山东大学 | 海水中有机胺实时质谱分析的膜富集喷雾电离装置和方法 |
| CN113567568B (zh) * | 2021-06-04 | 2024-03-22 | 复仪合契(南京)仪器科技有限公司 | 一种电磁hplc在线糖肽或糖蛋白富集装置 |
| KR102447238B1 (ko) | 2022-03-15 | 2022-09-27 | 주식회사 셀키 | N-연결형 및 o-연결형 당펩티드 통합 분석 방법 및 분석장치 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6723236B2 (en) | 2002-03-19 | 2004-04-20 | Waters Investments Limited | Device for solid phase extraction and method for purifying samples prior to analysis |
| US20090294362A1 (en) | 2008-05-30 | 2009-12-03 | Persson Jonas Par | Stationary phase for hydrophilic interaction chromatography |
| KR20120027055A (ko) | 2009-06-26 | 2012-03-20 | 리제네론 파라마큐티칼스 인코포레이티드 | 천연 면역글로불린 포맷을 가지는 용이하게 분리된 이중특이성 항체 |
| US10119944B2 (en) | 2013-12-24 | 2018-11-06 | Waters Technologies Corporation | Materials for hydrophilic interaction chromatography and processes for preparation and use thereof for analysis of glycoproteins and glycopeptides |
| JP6508342B2 (ja) | 2015-08-31 | 2019-05-08 | 株式会社島津製作所 | 高分子化合物の定量分析方法及び該定量分析のためのデータ処理装置 |
| CN109154604B (zh) | 2016-04-24 | 2023-07-21 | 沃特世科技公司 | 用于对用两亲强碱性部分改性的聚糖进行分析的带电表面反相色谱材料方法 |
| CN108072719B (zh) * | 2016-11-18 | 2021-03-26 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种富集分离糖肽的方法 |
-
2019
- 2019-07-11 TW TW108124438A patent/TW202012926A/zh unknown
- 2019-07-12 CN CN201980049693.4A patent/CN112513640B/zh active Active
- 2019-07-12 JP JP2021500860A patent/JP7412407B2/ja active Active
- 2019-07-12 EA EA202190263A patent/EA202190263A1/ru unknown
- 2019-07-12 BR BR112021000520-0A patent/BR112021000520A2/pt unknown
- 2019-07-12 SG SG11202100219WA patent/SG11202100219WA/en unknown
- 2019-07-12 CA CA3105821A patent/CA3105821A1/en active Pending
- 2019-07-12 EP EP19749884.3A patent/EP3821256B1/en active Active
- 2019-07-12 CN CN202410106299.2A patent/CN117929753A/zh active Pending
- 2019-07-12 AU AU2019301736A patent/AU2019301736A1/en active Pending
- 2019-07-12 EP EP24182906.8A patent/EP4407318A2/en active Pending
- 2019-07-12 AR ARP190101986A patent/AR115779A1/es unknown
- 2019-07-12 WO PCT/US2019/041541 patent/WO2020014572A1/en unknown
- 2019-07-12 US US16/509,798 patent/US11807665B2/en active Active
- 2019-07-12 MX MX2021000445A patent/MX2021000445A/es unknown
- 2019-07-12 KR KR1020217003563A patent/KR20210030401A/ko active Search and Examination
-
2021
- 2021-01-06 IL IL279975A patent/IL279975A/en unknown
-
2023
- 2023-09-01 US US18/241,381 patent/US20230406880A1/en active Pending
- 2023-12-26 JP JP2023218716A patent/JP2024045122A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP7412407B2 (ja) | 2024-01-12 |
| EP3821256B1 (en) | 2024-06-19 |
| MX2021000445A (es) | 2021-05-27 |
| US20200017544A1 (en) | 2020-01-16 |
| AU2019301736A1 (en) | 2021-01-28 |
| CN112513640B (zh) | 2024-02-02 |
| EA202190263A1 (ru) | 2021-04-21 |
| TW202012926A (zh) | 2020-04-01 |
| EP3821256A1 (en) | 2021-05-19 |
| CN112513640A (zh) | 2021-03-16 |
| WO2020014572A1 (en) | 2020-01-16 |
| IL279975A (en) | 2021-03-01 |
| US20230406880A1 (en) | 2023-12-21 |
| CA3105821A1 (en) | 2020-01-16 |
| CN117929753A (zh) | 2024-04-26 |
| AR115779A1 (es) | 2021-02-24 |
| JP2024045122A (ja) | 2024-04-02 |
| EP4407318A2 (en) | 2024-07-31 |
| SG11202100219WA (en) | 2021-02-25 |
| KR20210030401A (ko) | 2021-03-17 |
| US11807665B2 (en) | 2023-11-07 |
| JP2021530693A (ja) | 2021-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BR112021000520A2 (pt) | Detecção e quantificação de péptidos glicosilados | |
| KR101826449B1 (ko) | 펩티드 단편의 조제 방법 및 그것에 사용되는 펩티드 단편 조제용 킷, 및 분석 방법 | |
| EP2722673B1 (en) | Improved method of mapping glycans of glycoproteins | |
| US20230417759A1 (en) | Use of Amino Acids to Enhance Signal in Mass Spectral Analyses | |
| US20200033364A1 (en) | Method for simultaneous quantification of alxn1210 and eculizumab in human serum or urine | |
| WO2014195662A1 (en) | Separation and analysis systems and methods | |
| JP2023512521A (ja) | 天然液体クロマトグラフィ質量分析のためのプラットフォーム | |
| KR20210122803A (ko) | 항체 전하 이질성의 고유 마이크로유체 ce-ms 분석 | |
| Zhao et al. | Glycine additive facilitates site-specific glycosylation profiling of biopharmaceuticals by ion-pairing hydrophilic interaction chromatography mass spectrometry | |
| Reinert et al. | CE–MS Methods for the Characterization of Monoclonal Antibodies | |
| EP4062176B1 (en) | Label-free n-glycan quantification methods | |
| US20230043610A1 (en) | Native microfluidic ce-ms analysis of antibody charge heterogeneity | |
| KR20230123498A (ko) | 생체분자에서 스크램블된 디설파이드의 식별 방법 | |
| EA047025B1 (ru) | Использование аминокислот для усиления сигнала в масс-спектральном анализе | |
| WO2024155653A1 (en) | Target-based method for high-throughput and subclass-specific igg glycan profiling in human plasma | |
| Belov | Top-Down Proteomic Analysis of Protein Pharmaceuticals, Mixtures of Protein Complexes, and Ribosomal Protein Extracts by Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry | |
| CA3226049A1 (en) | Characterization of proteins by anion-exchange chromatography mass spectrometry (aex-ms) | |
| JP2024527758A (ja) | 陰イオン交換クロマトグラフィー－質量分析（ａｅｘ－ｍｓ）によるタンパク質の特徴付け方法 |