KR20230123498A - 생체분자에서 스크램블된 디설파이드의 식별 방법 - Google Patents
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Abstract
생체분자(예를 들어, 항체)에서 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합을 식별하기 위한 방법이 개시된다. 일 예에서, 방법은, 비환원 조건 하에서 생체분자의 분해를 수행하여 복수의 생체분자 단편을 포함하는 샘플을 제공하는 것, 샘플을 분리 컬럼과 접촉시키는 것, 트리플루오로아세트산(TFA) 및 소분자 첨가제를 포함하는 제1 이동상 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것, 아세토니트릴(ACN) 중의 TFA 및 소분자 첨가제를 포함하는 제2 이동상 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것, 용리된 샘플 상에서 부분 환원 절차를 수행하는 것, 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분을 질량 분석기에 적용하는 것, 및 부분적으로 환원된 용리된 샘플 상에서 질량 분석기 분석(mass spectrometric analysis)을 수행하여 생체분자에서 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합을 식별하는 것을 포함한다.
Description
서열 목록 참조
본 출원은 2021년 12월 17일에 작성되고 12,466 바이트를 함유하는 파일 10870WO01-Sequence로서 컴퓨터 판독 가능한 형식으로 제출된 서열 목록을 참조로 포함한다.
기술분야
본원에서 실시형태는 질량 스펙트럼 분석, 보다 구체적으로는, 생체분자에서 낮은 존재비(abundance) 스크램블된(scrambled) 디설파이드를 식별하기 위해서 질량 스펙트럼 분석을 사용하는 능력을 개선하기 위한 방법에 관한 것이다.
디설파이드 결합은 진핵생물 프로테옴에서 대부분의 단백질(거의 1/3)에 존재한다. 디설파이드 결합의 형성은 2개의 시스테인 잔기의 설프히드릴(SH) 측쇄 사이의 반응을 포함한다. 천연 디설파이드 결합 형성은 단백질을 안정화시키는 작용을 하며, 디설파이드 결합은 효과적인 단백질 기능에 중요하다.
치료용 단클론성 항체는 세포 표면 수용체 또는 다른 생물학적 표적 상의 특정 에피토프에 결합할 수 있고, 이러한 치료용 항체의 효능 및 안정성은 천연 디설파이드 결합의 적절한 형성에 좌우된다. 대안적으로, 치료용 단클론성 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 단백질에서 비천연(예를 들어, 스크램블된) 디설파이드 결합의 형성은 불안정화, 부적절한 폴딩, 응집체 형성 및 특정 단백질이 효과적으로 기능할 수 있게 하는 능력 부족으로 이어질 수 있다. 따라서, 단백질, 예를 들어, 치료용 항체에서 스크램블된 디설파이드의 존재를 밝히는 것이 중요하다. 단백질에서 디설파이드 스크램블링의 존재를 결정하는 현재의 과제는 낮은 존재비를 포함하고, 따라서 질량 스펙트럼 분석과 같은 방법론에 의존할 때 디설파이드 스크램블링을 검출하는 데 어려움이 있다는 것이다. 본원에서는 치료용 단클론성 항체와 같은 생체분자에서 낮은 존재비의 스크램블된 디설파이드를 식별하기 위해 질량 스펙트럼 분석을 사용하는 능력을 개선하는 방법을 논의한다.
일 양태에서, 본 발명은 생체분자에서 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합을 식별하는 방법을 제공한다. 이 방법은 비환원 조건 하에서 생체분자의 분해를 수행하여 생체분자의 복수의 단편을 포함하는 샘플을 산출하는 것; 샘플 성분이 컬럼 기질에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 샘플을 분리 컬럼에 접촉시키는 것; 제1 이동상 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것 - 여기서 제1 이동상 구배는 트리플루오로아세트산(TFA) 및 약 1 내지 2 mM 농도의 소분자 첨가제를 포함함 -; 제2 이동상 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것 - 여기서 제2 이동상 구배는 아세토니트릴(ACN) 중의 TFA 및 약 1 내지 2 mM 농도의 소분자 첨가제를 포함함 -; 용리된 샘플 성분을 10 내지 100 μM 농도의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 처리하여 부분 환원 절차를 수행하는 것; 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분을 질량 분석기에 적용하는 것; 및 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분에 대해 질량 분석기 분석(mass spectrometric analysis)을 수행하여 생체분자에서 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합을 식별하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제1 이동상 중의 소분자 첨가제는 글리신이다.
일부 실시형태에서, 제1 이동상 중의 소분자 첨가제는 글리신이고 글리신 농도는 약 1 mM이다.
일부 실시형태에서, 제1 이동상 중의 소분자 첨가제는 글리신이고, 글리신 농도는 약 2 mM이다.
일부 실시형태에서, 제2 이동상 중의 소분자 첨가제는 글리신이고, 글리신 농도는 약 1 mM이다.
일부 실시형태에서, 제2 이동상 중의 소분자 첨가제는 글리신이고 글리신 농도는 약 2 mM이다.
일부 실시형태에서, 제1 이동상 및 제2 이동상 중 하나 이상 중의 소분자 첨가제는 알라닌, 세린, 발린, N-아세틸 글리신, 메티오닌, β-알라닌, 아스파르트산 또는 N-메틸 글리신으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 이동상 중의 TFA 농도는 H2O 중의 약 0.05% 내지 0.1% TFA이다.
일부 실시형태에서, 제2 이동상 중의 TFA 농도는 80% ACN 및 20% H2O 중의 약 0.05% TFA 또는 80% ACN 및 20% H2O 중의 약 0.1% TFA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 생체분자는 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합 이소타입의 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 생체분자는 재조합 방식으로 생산된다.
일부 실시형태에서, 부분 환원 절차는 500 ms-3 s의 기간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 생체분자의 분해를 수행하는 것은, 변성 및 알킬화 단계를 수행하여 변성 알킬화 생체분자를 산출하는 것, 변성 알킬화 생체분자에 대해 사전분해 단계를 수행하여 사전분해된 변성 알킬화 생체분자를 산출하는 것, 및 사전분해 단계 후에 사전분해된 변성 알킬화 생체분자에 대해서 분해를 수행하여 샘플을 산출하고 이것을 분리 컬럼과 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변성 및 알킬화 단계는 약 5.5 내지 5.9의 pH에서 알킬화제의 존재 하에서 7 내지 9 M 우레아에서 생체분자를 변성시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 변성 및 알킬화 단계는 45 내지 55℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 알킬화제는 농도가 5 내지 15 mM인 N-에틸 말레이미드(NEM)이다. 일부 경우에, 알킬화제는 약 0.5 내지 5 mM 농도의 아이오도-아세트아미드(IAM)이다. 일부 경우에, 방법은 20 내지 40분 동안 변성 및 알킬화 단계를 수행하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 사전분해 단계를 수행하는 것은 pH 5 내지 5.6에서 재조합 Lys-C 프로테아제의 존재 하에서 변성 알킬화 생체분자를 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 사전분해 단계는 35 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 사전분해 단계는 30분 내지 90분의 기간 동안 수행된다. 일부 경우에, 재조합 Lys-C 프로테아제 대 변성 알킬화 생체분자의 비율은 각각 1:5 내지 1:20이다.
일부 실시형태에서, 분해 단계를 수행하는 것은 pH 5 내지 5.6에서 재조합 Lys-C 프로테아제 및 트립신 프로테아제의 존재 하에서 사전분해된 변성 알킬화 생체분자를 인큐베이션시키는 것을 포함한다. 일부 경우에, 분해 단계 동안 재조합 Lys-C 프로테아제 대 사전분해된 변성 알킬화 생체분자의 비율은 각각 1:5 내지 1:20이다. 일부 경우에, 트립신 프로테아제 대 사전분해된 변성 알킬화 생체분자의 비율은 각각 약 1:2 내지 약 1:10이다. 일부 경우에, 분해 단계는 35 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 경우에, 분해 단계는 2 내지 4시간 동안 수행된다.
일부 실시형태에서, 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분은 하나 이상의 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 각각은 동시에 질량 분석기에 들어간다. 일부 경우에, 질량 분석기는 탠덤 질량 분석기이며, 질량 분석기 분석을 수행하는 것은 MS1 스펙트럼 및 MS2 스펙트럼을 얻는 것을 포함한다. 일부 경우에, 병렬 반응 모니터링(PRM: parallel reaction monitoring) 포함 목록이, 상응하는 환원된 파트너 펩티드로 구축된다. 일부 경우에, 신뢰도 스코어링 시스템을 기반으로 하는 하나 이상의 디설파이드 펩티드에 대해 디설파이드 식별 신뢰도 점수가 배정된다.
일부 실시형태에서, 신뢰도 스코어링 시스템은 하기의 단계들을 포함한다: 디설파이드 펩티드의 MS1 질량이 질량 분석기 분석을 통해 식별되는지 여부를 표시하는 것; 디설파이드 펩티드에 상응하는 제1 환원 파트너 펩티드의 MS1 질량이 질량 분석기 분석을 통해 식별되는지 여부를 표시하는 것; 디설파이드 펩티드에 상응하는 제2 환원 파트너 펩티드의 MS1 질량이 질량 분석기 분석을 통해 식별되는지 여부를 표시하는 것; 제1 환원된 파트너 펩티드의 MS2 질량이 미리 결정된 역치보다 큰 점수로 식별되는지 여부를 표시하는 것; 및/또는 제2 환원된 파트너 펩티드의 MS2 질량이 미리 결정된 역치보다 큰 점수로 식별되는지 여부를 표시하는 것; 신뢰도 스코어링 시스템의 표시 단계 각각에 대해, 상응하는 펩티드가 식별되는 단일 지점을 배정하고, 상응하는 펩티드가 식별되지 않는 지점을 배정하지 않는 것; 단일 지점을 합산하는 것; 및 합산에 기초하여 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 배정하는 것 - 여기서, 합이 클수록 신뢰도가 높아짐 -.
일부 실시형태에서, 질량 분석기 분석을 수행하는 것은 생체분자에서 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합 각각에 대한 디설파이드 스크램블링 백분율을 결정하는 것을 포함한다. 예에서, 디설파이드 스크램블링 백분율은 비천연 디설파이드 결합을 포함하는 펩티드의 평균 피크 면적 대 비천연 디설파이드 결합에 포함된 펩티드의 평균 피크 면적과 비천연 디설파이드 결합에 포함된 시스테인 잔기에 상응하는 천연 디설파이드 결합을 포함하는 2개의 펩티드의 또 다른 평균 피크 면적의 합의 비율이다.
일부 실시형태에서, TCEP의 농도는 20 μM 내지 80 μM이다.
일부 실시형태에서, TCEP의 농도는 약 40 μM이다.
다양한 실시형태에서, 위에서 또는 본원에서 논의된 실시형태의 임의의 특징 또는 구성요소는 조합될 수 있고, 이러한 조합은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다. 상기 또는 본원에서 임의의 논의된 특정 값은 상기 또는 본원에서 논의된 다른 관련 값과 조합되어 범위의 상한과 하한을 나타내는 값을 갖는 범위를 기술할 수 있고, 이러한 범위와 이러한 범위 내에 속하는 모든 값들은 본 개시 내용의 범위 내에 포함된다. 위에서 또는 본원에서 논의된 각각의 값은 1%, 5%, 10% 또는 20%의 편차로 표현될 수 있다. 예를 들어, 10 mM의 농도는 10 mM ± 0.1 mM(1% 편차), 10 mM ± 0.5 mM(5% 편차), 10 mM ± 1 mM(10% 편차) 또는 10 mM ± 2 mM(20% 편차)로서 표현될 수 있다. 다른 실시형태는 이어지는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
실시형태는 첨부된 도면 및 청구범위와 함께 다음의 상세한 설명에 의해 쉽게 이해될 것이다. 실시형태는 예로서 설명되며 어떠한 방식으로도 첨부된 도면의 도면에 제한되지 않는다.
도 1a는 생체분자(예를 들어, 치료용 단클론성 항체)에서 천연 디설파이드 결합 및 비천연 디설파이드 결합의 예시적인 예를 도시한다.
도 1b는 디설파이드 스크램블링이 생체분자에서 어떻게 발생하는지에 대한 예시적인 계획을 도시한다.
도 2는 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)가 아닌 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)에 상응하는 펩티드 단편을 검출하는 능력을 도시한 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS) 및 탠덤 질량 분석법 분석을 통해 분석된 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)로부터 형성된 디설파이드에 대한 총 이온 전류(TIC) 및 추출된 이온 크로마토그래프(EIC)를 도시한다.
도 3은 다양한 농도의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 처리된 트립신-분해 단클론성 항체(mAb)의 예시적인 LC-MS 분석을 도시한다. mAb를 50 ul/분의 유량(0.02% TFA 및 0.08% FA)에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 분리한 후 디설파이드 연결을 유지하기 위해 비환원 조건에서 트립신으로 분해하였다. 분리 후, 컬럼 용리액을 다양한 농도의 TCEP(0 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 2 mM 및 4 mM) 및 NH4OH(최종 농도 0.12%)로 처리한 후 질량 분석법을 통해 분석하였다. TCEP와 NH4OH를 혼합 티(mixing tee)를 사용하여 2 μL/분의 유량으로 용리액에 첨가하였다. 데이터는 계수치 대 질량 대 전하 비율(m/z)로 제시한다. 다양한 TCEP 농도에서 디설파이드 및 상응하는 환원 펩티드(R1 및 R2)가 제시되어 있다.
도 4는 TCEP, NH4OH 및 글리신 농도의 함수로서 mAb1에 상응하는 펩티드 단편 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 3)의 MS 신호를 나타내는 그래프이다. 대조군(TCEP 없음, NH4OH 없음, 글리신 없음), 샘플 1(2 mM TCEP, 0.12% NH4OH), 샘플 2(2 mM TCEP, 0.12% NH4OH, 2 mM 글리신), 샘플 3(2 mM TCEP, 2 mM 글리신, NH4OH 없음) 및 샘플 4(2 mM 글리신 단독)를 포함하는 5개의 조건이 도시되어 있다. 대조군과 비교하여, 0.12% NH4OH의 존재 하에서 2 mM TCEP는 MS 신호를 감소시킨다(샘플 1). 2 mM TCEP 및 0.12% NH4OH를 함유하는 샘플에 2 mM 글리신을 포함시키면 샘플 1의 조건에 비해 약간의 개선(샘플 2)을 제공한다. NH4OH(샘플 3)의 부재 하에서 2 mM TCEP 및 2 mM 글리신은 유사하게 샘플 1 및 샘플 2의 조건에 비해서 약간의 개선만을 제공한다. 2 mM 글리신만을 함유하는 샘플(샘플 4)은 TCEP 및 글리신을 함유하는 샘플과 비교하여 대략 10x 신호 증폭을 나타낸다. 도 4에 예시된 샘플 각각에 대해, 조건은 이동상에 0.05% TFA를 함유한 0.1 ㎍의 로딩량의 mAb1을 포함하였다.
도 5a 및 도 5b는 TCEP 농도의 함수로서 mAb1에 상응하는 2개의 펩티드 단편 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 3)(도 5a) 및 DTLMISR(서열번호 4)(도 5b)의 MS 신호를 도시한다. 샘플 조건은 다양한 농도의 TCEP(0 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM, 400 μM, 800 μM 및 2000 μM)로 처리된, 0.1 ㎍의 로딩량의 mAb1, 0.05% TFA 및 2 mM 글리신을 포함하였다. 도시된 바와 같이, MS 신호는 TCEP의 농도가 증가함에 따라 감소한다.
도 6a 및 도 6b는 다양한 농도의 TCEP 존재 하에서 mAb1의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편의 MS 신호를 도시한다. 도 6a는 펩티드 NQVSLTCLVK(서열번호 5) 및 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(서열번호 6)에 상응하는 디설파이드에 대한 MS 신호를 도시하고, 도 6b는 상응하는 개별적인 환원된 펩티드에 대한 MS 신호를 도시한다. 샘플 조건은 제시된 TCEP 농도로 처리된, 1 ㎍의 로딩량의 mAb1, 0.05% TFA 및 2 mM 글리신을 포함하였다.
도 7a 및 도 7b는 TCEP를 사용한 환원 없이(도 7a) 그리고 40 μM에서 TCEP에 의한 부분 환원 후(도 7b) mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편의 상대 존재비를 예시한다. 도 7a 및 도 7b 각각에서, 환원된 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)에 상응하고, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. HPLC 용리액을 40 μM TCEP와 혼합하여 디설파이드의 부분적 환원을 유도하고, 2 mM 글리신을 첨가하여 글리신이 없는 샘플에 비해 MS 신호를 10 내지 20배 증폭시켰다. 용리 후 부분 환원 방법론은 환원된 파트너 펩티드와 동시에 디설파이드 펩티드가 질량 분석기에 들어가는 결과를 초래한다.
도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d, 도 8e, 도 8f 및 도 8g는 이동상에서 소분자 첨가제(예를 들어, 글리신) 및/또는 이온 페어링제(예를 들어, TFA 또는 FA)의 함수로서 디설파이드 펩티드 및 환원된 파트너 펩티드의 MS 신호를 예시하는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편의 상대 존재비를 도시한다. 도 8a 내지 도 8e 각각의 경우, 환원된 파트너 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)에 상응하고, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. 도 8f 및 도 8g 각각의 경우, 환원된 파트너 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)에 상응하고, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드를 포함한다. 도 8a 내지 도 8g 각각에 대한 샘플 조건은 5 ㎍의 분해된 mAb2 및 40 μM의 TCEP를 포함하였고, 도 8a는 글리신 없이 0.05% TFA를 포함하였고, 도 8b는 2 mM 글리신 및 0.05% TFA를 포함하였고, 도 8c는 글리신 없이 0.1% FA를 포함하였고, 도 8d는 글리신 없이 0.1% FA를 포함하였고, 도 8e는 2 mM 글리신 및 0.1% FA를 포함하였고, 도 8f는 글리신 없이 0.1% FA를 포함하였고, 도 8g는 2 mM 글리신 및 0.1% FA를 포함하였다.
도 9a 및 도 9b는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편에 대한 MS 신호를 도시한다. 도 9a 및 도 9b는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)이며, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. 도 9a 및 도 9b의 각각에 도시된 조건은 다음을 포함한다: 40 μM TCEP, 2 mM 글리신 및 0.05% TFA; 2000 μM TCEP, 0.12% NH4OH 및 0.05% TFA; 및 2000 μM TCEP, 0.12% NH4OH 및 0.1% FA. 도 9b는 도 9a에 도시된 것과 동일한 데이터를 도시하며, 이것은 40 μM TCEP 및 2 mM 글리신을 사용한 MS 신호 개선을 설명하기 위해 확대된 y축이 있다. 도 9a 및 도 9b 각각에 대한 mAb2 로딩량은 5 ug이었다.
도 10a 및 도 10b는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편에 대한 MS 신호를 도시한다. 도 10a 및 도 10b는 R1로서 표지된 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 R2로서 표시된 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)이며, 이것은 제시된 바와 같은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. 도 10a는 디설파이드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드의 상대적 존재비를 도시한다. 도 10b는 질량 분석법(MS2)의 제2 스테이지에 대한 m/z를 도시하며, 여기서, MS2 스펙트럼을 생성하기 위해 제1 스테이지(MS1)로부터의 이온이 선택적으로 단편화된다. 도 10a 및 도 10b의 경우, 샘플 조건은 5 ㎍의 로딩량의 mAb2, 40 μM TCEP, 2 mM 글리신 및 0.05% TFA를 포함하였다.
도 10c는 16개의 고유한 시스테인 잔기를 함유하는 예시적인 mAb를 예시한다.
도 11은 디설파이드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)의 MS/MS 스펙트럼을 도시한다. 펩티드 단편은 mAb2의 트립신 분해로부터 생성되었다. 도 11에 도시된 데이터는 디설파이드의 MS/MS 스펙트럼이 상응하는 환원된 파트너 펩티드와 비교할 때 상당한 정도의 복잡성을 포함하고 있으며, 40 μM TCEP로 컬럼 후 부분 환원을 수행하는 것이 임의의 검출 가능한 스크램블된 디설파이드의 보다 간단한 특징규명 가능하게 한다는 것을 예시한다.
도 12는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 시스테인 함유 펩티드를 도시한다. 시스테인 잔기 번호 및 시스테인이 mAb2의 중쇄(H) 또는 경쇄(L)에 위치하는지 여부에 대한 표시가 참조용으로 표시된다. 트립신-펩티드는 LSCAGSGFTFR(서열번호 8), AEDTAVYYCAK(서열번호 9), GPSVFPLAPCSR(서열번호 1), STSESTAALGCLVK(서열번호 7), TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2), TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK(서열번호 10), CK, NQVSLTCLVK(서열번호 37), WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(서열번호 11), DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR(서열번호 12), VEAEDVGFYYCMQALQTPYTFGQGTK(서열번호 13), SGTASVVCLLNNFYPR(서열번호 14), VYACEVTHQGLSSPVTK(서열번호 15) 및 SFNRGEC(서열번호 16)를 포함한다.
도 13은 힌지 영역 펩티드 YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK(서열번호 46)를 제외하고, mAb2로부터의 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결을 예시한다. 힌지 영역 펩티드는 제외되는데, 그 이유는 이러한 펩티드가 1개 초과(예를 들어, 2개)의 시스테인을 함유하여 1개 초과의 디설파이드 결합을 형성하고 따라서 이러한 펩티드의 스크램블된 버전이 매우 크고 복잡할 것으로 예상되기 때문이다. 스크램블된 디설파이드 연결을 식별하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 표적 MS2 접근법을 사용하는 탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 사용하였다. 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2를 분리하고 40 μM TCEP를 사용하여 부분적으로 환원시켰다. 2 mM 글리신을 사용하여 MS 신호를 증폭시켰다. 각각의 디설파이드 연결은 결정 시 신뢰 수준(미검출, 낮은 신뢰도, 중간 신뢰도, 높은 신뢰도, 매우 높은 신뢰도)에 따라 코딩된다. 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 71.6%가 높은 신뢰도 또는 매우 높은 신뢰도로 식별되었고, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 17%가 중간 신뢰도로 식별되었으며, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 11.3%가 낮은 신뢰도로 식별되었다.
도 14a, 도 14b 및 도 14c는 mAb2에 대한 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함하는 펩티드 단편을 생성하기 위해 사용되는 다양한 트립신 분해 프로토콜을 도시한다. mAb2에 대한 표준 작업 절차(SOP)(도 14a), mAb3에 대한 SOP(도 14b) 및 낮은 pH 분해 키트(도 14c)를 포함하는 3가지 상이한 프로토콜이 표시된다. mAb2에 대한 SOP를 사용하여 도 13에 도시된 데이터를 생성했음을 주목한다.
도 15a 및 도 15b는 트립신 분해 이전에 유리 시스테인 잔기를 표지하기 위한 도 14에 도시된 절차와 함께 사용되는 알킬화제인 아이오도-아세트아미드(IAM) 및 N-에틸 말레이미드(NEM)를 도시한다.
도 16은 도 14a 내지 도 14c에 예시적으로 도시된 분해 절차, 구체적으로 mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은-pH 분해 키트 각각을 사용하여 트립신-분해된 mAb2에 상응하는 UV 크로마토그램의 오버레이를 도시한다. 샘플을 전개시켜 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함하는 크로마토그램을 얻었다.
도 17a 및 도17b는 도 16에 도시된 UV 크로마토그램의 오버레이에 상응하는 선택 시간 윈도우를 도시한다. 도 17a는 약 14분에서 30분까지의 시간 윈도우를 도시하고, 도 17b는 약 34분에서 49분까지의 시간 윈도우를 도시한다.
도 18은 도 14a 내지 도 14c에 예시적으로 도시된 3개의 상이한 분해 절차 각각에 의해 얻어진, mAb2에 상응하는 다양한 천연 디설파이드에 대한 MS 신호를 나타내는 그래프를 도시한다. 천연 디설파이드는 C152H-C208H, C139H-C219L, C139H-C219L(오류(missed), 오절단(miscleavage)이라고 지칭됨), C22H-C96H, C372H-C430H, C266H-C326H, C139L-C199L, C23L-C93L, C231H-C231H 및 C234H3-C234H를 포함한다. 각각의 디설파이드의 경우에, 좌측에서 우측으로 mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은 pH 분해 키트 절차를 포함한다. MS 신호로 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 샘플을 전개시켜 도 18의 데이터를 생성하는데, 이것은 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함한다.
도 19a, 도 19b, 도 19c 및 도 19d는 mAb2 분해물의 다양한 mAb 도메인(예를 들어, VH/VL, CH1, CL, CH2, CH3)으로부터의 펩티드의 피크 면적을 도시한다. 각각의 도메인에 대해, 제시된 펩티드는 mAb2 SOP, mAb3 SOP 또는 낮은 pH 분해 키트를 통해 생성되었으며, 이것은 도 14a 내지 도 14c에 예시적으로 도시되어 있다. 도 19a는 VH/VL 도메인을 도시하고, 도 19b는 CH1/CL 도메인을 도시하고, 도 19c는 CH2 도메인을 도시하고, 도 19d는 CH3 도메인을 도시한다. 도 19a(상단)는 펩티드 DYAMTWVR(서열번호 17)을 포함하고, (하단)은 펩티드 SGQSPQLLIYLGSNR(서열번호 18)을 포함한다. 도 19b(상단)는 펩티드 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK(서열번호 19)를 포함하고, (하단)은 펩티드 ADYEK(서열번호 20)를 포함한다. 도 19c(상단)는 펩티드 DTLMISR(서열번호 39)을 포함하고, (하단)은 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 38)를 포함한다. 도 19D(상단)는 펩티드 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK(서열번호 21)를 포함하고, (하단)은 펩티드 TTPPVLDSDGSFFLYSR(서열번호 22)을 포함한다. 도시된 각각의 펩티드 및 상응하는 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 분해된 mAb2 5 ㎍ 및 글리신 2 mM을 포함한다.
도 20a, 도 20b 및 도 20c는 다양한 분해 프로토콜의 함수로서 mAb2 분해에 대한 디설파이드 스크램블링 백분율을 나타낸 표를 도시한다. 구체적으로, mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은 pH 분해 키트를 mAb2에 대해 개별적으로 시험하여 디설파이드 스크램블링 백분율이 분해 프로토콜에 의존하는지 여부를 결정하였다. 사용된 분해 프로토콜에 따라 가능한 모든 디설파이드 및 상응하는 스크램블링 백분율을 도시한다. 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 도 20a 내지 도 20c에 도시된 각각의 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 5 ㎍의 분해된 mAb2 및 2 mM 글리신을 포함한다.
도 20d는 도 20a 내지 도 20c에 요약된 실험에서 스크램블링 백분율을 결정하기 위해 사용되는 디설파이드 스크램블링 백분율을 결정하기 위한 식을 도시한다.
도 20e는 도 20a의 상기 표에 포함된 C208H-C93L 디설파이드 펩티드에 상응하는 간섭의 대표적인 예를 도시한다.
도 21a 및 도 21b는 도 20a 내지 도 20c에 도시된 정량화를 통해 결정된 바와 같은 고 존재비 스크램블된 디설파이드의 상대 존재비를 도시한다. 구체적으로, 도 21a는 상응하는 환원된 파트너 펩티드 STSESTAALGCLVK(서열번호 7) 및 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)의 디설파이드에 상응하는 C152H-C139H를 도시한다. 도 21b는 상응하는 환원된 파트너 펩티드 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR(서열번호 12) 및 LSCAGSGFTFR(서열번호 8)의 디설파이드에 상응하는 C23L-C22H를 도시한다. 도 21a 및 도 21b 각각에 대해서, 상대 존재비는 분해 프로토콜(mAb2 프로토콜, mAb3 프로토콜 또는 낮은 pH 분해 프로토콜)의 함수로 표시된다. 도 21a 및 도 21b 둘 다에 도시된 바와 같이, 크로마토그래피는 분해가 mAb2 프로토콜 및 mAb3 프로토콜로 수행되었을 때 높은 존재비 디설파이드를 쉽게 구별하였지만, 스크램블된 디설파이드의 크로마토그래프는 낮은 pH 분해 조건의 경우 기준선 노이즈와 구별할 수 없다. 각각의 조건에 대해, 샘플은 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신) 및 2 mM 글리신을 포함하였다.
도 22는 도 14에서 상기에 논의된 3개의 상이한 방법론, 즉, mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은-pH 분해 키트 절차 각각을 통해 분해된 높은 존재비 스크램블된 디설파이드(C152H-C139H)에 대한 UV 오버레이를 도시한다. UV 크로마토그램 오버레이는 환원된 파트너 펩티드 STSESTAALGCLVK(서열번호 7) 및 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)에 상응하는 C152H-C139H 디설파이드가 mAb2 및 mAb3 분해 프로토콜을 통해 생성되지만 낮은 pH 분해 프로토콜에서는 생성되지 않음을 나타낸다. 3가지 분해 절차 모두에 대한 샘플 조건은 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신) 5 ㎍ 및 2 mM의 글리신을 포함하였다.
도 23a, 도 23b 및 도 23c는 mAb 5에 대한 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함하는 단편을 생성하기 위해 사용되는 다양한 트립신 분해 프로토콜을 도시한다. mAb4 프로토콜(도 23a), mAb5 프로토콜(도 23b) 및 낮은-pH 분해 키트(도 23c)를 비롯한 3가지 상이한 프로토콜이 제시되어 있다.
도 24는 도 23a 내지 도 23c에 예시적으로 도시된 분해 절차, 구체적으로 mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 및 낮은-pH 분해 키트 각각을 사용하여 트립신-분해된 mAb5에 상응하는 UV 크로마토그램의 오버레이를 도시한다. 샘플을 전개시켜 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb5(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함하는 크로마토그램을 얻었다.
도 25a 및 도25b는 도 24에 도시된 UV 크로마토그램의 오버레이에 상응하는 선택 시간 윈도우를 도시한다. 도 25a는 약 15분에서 33분까지의 시간 윈도우를 도시하고, 도 25b는 약 35분에서 67분까지의 시간 윈도우를 도시한다.
도 26은 도 23a 내지 도 23c에 예시적으로 도시된 3개의 상이한 분해 절차 각각에 의해 얻어진, mAb5에 상응하는 다양한 천연 디설파이드에 대한 MS 신호를 나타내는 그래프를 도시한다. 천연 디설파이드는 C22H-C96H, C145H-C201H, C221H-C213L, C221H-C213L(오류, 오절단이라고 지칭), C227H-C227H, C230H-C230H, C262H-C322H, C368H-C426H, C23L-C88L, 및 C133L-C193L을 포함한다. 각각의 디설파이드의 경우에, 좌측에서 우측으로 mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 및 낮은 pH 분해 키트 절차를 포함한다. MS 신호로 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 샘플을 전개시켜 도 26의 데이터를 생성하는데, 이것은 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb5(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함한다.
도 27a, 도 27b, 도 27c 및 도 27d는 mAb5 분해물의 다양한 mAb 도메인(예를 들어, VH/VL, CH1, CL, CH2, CH3)으로부터의 펩티드의 피크 면적을 도시한다. 각각의 도메인에 대해, 제시된 펩티드는 mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 또는 낮은 pH 분해 키트를 통해 생성되었으며, 이것은 도 23a 내지 도 23c에 예시적으로 도시되어 있다. 도 27a는 VH/VL 도메인을 도시하고, 도 27b는 CH1/CL 도메인을 도시하고, 도 27c는 CH2 도메인을 도시하고, 도 27d는 CH3 도메인을 도시한다. 도 27a(상단)는 펩티드 EVQLVESGGGLVQPGGSLR(서열번호 23)을 포함하고, (하단)은 펩티드 DIQMTQSPSSLSASVGDR(서열번호 24)을 포함한다. 도 27b(상단)는 펩티드 GPSVFPLAPSSK(서열번호 25)를 포함하고, (하단)은 ADYEK(서열번호 40)를 포함한다. 도 27c(상단)는 펩티드 FNWYVDGVEVHNAK(서열번호 26)를 포함하고, (하단)은 ALPAPIEK(서열번호 27)를 포함한다. 도 27d(상단)은 펩티드 DELTK(서열번호 28)를 포함하고, (하단)은 펩티드 TTPPVLDSDGSFFLYSK(서열번호 29)를 포함한다. 도시된 각각의 펩티드 및 상응하는 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 분해된 mAb2 5 ㎍ 및 글리신 2 mM을 포함한다.
도 28은 mAb5의 트립신 분해로부터 생성된 시스테인 함유 펩티드를 도시한다. 시스테인 잔기 번호 및 시스테인이 mAb5의 중쇄(H) 또는 경쇄(L)에 위치하는지 여부에 대한 표시가 참조용으로 표시된다. 트립신 펩티드는 LSCAASGFTSSSYAMNWVR(서열번호 30), AEDTAVYYCAK(서열번호 41), STSGGTAALGCLVK(서열번호 31), DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK(서열번호 32), SCDK(서열번호 33), TPEVTCVVVDVSHEDPEVK(서열번호 34), NQVSLTCLVK(서열번호 42), WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(서열번호 43), VTITCR(서열번호 35), FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTLTFGQGTR(서열번호 36), SGTASVVCLLNNFYPR(서열번호 44), VYACEVTHQGLSSPVTK(서열번호 45) 및 GEC/SFNRGEC를 포함한다. 시스테인 C213L(GEC/SFNRGEC)과 관련하여, GEC는 예측된/예상된 트립신 펩티드이지만, SFNRGEC는 매우 일반적이고 풍부한 트립신 오류 절단을 함유한다. 특정 디설파이드 연결을 다루는 경우, GEC 펩티드 및 SFNRGEC 펩티드 둘 다는 동일한 시스테인 잔기를 함유하므로 하나의 형태의 존재는 다른 형태의 존재를 확인한다. 따라서, C213L 잔기는 본 명세서에서 GEC/SFNRGEC로 표현되고, SFNRGEC는 서열번호 16에 상응한다.
도 29는 힌지 영역 펩티드 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(서열번호 47)를 제외하고, mAb5로부터의 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결을 예시한다. 스크램블된 디설파이드 연결을 식별하기 위해 본원에 논의된 바와 같은 표적 MS2 접근법을 사용하는 탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 사용하였다. 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb5를 분리하고 40 μM TCEP를 사용하여 부분적으로 환원시켰다. 2 mM 글리신을 사용하여 MS 신호를 증폭시켰다. 분해 절차는 mAb4 프로토콜을 포함하였다(도 23a 참조). 각각의 디설파이드 연결은 결정 시 신뢰 수준(미검출, 낮은 신뢰도, 중간 신뢰도, 높은 신뢰도, 매우 높은 신뢰도)에 따라 코딩된다. 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 63.3%가 높은 신뢰도 또는 매우 높은 신뢰도로 식별되었고, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 20%가 중간 신뢰도로 식별되었으며, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 16.7%가 낮은 신뢰도로 식별되었다.
도 30a, 도 30b 및 도 30c는 다양한 분해 프로토콜의 함수로서 mAb5 분해에 대한 디설파이드 스크램블링 백분율을 나타낸 표를 도시한다. 구체적으로, mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 및 낮은 pH 분해 키트를 mAb5에 대해 개별적으로 시험하여 디설파이드 스크램블링 백분율이 분해 프로토콜에 의존하는지 여부를 결정하였다. 사용된 분해 프로토콜에 따라 가능한 모든 디설파이드 및 상응하는 스크램블링 백분율을 도시한다. 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 도 30a 내지 도 30c에 요약된 실험에서 스크램블링 백분율을 결정하기 위해서 사용된 디설파이드 스크램블링 백분율을 결정하기 위한 식은 도 20d에 제시된 식이다. 도 30a 내지 도 30c에 도시된 각각의 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 5 ㎍의 분해된 mAb5 및 2 mM 글리신을 포함한다.
도 31은 STSGGTAALGCLVK(서열번호 31)의 이합체 디설파이드에 상응하는 m/z 결정의 세트를 도시한다. 상단 크로마토그래프는 디설파이드 단독에 대한 m/z를 나타내고, 중간 크로마토그래프는 디설파이드 펩티드에 상응하는 완전히 환원된 펩티드에 대한 m/z를 도시하고, 하단 크로마토그래프는 디설파이드 펩티드에 상응하는 부분적으로 환원된 펩티드에 대한 m/z를 도시한다. 종합하면, 이러한 데이터는 부분적으로 환원된 샘플에서 변경된 동위원소 피크를 나타낸다. 더 높은 MS1 분해능으로 수집되는 데이터(TCEP 없음, 따라서 "디설파이드 단독")로 인해 상단 크로마토그래프에서 동위원소 피크가 더 뾰족하다. 표적 MS2 방법론을 사용하여 각각의 감소된 펩티드 피크의 정점 근처의 신호를 증가시키기 위해 수집된 MS2 스캔의 수를 최대화하기 위해 컬럼 후 TCEP 환원을 수행할 때 MS1 분해능이 감소하였다.
도 1a는 생체분자(예를 들어, 치료용 단클론성 항체)에서 천연 디설파이드 결합 및 비천연 디설파이드 결합의 예시적인 예를 도시한다.
도 1b는 디설파이드 스크램블링이 생체분자에서 어떻게 발생하는지에 대한 예시적인 계획을 도시한다.
도 2는 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)가 아닌 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)에 상응하는 펩티드 단편을 검출하는 능력을 도시한 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS) 및 탠덤 질량 분석법 분석을 통해 분석된 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)로부터 형성된 디설파이드에 대한 총 이온 전류(TIC) 및 추출된 이온 크로마토그래프(EIC)를 도시한다.
도 3은 다양한 농도의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 처리된 트립신-분해 단클론성 항체(mAb)의 예시적인 LC-MS 분석을 도시한다. mAb를 50 ul/분의 유량(0.02% TFA 및 0.08% FA)에서 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 통해 분리한 후 디설파이드 연결을 유지하기 위해 비환원 조건에서 트립신으로 분해하였다. 분리 후, 컬럼 용리액을 다양한 농도의 TCEP(0 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 2 mM 및 4 mM) 및 NH4OH(최종 농도 0.12%)로 처리한 후 질량 분석법을 통해 분석하였다. TCEP와 NH4OH를 혼합 티(mixing tee)를 사용하여 2 μL/분의 유량으로 용리액에 첨가하였다. 데이터는 계수치 대 질량 대 전하 비율(m/z)로 제시한다. 다양한 TCEP 농도에서 디설파이드 및 상응하는 환원 펩티드(R1 및 R2)가 제시되어 있다.
도 4는 TCEP, NH4OH 및 글리신 농도의 함수로서 mAb1에 상응하는 펩티드 단편 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 3)의 MS 신호를 나타내는 그래프이다. 대조군(TCEP 없음, NH4OH 없음, 글리신 없음), 샘플 1(2 mM TCEP, 0.12% NH4OH), 샘플 2(2 mM TCEP, 0.12% NH4OH, 2 mM 글리신), 샘플 3(2 mM TCEP, 2 mM 글리신, NH4OH 없음) 및 샘플 4(2 mM 글리신 단독)를 포함하는 5개의 조건이 도시되어 있다. 대조군과 비교하여, 0.12% NH4OH의 존재 하에서 2 mM TCEP는 MS 신호를 감소시킨다(샘플 1). 2 mM TCEP 및 0.12% NH4OH를 함유하는 샘플에 2 mM 글리신을 포함시키면 샘플 1의 조건에 비해 약간의 개선(샘플 2)을 제공한다. NH4OH(샘플 3)의 부재 하에서 2 mM TCEP 및 2 mM 글리신은 유사하게 샘플 1 및 샘플 2의 조건에 비해서 약간의 개선만을 제공한다. 2 mM 글리신만을 함유하는 샘플(샘플 4)은 TCEP 및 글리신을 함유하는 샘플과 비교하여 대략 10x 신호 증폭을 나타낸다. 도 4에 예시된 샘플 각각에 대해, 조건은 이동상에 0.05% TFA를 함유한 0.1 ㎍의 로딩량의 mAb1을 포함하였다.
도 5a 및 도 5b는 TCEP 농도의 함수로서 mAb1에 상응하는 2개의 펩티드 단편 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 3)(도 5a) 및 DTLMISR(서열번호 4)(도 5b)의 MS 신호를 도시한다. 샘플 조건은 다양한 농도의 TCEP(0 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 200 μM, 400 μM, 800 μM 및 2000 μM)로 처리된, 0.1 ㎍의 로딩량의 mAb1, 0.05% TFA 및 2 mM 글리신을 포함하였다. 도시된 바와 같이, MS 신호는 TCEP의 농도가 증가함에 따라 감소한다.
도 6a 및 도 6b는 다양한 농도의 TCEP 존재 하에서 mAb1의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편의 MS 신호를 도시한다. 도 6a는 펩티드 NQVSLTCLVK(서열번호 5) 및 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(서열번호 6)에 상응하는 디설파이드에 대한 MS 신호를 도시하고, 도 6b는 상응하는 개별적인 환원된 펩티드에 대한 MS 신호를 도시한다. 샘플 조건은 제시된 TCEP 농도로 처리된, 1 ㎍의 로딩량의 mAb1, 0.05% TFA 및 2 mM 글리신을 포함하였다.
도 7a 및 도 7b는 TCEP를 사용한 환원 없이(도 7a) 그리고 40 μM에서 TCEP에 의한 부분 환원 후(도 7b) mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편의 상대 존재비를 예시한다. 도 7a 및 도 7b 각각에서, 환원된 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)에 상응하고, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. HPLC 용리액을 40 μM TCEP와 혼합하여 디설파이드의 부분적 환원을 유도하고, 2 mM 글리신을 첨가하여 글리신이 없는 샘플에 비해 MS 신호를 10 내지 20배 증폭시켰다. 용리 후 부분 환원 방법론은 환원된 파트너 펩티드와 동시에 디설파이드 펩티드가 질량 분석기에 들어가는 결과를 초래한다.
도 8a, 도 8b, 도 8c, 도 8d, 도 8e, 도 8f 및 도 8g는 이동상에서 소분자 첨가제(예를 들어, 글리신) 및/또는 이온 페어링제(예를 들어, TFA 또는 FA)의 함수로서 디설파이드 펩티드 및 환원된 파트너 펩티드의 MS 신호를 예시하는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편의 상대 존재비를 도시한다. 도 8a 내지 도 8e 각각의 경우, 환원된 파트너 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)에 상응하고, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. 도 8f 및 도 8g 각각의 경우, 환원된 파트너 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)에 상응하고, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드를 포함한다. 도 8a 내지 도 8g 각각에 대한 샘플 조건은 5 ㎍의 분해된 mAb2 및 40 μM의 TCEP를 포함하였고, 도 8a는 글리신 없이 0.05% TFA를 포함하였고, 도 8b는 2 mM 글리신 및 0.05% TFA를 포함하였고, 도 8c는 글리신 없이 0.1% FA를 포함하였고, 도 8d는 글리신 없이 0.1% FA를 포함하였고, 도 8e는 2 mM 글리신 및 0.1% FA를 포함하였고, 도 8f는 글리신 없이 0.1% FA를 포함하였고, 도 8g는 2 mM 글리신 및 0.1% FA를 포함하였다.
도 9a 및 도 9b는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편에 대한 MS 신호를 도시한다. 도 9a 및 도 9b는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)이며, 이것은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. 도 9a 및 도 9b의 각각에 도시된 조건은 다음을 포함한다: 40 μM TCEP, 2 mM 글리신 및 0.05% TFA; 2000 μM TCEP, 0.12% NH4OH 및 0.05% TFA; 및 2000 μM TCEP, 0.12% NH4OH 및 0.1% FA. 도 9b는 도 9a에 도시된 것과 동일한 데이터를 도시하며, 이것은 40 μM TCEP 및 2 mM 글리신을 사용한 MS 신호 개선을 설명하기 위해 확대된 y축이 있다. 도 9a 및 도 9b 각각에 대한 mAb2 로딩량은 5 ug이었다.
도 10a 및 도 10b는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편에 대한 MS 신호를 도시한다. 도 10a 및 도 10b는 R1로서 표지된 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 R2로서 표시된 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)이며, 이것은 제시된 바와 같은 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함한다. 도 10a는 디설파이드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드의 상대적 존재비를 도시한다. 도 10b는 질량 분석법(MS2)의 제2 스테이지에 대한 m/z를 도시하며, 여기서, MS2 스펙트럼을 생성하기 위해 제1 스테이지(MS1)로부터의 이온이 선택적으로 단편화된다. 도 10a 및 도 10b의 경우, 샘플 조건은 5 ㎍의 로딩량의 mAb2, 40 μM TCEP, 2 mM 글리신 및 0.05% TFA를 포함하였다.
도 10c는 16개의 고유한 시스테인 잔기를 함유하는 예시적인 mAb를 예시한다.
도 11은 디설파이드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)의 MS/MS 스펙트럼을 도시한다. 펩티드 단편은 mAb2의 트립신 분해로부터 생성되었다. 도 11에 도시된 데이터는 디설파이드의 MS/MS 스펙트럼이 상응하는 환원된 파트너 펩티드와 비교할 때 상당한 정도의 복잡성을 포함하고 있으며, 40 μM TCEP로 컬럼 후 부분 환원을 수행하는 것이 임의의 검출 가능한 스크램블된 디설파이드의 보다 간단한 특징규명 가능하게 한다는 것을 예시한다.
도 12는 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 시스테인 함유 펩티드를 도시한다. 시스테인 잔기 번호 및 시스테인이 mAb2의 중쇄(H) 또는 경쇄(L)에 위치하는지 여부에 대한 표시가 참조용으로 표시된다. 트립신-펩티드는 LSCAGSGFTFR(서열번호 8), AEDTAVYYCAK(서열번호 9), GPSVFPLAPCSR(서열번호 1), STSESTAALGCLVK(서열번호 7), TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2), TPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK(서열번호 10), CK, NQVSLTCLVK(서열번호 37), WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(서열번호 11), DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR(서열번호 12), VEAEDVGFYYCMQALQTPYTFGQGTK(서열번호 13), SGTASVVCLLNNFYPR(서열번호 14), VYACEVTHQGLSSPVTK(서열번호 15) 및 SFNRGEC(서열번호 16)를 포함한다.
도 13은 힌지 영역 펩티드 YGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK(서열번호 46)를 제외하고, mAb2로부터의 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결을 예시한다. 힌지 영역 펩티드는 제외되는데, 그 이유는 이러한 펩티드가 1개 초과(예를 들어, 2개)의 시스테인을 함유하여 1개 초과의 디설파이드 결합을 형성하고 따라서 이러한 펩티드의 스크램블된 버전이 매우 크고 복잡할 것으로 예상되기 때문이다. 스크램블된 디설파이드 연결을 식별하기 위해 본원에 개시된 바와 같은 표적 MS2 접근법을 사용하는 탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 사용하였다. 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2를 분리하고 40 μM TCEP를 사용하여 부분적으로 환원시켰다. 2 mM 글리신을 사용하여 MS 신호를 증폭시켰다. 각각의 디설파이드 연결은 결정 시 신뢰 수준(미검출, 낮은 신뢰도, 중간 신뢰도, 높은 신뢰도, 매우 높은 신뢰도)에 따라 코딩된다. 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 71.6%가 높은 신뢰도 또는 매우 높은 신뢰도로 식별되었고, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 17%가 중간 신뢰도로 식별되었으며, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 11.3%가 낮은 신뢰도로 식별되었다.
도 14a, 도 14b 및 도 14c는 mAb2에 대한 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함하는 펩티드 단편을 생성하기 위해 사용되는 다양한 트립신 분해 프로토콜을 도시한다. mAb2에 대한 표준 작업 절차(SOP)(도 14a), mAb3에 대한 SOP(도 14b) 및 낮은 pH 분해 키트(도 14c)를 포함하는 3가지 상이한 프로토콜이 표시된다. mAb2에 대한 SOP를 사용하여 도 13에 도시된 데이터를 생성했음을 주목한다.
도 15a 및 도 15b는 트립신 분해 이전에 유리 시스테인 잔기를 표지하기 위한 도 14에 도시된 절차와 함께 사용되는 알킬화제인 아이오도-아세트아미드(IAM) 및 N-에틸 말레이미드(NEM)를 도시한다.
도 16은 도 14a 내지 도 14c에 예시적으로 도시된 분해 절차, 구체적으로 mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은-pH 분해 키트 각각을 사용하여 트립신-분해된 mAb2에 상응하는 UV 크로마토그램의 오버레이를 도시한다. 샘플을 전개시켜 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함하는 크로마토그램을 얻었다.
도 17a 및 도17b는 도 16에 도시된 UV 크로마토그램의 오버레이에 상응하는 선택 시간 윈도우를 도시한다. 도 17a는 약 14분에서 30분까지의 시간 윈도우를 도시하고, 도 17b는 약 34분에서 49분까지의 시간 윈도우를 도시한다.
도 18은 도 14a 내지 도 14c에 예시적으로 도시된 3개의 상이한 분해 절차 각각에 의해 얻어진, mAb2에 상응하는 다양한 천연 디설파이드에 대한 MS 신호를 나타내는 그래프를 도시한다. 천연 디설파이드는 C152H-C208H, C139H-C219L, C139H-C219L(오류(missed), 오절단(miscleavage)이라고 지칭됨), C22H-C96H, C372H-C430H, C266H-C326H, C139L-C199L, C23L-C93L, C231H-C231H 및 C234H3-C234H를 포함한다. 각각의 디설파이드의 경우에, 좌측에서 우측으로 mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은 pH 분해 키트 절차를 포함한다. MS 신호로 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 샘플을 전개시켜 도 18의 데이터를 생성하는데, 이것은 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함한다.
도 19a, 도 19b, 도 19c 및 도 19d는 mAb2 분해물의 다양한 mAb 도메인(예를 들어, VH/VL, CH1, CL, CH2, CH3)으로부터의 펩티드의 피크 면적을 도시한다. 각각의 도메인에 대해, 제시된 펩티드는 mAb2 SOP, mAb3 SOP 또는 낮은 pH 분해 키트를 통해 생성되었으며, 이것은 도 14a 내지 도 14c에 예시적으로 도시되어 있다. 도 19a는 VH/VL 도메인을 도시하고, 도 19b는 CH1/CL 도메인을 도시하고, 도 19c는 CH2 도메인을 도시하고, 도 19d는 CH3 도메인을 도시한다. 도 19a(상단)는 펩티드 DYAMTWVR(서열번호 17)을 포함하고, (하단)은 펩티드 SGQSPQLLIYLGSNR(서열번호 18)을 포함한다. 도 19b(상단)는 펩티드 DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK(서열번호 19)를 포함하고, (하단)은 펩티드 ADYEK(서열번호 20)를 포함한다. 도 19c(상단)는 펩티드 DTLMISR(서열번호 39)을 포함하고, (하단)은 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 38)를 포함한다. 도 19D(상단)는 펩티드 GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK(서열번호 21)를 포함하고, (하단)은 펩티드 TTPPVLDSDGSFFLYSR(서열번호 22)을 포함한다. 도시된 각각의 펩티드 및 상응하는 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 분해된 mAb2 5 ㎍ 및 글리신 2 mM을 포함한다.
도 20a, 도 20b 및 도 20c는 다양한 분해 프로토콜의 함수로서 mAb2 분해에 대한 디설파이드 스크램블링 백분율을 나타낸 표를 도시한다. 구체적으로, mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은 pH 분해 키트를 mAb2에 대해 개별적으로 시험하여 디설파이드 스크램블링 백분율이 분해 프로토콜에 의존하는지 여부를 결정하였다. 사용된 분해 프로토콜에 따라 가능한 모든 디설파이드 및 상응하는 스크램블링 백분율을 도시한다. 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 도 20a 내지 도 20c에 도시된 각각의 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 5 ㎍의 분해된 mAb2 및 2 mM 글리신을 포함한다.
도 20d는 도 20a 내지 도 20c에 요약된 실험에서 스크램블링 백분율을 결정하기 위해 사용되는 디설파이드 스크램블링 백분율을 결정하기 위한 식을 도시한다.
도 20e는 도 20a의 상기 표에 포함된 C208H-C93L 디설파이드 펩티드에 상응하는 간섭의 대표적인 예를 도시한다.
도 21a 및 도 21b는 도 20a 내지 도 20c에 도시된 정량화를 통해 결정된 바와 같은 고 존재비 스크램블된 디설파이드의 상대 존재비를 도시한다. 구체적으로, 도 21a는 상응하는 환원된 파트너 펩티드 STSESTAALGCLVK(서열번호 7) 및 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)의 디설파이드에 상응하는 C152H-C139H를 도시한다. 도 21b는 상응하는 환원된 파트너 펩티드 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR(서열번호 12) 및 LSCAGSGFTFR(서열번호 8)의 디설파이드에 상응하는 C23L-C22H를 도시한다. 도 21a 및 도 21b 각각에 대해서, 상대 존재비는 분해 프로토콜(mAb2 프로토콜, mAb3 프로토콜 또는 낮은 pH 분해 프로토콜)의 함수로 표시된다. 도 21a 및 도 21b 둘 다에 도시된 바와 같이, 크로마토그래피는 분해가 mAb2 프로토콜 및 mAb3 프로토콜로 수행되었을 때 높은 존재비 디설파이드를 쉽게 구별하였지만, 스크램블된 디설파이드의 크로마토그래프는 낮은 pH 분해 조건의 경우 기준선 노이즈와 구별할 수 없다. 각각의 조건에 대해, 샘플은 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신) 및 2 mM 글리신을 포함하였다.
도 22는 도 14에서 상기에 논의된 3개의 상이한 방법론, 즉, mAb2 SOP, mAb3 SOP 및 낮은-pH 분해 키트 절차 각각을 통해 분해된 높은 존재비 스크램블된 디설파이드(C152H-C139H)에 대한 UV 오버레이를 도시한다. UV 크로마토그램 오버레이는 환원된 파트너 펩티드 STSESTAALGCLVK(서열번호 7) 및 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)에 상응하는 C152H-C139H 디설파이드가 mAb2 및 mAb3 분해 프로토콜을 통해 생성되지만 낮은 pH 분해 프로토콜에서는 생성되지 않음을 나타낸다. 3가지 분해 절차 모두에 대한 샘플 조건은 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신) 5 ㎍ 및 2 mM의 글리신을 포함하였다.
도 23a, 도 23b 및 도 23c는 mAb 5에 대한 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함하는 단편을 생성하기 위해 사용되는 다양한 트립신 분해 프로토콜을 도시한다. mAb4 프로토콜(도 23a), mAb5 프로토콜(도 23b) 및 낮은-pH 분해 키트(도 23c)를 비롯한 3가지 상이한 프로토콜이 제시되어 있다.
도 24는 도 23a 내지 도 23c에 예시적으로 도시된 분해 절차, 구체적으로 mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 및 낮은-pH 분해 키트 각각을 사용하여 트립신-분해된 mAb5에 상응하는 UV 크로마토그램의 오버레이를 도시한다. 샘플을 전개시켜 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb5(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함하는 크로마토그램을 얻었다.
도 25a 및 도25b는 도 24에 도시된 UV 크로마토그램의 오버레이에 상응하는 선택 시간 윈도우를 도시한다. 도 25a는 약 15분에서 33분까지의 시간 윈도우를 도시하고, 도 25b는 약 35분에서 67분까지의 시간 윈도우를 도시한다.
도 26은 도 23a 내지 도 23c에 예시적으로 도시된 3개의 상이한 분해 절차 각각에 의해 얻어진, mAb5에 상응하는 다양한 천연 디설파이드에 대한 MS 신호를 나타내는 그래프를 도시한다. 천연 디설파이드는 C22H-C96H, C145H-C201H, C221H-C213L, C221H-C213L(오류, 오절단이라고 지칭), C227H-C227H, C230H-C230H, C262H-C322H, C368H-C426H, C23L-C88L, 및 C133L-C193L을 포함한다. 각각의 디설파이드의 경우에, 좌측에서 우측으로 mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 및 낮은 pH 분해 키트 절차를 포함한다. MS 신호로 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 샘플을 전개시켜 도 26의 데이터를 생성하는데, 이것은 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb5(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함한다.
도 27a, 도 27b, 도 27c 및 도 27d는 mAb5 분해물의 다양한 mAb 도메인(예를 들어, VH/VL, CH1, CL, CH2, CH3)으로부터의 펩티드의 피크 면적을 도시한다. 각각의 도메인에 대해, 제시된 펩티드는 mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 또는 낮은 pH 분해 키트를 통해 생성되었으며, 이것은 도 23a 내지 도 23c에 예시적으로 도시되어 있다. 도 27a는 VH/VL 도메인을 도시하고, 도 27b는 CH1/CL 도메인을 도시하고, 도 27c는 CH2 도메인을 도시하고, 도 27d는 CH3 도메인을 도시한다. 도 27a(상단)는 펩티드 EVQLVESGGGLVQPGGSLR(서열번호 23)을 포함하고, (하단)은 펩티드 DIQMTQSPSSLSASVGDR(서열번호 24)을 포함한다. 도 27b(상단)는 펩티드 GPSVFPLAPSSK(서열번호 25)를 포함하고, (하단)은 ADYEK(서열번호 40)를 포함한다. 도 27c(상단)는 펩티드 FNWYVDGVEVHNAK(서열번호 26)를 포함하고, (하단)은 ALPAPIEK(서열번호 27)를 포함한다. 도 27d(상단)은 펩티드 DELTK(서열번호 28)를 포함하고, (하단)은 펩티드 TTPPVLDSDGSFFLYSK(서열번호 29)를 포함한다. 도시된 각각의 펩티드 및 상응하는 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 분해된 mAb2 5 ㎍ 및 글리신 2 mM을 포함한다.
도 28은 mAb5의 트립신 분해로부터 생성된 시스테인 함유 펩티드를 도시한다. 시스테인 잔기 번호 및 시스테인이 mAb5의 중쇄(H) 또는 경쇄(L)에 위치하는지 여부에 대한 표시가 참조용으로 표시된다. 트립신 펩티드는 LSCAASGFTSSSYAMNWVR(서열번호 30), AEDTAVYYCAK(서열번호 41), STSGGTAALGCLVK(서열번호 31), DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK(서열번호 32), SCDK(서열번호 33), TPEVTCVVVDVSHEDPEVK(서열번호 34), NQVSLTCLVK(서열번호 42), WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(서열번호 43), VTITCR(서열번호 35), FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTLTFGQGTR(서열번호 36), SGTASVVCLLNNFYPR(서열번호 44), VYACEVTHQGLSSPVTK(서열번호 45) 및 GEC/SFNRGEC를 포함한다. 시스테인 C213L(GEC/SFNRGEC)과 관련하여, GEC는 예측된/예상된 트립신 펩티드이지만, SFNRGEC는 매우 일반적이고 풍부한 트립신 오류 절단을 함유한다. 특정 디설파이드 연결을 다루는 경우, GEC 펩티드 및 SFNRGEC 펩티드 둘 다는 동일한 시스테인 잔기를 함유하므로 하나의 형태의 존재는 다른 형태의 존재를 확인한다. 따라서, C213L 잔기는 본 명세서에서 GEC/SFNRGEC로 표현되고, SFNRGEC는 서열번호 16에 상응한다.
도 29는 힌지 영역 펩티드 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(서열번호 47)를 제외하고, mAb5로부터의 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결을 예시한다. 스크램블된 디설파이드 연결을 식별하기 위해 본원에 논의된 바와 같은 표적 MS2 접근법을 사용하는 탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 사용하였다. 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb5를 분리하고 40 μM TCEP를 사용하여 부분적으로 환원시켰다. 2 mM 글리신을 사용하여 MS 신호를 증폭시켰다. 분해 절차는 mAb4 프로토콜을 포함하였다(도 23a 참조). 각각의 디설파이드 연결은 결정 시 신뢰 수준(미검출, 낮은 신뢰도, 중간 신뢰도, 높은 신뢰도, 매우 높은 신뢰도)에 따라 코딩된다. 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 63.3%가 높은 신뢰도 또는 매우 높은 신뢰도로 식별되었고, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 20%가 중간 신뢰도로 식별되었으며, 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결의 16.7%가 낮은 신뢰도로 식별되었다.
도 30a, 도 30b 및 도 30c는 다양한 분해 프로토콜의 함수로서 mAb5 분해에 대한 디설파이드 스크램블링 백분율을 나타낸 표를 도시한다. 구체적으로, mAb4 프로토콜, mAb5 프로토콜 및 낮은 pH 분해 키트를 mAb5에 대해 개별적으로 시험하여 디설파이드 스크램블링 백분율이 분해 프로토콜에 의존하는지 여부를 결정하였다. 사용된 분해 프로토콜에 따라 가능한 모든 디설파이드 및 상응하는 스크램블링 백분율을 도시한다. 도시된 데이터는 모든 주요 전하 상태의 모든 동위원소 피크를 포함한다. 도 30a 내지 도 30c에 요약된 실험에서 스크램블링 백분율을 결정하기 위해서 사용된 디설파이드 스크램블링 백분율을 결정하기 위한 식은 도 20d에 제시된 식이다. 도 30a 내지 도 30c에 도시된 각각의 분해 프로토콜에 대해, 샘플 조건은 5 ㎍의 분해된 mAb5 및 2 mM 글리신을 포함한다.
도 31은 STSGGTAALGCLVK(서열번호 31)의 이합체 디설파이드에 상응하는 m/z 결정의 세트를 도시한다. 상단 크로마토그래프는 디설파이드 단독에 대한 m/z를 나타내고, 중간 크로마토그래프는 디설파이드 펩티드에 상응하는 완전히 환원된 펩티드에 대한 m/z를 도시하고, 하단 크로마토그래프는 디설파이드 펩티드에 상응하는 부분적으로 환원된 펩티드에 대한 m/z를 도시한다. 종합하면, 이러한 데이터는 부분적으로 환원된 샘플에서 변경된 동위원소 피크를 나타낸다. 더 높은 MS1 분해능으로 수집되는 데이터(TCEP 없음, 따라서 "디설파이드 단독")로 인해 상단 크로마토그래프에서 동위원소 피크가 더 뾰족하다. 표적 MS2 방법론을 사용하여 각각의 감소된 펩티드 피크의 정점 근처의 신호를 증가시키기 위해 수집된 MS2 스캔의 수를 최대화하기 위해 컬럼 후 TCEP 환원을 수행할 때 MS1 분해능이 감소하였다.
본 발명에 대해 설명하기 전에, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법과 실험 조건에 국한되지 않으며, 이러한 방법과 조건은 바뀔 수 있다고 이해될 것이다. 또한, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에 사용된 용어는 오직 특정 실시형태를 설명하려는 목적을 위한 것이며 이를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 임의의 실시형태 또는 실시형태의 특징은 서로 조합될 수 있고, 이러한 조합은 본 발명의 범위 내에 명시적으로 포함된다. 다음의 상세한 설명에서, 본 명세서의 일부를 형성하고 실시될 수 있는 예시적인 실시형태에 의해 도시된 첨부 도면을 참조한다. 다른 실시형태가 이용될 수 있고 구조적 또는 논리적 변화가 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해해야 한다.
다양한 작업은 실시형태를 이해하는 데 도움이 될 수 있는 방식으로 차례로 다중 개별 동작으로 설명될 수 있지만; 설명의 순서는 이러한 작업이 순서에 좌우된다는 것을 의미하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
설명은 위/아래, 뒤/앞 및 상단/하단과 같은 관점 기반 설명을 사용할 수 있다. 이러한 설명은 단지 논의를 용이하게 하기 위해 사용되며 개시된 실시형태의 적용을 제한하려는 의도가 아니다.
"결합된" 및 "연결된"이라는 용어는 그의 파생어와 함께 사용될 수 있다. 이 용어들은 서로 동의어로 의도된 것이 아님을 이해해야 한다. 오히려, 특정 실시형태에서, "연결된"은 둘 이상의 요소가 서로 직접적인 물리적 또는 전기적 접촉을 하고 있음을 나타내기 위해 사용될 수 있다. "결합된"은 둘 이상의 요소가 직접적인 물리적 또는 전기적 접촉을 하고 있음을 의미할 수 있다. 그러나, "결합된"은 또한 둘 이상의 요소가 서로 직접 접촉하지는 않지만 여전히 서로 협력하거나 상호 작용한다는 것을 의미할 수도 있다.
설명의 목적을 위해, "A/B" 형태 또는 "A 및/또는 B" 형태의 어구는 (A), (B) 또는 (A 및 B)를 의미한다. 설명의 목적상 "A, B 및 C 중 적어도 하나" 형태의 어구는 (A), (B), (C), (A 및 B), (A 및 C), (B 및 C) 또는 (A, B 및 C)를 의미한다. 설명의 목적을 위해 "(A)B" 형태의 어구는 (B) 또는 (AB)를 의미하고, 즉, A는 선택적 요소이다.
설명은 "실시형태" 또는 "실시형태들"이라는 용어를 사용할 수 있으며, 이들은 각각 동일하거나 상이한 실시형태 중 하나 이상을 지칭할 수 있다. 또한, 실시형태와 관련하여 사용된 "포함하는", "갖는" 등의 용어는 동의어이며, 일반적으로 "개방된" 용어로 의도된다(예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이들로 제한되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하지만 이들로 제한되지 않는다" 등으로 해석되어야 한다.).
본원에서 임의의 복수 및/또는 단수 용어의 사용과 관련하여, 당업자는 문맥 및/또는 적용에 적절하게 복수에서 단수로 및/또는 단수에서 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 순열은 명확성을 위해 본원에 명시적으로 설명될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 나열된 특정 수치에 대한 언급에서 사용되는 경우 그 값이 나열된 값과 1% 이하로 달라질 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 "약 100"이라는 표현은 99 내지 101, 및 그 사이의 모든 값들(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 이제 설명된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 간행물은 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함된다.
본원에 사용된 약어
ACN: 아세토니트릴
AU: 흡광도 단위
CH: 불변 중쇄
CL: 불변 경쇄
Cys: 시스테인
DDA: 데이터-의존적 획득
EIC: 추출된 이온 크로마토그래프
E/S: 효소/기질
FA: 포름산
HILIC: 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
IAM: 아이오도-아세트아미드
IgG: 면역글로불린 G
LC: 액체 크로마토그래피
LC-MS: 액체 크로마토그래피-질량 분석법
mAb: 단클론성 항체
MPA: 이동상 A
MPB: 이동상 B
MS: 질량 분석법
MS/MS: 탠덤 질량 분석법
MS1: 탠덤 질량 분석기의 제1 질량 분석기
MS2: 탠덤 질량 분석기의 제2 질량 분석기
MW: 분자량
NEM: N-에틸 말레이미드
PRM: 병렬 반응 모니터링
RPLC: 역상 액체 크로마토그래피
RPLC-MS/MS: 역상 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법
TCEP: 트리스(2-카르복시에틸)포스핀
TFA: 트리플루오로아세트산
TIC: 총 이온 전류
UV: 자외선
VH: 가변 중쇄
VL: 가변 경쇄
정의
본원에 사용되는 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 구성된 면역글로불린 분자(즉, "완전 항체 분자"), 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM) 또는 이의 항원 결합 단편을 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "VH") 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 다양한 실시형태에서, 중쇄는 IgG 이소타입일 수 있다. 일부 경우에, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 중쇄는 이소타입 IgG1/IgG2 또는 IgG4/IgG2의 키메라 힌지 영역을 선택적으로 포함하는 이소타입 IgG1 또는 IgG4로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR" 또는"VL") 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 영역 및 VL 영역은, 구조틀 영역(FR)으로 명명되는 보다 보존된 영역이 개재된, 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 이는 아미노-말단 → 카르복시-말단으로, 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된다. 용어 "항체"는 임의의 이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화 및 비-글리코실화된 면역글로불린 둘 모두에 대한 지칭을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질주입된(transfected) 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 항체 표면에 대한 리뷰에 대해서는, 문헌[Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003)]; 및 문헌[M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983)]을 참고한다.
항체라는 용어는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종 사량체 면역글로불린을 포함하는 "이중특이적 항체"를 포함한다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄 및 6개의 CDR을 포함하는 이중특이적 항체의 절반은 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하고, 항체의 나머지 절반은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 동일한 항원이지만 상이한 에피토프 또는 비-중첩 에피토프에서 결합할 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체의 양쪽 절반은 이중 특이성을 유지하면서 동일한 경쇄를 갖는다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공개 제2010/0331527호(2010년 12월 30일)에 기재되어 있다.
항체의 "항원-결합 부분"(또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(문헌[Ward et al. (1989) Nature 241:544-546]), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 합성 링커에 의해 결합되어 단일 단백질 사슬을 형성하는 Fv 단편의 2개 도메인인 VL 및 VH로 이루어지는 scFv(여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자를 형성함)를 포함한다. 단일 쇄 항체, 예컨대, 디아바디의 다른 형태는 또한 용어 "항체" 하에 포함된다(예를 들어, 문헌[Holliger et at. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448]; 및 문헌[Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123] 참조).
또한, 항체 및 이의 항원-결합 단편은 당업계에 일반적으로 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다(문헌[Sambrook et al., 1989] 참조). 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서 인간 항체를 생성하는 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, VELOCIMMUNE® 기술(예를 들어, 미국 특허 제6,596,541호, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® 참조) 또는 단클론성 항체를 생성하는 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여, 원하는 항원에 대한 고 친화성 키메라 항체가 초기에 단리되어 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는다. VELOCIMMUNE® 기술학은 마우스가 항원성 자극에 반응하여 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생산하도록 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동가능하게 연결된 인간 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스의 생성을 수반한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 단리되고, 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 다음으로 상기 DNA는 완전한 인간 항체를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 mAb는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이발생에 의해 또는 생체내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예를 들어 CDR, 특히 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용되는 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종(예를 들어 마우스)의 생식계열에서 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열 상에 이식된 mAb를 포함하도록 의도되지 않는다. 상기 용어는 비-인간 포유류에서 또는 비-인간 포유류의 세포에서 재조합 방식으로 생성된 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상체로부터 단리되거나 인간 대상체에서 생성된 항체를 포함하려고 의도하지 않는다.
본원에서 사용되는, 용어 "디설파이드"는 2개의 티올 기로부터 유래된 공유 결합을 지칭하도록 의도된다. 단백질, 예를 들어 단클론성 항체에서, 이러한 결합은 2개의 시스테인 아미노산의 티올 기 사이에서 형성된다. 디설파이드 결합은 단백질 구형 구조를 안정화하고, 단백질을 각각의 입체배좌로 유지하는 데 기여하기 때문에, 단백질 폴딩 및 안정성에 중요한 역할을 한다. 본원에서 논의된 바와 같이, 디설파이드 또는 디설파이드 펩티드는 각각의 상응하는 펩티드 상의 시스테인 잔기를 통해 공유 결합된 2개의 펩티드를 포함하며, 환원된 형태의 2개의 펩티드 각각은 "환원된 파트너 펩티드"로 지칭된다. 이러한 디설파이드 펩티드는 디설파이드 결합이 온전하게 유지되는 비환원 조건 하에서 프로테아제 분해(예를 들어, 트립신 프로테아제 분해 및/또는 재조합 Lys-C 프로테아제 분해)를 통해 생성될 수 있다. 그런 다음 이러한 디설파이드 펩티드는 환원제(예를 들어, DTT, TCEP 등)를 통해 상응하는 환원된 파트너 펩티드로 환원될 수 있다. 본원에서 사용되는, 용어 "스크램블된 디설파이드" 또는 "디설파이드 스크램블링"은 단클론성 항체와 같은 특정 생체분자에 고유하지 않은 디설파이드 결합을 포함한다.
용어 "친수성 상호작용 크로마토그래피" 또는 HILIC은 친수성 화합물이 소수성 화합물보다 더 오래 유지되는 친수성 고정상 및 소수성 유기 이동상을 사용하는 공정을 포함하는 것으로 의도된다. 특정 실시형태에서, 공정은 수혼화성 용매 이동상을 이용한다.
본원에서 사용되는, 용어 "샘플"은 예를 들어, 분리, 분석, 추출 또는 농축을 포함하는 본 발명의 방법에 따른 조작이 수행되는 적어도 하나의 분석물 분자, 예를 들어, 디설파이드 펩티드 및/또는 단클론성 항체로부터 얻은 것과 같은 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함하는 분자의 혼합물을 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "분석" 또는 "분석하는"은 상호 교환적으로 사용되며, 관심 분자(예를 들어, 단클론성 항체, 디설파이드 펩티드 및/또는 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 생체분자)를 분리, 검출, 단리, 정제, 가용화 및/또는 특징규명하는 다양한 방법 중 임의의 것을 지칭한다. 예는 고체상 추출, 고체상 마이크로 추출, 전기영동, 질량 분석법, 예를 들어, ESI-MS, 탠덤 질량 분석법(MS/MS) 또는 MALDI-MS, 액체 크로마토그래피, 예를 들어, 고성능, 예를 들어, 역상, 순상 또는 크기 배제, 이온쌍 액체 크로마토그래피, 액체-액체 추출, 예를 들어, 가속 유체 추출, 초임계 유체 추출, 마이크로웨이브 보조 추출, 막 추출, 속슬렛 추출, 침전, 정화, 전기화학적 검출, 염색, 원소 분석, 에드먼드 분해, 핵 자기 공명, 적외선 분석, 유동 주입 분석, 모세관 전기크로마토그래피, 자외선 검출, 및 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
"전자분무 이온화 질량 분석법" 또는 "ESI-MS"는 에어로졸을 생성하기 위해 액체에 고전압이 인가되는 전자분무를 사용하여 이온을 생성하기 위해 질량 분석법에서 사용되는 기술이다. 예를 들어, 전자분무에서, 이온은 비공유 상호 작용을 보존할 수 있는 깨지기 쉬운 분자가 온전하게 이온화되도록 하는 용액 중에서 단백질/펩티드로부터 생성된다. 전자분무 이온화는 액체 크로마토그래피와 질량분석법(LC-MS)을 결합하기 위해 선택한 이온 공급원이다. 분석은 LC 컬럼으로부터 용리되는 액체를 전자분무에 직접 공급하여 온라인으로 수행하거나, 추후에 고전적인 나노전자분무-질량 분석 설정에서 분석할 분획을 수집하여 오프라인으로 수행할 수 있다. LC-MS는 바이오마커 정량화, 서열 변이체 분석, 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 식별 및 정량화를 포함하여 단백질을 특징규명하는 데 사용할 수 있다.
"탠덤 질량 분석법" 또는 "MS/MS" 또는 "MS2"는 단백질 및 펩티드와 같은 생체분자 분석에 사용되는 기술이다. 탠덤 질량 분석법에서 제1 질량 분석기(MS1)는 이온 공급원을 통해 공급되는 이온으로부터 특정 질량 대 전하 비율(m/z)(또는 질량 대 전하 비율의 범위)의 이온(예를 들어, ESI, MALDI 등을 통해 이온화된 샘플)을 선택한다. 이온은 단편화되고, 제2 질량 분석기(MS2)는 단편 이온의 질량 스펙트럼을 기록한다. 탠덤 질량 분석법은 선택, 단편화 및 검출의 3개의 구별되는 단계들을 포함한다. 이 단계들의 분리는 공간 또는 시간에서 실현될 수 있다. 공간 기기의 전형적인 탠덤 질량 분석법은 QqQ(삼중 사중극자), QTOF(사중극자 비행 시간), 하이브리드 이온 트랩/FTMS(푸리에 변환 질량 분석법) 등을 포함한다. 탠덤 인 타임 MS/MS 기기는 이온 트랩 및 FT-ICR MS(푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분석법)을 포함한다. 단편화 단계는 일반적으로 충돌 활성화(CA) 또는 충돌 유도 해리(CID)라고 하는 공정에서 선택된 이온을 중성 가스와 충돌시킴으로써 수행된다.
본원에서 논의된, "부분적으로 환원된" 또는 "부분적인 환원"은 샘플(예를 들어, 생체분자 또는 생체분자의 단편)을 샘플 내에 존재하는 디설파이드 결합의 일부 분획을 이의 상응하는 환원된 대응물로 전환하지만, 샘플에 존재하는 모든 디설파이드가 환원되지는 않도록 하는 농도에서 그리고/또는 시간 동안 환원제로 처리하는 것을 포함한다.
본원에서 논의된, "병렬 반응 모니터링" 또는 "PRM"은 동일한 실험에서 복수의 단백질/펩티드를 정량화하는 데 사용되는 표적 프로테오믹스 기술을 지칭한다. PRM에서, 선택된 전구체 단독 대신에 모든 단편 이온이 선택된 전구체의 단편화 후에 측정된다. PRM은 전형적으로 Orbitrap 또는 비행 시간(ToF: Time of flight) 분석기에서 수행된다. PRM은 목표 전이(생성 이온)가 미리 선택될 필요가 없기 때문에 검정 개발 시간을 단축할 수 있다. PRM은 대부분의 간섭을 제거하여 개선된 정확도 및 아토몰(attomole) 수준의 검출 및 정량화 한계를 제공한다.
본원에서 논의된, "데이터-의존 획득" 또는 "DDA"는 탠덤 질량 분석법에서의 획득 모드를 지칭한다. DDA 모드에서, 질량 분석기는 탠덤 질량 분석법의 제1 스테이지에서 가장 강한 펩티드 이온을 선택하고, 그 다음 질량 분석법의 제2 스테이지에서 단편화 및 분석된다.
일반적인 설명
치료용 항체는 암, 감염 및 다른 병태와 같은 질환의 치료에 점점 더 많이 사용되고 있다. 치료용 항체는 예를 들어, 항원(예를 들어, 표적 세포에 존재함)에 결합하여 기능함으로써, 질환과 싸우는 분자를 유인하고/하거나 면역 체계 반응을 통해 세포 사멸을 유발하고/하거나 그렇지 않았으면 감염 및/또는 질환으로 이어졌을 과정(예를 들어, 세포 내로의 바이러스 유입 또는 수용체와 리간드 간의 상호작용)을 차단한다. 효과적이기 위해서는, 치료용 항체가 안정적이고 적절하게 접혀 있어야 한다. 부적절한 폴딩 및/또는 저하된 안정성은 이러한 분자의 비효율성에 기여할 수 있다. 부적절한 폴딩 및/또는 저하된 안정성에 대한 한 가지 이유는 치료용 항체 개발 과정의 일부 시점에서 비천연(예를 들어, 스크램블된) 디설파이드 결합의 형성을 포함한다. 따라서, 치료용 항체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 치료용 생체분자에서 스크램블된 디설파이드 결합을 쉽게 결정할 수 있는 방법이 필요하다.
생체분자에서 스크램블된 디설파이드 결합의 특징규명에 기초한 질량 분석법의 새로운 방법론이 본원에 개시된다. 개시된 방법론은 단클론성 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는 생체분자에서 스크램블된 디설파이드 결합을 안정적으로 검출하고 정량화하는 능력을 향상시킨다. 본원에서 논의된 바와 같이, 놀랍게도 액체 크로마토그래피 이동상 용액에 소분자 첨가제(예를 들어, 글리신)를 포함시키는 것으로 인한 질량 스펙트럼 신호의 개선이 특히 액체 크로마토그래피 분리 컬럼으로부터 용리되는 샘플 성분을 부분적으로 환원시키는 데 사용되는 환원제의 농도에 좌우된다는 것을 발견하였다. 또한 놀랍게도 질량 스펙트럼 신호에 대한 개선 및 질량 스펙트럼 분석을 사용하여 생체분자의 디설파이드 펩티드 단편에 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 검출하는 능력이 액체 크로마토그래피 분리 동안 이동상에 포함된 이온 페어링제의 선택에 크게 좌우된다는 것을 발견하였다. 또한 추가로, 분해된 샘플 성분이 분리되고 질량 분석법을 통해 분석되기 전의 생체분자 분해 조건이 특정 조건 하에서 인공 디설파이드 스크램블링을 신뢰성 있게 유도할 수 있고, 이러한 인공 디설파이드 스크램블링이 산성 pH에서 분해 절차를 수행함으로써 회피될 수 있다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 상기 발견은 본원에 개시된 바와 같이 탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 사용하여 높은 신뢰도로 생체분자에서 스크램블된 디설파이드 결합을 신뢰성 있게 검출하고 정량화하는 개선된 능력을 가능하게 한다. 따라서, 개시된 방법론은 디설파이드 스크램블링에 대한 치료용 생체분자(예를 들어, 단클론성 항체)를 스크리닝하는 능력을 가능하게 하는 측면에서 매우 광범위한 응용분야를 가지며, 이는 다시 이러한 분자의 사용으로부터 유래된 치료제의 유효성을 개선할 수 있다.
본원에서 논의된, 액체 크로마토그래피 방법론을 통한 프로테아제 분해된 생체분자의 분리는 사용된 하나 이상의 완충액의 구배를 포함할 수 있다. 상기 완충액 중 하나 이상은 일부 예에서 포르메이트, 아세테이트, TFA 및 염을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 이온 페어링제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 이온 페어링제는 TFA를 포함한다.
2개의 완충액이 사용되는 경우, 크로마토그래피 전개 과정에 걸쳐 제2 완충액의 농도 또는 백분율이 증가하는 반면 제1 완충액의 농도는 감소할 수 있다. 예를 들어, 제1 완충액의 백분율은 크로마토그래피 전개 과정에 걸쳐서 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45% 또는 약 40%부터, 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%로 감소될 수 있다. 다른 예로서, 제2 완충액의 백분율은 동일한 전개 과정에 걸쳐서 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35% 또는 약 40%부터, 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45% 또는 약 40%로 증가될 수 있다. 선택적으로, 제1 및 제2 완충액의 농도 또는 백분율은 크로마토그래피 전개 종료 시 시작 값으로 돌아갈 수 있다. 예를 들어, 제1 완충액의 백분율은 85%부터, 63%, 59%, 10%, 85%까지 5개 단계로 변화될 수 있고; 동일한 단계에서 제2 완충액의 백분율은 15%부터, 37%, 41%, 90%, 15%까지로 변화된다. 백분율은 선형 구배 또는 비선형(예를 들어, 단계적) 방식으로 점진적으로 변화될 수 있다. 예를 들어, 구배는 다중상, 예를 들어, 2상, 3상 등일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 이온 페어링제를 사용하지 않고 이동상의 증가하는 극성에 상응하는 감소하는 아세토니트릴 완충액 구배를 사용한다.
일부 실시형태에서, 이동 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것은 제1 이동 구배 완충액을 분리 컬럼에 적용하는 것 및 제2 이동 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것을 포함하며, 여기서 제1 이동상 완충액은 TFA 및 소분자 첨가제(예를 들어, 아미노산)를 포함하고, 제2 이동상 완충액은 ACN 중의 TFA 및 소분자 첨가제 (예를 들어, 아미노산)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 소분자 첨가제는 글리신, 알라닌, 세린, 발린, N-아세틸 글리신, 메티오닌, β-알라닌, 아스파르트산 또는 N-메틸 글리신으로부터 선택된다. 일부 경우에, 아미노산은 글리신, 알라닌, 세린 또는 발린으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 알라닌이다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 세린이다. 일부 실시형태에서, 아미노산은 발린이다. 일부 실시형태에서, 제1 이동상 완충액 중의 아미노산은 글리신이다. 일부 실시형태에서, 제2 이동상 완충액 중의 아미노산은 글리신이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 이동상 완충액 중의 아미노산은 글리신이다. 일부 실시형태에서, 제1 및/또는 제2 이동상 완충액 중의 소분자 첨가제(예를 들어, 아미노산)는 소분자(예를 들어, 변형된 아미노산) 또는 상기 또는 본원에서 식별된 다른 아미노산 중 하나이다.
이동상 완충액 중의 소분자 첨가제(예를 들어, 아미노산)의 농도는 약 0.5 mM 내지 약 5 mM, 예컨대, 약 0.5 mM 내지 약 3 mM, 약 1 mM 내지 약 2 mM, 예컨대, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM, 0.9 mM, 1.0 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, 1.7 mM, 1.8 mM, 1.9 mM, 2.0 mM, 2.1 mM, 2.2 mM, 2.3 mM, 2.4 mM, 2.5 mM, 2.6 mM, 2.7 mM, 2.8 mM, 2.9 mM, 3.0 mM, 3.1 mM, 3.2 mM, 3.3 mM, 3.4 mM, 3.5 mM, 3.6 mM, 3.7 mM, 3.8 mM, 3.9 mM, 4.0 mM,4.1 mM, 4.2 mM, 4.3 mM, 4.4 mM, 4.5 mM, 4.6 mM, 4.7 mM, 4.8 mM, 4.9 mM, 또는 5.0 mM이다. 일부 실시형태에서, 소분자 첨가제(예를 들어, 아미노산)는 5 mM 미만이다. 일부 실시형태에서, 소분자 첨가제는 5 mM 미만의 농도의 글리신이다. 일부 실시형태에서, 제1 이동상 완충액 중의 아미노산은 글리신이고, 농도는 약 1 내지 약 2 mM 글리신이다. 일부 실시형태에서, 제2 이동상 완충액 중의 아미노산은 글리신이고, 농도는 약 1 내지 약 2 mM 글리신이다. 일부 실시형태에서, 제1 이동상 완충액 중의 글리신 농도는 약 1 mM이다. 일부 실시형태에서, 제1 이동상 완충액 중의 글리신 농도는 약 2 mM이다. 일부 실시형태에서, 제2 이동상 완충액 중의 아미노산은 글리신이고, 농도는 약 1 내지 약 2 mM 글리신이다. 일부 실시형태에서, 제2 이동상 완충액 중의 글리신 농도는 약 1 mM이다. 일부 실시형태에서, 제2 이동상 완충액 중의 글리신 농도는 약 2 mM이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 이동상 완충액 중의 아미노산은 글리신이고, 농도는 약 1 내지 약 2 mM 글리신이다.
일부 실시형태에서, 제1 이동상 중의 TFA 농도는 H2O 중의 약 0.03% 내지 0.15% TFA, 예컨대, 약 0.03% 내지 0.1%이다. 일부 실시형태에서, TFA 농도는 H2O 중의 약 0.05% 내지 약 0.1% TFA이다. 예를 들어, TFA 농도는 H2O 중의 약 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 또는 0.1%이다. 일부 실시형태에서, 제2 이동상 중의 TFA 농도는 80% ACN 및 20% H2O 중의 약 0.05% TFA 또는 80% ACN 및 20% H2O 중의 약 0.1% TFA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제2 이동상 중의 ACN의 농도는 약 60% 내지 100%, 예컨대, 80% 내지 100%, 예컨대, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%이다.
일부 실시형태에서, 샘플은 펩티드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 디설파이드 결합 연결부를 통해 시스테인 잔기를 통해 연결된 펩티드를 포함한다. 예를 들어, 샘플은 비환원 조건 하에서 단클론성 항체 또는 다른 생체분자의 단백질 분해를 통해서 얻어진 디설파이드 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단클론성 항체는 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합 이소타입이다.
일부 실시형태에서, 방법은 샘플 성분이 기질에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 샘플을 분리 컬럼과 접촉시키기 전에 샘플을 제조하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 샘플 제조는 샘플 변성 및 알킬화를 허용하는 조건 하에서 샘플을 변성/알킬화 용액과 접촉시키는 것을 포함한다. 예에서, 변성제는 우레아이다. 샘플 변성(예를 들어, 단백질 변성)을 유발하기에 충분한 우레아의 농도는 7 내지 9 M 우레아, 예를 들어 8 M 우레아일 수 있다. 예에서, 변성/알킬화 용액은 알킬화제를 포함한다. 알킬화제는 일 예에서 아이오도-아세트아미드(IAM)를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 알킬화제는 N-에틸 말레이미드(NEM)를 포함할 수 있다. 예에서, 변성/알킬화 용액 중의 알킬화제는 약 0.5 mM 내지 약 10 mM, 예를 들어 약 1 mM 내지 약 8 mM의 농도이다. 일부 예에서, 변성/알킬화 용액 중의 알킬화제는 NEM이고, 농도는 약 6 mM 내지 약 10 mM, 예를 들어 8 mM이다. 일부 예에서, 변성/알킬화 용액 중의 알킬화제는 IAM이고, 농도는 약 0.5 mM 내지 약 5 mM, 예를 들어 약 1 mM, 또는 약 2 mM, 또는 약 3 mM 또는 약 4 mM 또는 약 5 mM, 예를 들어 2.4 mM이다. 일부 예에서, 변성/알킬화 용액은 약 10분 내지 약 60분, 예를 들어 20분, 또는 30분, 또는 40분, 또는 50분의 시간 기간 동안 샘플과 접촉된다. 예에서 변성/알킬화 용액은 약 40℃ 내지 약 60℃, 예를 들어 약 50℃의 온도이다. 예에서, 변성/알킬화 용액의 pH는 산성이다. 예를 들어, pH는 약 5 내지 약 6.5, 예를 들어 약 5.5 내지 약 6.0, 예를 들어 약 5.7일 수 있다.
일부 예에서, 샘플 성분이 기질에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 샘플을 분리 컬럼에 접촉시키기 전에 샘플을 제조하는 것은 샘플을 변성/알킬화 용액과 접촉시킨 후, 샘플을 사전분해 용액과 접촉시키는 것을 포함한다. 예에서, 사전분해 용액은 프로테아제, 예를 들어, 세린 프로테아제를 포함한다. 예에서, 프로테아제는 엔도프로테이나제 LysC이다. 예에서, 프로테아제는 재조합 프로테아제, 예를 들어, 재조합 엔도프로테이나제 LysC이다. 예에서, 사전분해 용액은 각각 약 1:2 내지 약 1:20, 예를 들어, 약 1:5 내지 약 1:15, 예를 들어, 약 1:10의 효소/기질 비율로 프로테아제를 포함한다. 예에서, 사전분해 용액은 약 30분 내지 2시간, 예를 들어 1시간 동안 샘플과 접촉된다. 예에서, 사전분해 용액은 약 35 내지 40℃, 예를 들어 약 37℃의 온도이다. 예에서, 사전분해 용액은 산성 pH, 예를 들어, 약 5 내지 약 6, 예를 들어, 약 5.2 내지 5.5, 예를 들어 약 5.3의 pH를 갖는다.
일부 예에서, 샘플 성분이 기질에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 샘플을 분리 컬럼에 접촉시키기 전에 샘플을 제조하는 것은 샘플을 변성/알킬화 용액과 접촉시킨 후, 샘플을 사전분해 용액과 접촉시키는 것, 샘플을 분해 용액과 접촉시키는 것을 포함한다. 예에서, 분해 용액은 제1 프로테아제, 예를 들어, 세린 프로테아제를 포함한다. 예에서, 제1 프로테아제는 엔도프로테이나제 LysC이다. 예에서, 제1 프로테아제는 재조합 프로테아제, 예를 들어, 재조합 엔도프로테이나제 LysC이다. 예에서, 분해 용액은 각각 약 1:2 내지 약 1:20, 예를 들어, 약 1:5 내지 약 1:15, 예를 들어, 약 1:10의 효소/기질 비율로 제1 프로테아제를 포함한다. 예에서, 분해 용액은 제2 프로테아제, 예를 들어, 세린 프로테아제를 포함한다. 예에서, 제2 프로테아제는 트립신이다. 예에서, 분해 용액은 각각 약 1:2 내지 약 1:10, 예를 들어, 약 1:5의 효소/기질 비율로 제2 프로테아제를 포함한다. 예에서, 분해 용액은 약 1시간 내지 약 4시간, 예를 들어 3시간 동안 샘플에 접촉된다. 예에서, 분해 용액은 약 35 내지 40℃, 예를 들어 약 37℃의 온도이다. 예에서, 분해 용액은 산성 pH, 예를 들어, 약 5 내지 약 6, 예를 들어, 약 5.2 내지 5.5, 예를 들어 약 5.3의 pH를 갖는다.
본원에서 논의된 부분 환원 절차는 분리 후 액체 크로마토그래피 컬럼으로부터 용리된 샘플 성분에 대해 수행된다. 부분적 환원 절차 전에, 샘플 성분은 환원되지 않은 분해된 생체분자(들)(예를 들어, 단클론성 항체)를 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 부분 환원 절차는 용리된 샘플 성분을 환원제로 처리하는 것을 포함한다. 예에서 환원제는 TCEP이다. 예를 들어, 용리된 샘플 성분을 부분적으로 환원시키기 위해 사용되는 환원제의 농도는 약 20 μM 내지 약 100 μM, 예를 들어 약 30 μM 내지 약 60 μM, 예를 들어 약 40 μM이다. 하기 실시예 1 및 적어도 도 6a 및 도 6b에서 논의된 바와 같이, 놀랍게도 환원된 파트너 펩티드의 MS 신호가 특정 범위의 TCEP 농도(약 20 μM 내지 약 100 μM)에 크게 의존하고, 감소된 MS 신호가 특정 범위 외부의 TCEP 농도(예를 들어, 더 높은 농도 및 더 낮은 농도 둘 다)와 연관되는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 TCEP의 농도가 높을수록(예를 들어, 400 μM에서 2 mM 및 그 초과) 디설파이드 펩티드에 상응하는 환원된 파트너 펩티드의 존재비가 증가하여 더 높은 TCEP 농도에서 상응하는 환원된 파트너에 대한 MS 신호가 증가할 것으로 예상되었기 때문에 특히 놀랍다. 따라서 낮은 TCEP 농도(예를 들어, 20 내지 100 μM, 예를 들어, 약 40 μM)가 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 검출하는 능력을 저하시키기 보다는 개선시켰다는 발견은 예상치 못한 것이었다. 예에서, 부분 환원 절차는 용리된 샘플 성분을 NH4OH로 추가로 처리하는 것을 포함한다. 예에서, NH4OH의 최종 백분율은 약 0.05% 내지 약 0.2%, 예를 들어 약 0.12%이다. 예에서, 부분 환원 절차는 약 0.5초 내지 약 5초, 예를 들어 약 1 내지 3초, 예를 들어, 약 2초의 기간 동안 용리된 샘플 성분에 대해 수행된다. 예를 들어, 부분 환원 절차에 상응하는 효율은 약 1 내지 3%이다.
일부 실시형태에서, 분리 컬럼은 액체 크로마토그래피(LC) 분리 컬럼이다. HPLC를 비롯한 액체 크로마토그래피는 디설파이드 펩티드를 비롯한 펩티드와 같은 구조물을 분리하는 데 사용될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피, 역상 HPLC, 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 및 NP-HPLC를 비롯한 순상(NP) 크로마토그래피를 포함하는 다양한 형태의 액체 크로마토그래피를 사용하여 이러한 구조물을 분리할 수 있다(예를 들어, 문헌[Alpert et al., J. Chromatogr. A 676:191-202 (1994)] 참조). 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)는 NP-HPLC의 변형이며, 이것은 부분적으로 수성 이동상으로 수행될 수 있어서, 펩티드, 디설파이드 펩티드, 탄수화물, 핵산 및 많은 단백질의 순상 분리를 허용한다. HILIC의 용리 순서는 역상 HPLC의 용리 순서와 반대인 최소 극성에서 최대 극성이다. HPLC는 예를 들어, Waters(예를 들어, Waters 2695 Alliance HPLC 시스템), Agilent, Perkin Elmer, Gilson 등의 HPLC 시스템에서 수행될 수 있다.
NP-HPLC, 바람직하게는 HILIC는 일부 예에서 본원에 기술된 방법에 사용될 수 있다. NP-HPLC는 분석물과 정지상(예를 들어, 기질) 사이의 극성 상호작용을 기반으로 분석물을 분리한다. 극성 분석물은 극성 정지상과 회합하여 이에 의해서 보유된다. 분석물 극성이 증가함에 따라 흡착 강도가 증가하고, (이동상 대비) 극성 분석물과 극성 고정상 간의 상호 작용으로 인해 용리 시간이 증가한다. 이동상에 더 많은 극성 용매를 사용하면 분석물의 체류 시간이 줄어드는 반면, 소수성 용매가 많을수록 체류 시간이 증가하는 경향이 있다.
실리카, 아미노, 아미드, 셀룰로스, 시클로덱스트린 및 폴리스티렌 기질을 포함하는 다양한 유형의 기질이 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피용 NP-HPLC와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 유용한 기질의 예는 다음을 포함한다: polySulfoethyl Aspartamide(예를 들어, PolyLC 제품), 설포베타인 기질, 예를 들어, ZIC®-HILIC(예를 들어, SeQuant 제품), POROS® HS(예를 들어, Applied Biosystems 제품), POROS® S(예를 들어, Applied Biosystems 제품), PolyHydroethyl Aspartamide(예를 들어, PolyLC 제품), Zorbax 300 SCX(예를 들어, Agilent 제품), PolyGLYCOPLEX®(예를 들어, PolyLC 제품), Amide-80(예를 들어, Tosohaas 제품), TSK GEL® Amide-80(예를 들어, Tosohaas 제품), Polyhydroxyethyl A(예를 들어, PolyLC 제품), Glyco-Sep-N(예를 들어, Oxford GlycoSciences 제품) 및 Atlantis HILIC(예를 들어, Waters 제품). 일부 실시형태에서, 개시된 방법은 하기 작용기 중 하나 이상을 이용하는 컬럼을 포함한다: 카르바모일기, 설포프로필기, 설포에틸기(예를 들어, 폴리(2-설포에틸 아스파르트아미드)), 히드록시에틸기(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸 아스파르트아미드)) 및 방향족 설폰산기.
일부 실시형태에서, 역상 HPLC는 본원에 기재된 방법과 함께 사용될 수 있다. 역상 HPLC는 분석물과 정지상(예를 들어, 기질) 사이의 비극성 상호작용을 기반으로 분석물을 분리한다. 비극성 분석물은 비극성 정지상과 회합하여 이에 의해서 보유된다. 흡착 강도는 분석물의 비극성에 따라 증가하고, (이동상 대비) 비극성 분석물과 비극성 정지상 사이의 상호 작용으로 인해 용리 시간이 증가한다. 이동상에 더 많은 비극성 용매를 사용하면 분석물의 체류 시간이 줄어드는 반면, 극성 용매가 많을수록 체류 시간이 증가하는 경향이 있다.
컬럼 온도는 예를 들어, 상업적 컬럼 가열기를 사용하여 크로마토그래피 실행 전체에 걸쳐 일정한 온도로 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 컬럼은 약 18℃ 내지 약 70℃, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 60℃, 약 40℃ 내지 약 50℃, 예를 들어, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃의 온도로 유지된다. 일부 실시형태에서, 컬럼 온도는 약 40℃이다.
이동상의 유량은 약 0 내지 약 100 ml/분일 수 있다. 분석 제안의 경우, 유량은 일반적으로 0 내지 10 ml/분의 범위이며 분취용 HPLC의 경우 100 ml/분를 초과하는 유량을 사용할 수 있다. 예를 들어, 유량은 약 0.5, 약 1, 약 1.5, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5 또는 약 5 ml/분(또는 분취용 HPLC의 경우 그 초과)일 수 있다. 동일한 패킹, 동일한 길이를 갖지만 직경이 더 작은 컬럼으로 대체하는 것은 더 넓은 직경의 컬럼에서 볼 수 있는 것과 동일한 체류 시간 및 피크에 대한 분해능을 유지하기 위해 유량을 감소시킬 필요가 있다. 일부 실시형태에서, 4.6 x 100 mm, 5 μm 컬럼에서 약 1 ml/분과 동등한 유량이 사용된다.
일부 실시형태에서, 실행 시간은 약 15 내지 약 240분, 예를 들어, 약 20 내지 약 70분, 약 30 내지 약 60분, 약 40 내지 약 90분, 약 50분 내지 약 100분, 약 60 내지 약 120분, 약 50 내지 약 80분일 수 있다.
예에서, 부분 환원 절차 후, 부분 환원된 샘플은 질량 분석법을 통해 분석된다. 예에서, 부분적으로 환원된 샘플은 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함한다. 예에서, 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드는 거의 동시에 질량 분석기에 들어간다.
예에서, 질량 분석법을 통해 샘플을 분석하는 것은 탠덤 질량 분석기 구성에 의존하여 MS1 스펙트럼 및 MS2 스펙트럼을 얻는 것을 포함한다. 예에서, MS2 스펙트럼을 얻는 것은 표적화된 MS2 접근 방식을 포함한다. 이러한 표적화된 MS2 접근법은 시스테인 잔기를 함유하는 디설파이드 펩티드에 상응하는 프로테아제 분해된(예를 들어, 트립신 분해된) 환원된 파트너 펩티드만을 표적화하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스테인을 함유하는 상응하는 환원된 파트너 펩티드만을 표적으로 하는 것은 상응하는 환원된 파트너 펩티드에 비해서 디설파이드 펩티드가 기하급수적으로 더 많은 단편화가 가능하기 때문에, 디설파이드 펩티드를 표적화하려는 시도에 MS/MS가 사용되는 접근법과 비교하여 임의의 스크램블된 디설파이드의 극적으로 더 단순한 특징규명을 가능하게 한다. 단클론성 항체를 예로 사용하면, 이러한 단클론성 항체는 특정 수의 시스테인 잔기(예를 들어, 16개)를 함유할 수 있다. 본원에서 논의된 부분 환원 절차를 사용함으로써, 시스테인을 함유하는 단지 15개의 환원된 트립신 펩티드(15개의 트립신 펩티드로부터 항체의 힌지 영역을 제외한 것)가 MS2 스테이지에서 표적화될 필요가 있다. 따라서, 예에서, 질량 분석법을 통해 샘플을 분석하는 것은 시스테인을 함유하는 프로테아제 생성 단편만으로 PRM 포함 목록을 작성하고 전체 구배에 걸쳐 스캐닝하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, MS2 스캔 수를 늘리기 위해 MS1 분해능을 낮출 수 있다.
예에서, 질량 분광법을 통해 샘플을 분석하는 것은 특정 생체분자에서 각각의 가능한 디설파이드 펩티드 가능성에 대한 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 배정하는 것을 포함한다. 예에서 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 배정하는 것은 생성된 MS/MS 데이터와 관련된 다수의 쿼리 중에서 긍정적으로 대답한 각각의 쿼리에 대해 점수를 배정하는 것을 포함한다. 예에서, 쿼리는 디설파이드 펩티드의 MS1 질량이 식별되는지 여부, 제1 상응하는 환원 펩티드의 MS1 질량이 확인되는지 여부, 제2 상응하는 환원 펩티드의 MS1 질량이 확인되는지 여부, 제1 상응하는 환원 펩티드의 바이오닉 MS2 식별이 미리 결정된 임계값보다 큰 점수로 식별되는지 여부 및 제2 상응하는 환원 펩티드의 바이오닉 MS2 식별이 또 다른 미리 결정된 임계값보다 큰 점수로 식별되는지 여부를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 예에서, 미리 결정된 임계값은 동일하지만, 미리 결정된 임계값이 상이한 것은 본 개시내용의 범주 내에 있다. 예에서, 질량 분석법을 통해 샘플을 분석하는 것은 특정 생체분자(예를 들어, 단클론성 항체)에서 각각의 가능한 디설파이드 연결에 대한 스크램블링 백분율을 배정하는 것을 포함한다.
실시예
다음의 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법을 어떻게 제조하고 사용하는지에 대한 완벽한 개시 및 설명을 제공하도록 제시되며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오류와 편차도 있다고 해야 할 것이다. 달리 명시하지 않는 한, 부(part)는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 실온은 약 25℃이고, 압력은 대기압 또는 이의 부근이다.
실시예 1: 디설파이드의 최적화된 컬럼 후 부분 환원 및 MS 신호 증폭.
항체(예를 들어, 단클론성 항체) 및 다른 생체분자는 안정성 및 효과적인 기능성에 기여하는 천연 디설파이드 결합을 보유한다. 그러나 특정 조건(예를 들어, 알칼리성 조건) 하에서, 비천연(본원에서는 스크램블된이라고도 함) 디설파이드 결합이 발생할 수 있으므로, 안정성 및 기능적 효과가 저하될 수 있다. 도 1a는 복수의 천연 디설파이드 결합을 갖는 mAb(좌측) 및 다수의 스크램블된 디설파이드 결합을 갖는 동일한 mAb(우측)를 도시한다. 도 1b는 디설파이드 결합이 염기성 조건 하에서 어떻게 재배열(예를 들어, 스크램블)할 수 있는지를 예시하는 단순화된 도식을 예시한다. 본 개시내용은 mAb에 중점을 두고 생체분자에서 스크램블된 디설파이드 결합을 검출하는 것에 관한 것이다.
스크램블된 디설파이드를 갖는 치료용 mAb(또는 다른 치료용 생체분자)는 저하된 기능성을 나타낼 수 있으므로, 스크램블된 디설파이드를 검출하는 능력이 중요하다. 도 2는 mAb에서 낮은 존재비의 스크램블된 디설파이드를 명확하게 식별하는 것이 어려울 수 있음을 나타낸다. 도 2에는 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)(상단 패널) 및 탠덤 질량 분석법(MS/MS) 분석(하단 패널)을 통해 분석된 바와 같이 상응하는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)로부터 형성된 디설파이드(C133H-C202H, 상대 존재비 0.2%)이다. EIC는 디설파이드에 해당하는 m/z 비율을 나타내지만, MS/MS 분석은 너무 복잡하여 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)에 상응하는 단편을 식별할 수 없다.
MS/MS 분석에서 디설파이드 쌍을 단편화하는 것과 연관된 복잡성 문제는 질량 스펙트럼 분석 전에 디설파이드 쌍을 적어도 부분적으로 감소시킴으로써 감소될 수 있다. 도 3은 증가하는 TCEP 농도(0 mM, 0.4 mM, 0.8 mM, 2 mM, 4 mM)의 함수로서 디설파이드 및 상응하게 환원된 파트너 펩티드의 계수치 대 질량 대 전하(m/z)를 도시한 일련의 플롯이 도시되어 있다. 간략하게, mAb를 디설파이드 연결을 유지하기 위해 비환원 조건 하에서 트립신으로 분해하였고, 비환원 분해물을 HPLC를 통해 분리하였다. 분리 후, 예시된 농도의 TCEP를 1 내지 3초 동안 용리된 디설파이드와 반응시킨 후(예를 들어, 부분 환원) 질량 분석기에 넣었다. 또한 NH4OH(최종 농도 0.12%)를 TCEP와 함께 첨가하여 디설파이드 환원에서 TCEP의 효과를 증가시켰다. 이 방법론을 사용하면, 디설파이드가 환원된 펩티드와 함께 용리되어 모든 성분이 정확히 동일한 체류 시간을 갖는다. 실험 절차를 위해, 분해된 mAb를 50 μL/분(0.02% TFA, 0.08% FA)에서 컬럼을 통해 전개시키고, TCEP 및 NH4OH를 분리 후 주사기 및 혼합 티를 통해 샘플에 첨가하였다. 실험은 2 mM TCEP에서 환원된 파트너 펩티드에 대한 가장 높은 신호를 설명한다.
낮은 존재비의 디설파이드는 MS 신호가 너무 낮은 경우 검출, 식별 및 정량화가 어려울 수 있기 때문에, TCEP를 함유하는 이동상 용리액에 글리신을 첨가하는 것이 스크램블된 디설파이드의 MS 신호를 개선할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 구체적으로, 글리신이 2 mM TCEP를 또한 포함하는 샘플에서 MS 신호를 개선시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 실험 절차는 도 4에 도시된 바와 같은 다양한 조건 하에서 mAb1로부터의 펩티드 단편 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 3)의 MS 신호를 조사하는 것을 포함하였다. 결과는 2 mM TCEP가 그렇지 않았으면 글리신(2 mM) 첨가에 의해 관찰되었을 MS 신호 증폭을 억제함을 나타낸다. 좌측에서 우측으로 진행하면, TCEP 및 NH4OH를 함유하는 샘플 1은 TCEP, NH4OH 및 글리신이 없는 대조군과 비교하여 감소된 신호를 나타내었다. TCEP 및 NH4OH(샘플 2)를 함유하는 샘플(샘플 2)에 2 mM 글리신을 첨가한 것은 약간의 개선만을 나타내었고, TCEP 및 글리신(샘플 3)의 첨가를 유지하면서 NH4OH를 제거한 것은 샘플 3에 비해 MS 신호의 약간의 개선만을 나타내었다. 샘플 4만(TCEP 및 NH4OH의 부재 하에서 2 mM 글리신) 상당한 MS 신호 증폭을 나타냈는데, 이는 2 mM의 TCEP가 2 mM 글리신의 MS 신호 증폭 효과를 억제함을 나타낸다(샘플 3과 샘플 4 비교).
글리신 유도된 MS 신호 증폭에 대한 TCEP의 이러한 억제 효과를 용량-반응 연구에서 추가로 조사하였다. 도 5a는 0 μM 내지 2000 μM의 TCEP 농도 범위에 걸쳐 mAb1로부터의 펩티드 단편 VVSVLTVLHQDWLNGK(서열번호 3)의 MS 신호를 도시하고, 도 5b는 동일한 TCEP 농도 범위에 걸쳐 또 다른 펩티드 DTLMISR(서열번호 4)의 MS 신호를 도시한다. 도 5a 및 도 5b 둘 다 TCEP의 농도가 증가함에 따라 MS 신호가 감소함을 나타낸다. 각각의 도 5a 및 5b에 대해, 샘플 조건은 표시된 TCEP 농도와 함께 0.1 ㎍ 농도의 mAb1, 0.05% TFA 및 2 mM 글리신을 포함한다.
도 5a 및 도 5b의 결과는 더 낮은 TCEP 농도와 관련된 더 높은 MS 신호를 예시한다. 디설파이드 연결 펩티드 쌍에 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 검출하는 능력을 유지하면서, 더 낮은 농도의 TCEP가 MS 신호에 대한 억제 효과를 적어도 부분적으로 회피할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 도 6a는 펩티드 NQVSLTCLVK(서열번호 5) 및 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(서열번호 6)에 상응하는 디설파이드에 대한 MS 신호가 도시되어 있고, 도 6b에는 상응하는 환원된 파트너 펩티드에 대한 MS신호가 도시되어 있다. 각각의 도 6a 및 도 6b 각각의 경우, 도 5a 및 도 5b에 대해 상기에 논의된 것과 유사하게 0 μM 내지 2000 μM 범위의 다양한 TCEP 농도를 시험하였다. 도 6a 및 도 6b의 샘플 조건은 명시된 TCEP 농도와 함께 1 ㎍의 로딩량의 트립신 분해된 mAb1, 0.05% TFA 및 2 mM 글리신을 포함하였다. 데이터는 증가하는 농도의 TCEP가 디설파이드에 상응하는 MS 신호를 억제하고(도 6a), TCEP가 디설파이드 연결 펩티드 쌍을 효과적으로 감소시키는 범위(약 20 μM 내지 약 100 μM)가 있고, 또한 여기서 MS가 신호가 바람직하지 않게 억제되지 않는다는 것을 나타낸다. 상응하는 환원된 파트너 펩티드에 대한 증가된 MS 신호(도 6b)는 MS/MS 식별에 바람직하다. 최상의 MS 신호는 약 40 μM TCEP에서의 것으로 나타났다.
따라서, 디설파이드를 상응하는 환원된 파트너 펩티드로 부분적으로 환원시키기 위해 40 μM TCEP로 추가 실험을 수행하였다. 도 7a 및 도 7b로 돌아와서, TCEP로 처리하지 않은(도 7a) 및 40 μM의 TCEP로의 처리를 통해 디설파이드가 부분 환원된(도 7b) GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)로 구성된 디설파이드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드에 대한 상대 존재비가 도시되어 있다. 분석된 펩티드 단편은 HPLC에 적용되기 전에 mAb2의 트립신 분해로부터 생성되었다. 디설파이드의 부분적 환원이 없는 경우, 상응하는 환원된 파트너 펩티드에 대한 신호가 보이지 않는 반면(도 7a), 디설파이드 펩티드가 40 μM TCEP에 의해 부분적으로 환원될 때 상응하는 환원된 파트너 펩티드에 대해 양호한 신호가 관찰되었다(도 7b).
도 8a 및 도 8b로 돌아와서, 글리신은 40 μM TCEP 및 TFA(0.05%)의 존재 하에서 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드의 MS 신호를 10배 이상(예를 들어, 10x 내지 20x) 개선시키는 것으로 관찰되었다. 도 8c 내지 도 8g는 글리신의 존재 또는 부재 하에서 FA가 환원된 파트너 펩티드의 검출을 개선하는 데 사용될 수 있는지 여부를 보여주는 데이터를 도시한다. 도 8a 내지 도 8e 각각의 경우, 환원된 파트너 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)에 상응하고, 이는 환원되지 않은 형태로 디설파이드 펩티드를 포함하고, 도 8f 내지 도 8e 각각의 경우, 환원된 파트너 펩티드는 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)에 상응하고, 이는 환원되지 않은 형태로 디설파이드를 포함한다. 도 8a 내지 도 8g 각각은 컬럼 분리 후 40 μM TCEP로 처리된 mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편의 상대 존재비를 나타낸다. 예시된 바와 같이, 이온 페어링제가 TFA(도 8a 및 도 8b 참조)이든 FA(도 8c 내지 도 8e, 및 도 8f 내지 도 8g 참조)이든 간에 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 검출하기 위해서는 글리신(예를 들어, 2 mM)이 필요하다.
도 9a 및 도 9b를 참조하면. mAb2의 트립신 분해로부터 생성된 펩티드 단편에 대한 MS 신호가 도시되어 있다. 디설파이드는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)의 디설파이드에 상응한다. 동일한 데이터가 도 9a 및 도 9b 둘 다에 도시되어 있고, 도 9b는 도 9a의 y-축 확대를 도시한다. 데이터는, 2 mM TCEP, 0.12% NH4OH, 및 0.05% TFA, 또는 2 mM TCEP, 0.12% NH4OH, 및 0.1% FA로 처리된 샘플과 비교하여, 40 μM TCEP로 부분 환원이 수행되고 이동상이 2 mM 글리신 및 0.05% TFA를 포함하는 조건 하에서 디설파이드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 둘 다에 대해 가장 큰 MS 신호가 관찰되었음을 나타낸다. 이동상이 2 mM TCEP, 0.12% NH4OH 및 0.1% FA를 포함하는 조건 하에서 얻은 데이터는, 글리신 없이 FA를 사용하여 환원된 파트너 펩티드를 검출할 수 있음을 나타낸다. 그러나, 이것은 상기에서 논의한 바와 같이 개선된 MS 신호를 얻기 위해 회피하는 것이 바람직한 다른 성분(2 mM TCEP 및 0.12% NH4OH)의 고 농도 조건을 요구하는 것으로 보인다. 더 약한 농도(예를 들어, 40 μM TCEP, 0% NH4OH)에서, 환원된 펩티드를 검출하려면 이동상에 TFA가 필요하다.
실시예 2: 스크램블된 디설파이드의 MS/MS 검출의 최적화.
TCEP(예를 들어, 20 내지 100 μM)를 사용하여 상기에 논의된 부분 환원 전략은 전형적인 1 내지 3% 환원 효율을 초래하는 것으로 추론되었으며, 이것은 우선 낮은 존재비의 스크램블된 디설파이드 상단에 존재한다. 따라서, 합리적인 MS1 신호가 있더라도 데이터-의존적 획득(DDA)에서는 MS2 스캔이 존재하지 않을 수 있고/있거나 MS2 스캔이 피크의 꼬리 단부에서 발생하는 경우 너무 약할 수 있음을 인식하였다.
이러한 문제를 설명하기 위해, 40 μM TCEP로 부분 환원한 후 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2를 탠덤 질량 분석법에 적용하였다. 이동상은 2 mM 글리신 및 0.05% TFA를 포함하였다. 도 10a에는 R1로 표지된 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 R2로 표지된 TYTCNVDHKPSNTK(서열번호 2)의 상대 존재비(MS1)가 도시되어 있다. 도 10b는 MS/MS 분석의 제2 스테이지(MS2)에 대한 m/z의 함수로서 상대 존재비를 도시한다. 도시된 바와 같이, MS1 신호가 적절하더라도 MS2 신호가 약하거나 존재하지 않을 수 있다.
따라서, MS2 스캔이 존재하고 각 피크의 정점 근처에 있음을 보장하기 위해, 모든 환원된 시스테인 함유 펩티드에 상응하는 표적화된 MS2 접근법을 개발하였다. 구체적으로, 도 10c로 돌아가서, 힌지를 포함하는 15개의 트립신 환원된 펩티드에 상응하는, 도시된 바와 같은 16개의 고유한 시스테인 잔기를 함유하는 mAb의 예시적인 도면이 도시되어 있다. 상기에 설명한 부분 환원 전략에 의존하지 않고 개별적으로 모든 디설파이드 조합을 표적으로 하면 120개의 고유한 디설파이드 펩티드가 산출되며 그 중 8개는 천연이다. 따라서, 부분 환원을 수행함으로써, 시스테인을 함유하는 약 15개의 환원된 트립신 펩티드를 표적으로 하는 것이 다만 필요하다. 따라서, 방법론은 약 15개의 펩티드로 병렬 반응 모니터링(PRM) 포함 목록을 구축하고 전체 구배에 걸쳐 스캐닝하는 것을 포함할 수 있다. 환원된 펩티드의 수(예를 들어, 약 15개)는 힌지 펩티드의 생략으로 인해 근사치로 명시되지만, 사용자 선호도에 따라 포함될 수 있는 다른 오절단된 펩티드가 존재할 가능성이 있을 수 있다. 또한 증가된 MS2 스캔 수를 위해 MS1 분해능을 낮출 수 있다.
도 11은 디설파이드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1) 및 STSESTAALGCLVK(서열번호 7)의 MS/MS 스펙트럼을 도시한다. 펩티드 단편은 mAb2의 트립신 분해로부터 생성되었다. 도 11에 도시된 데이터는 디설파이드의 MS/MS 스펙트럼이 상응하는 환원된 파트너 펩티드와 비교할 때 상당한 정도의 복잡성을 포함하고 있으며, 40 μM TCEP로 컬럼 후 부분 환원을 수행하는 것이 임의의 검출 가능한 스크램블된 디설파이드의 보다 간단한 특징규명 가능하게 한다는 것을 예시한다. 다른 방식으로 말하면, 환원된 펩티드는 단일 펩티드에 비해 기하급수적으로 더 많은 단편화가 가능하기 때문에 복잡성이 증가된 디설파이드의 MS/MS 스펙트럼으로 인해, 디설파이드 펩티드보다 훨씬 단순한 MS/MS 스펙트럼을 갖는다.
스크램블된 디설파이드의 MS/MS 검출을 용이하게 하기 위해, 다음의 신뢰도 스코어링 시스템을 개발하였다. 신뢰도 스코어링 시스템은 5개의 예/아니오 쿼리로 구성된다. 제1 쿼리는 특정 디설파이드의 MS1 질량이 식별되는지 여부를 판단한다. 제2 쿼리는 제1 환원된 파트너 펩티드의 MS1 질량이 식별되는지 여부를 판단한다. 제3 쿼리는 제2 환원된 파트너 펩티드의 MS1 질량이 식별되는지 여부를 판단한다. 제1 환원 파트너 펩티드 및 제2 환원 파트너 펩티드는 시스테인 잔기를 통해 연결될 때 제1 쿼리에서 언급된 디설파이드를 포함한다는 것이 본 개시내용에 기초하여 이해될 수 있다. 제4 쿼리는 제1 환원 파트너 펩티드의 바이오닉 MS2 ID가 미리 결정된 임계값(예를 들어, > 200)보다 큰 점수를 갖는지 여부를 판단한다. 제5 쿼리는 제2 환원 파트너 펩티드의 바이오닉 MS2 ID가 또 다른 미리 결정된 임계값(예를 들어, > 200)보다 큰 점수를 갖는지 여부를 판단한다. 각각의 쿼리에 대해, "예"는 1포인트를 초래하고, "아니오"는 아니오 또는 0포인트를 초래한다. 따라서 디설파이드 ID 신뢰도 점수는 다음과 같다. 0 = 미검출, 1 = 낮은 신뢰도, 2 = 중간 신뢰도, 3 = 높은 신뢰도, 4 또는 5 = 매우 높은 신뢰도. 신뢰도 결정의 정확도를 개선하기 위해서, 옵션은 부분 환원(예를 들어, TCEP의 부재) 없이 추가 샘플을 전개시켜 환원된 펩티드 피크가 동일한 체류 시간에 사라지는지 결정하는 것일 수 있다. 이러한 신뢰도 결정 체계를 복잡하게 만들 수 있는 몇 가지 문제는 짧은(예를 들어, 2 내지 3개의 잔기 펩티드) 것이 검출되지 않을 수 있고 이합체 디설파이드 펩티드가 상응하는 환원된 파트너 펩티드와 동일한 m/z를 갖는다는 것이다(그러나 도 31에 관련하여 하기 참조).
실시예 3: mAb2 디설파이드 스크램블링의 정량
스크램블된 디설파이드에 대한 신뢰도 값을 식별하고 배정하기 위한 상기 설계된 표적화된 MS2 접근법이 mAb2에 적용되었다. 구체적으로, mAb2를 비환원 조건 하에서 트립신 분해시켰고, 펩티드 단편을 HPLC를 통해 분리시켰고, 용리된 성분을 MS/MS 분석 전에 40 μM TCEP를 통해 부분적으로 환원시켰다(예를 들어, 표적화된 MS2). 2 mM 글리신을 사용하여 MS 신호를 증폭시켰다. 도 12는 시스테인 잔기를 함유하는 mAb2의 트립신 펩티드, 및 잔기가 경쇄(L) 또는 중쇄(H) 상에 존재하는 지의 여부에 대한 명칭 및 잔기 번호를 포함하는 상응하는 시스테인 표지를 도시한다.
결과는 도 13에 도시되어 있는데, 이것은 신뢰도 수준에 의해서 코딩된 mAb2로부터의 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결을 나타낸다. 스크램블된 디설파이드 연결 중 71.6%가 높은 또는 매우 높은 신뢰도 수준으로 식별되었고, 17%가 중간 신뢰도 수준으로 식별되었고, 11.3%가 낮은 신뢰도 수준으로 식별되었다. 힌지에 상응하는 스크램블된 펩티드가 분석으로부터 누락되었다. 이 데이터는, 가능한 모든 스크램블된 디설파이드의 대다수가 어느 정도 식별 가능하였다는 것을 나타내었다. 결과는, 디설파이드 스크램블링이 트립신 분해에 사용되는 프로토콜에 의해 인공적으로 발생할 수 있는지 여부에 대한 의문을 제기하였다. 따라서, 이러한 문제를 하기에 논의된 바와 같이 조사하였다.
도 14a 내지 도 14c는 mAb2 프로토콜(도 13에 도시된 데이터를 생성하기 위해 사용된 도 14a), mAb3 프로토콜(도 14b) 및 낮은 pH 분해 키트(도 14c)(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)에 상응하는 상이한 분해 프로토콜을 도시한다. 도 14a 내지 도 14c에 나타낸 바와 같이, 각각의 프로토콜은 유사한 단계(예를 들어, 완충액 교환, 변성, 알킬화, 분해)를 포함하며, 표시된 바와 같이 약간의 차이가 있다. 각각의 프로토콜은 mAb2 및 mAb3 프로토콜에서 아이오도-아세트아미드(IAM)를 사용한 알킬화를 포함하고 낮은 pH 분해 키트에서 N-에틸 말레이미드(NEM)를 포함하는 알킬화 단계를 포함한다. IAM 및 NEM의 구조 및 이들이 시스테인 잔기를 표지하는 방법은 도 15a 및 도 15b 각각에 참조용으로 제시되어 있다. 프로토콜 간의 다른 주요 차이점은 변성, 알킬화 및 분해 단계가 수행되는 pH에 집중된다. 또한, 낮은 pH 분해 키트 절차는 트립신을 추가로 포함하는 분해 단계 이전에 재조합 Lys-C 프로테아제를 사용한 추가 사전분해 단계를 포함한다. 중요한 것은, 낮은 pH 분해 키트 절차를 위한 변성/알킬화 단계는 pH 5.7에서 수행되고, 사전분해 단계는 pH 5.3에서 수행되며, 분해 단계는 pH 5.3에서 수행된다는 것이다. 이는 더 높은 pH(예를 들어, 7.5)에서 수행되는 mAb2 및 mAb3 프로토콜에 상응하는 유사한 단계와 대조적이다.
도 16으로 돌아와서, 낮은 pH 키트 절차와 관련된 낮은 pH에도 불구하고, 낮은 pH 키트 절차가 mAb2 및 mAb3 절차의 결과와 대등한 결과를 산출함을 나타내는 UV 크로마토그래프가 도시되어 있다. 도 16은 약 9분에서 약 72분까지의 UV 크로마토그래프를 도시한다. 도 17a는 약 14분에서 약 30분까지의 시간 창을 강조하기 위한 UV 크로마토그래프의 일부를 도시하고, 도 17b는 약 34분에서 약 49분까지의 시간 창을 강조하기 위한 도 16의 UV 크로마토그래프의 또 다른 부분을 도시한다. 종합하면, 도 16 내지 도 17b는 더 높은 pH 트립신 분해 절차(예를 들어, mAb2 및 mAb3 절차)와 비교하여 낮은 pH 키트 절차와 관련된 더 낮은 pH를 사용하여 대등한 트립신 분해가 달성될 수 있음을 예시한다. 도 16 내지 도 17b에 도시된 UV 크로마토그래프의 경우, 개별 샘플은 mAb2 절차, mAb3 절차 및 낮은 pH 분해 키트 절차를 통해 분해된 mAb2 5 ㎍에 상응한다.
동일한 샘플을 사용하여 사용된 분해 절차(예를 들어, mAb2 절차, mAb3 절차 또는 낮은 pH 분해 키트 절차)에 따라 MS 신호에 임의의 식별할 수 있는 차이가 있는지 평가하였다. 도 18로 돌아와서, 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)에 상응하는 다수의 상이한 천연 디설파이드 펩티드에 대한 MS 신호를 예시하는 그래프가 도시되어 있다. 도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, mAb2 절차, mAb3 절차 또는 낮은 pH 분해 키트 절차가 디설파이드 펩티드 단편을 생성하기 위해 사용되었는지 여부에 관계없이, 각각의 천연 디설파이드에 대해 대등한 신호 강도가 관찰되었다.
도 19a 내지 도 19d는 낮은 pH 분해가 기본 분해 절차(예를 들어, mAb2 및 mAb3 절차)와 비교하여 전체 단백질에 걸쳐 유사한 분해 효율을 가짐을 예시한다. 도 19a 내지 도 19d는 mAb의 모든 다양한 영역(예를 들어, VH, VL, CH1, CH2, CH3, CL) 내에서 비-시스테인 함유 펩티드의 MS1 피크 통합을 나타낸다. 도 18에 도시된 데이터와 조합하여 도 19a 내지 도 19d의 데이터는 보고된 스크램블된 디설파이드 수준(도 20a 내지 도 20c 참조)이 낮은 pH 분해 조건과 관련하여 정확하다는 것을 뒷받침한다. 이러한 데이터가 산성 조건(예를 들어, 낮은 pH 분해 키트 절차) 하에서 분해된 샘플에서 대등한 분해 및 MS 신호 수준을 시사하였기 때문에, 초기에 식별된 스크램블된 디설파이드의 양이(도 13 참조) 분해 절차의 선택에 의해서 인공적으로 유발되었는지의 여부를 평가하였다. 도 20a 내지 도 20c 각각은 표적화된 MS2 접근법을 포함하는 상기에 논의된 절차를 통해 검출된 디설파이드 펩티드를 예시하는 표를 도시한다. 도 20a 내지 도 20c는 mAb2로부터 가능한 모든 스크램블된 디설파이드 연결이 도시되어 있고, 이것은 mAb2 절차, mAb3 절차 및 낮은 pH 분해 키트 절차에 상응하는 3가지의 상이한 분해 절차 각각에 대한 스크램블된 디설파이드의 정량화된 존재비에 상응하는 히트 맵으로서 도시되어 있다(도 14a 내지 도 14c 참조). 각각의 가능한 스크램블된 디설파이드에 대해, 특정 분해 방법(예를 들어, mAb2 절차, mAb3 절차 또는 낮은 pH 키트 분해 절차)의 함수로서 스크램블링 백분율을 계산하였다. 스크램블링 백분율을 계산하기 위한 식이 도 20d에 도시되어 있다. 약술하자면, 스크램블된 디설파이드의 피크 면적을 천연 디설파이드 둘 모두의 평균 피크 면적과 스크램블된 디설파이드의 피크 면적의 합으로 나눔으로써 스크램블링 백분율을 결정하였다. 도 20a 내지 도 20c에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 스크램블된 디설파이드는 더 높은 pH 분해 절차(예를 들어, mAb2 및 mAb3 절차)가 사용되었을 때 식별된 더 높은 백분율과 비교하여 낮은 pH 분해 절차가 사용되었을 때 0.01% 미만으로 정량화되었다. 일부 디설파이드의 경우, 간섭이 있었고, 도 20e는 이러한 간섭의 대표적인 예를 도시한다.
도 20a는 도 20c(C23L-C22H)에서와 같이, 식별된 특히 높은 존재비의 스크램블된 디설파이드(C152H-C139H)를 강조하는 타원형을 포함한다. 이들을 도 21a 및 도 21b와 관련하여 논의된 바와 같이 추가로 조사하였다. 구체적으로, 도 21a 및 도 21b는 트립신 분해 절차가 더 높은 pH(예를 들어, mAb2 및 mAb3 절차) 또는 더 낮은 pH(낮은 pH 분해 키트 절차)에서 수행되었을 때 높은 존재비의 스크램블된 디설파이드의 상대 존재비를 도시한다. 도 21a는 환원된 파트너 펩티드 STSESTAALGCLVK(서열번호 7) 및 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)에 상응하는 C152H-C139H를 도시하고, 도 21b는 상응하는 환원된 파트너 펩티드 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR(서열번호 12) 및 LSCAGSGFTFR(서열번호 8)의 디설파이드에 상응하는 C23L-C22H를 도시한다. 도 21a 및 도 21b 각각에 대해서, 상대 존재비는 분해 프로토콜(mAb2 프로토콜, mAb3 프로토콜 또는 낮은 pH 분해 프로토콜)의 함수로 표시된다. 도 21a 및 도 21b 둘 다에 도시된 바와 같이, EIC는 분해가 mAb2 프로토콜 및 mAb3 프로토콜로 수행되었을 때 높은 존재비 디설파이드를 기준선 노이즈로부터 쉽게 구별하였지만, 스크램블된 디설파이드의 EIC는 낮은 pH 분해 조건의 경우 기준선 노이즈와 구별할 수 없다. 각각의 조건에 대해, 샘플은 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb2(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신) 및 2 mM 글리신을 포함하였다. 이러한 관찰은 도 22에 도시된 데이터와 일치하는데, 이것은 C152H-C139H 스크램블된 디설파이드(환원된 파트너 펩티드 STSESTAALGCLVK(서열번호 7) 및 GPSVFPLAPCSR(서열번호 1)에 상응함)의 UV 크로마토그래프를 도시하고 있으며, 이는 mAb2 또는 mAb3 분해 프로토콜이 샘플을 생성하는 데 사용된 경우 높은 존재비의 스크램블된 디설파이드를 포함하는 것을 나타내었다. 구체적으로, 도 22는 샘플이 mAb2 및 mAb3 분해 절차를 통해 제조되었을 때 보이는 관찰된 피크와 비교하여 낮은 pH 분해 키트 절차를 통해 제조된 샘플에 대한 상응하는 피크의 부재를 도시한다.
실시예 4: mAb5 디설파이드 스크램블링의 정량
실시예 3과 관련하여 상기에 논의된 것과 유사한 일련의 실험을 본원에서 mAb5로 명명된 또 다른 단클론성 항체에 대해 수행하였다. 도 23a 내지 도 23c는 조사된 상이한 분해 프로토콜, 구체적으로 상기에 논의되고 도 14c에 도시된 mAb4 절차, mAb5 절차 및 동일한 낮은 pH 분해 키트 절차를 도시한다. 각각의 절차의 세부 사항은 도 23a 내지 도 23c에 도시되어 있고, 주요 차이점은 mAb4 및 mAb5 분해 절차와 비교하여 낮은 pH 분해 키트 절차와 관련된 변성/알킬화 단계(예를 들어, pH 5.7) 및 분해 단계(예를 들어, pH 5.3)의 더 낮은 pH이다.
도 24는 도 23a 내지 도 23c에 예시적으로 도시된 각각의 분해 절차를 사용하여 트립신 분해된 mAb5(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)에 상응하는 UV 크로마토그램의 오버레이를 예시한다(예를 들어, mAb4 절차, mAb5 절차 및 낮은 pH 분해 키트 절차). mAb2 항체에 대해 상기에 나타낸 것과 유사하게(도 16 내지 도 17b 참조), 도 24는 낮은 pH 분해 키트 절차와 관련된 낮은 pH에도 불구하고 mAb4 및 mAb5 분해 절차를 사용한 분해와 비교할 때 대등한 분해가 달성되었음을 설명한다. 샘플을 전개시켜 2 mM 글리신의 존재 하에서 5 ㎍의 트립신 분해된 mAb5(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)를 포함하는 도 24에 도시된 크로마토그램을 얻었다. 도 25a 및 도 25b는 도 24에 도시된 전체 크로마토그래프의 일부를 도시하는데, 이것은 더 높은 pH 분해 조건(예를 들어, mAb4 및 mAb5 분해 절차) 또는 더 낮은 pH 분해 조건(예를 들어, 낮은 pH 분해 키트 절차)이 사용되었는지 여부에 관계없이, mAb5의 분해가 유사하다는 사실을 강조하기 위한 더 양호한 시각적 분해능을 위한 것이다.
도 24 내지 도 25b와 관련하여 논의된 동일한 샘플을 사용하여 사용된 분해 절차(예를 들어, mAb4 절차, mAb5 절차 또는 낮은 pH 분해 키트 절차)에 따라 MS 신호에 임의의 식별할 수 있는 차이가 있는지 평가하였다. 도 26으로 돌아와서, 트립신 분해된 mAb5(또는 낮은 pH 분해 프로토콜의 경우 낮은 pH 저항성 재조합 LysC와 함께 트립신)에 상응하는 다수의 상이한 천연 디설파이드 펩티드에 대한 MS 신호(예를 들어, 피크 면적)를 예시하는 그래프가 도시되어 있다. 도 26에서 볼 수 있는 바와 같이, mAb4 절차, mAb5 절차 또는 낮은 pH 분해 키트 절차가 디설파이드 펩티드 단편을 생성하기 위해 사용되었는지 여부에 관계없이, 각각의 천연 디설파이드에 대해 대등한 신호 강도가 관찰되었다.
도 27a 내지 도 27d는 낮은 pH 분해가 기본 분해 절차(예를 들어, mAb4 및 mAb5 절차)와 비교하여 전체 단백질에 걸쳐 유사한 분해 효율을 가짐을 예시한다. 도 27a 내지 도 27d는 mAb의 모든 다양한 영역(예를 들어, VH, VL, CH1, CH2, CH3, CL) 내에서 비-시스테인 함유 펩티드의 MS1 피크 통합을 나타낸다. 도 26에 도시된 데이터와 조합하여 도 27a 내지 도 27d의 데이터는 보고된 스크램블된 디설파이드 수준(도 30a 내지 도 30c 참조)이 낮은 pH 분해 조건과 관련하여 정확하다는 것을 뒷받침한다.
스크램블된 디설파이드에 대한 신뢰도 값을 식별하고 배정하기 위한 상기 논의된 표적화된 MS2 접근법이 mAb5에 적용되었다. 구체적으로, mAb5를 mAb4 분해 절차를 사용하여 비환원 조건 하에서 트립신 분해시켰고, 펩티드 단편을 HPLC를 통해 분리시켰고, 용리된 성분을 MS/MS 분석 전에 40 μM TCEP를 통해 부분적으로 환원시켰다(예를 들어, 표적화된 MS2). 2 mM 글리신을 사용하여 MS 신호를 증폭시켰다. 도 28은 시스테인 잔기를 함유하는 mAb5의 트립신 펩티드, 및 잔기가 경쇄(L) 또는 중쇄(H) 상에 존재하는 지의 여부에 대한 명칭 및 잔기 번호를 포함하는 상응하는 시스테인 표지를 도시한다.
결과는 도 29에 도시되어 있는데, 이것은 신뢰도 수준에 의해서 코딩된 mAb2로부터의 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결을 나타낸다. 스크램블된 디설파이드 연결 중 63.3%가 높은 또는 매우 높은 신뢰도 수준으로 식별되었고, 20%가 중간 신뢰도 수준으로 식별되었고, 16.7%가 낮은 신뢰도 수준으로 식별되었다. 힌지에 상응하는 스크램블된 펩티드가 분석으로부터 누락되었다. 이 데이터는, 가능한 모든 스크램블된 디설파이드의 대다수가 어느 정도 식별 가능하였다는 것을 나타내었다. 다시, 결과는 디설파이드 스크램블링이 트립신 분해에 사용되는 프로토콜에 의해 인공적으로 발생할 수 있는지 여부에 대한 의문을 제기하였다.
따라서, 이 문제를 mAb2 항체에 대해 위에서 논의한 것과 유사한 방식으로 조사하였다. 구체적으로, mAb5 항체에 대해, 식별된 스크램블된 디설파이드의 양이 분해 절차의 선택(예를 들어, 더 높은 pH 분해 절차)에 의해 인공적으로 야기되었는지 여부를 결정하기 위한 실험을 수행하였다(도 29 참고). 도 30a 내지 도 30c 각각은 각각의 식별된 디설파이드 펩티드 단편에 신뢰도 수준을 배정하기 위해 신뢰도 스코어링 시스템과 조합된 표적화된 MS2 접근법을 포함한 상기에 논의된 절차를 통해 검출된 디설파이드를 예시하는 표를 도시한다. 도 30a 내지 도 30c는 mAb4 절차, mAb5 절차 및 낮은 pH 분해 키트 절차에 상응하는 3가지의 상이한 분해 절차 각각에 대해, 도 29에 대해 논의된 것과 유사한 방식으로 신뢰도 수준에 의해 코딩된 mAb5로부터의 모든 가능한 스크램블된 디설파이드 연결이 도시되어 있다(도 23a 내지 도 23c 참고). 각각의 가능한 스크램블된 디설파이드에 대해, 특정 분해 방법(예를 들어, mAb4 절차, mAb5 절차 또는 낮은 pH 키트 분해 절차)의 함수로서 스크램블링 백분율을 계산하였다. 스크램블링 백분율을 계산하기 위한 식이 도 20d에 도시되어 있고, 상기에 논의되어 있다. 도 30a 내지 도 30c에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 스크램블된 디설파이드는 더 높은 pH 분해 절차(예를 들어, mAb2 및 mAb3 절차)가 사용되었을 때 식별된 더 높은 백분율과 비교하여 낮은 pH 분해 절차가 사용되었을 때 0.01% 미만으로 정량화되었다. 일부 디설파이드의 경우, 상기에 논의되고 도 20e에 예시적으로 도시된 것과 유사한 간섭이 있었다.
종합하면, 본원에서 논의된 방법론은 생체분자, 예를 들어, 단클론성 항체에서 낮은 존재비의 스크램블된 디설파이드를 식별하는 데 효과적으로 사용될 수 있다.
이들 실시예는, 컬럼 후 TCEP 부분 환원이 (온전한 디설파이드 펩티드의 MS/MS 스펙트럼과 비교하여) 더 간단한 MS/MS 스펙트럼의 생성을 통해서 그리고 정확히 동일한 체류 시간을 공유하는 모든 성분을 사용하는 경우 스크램블된 디설파이드 펩티드를 식별하는 간단하고 효과적인 방법임을 입증한다. 또한, 실험은 보다 염기성(예를 들어, pH 7.5) 조건 하의 분해 조건이 인공 디설파이드 스크램블링을 유도할 수 있음을 보여준다. 따라서, 인공 스크램블된 디설파이드 펩티드의 존재비는 분해 프로토콜에 의존할 수 있으며, 유리 티올은 디설파이드 스크램블링에 기여할 가능성이 있지만 전적으로 책임이 있는 것은 아니다. 보다 산성인 조건(예를 들어, pH 5.7)에서 비환원 분해를 수행하면 인공 디설파이드 스크램블링을 방지할 수 있다. 마지막으로, 본원에 논의된 mAb(예를 들어, mAb2 및 mAb5)는 무시할 수 있는 수준의 실제 스크램블된 디설파이드를 함유하는 것으로 나타났다.
특정 실시형태가 본원에 예시되고 설명되었지만, 당업자는 동일한 목적을 달성하기 위해 계산된 다양한 대안 및/또는 동등한 실시형태 또는 구현이 범주로부터 벗어나지 않으면서 제시되고 기재된 실시형태를 대체할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 실시형태가 매우 광범위한 방식으로 구현될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다. 본 출원은 본원에 논의된 실시형태의 임의의 적응 또는 변형을 포함하도록 의도된다. 따라서, 실시형태는 청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 제한된다는 것이 명백히 의도된다.
SEQUENCE LISTING
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro
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Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
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Lys
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Arg
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Ser Leu Arg
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Asp Arg
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Lys
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Trp Val Arg
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<223> Peptide of mAb5
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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<223> Peptide of mAb5
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Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu
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Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
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Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
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<223> Peptide of mAb5
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Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser
20 25 30
Thr Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg
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<223> Peptide of mAb2
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Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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<223> Peptide of mAb5
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
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<223> Peptide of mAb5
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1 5 10 15
Lys
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<223> Peptide of mAb2
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Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
1 5 10 15
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25
<210> 47
<211> 26
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide of mAb5
<400> 47
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25
Claims (51)
- 생체분자에서 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합을 식별하기 위한 방법으로서:
비환원 조건 하에서 상기 생체분자의 분해를 수행하여 상기 생체분자의 복수의 단편을 포함하는 샘플을 산출하는 것;
상기 샘플 성분이 컬럼 기질에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 상기 샘플을 분리 컬럼에 접촉시키는 것;
제1 이동상 구배를 상기 분리 컬럼에 적용하는 것 - 상기 제1 이동상 구배는 트리플루오로아세트산(TFA) 및 약 1 내지 2 mM 농도의 소분자 첨가제를 포함함 -;
제2 이동상 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것 - 상기 제2 이동상 구배는 아세토니트릴(ACN) 중의 TFA 및 약 1 내지 2 mM 농도의 소분자 첨가제를 포함함 -;
용리된 샘플 성분을 10 내지 100 μM 농도의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 처리하여 부분 환원 절차를 수행하는 것;
상기 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분을 질량 분석기에 적용하는 것; 및
상기 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분에 대해 질량 분석기 분석(mass spectrometric analysis)을 수행하여 상기 생체분자에서 상기 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합을 식별하는 것을 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 제1 이동상 중의 소분자 첨가제는 글리신, 알라닌, 세린, 발린, N-아세틸 글리신, 메티오닌, β-알라닌, 아스파르트산 또는 N-메틸 글리신으로부터 선택되는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 소분자 첨가제는 글리신인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 이동상 중의 소분자 첨가제는 글리신, 알라닌, 세린, 발린, N-아세틸 글리신, 메티오닌, β-알라닌, 아스파르트산 또는 N-메틸 글리신으로부터 선택되는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 소분자 첨가제는 글리신인, 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이동상 중의 TFA 농도는 H2O 중의 약 0.05% 내지 0.1% TFA인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 이동상 중의 TFA 농도는 80% ACN 및 20% H2O 중의 약 0.05% TFA 또는 80% ACN 및 20% H2O 중의 약 0.1% TFA를 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부분 환원 절차는 500 ms-3 s의 기간 동안 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 분자를 분해하는 것은 하기를 추가로 포함하는, 방법:
변성 및 알킬화 단계를 수행하여 변성 알킬화 생체분자를 산출하는 것;
상기 변성 알킬화 생체분자에 사전분해 단계를 수행하여 상기 사전분해된 변성 알킬화 생체분자를 산출하는 것; 및
상기 사전분해 단계 이후에 상기 사전분해된 변성 알킬화 생체분자에 분해 단계를 수행하여 샘플을 산출하고 이것을 분리 컬럼과 접촉시키는 것. - 제9항에 있어서, 상기 변성 및 알킬화 단계는 약 5.5 내지 5.9의 pH에서 알킬화제의 존재 하에서 7 내지 9 M 우레아에서 생체분자를 변성시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 변성 및 알킬화 단계를 45 내지 55℃에서 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 알킬화제는 5 내지 15 mM 농도의 N-에틸 말레이미드(NEM)인, 방법.
- 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 알킬화제는 약 0.5 내지 5 mM 농도의 아이오도-아세트아미드(IAM)인, 방법.
- 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성 및 알킬화 단계를 20 내지 40분 동안 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전분해 단계를 수행하는 것은 pH 5 내지 5.6에서 재조합 Lys-C 프로테아제의 존재 하에서 상기 변성 알킬화 생체분자를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전분해 단계를 35 내지 40℃에서 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전분해 단계를 30분 내지 90분 동안 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 Lys-C 프로테아제 대 상기 변성 알킬화 생체분자의 비율은 각각 1:5 내지 1:20인, 방법.
- 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해 단계를 수행하는 것은 pH 5 내지 5.6에서 재조합 Lys-C 프로테아제 및 트립신 프로테아제의 존재 하에서 상기 사전분해된 변성 알킬화 생체분자를 인큐베이션시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제9항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해 단계 동안 재조합 Lys-C 프로테아제 대 상기 사전분해된 변성 알킬화 생체분자의 비율은 각각 약 1:5 내지 1:20인, 방법.
- 제9항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 트립신 프로테아제 대 상기 사전분해된 변성 알킬화 생체분자의 비율은 각각 1:2 내지 1:10인, 방법.
- 제9항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해 단계를 35 내지 40℃에서 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제9항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해 단계를 2 내지 4시간 동안 수행하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분은 하나 이상의 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드를 포함하는, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 하나 이상의 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드 각각은 동시에 질량 분석기에 들어가는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 질량 분석기는 탠덤 질량 분석기이고;
상기 질량 분석기 분석을 수행하는 것은 MS1 스펙트럼 및 MS2 스펙트럼을 얻는 것을 포함하는, 방법. - 제26항에 있어서, 상기 상응하는 환원된 파트너 펩티드로 병렬 반응 모니터링(PRM: parallel reaction monitoring) 포함 목록을 구축하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 신뢰도 스코어링 시스템에 기초한 하나 이상의 디설파이드 펩티드에 대한 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 배정하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 신뢰도 스코어링 시스템은 하기를 추가로 포함하는, 방법:
디설파이드 펩티드의 MS1 질량이 상기 질량 분석기 분석을 통해 식별되는지 여부를 표시하는 것;
상기 디설파이드 펩티드에 상응하는 제1 환원 파트너 펩티드의 MS1 질량이 상기 질량 분석기 분석을 통해 식별되는지 여부를 표시하는 것;
상기 디설파이드 펩티드에 상응하는 제2 환원 파트너 펩티드의 MS1 질량이 상기 질량 분석기 분석을 통해 식별되는지 여부를 표시하는 것;
상기 제1 환원된 파트너 펩티드의 MS2 질량이 미리 결정된 임계값보다 높은 점수로 식별되는지 여부를 표시하는 것;
상기 제2 환원된 파트너 펩티드의 MS2 질량이 상기 미리 결정된 임계값보다 높은 점수로 식별되는지 여부를 표시하는 것;
상기 신뢰도 스코어링 시스템의 표시 단계 각각에 대해, 상기 상응하는 펩티드가 식별되는 단일 지점을 배정하고 상기 상응하는 펩티드가 식별되지 않는 지점을 배정하지 않는 것;
상기 단일 지점을 합산하는 것; 및
상기 합산에 기초하여 상기 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 배정하는 것 - 여기서, 합이 클수록 신뢰도가 높아짐 -. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석기 분석을 수행하는 것은,
상기 생체분자에서 하나 이상의 비천연 디설파이드 결합 각각에 대한 디설파이드 스크램블링(scrambling) 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하며;
상기 디설파이드 스크램블링 백분율은 비천연 디설파이드 결합을 포함하는 펩티드의 평균 피크 면적 대 비천연 디설파이드 결합에 포함된 펩티드의 평균 피크 면적과 비천연 디설파이드 결합에 포함된 시스테인 잔기에 상응하는 천연 디설파이드 결합을 포함하는 2개의 펩티드의 또 다른 평균 피크 면적의 합의 비율인, 방법. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCEP의 농도는 20 μM 내지 80 μM인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 TCEP의 농도는 40 μM인, 방법.
- 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체분자는 단클론성 항체이고;
상기 단클론성 항체는 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합 이소타입인, 방법. - 제33항에 있어서, 상기 단클론성 항체는 재조합 방식으로 생산된, 방법.
- 생체분자에서 하나 이상의 스크램블된 디설파이드 결합을 식별하는 방법으로서,
비환원 조건 하에서 그리고 산성 pH에서 상기 생체분자의 분해를 수행하여 하나 이상의 디설파이드 펩티드를 포함하는 샘플을 산출하는 것;
상기 샘플을 분리 컬럼과 접촉시켜 상기 샘플의 성분을 분리하는 것 - 상기 성분의 분리는 1 내지 2 mM 농도의 글리신의 존재 하에서 수행됨 -;
상기 분리 컬럼을 통한 분리 후에 용리된 샘플 성분을 부분적으로 환원시키는 것; 및
제1 질량 분석기를 통해 하나 이상의 디설파이드 펩티드 및/또는 상응하는 환원된 파트너 펩티드 각각의 MS1 질량을 식별하는 것, 및 제2 질량 분석기를 통해 상기 하나 이상의 디설파이드 펩티드 각각이 아닌 상기 상응하는 환원된 파트너 펩티드만을 표적화함으로써 상기 상응하는 환원된 파트너 펩티드 중 하나 이상의 MS2 질량만을 식별하는 것을 포함하는, 상기 부분적으로 환원된 용리된 샘플 성분 상에서 탠덤 질량 분석기를 통해서 질량 분석기 분석을 수행하는 것을 포함하는, 방법. - 제35항에 있어서, 상기 하나 이상의 디설파이드 펩티드 각각이 아닌 상기 상응하는 환원된 파트너 펩티드만을 표적화하는 것은
상기 상응하는 환원된 파트너 펩티드만으로 병렬 반응 모니터링 포함 목록을 구축하는 것을 추가로 포함하는, 방법. - 제35항 또는 제36항에 있어서,
상기 하나 이상의 디설파이드 펩티드 각각에 대해서 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 배정하는 것을 추가로 포함하는, 방법. - 제37항에 있어서, 상기 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 배정하는 것은, 특정 디설파이드 펩티드 및 상응하는 환원된 파트너 펩티드에 대해서, 식별 가능한 각각의 MS1 질량에 대한 지점 및 미리 결정된 임계값 검출 수준을 초과하는 각각의 식별 가능한 MS2 질량에 대한 지점을 배정하는 것; 및
상기 지점을 합산하여 상기 디설파이드 식별 신뢰도 점수를 얻는 것을 포함하는 디설파이드 신뢰도 스코어링 시스템에 기초하며, 최대 점수는 최고 신뢰도 점수에 상응하는 5인, 방법. - 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석기 분석을 수행하는 것은
상기 생체분자에서 상기 하나 이상의 스크램블된 디설파이드 결합 각각에 대해서 디설파이드 스크램블링 백분율을 결정하는 것을 추가로 포함하며;
상기 디설파이드 스크램블링 백분율은 스크램블된 디설파이드 결합을 포함하는 펩티드의 평균 피크 면적 대 상기 스크램블된 디설파이드 결합을 포함하는 펩티드의 평균 피크 면적과 상기 스크램블된 디설파이드 결합에 포함된 시스테인 잔기에 상응하는 천연 디설파이드 결합을 포함하는 2개의 펩티드의 또 다른 평균 피크 면적의 합의 비율인, 방법. - 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 컬럼을 통한 분리 후에 용리된 샘플 성분을 부분적으로 환원시키는 것은 10 내지 100 μM 농도의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)을 사용한 용리된 샘플 성분의 처리를 통해서 이루어지는, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 TCEP의 농도는 20 내지 80 μM인, 방법.
- 제40항에 있어서, 상기 TCEP의 농도는 40 μM인, 방법.
- 제40항에 있어서, 용리된 샘플 성분을 약 1 내지 3초의 시간 동안 부분적으로 환원시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제35항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 용리된 샘플 성분을 부분적으로 환원시키는 것은 약 1 내지 3%의 환원 효율로 일어나는, 방법.
- 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 컬럼은 역상 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼인, 방법.
- 제35항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 컬럼은 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 컬럼인, 방법.
- 제35항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리 컬럼 상에서의 상기 성분의 분리는 0.05 내지 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)의 존재 하에서 그리고 NH4OH의 부재 하에서 수행되는, 방법.
- 제35항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산성 pH는 5 내지 5.6인, 방법.
- 제35항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해를 수행하는 것은 상기 생체분자를 재조합 Lys-C 프로테아제 및 트립신 프로테아제의 존재 하에서 인큐베이션시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제35항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분해를 수행하기 전에, 상기 생체 분자를 pH 5.5 내지 5.9에서 하나 이상의 알킬화제의 존재 하에서 변성시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제35항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체분자는 단클론성 항체이고; 상기 단클론성 항체는 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합 이소타입인, 방법.
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