KR102447238B1 - N-연결형 및 o-연결형 당펩티드 통합 분석 방법 및 분석장치 - Google Patents

N-연결형 및 o-연결형 당펩티드 통합 분석 방법 및 분석장치 Download PDF

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Abstract

N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법은 분석장치가 시료에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 입력받는 단계, 상기 분석장치가 상기 질량 스펙트럼 데이터에서 추출한 탄뎀 스펙트럼(MS/MS) 데이터를 이용하여 당펩티드 스펙트럼 데이터만을 선별하는 단계, 상기 분석장치가 상기 당펩티드 스펙트럼 데이터에서 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 구분하는 단계 및 상기 분석장치가 상기 N-연결형 당펩티드 또는 상기 O-연결형 당펩티드 각각에 대하여 일정한 후보 피크들에 대한 피크값을 기준으로 당사슬 변형을 확인하는 단계를 포함한다.

Description

N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법 및 분석장치{INTEGRATED ANALYSIS METHOD FOR N-LINKED AND O-LINKED GLYCOPEPTIDES AND ANALYSIS APPARATUS}
이하 설명하는 기술은 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합적으로 정량 분석하는 기법에 관한 것이다.
인간 혈액과 같은 시료에 대한 다양한 분석 방법이 연구되었다. 인간 혈액의 단백질 중 50% 이상이 당단백질로 알려져있다. 당단백질은 당의 다양성 때문에 정성, 정량 분석이 단백체 또는 유전체 분석에 비하여 상대적으로 어렵다. 다만, 고분해능 질량분석기(High Resolution Mass Spectrometer)의 도입으로 당 및 당단백질의 분석이 빠른 속도로 발전하였다.
한국공개특허 제10-2021-0030401호 (2021.03.17)
단백질에 당사슬이 부가되는 당화는 N-연결형 당질화 (N-linked glycosylation) 및 O-연결형 당질화 (O-linked glycosylation)로 구분된다. 종래 당펩티드 분석을 위한 프로그램들은 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 동시에 분석하지 못한다. 나아가 종래 분석 기법은 당펩티드의 당사슬에 발생한 변형에 대하여 세부적인 분석을 제공하지 못한다.
이하 설명하는 기술은 상대적으로 낮은 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드를 효율적으로 동시에 분석하는 기법을 제공하고자 한다.
N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법은 분석장치가 시료에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 입력받는 단계, 상기 분석장치가 상기 질량 스펙트럼 데이터에서 추출한 탄뎀 스펙트럼(MS/MS) 데이터를 이용하여 당펩티드 스펙트럼 데이터만을 선별하는 단계, 상기 분석장치가 상기 당펩티드 스펙트럼 데이터에서 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 구분하는 단계 및 상기 분석장치가 상기 N-연결형 당펩티드 또는 상기 O-연결형 당펩티드 각각에 대하여 일정한 후보 피크들에 대한 피크값을 기준으로 당사슬 변형을 확인하는 단계를 포함한다.
N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석장치는 시료에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 입력받는 입력장치 및 상기 질량 스펙트럼 데이터에서 추출한 탄뎀 스펙트럼(MS/MS) 데이터를 이용하여 당펩티드 스펙트럼 데이터를 선별하고, 상기 당펩티드 스펙트럼 데이터에서 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 구분하고, 상기 N-연결형 당펩티드 또는 상기 O-연결형 당펩티드 각각에 대하여 일정한 후보 피크들에 대한 피크값을 기준으로 당사슬 변형을 확인하는 연산장치를 포함한다.
이하 설명하는 기술은 인간 혈액 내에 당단백질의 당펩티드를 온전한 형태로 정성 및 정량분석 함으로써 질병 관련 표지자(Biomarker)인 당단백질을 효과적으로 발굴할 수 있다.
이하 설명하는 기술은 단백질의 당사슬에 부가되는 대표적인 번역 후 수식(post-translational modification)인 당질화 (glycosylation) 반응, N-/O-연결형 당화 및 당쇄화 위치를 알 수 있으며, 또한 N-/O-연결형 당쇄의 종류 및 곁사슬 수의 증가, 당사슬에 부가되는 다양한 변형 (O-Acetylation, Lactylation, Sulfation, Methylation, Mannose-6-Phosphate) 등 다양한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 N-연결형 및 O-연결형 통합 당펩티드 분석 시스템에 대한 예이다.
도 2는 N-연결형 및 O-연결형 통합 당펩티드 분석의 개략적인 과정에 대한 예이다.
도 3은 N-연결형 및 O-연결형 통합 당펩티드 분석 과정 중 당사슬 변형 정보를 획득하는 과정에 대한 예이다.
도 4는 17개의 옥소늄 이온에 대한 예이다.
도 5는 시알산 점수를 연산한 결과의 예이다.
도 6은 시알산의 0-아세틸화를 결정하는 피크들에 대한 예이다.
도 7은 시알산의 젖산화를 결정하는 피크들에 대한 예이다.
도 8은 시알산의 황산화를 결정하는 피크들에 대한 예이다.
도 9는 GlcNAc의 젖산화를 결정하는 피크들의 예이다.
도 10은 만노스의 인산화를 결정하는 피크들의 예이다.
도 11은 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드를 통합 분석하는 분석장치에 대한 예이다.
이하 설명하는 기술은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 이하 설명하는 기술을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이하 설명하는 기술의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
제1, 제2, A, B 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 해당 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되지는 않으며, 단지 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 이하 설명하는 기술의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 기재된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 기재된 항목들 중의 어느 항목을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어에서 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 해석되지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, "포함한다" 등의 용어는 설명된 특징, 개수, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 의미하는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 개수, 단계 동작 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에 대한 상세한 설명을 하기에 앞서, 본 명세서에서의 구성부들에 대한 구분은 각 구성부가 담당하는 주기능 별로 구분한 것에 불과함을 명확히 하고자 한다. 즉, 이하에서 설명할 2개 이상의 구성부가 하나의 구성부로 합쳐지거나 또는 하나의 구성부가 보다 세분화된 기능별로 2개 이상으로 분화되어 구비될 수도 있다. 그리고 이하에서 설명할 구성부 각각은 자신이 담당하는 주기능 이외에도 다른 구성부가 담당하는 기능 중 일부 또는 전부의 기능을 추가적으로 수행할 수도 있으며, 구성부 각각이 담당하는 주기능 중 일부 기능이 다른 구성부에 의해 전담되어 수행될 수도 있음은 물론이다.
또, 방법 또는 동작 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
이하 설명하는 기술은 샘플에서 N-연결형 당펩티드 및 O-연결형 당펩티드를 분석하는 기법이다.
이하 설명에서 사용하는 용어에 대하여 설명한다. 용어에 대한 별다른 정의가 없는 경우 해당 용어는 해당 분야에서 널리 이해되는 사전적 의미로 해석될 수 있다.
"샘플"은 일반적으로 당펩티드 분석 대상의 혈액(혈청)이다. 나아가, 샘플은 당펩티드 분석 가능한 다른 형태의 시료일 수도 있다. 이하 설명에서 분석 대상은 기본적으로 인간을 의미한다. 나아가 분석 대상은 동물, 식물, 곤충, 효모 등이 될 수도 있다.
"가수분해"는 당단백질로부터 당만을 분리하는 과정을 의미한다. 상기 가수분해 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법이라면 어떠한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 상기 가수분해는 가수분해 효소를 사용하여 수행될 수 있고, 이는 구체적으로, 트립신(trypsin), 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(chymotrypsin) 및 프로테나아제 K(proteinase K)로 구성된 군으로부터 선택된 효소로 수행될 수 있다.
"탄뎀 스펙트럼(MS/MS)"은 전체 질량 스펙트럼(MS) 중에서 관심있는 이온 또는 상대적으로 감도가 높은 이온들을 선택하여 분석한 스펙트럼을 의미한다. 탄뎀 스펙트럼은 CID(collision-induced dissociation) 또는 HCD(Higher-energy C-trap dissociation)-MS/MS 스펙트럼일 수 있다.
이하 분석장치가 스펙트럼 데이터를 분석하여 N-연결형 당펩티드 및 O-연결형 당펩티드를 분석한다고 설명한다. 분석장치는 일정한 데이터 처리가 가능한 다양한 장치로 구현될 수 있다. 예컨대, 분석장치는 PC, 네트워크상의 서버, 스마트 기기, 전용 프로그램이 임베딩된 칩셋 등으로 구현될 수 있다.
도 1은 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통한 분석 시스템(100)에 대한 예이다. N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석은 한 번은 분석 프로세스를 통하여 N-연결형 당펩티드 및 O-연결형 당펩티드를 모두 분석하는 것을 말한다. 도 1은 분석 장치가 컴퓨터 단말(130) 및/또는 서버(140)인 예이다.
고분해능 질량분석기(110)는 시료에 대한 질량 분석을 수행한다. 고분해능 질량분석기(110)는 질량 분석 결과로 디지털 데이터 형태의 질량 스펙트럼 데이터를 생성한다. 고분해능 질량분석기(110)는 생성한 질량 스펙트럼 데이터를 별도의 데이터베이스(DB, 120)에 저장할 수도 있다.
도 1에서 사용자(A)는 컴퓨터 단말(130)을 이용하여 스펙트럼 데이터를 분석하여 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석을 진행할 수 있다. 컴퓨터 단말(130)은 유선 또는 무선 네트워크를 통해 고분해능 질량분석기(110) 또는 DB(120)로부터 스펙트럼 데이터를 입력받을 수 있다. 경우에 따라 컴퓨터 단말(130)은 고분해능 질량분석기(110)와 물리적으로 연결된 장치일 수도 있다. 컴퓨터 단말(130)은 초기 질량 스펙트럼 데이터를 기준으로 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 결과를 산출한다. 컴퓨터 단말(130)은 각 스펙트럼 데이터에서 SNR (Signal to noise ratio)을 계산하고, SNR 값이 일정한 값(예컨대 2) 이하인 경우 분석에 이용할 수 있다. 구체적인 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 과정은 후술한다. 사용자 A는 컴퓨터 단말(130)에서 분석 결과를 확인할 수 있다.
서버(140)는 고분해능 질량분석기(110) 또는 DB(120)로부터 스펙트럼 데이터를 수신할 수 있다. 서버(140)는 각 스펙트럼 데이터에서 SNR을 계산하여, SNR 값이 일정한 값(예컨대 2) 이하인 경우만 분석에 이용할 수 있다. 서버(140)는 초기 질량 스펙트럼 데이터를 기준으로 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 결과를 산출한다. 구체적인 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 과정은 후술한다. 서버(140)는 분석 결과를 사용자 A의 단말에 전송할 수 있다. 사용자 A는 시료에 대한 분석 결과를 확인할 수 있다.
도 2는 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석의 개략적인 과정(200)에 대한 예이다.
분석장치는 초기 질량 스펙트럼 데이터를 입력받는다. 초기 질량 스펙트럼 데이터는 질량 분석기가 시료를 분석하여 생성한 데이터를 말한다. 분석장치는 초기 질량 스펙트럼 데이터에서 MS (질량 스펙트럼) 데이터와 탄뎀 스펙트럼(MS/MS) 데이터를 추출할 수 있다(210). 예컨대, 분석장치는 RAWConverter v1.1(The Scripps Research Institute, 미국)을 이용하여 초기 질량 스펙트럼 데이터에서 ms1(MS) 및 ms2(MS/MS) 파일을 추출할 수 있다.
분석장치는 MS/MS 데이터를 이용하여 당펩티드의 스펙트럼을 선별한다(200). 분석장치는 시료에 있는 펩티드와 당펩티드를 구분하는 값을 설정하여 당펩티드의 스펙트럼만 선별할 수 있다. 분석장치는 각 탄뎀 스펙트럼에 확인된 피크 및 피크의 강도를 확인하고, 이를 이용하여 산출되는 일정한 점수의 분포를 기준으로 펩티드와 당펩티드를 구분하는 값을 결정할 수 있다.
분석장치는 당펩티드 스펙트럼을 구분하는데 사용한 점수를 기준으로 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 구분할 수 있다(230).
분석장치는 MS 데이터를 기준으로 동위원소 분포를 얻고, 이를 사전에 구축한 데이터베이스와 비교하여 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 동정할 수 있다(240).
이후 분석장치는 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드에 대하여 각각 정량분석을 수행할 수 있다(250). 정량 분석은 해당 당펩티드의 양에 대한 정보, 당사슬의 종류, 당사슬에 부가되는 변형 등에 대한 정보를 포함할 수 있다.
도 3은 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 과정 중 당사슬 변형 정보를 획득하는 과정(300)에 대한 예이다. 도 3은 MS/MS 데이터를 이용하여 초기 질량 스펙트럼 데이터에서 N-연결형 당펩티드 및 O-연결형 당펩티드를 구분하여 각각 정량 분석을 수행하는 과정의 예이다. 도 3은 특히 당사슬 변형을 확인하는 과정을 중심으로 설명한다.
분석장치는 먼저 초기 질량 스펙트럼 데이터에서 MS/MS 데이터를 추출한다. 분석장치는 MS/MS 데이터에서 일정한 후보 피크들을 기준으로 아래 MM 점수(MM- score)를 연산할 수 있다(310).
분석장치는 모두 17개의 피크들로 구성된 피크 그룹(Oxonium ion peaks)을 이용하여 각 탄템 스펙트럼에서 MM 점수를 연산한다. 아래 표 1은 피크 그룹들에 대한 예이다. 각 피크 그룹은 질량 대 전하비(m/z)로 정의된다.
이온 번호 Mass (m/z) 설명
1 129.0552 Fucose - H2O
2 138.0555 HexNAc - 2H2O-CH2O
3 145.0500 Hex - H2O
4 147.0657 Fucose
5 163.0606 Hex
6 168.0661 HexNAc - 2H2O
7 186.0766 HexNAc - H2O
8 204.0872 HexNAc
9 274.0927 NeuAC - H2O
290.0870 NeuGC - H2O
10 292.1032 NeuAC
308.0976 NeuGC
11 350.1451 HexNAc+Fucose
12 366.1400 HexNAc+Hex
13 454.1560 NeuAC +Hex
470.1509 NeuGC +Hex
14 528.1928 Hex+HexNAc+Hex
15 657.2354 NeuAC+Hex+HexNAc
673.2309 NeuGC+Hex+HexNAc
16 126.0550 HexNAc - 2H2O - acetyl(42.01058)
17 144.0656 HexNAc - H2O - acetyl(42.01058)
분석장치는 상기 피크 그룹의 각 탄뎀 스펙트럼에서 아래 수학식 1로 표현되는 MM 점수를 연산한다.
Figure 112022027782475-pat00001
Figure 112022027782475-pat00002
수학식 1에서 N은 전체 옥소늄 이온의 개수이다. 즉, N은 17일 수 있다. n은 샘플의 스펙트럼 데이터에서 확인되는 옥소늄 이온의 개수(= 당피크의 수)이다. Ii는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(base peak intensity, BPI)이다. C는 상수값이다. MassError는 실험값과 이론값의 차이를 의미한다. 이론값은 해당 이온에 대한 이론적인 피크 세기를 말한다.
분석장치는 피크들에 대한 MM 점수 분포에 가우시안 피팅(Gaussian fitting)을 적용하여 당펩티드 스펙트럼만을 선별할 수 있다.
분석장치는 MM 점수 분포를 이용하여 선별한 당펩티드 스펙트럼에서 N-연결형 당펩티드 스펙트럼과 O-연결형 당펩티드 스펙트럼을 구분할 수 있다(320). 분석장치는 수학식 1에서 사용한 Oi를 기준으로 특정 대역의 피크에 대한 값을 기준으로 N-연결형 당펩티드 스펙트럼과 O-연결형 당펩티드 스펙트럼을 구분할 수 있다. 분석장치는 아래 수학식 2을 통해 연산되는 값(GGRatio)를 기준으로 N-연결형 당펩티드 스펙트럼과 O-연결형 당펩티드 스펙트럼을 구분할 수 있다.
Figure 112022027782475-pat00003
수학식 2는 괄호안의 값은 특정 질량 대 전하비(m/z)를 말한다. 분석장치는 GGRatio < 3이면 해당 스펙트럼은 O-연결형 당펩티드 스펙트럼이라고 판단한다. 분석장치는 GGRatio ≤ 3이면 해당 스펙트럼은 N-연결형 당펩티드 스펙트럼이라고 판단한다.
이후 분석장치는 N-연결형 당펩티드과 O-연결형 당펩티드에 대하여 각각 정량 분석을 할 수 있다. 도 3은 N-연결형 당펩티드에 대하여 추가적으로 당사슬 변형 정보를 산출하는 과정을 도시한다. O-연결형 당펩티드에 대해서도 유사한 과정으로 당사슬 변형 정보를 산출할 수도 있다.
도 4는 17개의 옥쇼늄 이온에 대한 예이다. 도 3 및 표 1에서 설명한 MM 점수 산출의 기준이 되는 피크 그룹에 해당한다. 글라이칸(glycan)에서 발생할 수 있는 변형(modification)은 O-아세틸화(Acetylation) (42.01002, NeuAc or NeuGc), 젖산화(Lactylation) (71.01276, NeuAc or NeuGc or GalNAc) 및 황산화(Sulfation) (79.95627, NeuAc or NeuGc)이다.
분석장치는 시알산 점수(sialic acid score, SiA-점수)를 기준으로 먼저 시알산이 있는 당펩티드와 시알산이 없는 당펩티드를 구분한다(330). SiA- 점수는 아래 수학식 3과 같이 표현될 수 있다.
Figure 112022027782475-pat00004
SiA- 점수는 시알산 (NeuAc 및/또는 NeuGc) 전체에 대한 피크의 세기의 합에 해당한다. Sialic acidi는 i번째 시알산의 피크 세기를 의미한다.
분석장치는 SiA- 점수를 기준으로 아래 표 2와 같이 당펩티드를 구분할 수 있다. 분석장치는 SiA- 점수 ≥ 15 인경우 시알산이 있는 당펩티드로 판단한다. 분석장치는 SiA- 점수 < 15 인경우 시알산이 없는 당펩티드로 판단할 수 있다. 또는 분석장치는 SiA- 점수 = 0 인경우를 시알산이 없는 당펩티드라고 판단할 수도 있다.
Case SiA-점수 분류
Case1 SiA-점수 < 15 또는 SiA-점수 = 0 시알산 없는 당펩티드
Case2 NeuAc > 15 & NeuGc <15 NeuAC 있는 당펩티드
Case3 NeuAc < 15 & NeuGc >15 NeuGC 있는 당펩티드
Case4 NeuAc > 15 & NeuGc >15 NeuAC 및 NeuGC 있는 당펩티
도 5는 시알산 점수를 연산한 결과의 예이다. 도 5(A)는 시알산 점수 산정의 기준이 되는 피크를 나타낸 예이다. 즉, 시알산 점수는 NeuAc 및 NeuGc에서 나타날 수 있는 다양한 유형 (17개의 옥쇼늄 이온중 시알산 관련 이온) 전체에 대한 점수를 산정하는 것이다. 도 5(B)는 상기 표 2의 경우(Case 1 ~ Case 4)에 해당하는 결과를 나타내는 예이다. 도 5(B)의 세로축은 상대값(relative abundance)이다.
이후 분석장치는 시알산이 없는 당펩티드 또는 시알산이 있는 당펩티드 각각에 대하여 가능한 당사슬 변형을 최종적으로 확인한다. 이를 위하여 분석장치는 각 변형에 대한 변형 점수(Modification score, Mod-점수)를 연산한다(340 또는 350). 분석장치는 가능한 각 변형들에 대하여 Mod-점수를 연산하고, Mod-점수가 임계값 이상이면 특정 변형으로 판단할 수 있다. 예컨대, 분석장치는 특정 변형의 Mod-점수가 10 이상이면 해당 변형으로 판단할 수 있다(340의 yes 또는 350의 yes). 분석장치는 모든 변형에 대한 Mod-점수가 10 미만이면 변형이 없는 당펩티드로 판단할 수 있다(340의 no 또는 350의 no). 이하 각 Mod-점수에 대하여 설명한다.
도 6은 시알산의 0-아세틸화를 결정하는 피크들에 대한 예이다. 분석장치는 아래 수학식 4 및 수학식 5로 표현되는 Mod-점수를 기준으로 시알산의 0-아세틸화를 결정할 수 있다. 수학식 4는 모노(mono) 아세틸화에 대한 식이고, 수학식 5는 디(di) 아세틸화에 대한 식이다. 예컨대, 분석장치는 수학식 4의 Mod-점수가 임계값(예컨대, 10) 이상이면 시알산의 모노 아셀틸화가 있다고 판단할 수 있다.
Figure 112022027782475-pat00005
Figure 112022027782475-pat00006
수학식 4 및 수학식 5에서 N은 예상되는 특정 이온들 전체 개수(도 6의 전체 피크들의 개수)이고, n는 샘플에서 확인되는 이온 개수이고, Imi는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(BPI)이다.
도 7은 시알산의 젖산화를 결정하는 피크들에 대한 예이다. 분석장치는 아래 수학식 6으로 표현되는 Mod-점수를 기준으로 시알산의 젖산화를 결정할 수 있다. 예컨대, 분석장치는 수학식 6의 Mod-점수가 임계값(예컨대, 10) 이상이면 시알산의 젓산화가 있다고 판단할 수 있다.
Figure 112022027782475-pat00007
수학식 6에서 N은 예상되는 특정 이온들 전체 개수(도 7의 전체 피크들의 개수)이고, n는 샘플에서 확인되는 이온 개수이고, Imi는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(BPI)이다.
도 8은 시알산의 황산화를 결정하는 피크들에 대한 예이다. 분석장치는 아래 수학식 7로 표현되는 Mod-점수를 기준으로 시알산의 젖산화를 결정할 수 있다. 예컨대, 분석장치는 수학식 7의 Mod-점수가 임계값(예컨대, 10) 이상이면 시알산의 황산화가 있다고 판단할 수 있다.
Figure 112022027782475-pat00008
수학식 7에서 N은 예상되는 특정 이온들 전체 개수(도 8의 전체 피크들의 개수)이고, n는 샘플에서 확인되는 이온 개수이고, Imi는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(BPI)이다.
도 9는 GlcNAc의 젖산화를 결정하는 피크들의 예이다. 분석장치는 아래 수학식 8로 표현되는 Mod-점수를 기준으로 GlcNAc의 젖산화를 결정할 수 있다. 예컨대, 분석장치는 수학식 8의 Mod-점수가 임계값(예컨대, 10) 이상이면 GlcNAc의 황산화가 있다고 판단할 수 있다.
Figure 112022027782475-pat00009
수학식 8에서 N은 예상되는 특정 이온들 전체 개수(도 9의 전체 피크들의 개수)이고, n는 샘플에서 확인되는 이온 개수이고, Imi는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(BPI)이다.
도 10은 만노스(mannose)의 인산화(Phosphorylation)를 결정하는 피크들의 예이다. 분석장치는 아래 수학식 9로 표현되는 Mod-점수를 기준으로 만노스의 인산화를 결정할 수 있다. 예컨대, 분석장치는 수학식 9의 Mod-점수가 임계값(예컨대, 10) 이상이면 만노스의 인산화가 있다고 판단할 수 있다.
Figure 112022027782475-pat00010
수학식 9에서 N은 예상되는 특정 이온들 전체 개수(도 10의 전체 피크들의 개수)이고, n는 샘플에서 확인되는 이온 개수이고, Imi는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(BPI)이다.
정리하면, 분석장치는 당펩티드의 종류를 구분한 후 시알산 점수(SiA-점수)와 변형 점수(Mod-점수)를 이용하여 아래 표 3과 같이 당사슬의 변형을 분류할 수 있다.
MM 점수 SiA-점수 Mod-점수
당펩티드 유형 with Sialic acids (NeuAc) *without Modification
*with mono-O-Acetylation : #ofSiA
*with di-O-Acetylation : #ofSiA *2
*with mono- and di-O-Acetylation
*with Lactylation : #ofSiA
*with Sulfation : #ofSiA
with Sialic acids (NeuGc *without Modification
*with mono-O-Acetylation
*with di-O-Acetylation
*with mono- and di-O-Acetylation
*with Lactylation
*with Sulfation
without Sialic acids *without Modification
*with GN-Lactylation : #ofGN
도 11은 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드를 통합 분석하는 분석장치에 대한 예이다.
분석장치(400)는 전술한 분석장치(도 1의 130 및 140)에 해당한다. 분석장치(400)는 물리적으로 다양한 형태로 구현될 수 있다. 예컨대, 분석장치(400)는 PC와 같은 컴퓨터 장치, 네트워크의 서버, 데이터 처리 전용 칩셋 등의 형태를 가질 수 있다.
분석장치(400)는 저장장치(410), 메모리(420), 연산장치(430), 인터페이스 장치(440), 통신장치(450) 및 출력장치(460)를 포함할 수 있다.
저장장치(410)는 초기 질량 스펙트럼 데이터에서 N-연결형 당펩티드 및 O-연결형 당펩티드를 분석하는 프로그램을 저장할 수 있다.
저장장치(410)는 당펩티드를 동정하기 위한 이론전인 동위원소의 피크들 및 피크의 상대적 강도값 등을 저장할 수 있다.
저장장치(410)는 분석 결과를 저장할 수 있다.
메모리(420)는 분석장치(400)가 질량 스펙트럼 데이터를 분석하는 과정에서 생성되는 데이터 및 정보 등을 저장할 수 있다.
인터페이스 장치(440)는 외부로부터 일정한 명령 및 데이터를 입력받는 장치이다. 인터페이스 장치(440)는 물리적으로 연결된 입력 장치 또는 외부 저장장치로부터 초기 스펙트럼 데이터를 입력받을 수 있다. 인터페이스 장치(440)는 사용자로부터 별도의 실험적 데이터를 입력받을 수도 있다. 인터페이스 장치(440)는 분석 결과를 외부 객체에 전달할 수도 있다.
통신장치(450)는 유선 또는 무선 네트워크를 통해 일정한 정보를 수신하고 전송하는 구성을 의미한다. 통신장치(450)는 외부 객체로부터 초기 스펙트럼 데이터를 수신할 수 있다. 통신장치(450)는 분석에 필요한 별도의 실험적 데이터를 수신할 수도 있다. 또는 통신장치(450)는 분석 결과를 사용자 단말과 같은 외부 객체에 송신할 수도 있다.
인터페이스 장치(440) 및 통신장치(450)는 사용자 또는 다른 물리적 객체로부터 일정한 데이터를 주고받는 구성이므로, 포괄적으로 입출력장치라고도 명명할 수 있다. 정보 내지 데이터 입력 기능에 한정하면 인터페이스 장치(440) 및 통신장치(450)는 입력장치라고 할 수도 있다.
출력장치(460)는 일정한 정보를 출력하는 장치이다. 출력장치(460)는 데이터 처리 과정에 필요한 인터페이스, 분석 결과, 분석 내용에 대한 시각 자료 등을 출력할 수 있다.
연산 장치(430)는 초기 질량 스펙트럼 데이터에서 MS 데이터 및/또는 MS/MS 데이터를 추출할 수 있다.
연산 장치(430)는 MS/MS 데이터에서 MM 점수를 연산할 수 있다.
연산 장치(430)는 MM 점수의 분포에 대한 가우시안 피팅을 하여 당펩티드 스펙트럼을 선별할 수 있다.
연산 장치(430)는 전술한 GGRatio를 연산하여 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 구분할 수 있다.
연산 장치(430)는 구분한 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드에 대하여 필요한 정량 분석을 각각 수행할 수 있다. 특히, 연산 장치(430)는 당사슬의 변형을 확인하여 정량할 수 있다.
연산 장치(430)는 전술한 SiA-점수를 연산하고, SiA-점수를 기준으로 시알산이 있는 당펩티드와 시알산이 없는 당펩티드를 구분할 수 있다.
이후, 연산 장치(430)는 시알산이 있는 당펩티드 또는 시알산이 없는 당펩티드 각각에 대하여 전술한 Mod-점수를 연산하여 당사슬 변형의 유형을 확인하고, 변형을 정량할 수 있다. 연산 장치(430)는 변형별 Mod-점수를 연산하여 해당 점수가 일정한 임계값 이상인 경우 해당 당펩티드는 해당 당사슬 변형이 있는 것으로 판단할 수 있다. 이 과정은 수학식 4 내지 수학식 9에서 설명한 바와 같다.
연산 장치(430)는 데이터를 처리하고, 일정한 연산을 처리하는 프로세서, AP, 프로그램이 임베디드된 칩과 같은 장치일 수 있다.
또한, 상술한 바와 같은 시료 분석 방법, 당펩티드 분석 방법 내지 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법은 컴퓨터에서 실행될 수 있는 실행가능한 알고리즘을 포함하는 프로그램(또는 어플리케이션)으로 구현될 수 있다. 상기 프로그램은 일시적 또는 비일시적 판독 가능 매체(non-transitory computer readable medium)에 저장되어 제공될 수 있다.
비일시적 판독 가능 매체란 레지스터, 캐쉬, 메모리 등과 같이 짧은 순간 동안 데이터를 저장하는 매체가 아니라 반영구적으로 데이터를 저장하며, 기기에 의해 판독(reading)이 가능한 매체를 의미한다. 구체적으로는, 상술한 다양한 어플리케이션 또는 프로그램들은 CD, DVD, 하드 디스크, 블루레이 디스크, USB, 메모리카드, ROM (read-only memory), PROM (programmable read only memory), EPROM(Erasable PROM, EPROM) 또는 EEPROM(Electrically EPROM) 또는 플래시 메모리 등과 같은 비일시적 판독 가능 매체에 저장되어 제공될 수 있다.
일시적 판독 가능 매체는 스태틱 램(Static RAM，SRAM), 다이내믹 램(Dynamic RAM，DRAM), 싱크로너스 디램 (Synchronous DRAM，SDRAM), 2배속 SDRAM(Double Data Rate SDRAM，DDR SDRAM), 증강형 SDRAM(Enhanced SDRAM，ESDRAM), 동기화 DRAM(Synclink DRAM，SLDRAM) 및 직접 램버스 램(Direct Rambus RAM，DRRAM) 과 같은 다양한 RAM을 의미한다.
본 실시예 및 본 명세서에 첨부된 도면은 전술한 기술에 포함되는 기술적 사상의 일부를 명확하게 나타내고 있는 것에 불과하며, 전술한 기술의 명세서 및 도면에 포함된 기술적 사상의 범위 내에서 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 변형 예와 구체적인 실시례는 모두 전술한 기술의 권리범위에 포함되는 것이 자명하다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 분석장치가 시료에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 입력받는 단계;
    상기 분석장치가 상기 질량 스펙트럼 데이터에서 추출한 탄뎀 스펙트럼(MS/MS) 데이터를 이용하여 당펩티드 스펙트럼 데이터만을 선별하는 단계;
    상기 분석장치가 상기 당펩티드 스펙트럼 데이터에서 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 구분하는 단계; 및
    상기 분석장치가 상기 N-연결형 당펩티드 또는 상기 O-연결형 당펩티드 각각에 대하여 일정한 후보 피크들에 대한 피크값을 기준으로 당사슬 변형을 확인하는 단계를 포함하되,
    상기 분석장치는 당펩티드에서 가능한 모든 당사슬 변형들에 대하여 아래 수학식으로 표현되는 변형 점수를 연산하고, 변형 점수가 임계값 이상인 경우 해당 변형이 있다고 판단하고,
    Figure 112022070333431-pat00033

    여기서, MoDscore는 변형 점수, N은 해당 변형의 판단 기준이 되는 이온 피크 후보들의 전체 개수, n은 샘플의 스펙트럼 데이터에서 확인되는 이온의 개수. Ii는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(base peak intensity, BPI)이고,
    상기 당사슬 변형이 시알산의 0-아세틸화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 NeuAC에 대하여 274, 282, 316, 334, 358, 376, 454, 496, 538, 657, 699 및 741이고, NeuGC에 대하여 290, 308, 332, 350, 374, 392, 470, 512, 554, 673, 715 및 757이고,
    상기 당사슬 변형이 시알산의 젖산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 NeuAC에 대하여 274, 292, 347, 365, 454, 527, 657 및 730이고, NeuGC에 대하여 290, 308, 363, 381, 470, 543, 673 및 746이고,
    상기 당사슬 변형이 시알산의 황산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 NeuAC에 대하여 274, 292, 354, 372, 454, 534, 657 및 737이고, NeuGC에 대하여 290, 308, 370, 388, 470, 550, 673 및 753이고,
    상기 당사슬 변형이 GlcNAc의 젖산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 138, 211, 168, 241, 186, 259, 204, 277, 366, 439, 528 및 601이고,
    상기 당사슬 변형이 만노스의 인산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 145, 225, 163, 243, 528 및 608인 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분석장치는 복수의 옥소늄 이온 피크들(Oxonium ion peaks) 각각에 대하여 아래 수식으로 표현되는 점수를 산출하고, 점수 분포에 대한 가우시안 피팅을 하여 상기 스펙트럼 데이터를 선별하는 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법.
    Figure 112022027782475-pat00011
    ,
    Figure 112022027782475-pat00012

    (N은 상기 복수
    의 옥소늄 이온 피크들의 전체 개수, n은 샘플의 스펙트럼 데이터에서 확인되는 옥소늄 이온의 개수. Ii는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(base peak intensity, BPI), C는 상수값임)
  3. 제2항에 있어서,
    상기 복수의 옥쇼늄 이온 피크들은 아래 표에 해당하는 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법.
    Figure 112022027782475-pat00013
  4. 제1항에 있어서,
    상기 분석장치가 아래 수식으로 산출되는 값이 3 미만인 경우 현재 당펩티드 스펙트로 데이터는 N-연결형 당펩티드로 판단하고, 상기 값이 3이상인 경우 O-연결형 당펩티드로 판단하는 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석 방법.
    Figure 112022027782475-pat00014
    ,
    Figure 112022027782475-pat00015

    (138, 168, 126 및 144는 특정 피크에 대한 질량 대 전하비(m/z)를 나타내고, Ii는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(base peak intensity, BPI)이고, C는 상수값임)
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 시료에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 입력받는 입력장치; 및
    상기 질량 스펙트럼 데이터에서 추출한 탄뎀 스펙트럼(MS/MS) 데이터를 이용하여 당펩티드 스펙트럼 데이터를 선별하고, 상기 당펩티드 스펙트럼 데이터에서 N-연결형 당펩티드와 O-연결형 당펩티드를 구분하고, 상기 N-연결형 당펩티드 또는 상기 O-연결형 당펩티드 각각에 대하여 일정한 후보 피크들에 대한 피크값을 기준으로 당사슬 변형을 확인하는 연산장치를 포함하되,
    상기 연산장치는 당펩티드에서 가능한 모든 당사슬 변형들에 대하여 아래 수학식으로 표현되는 변형 점수를 연산하고, 변형 점수가 임계값 이상인 경우 해당 변형이 있다고 판단하고,
    Figure 112022070333431-pat00034

    여기서, MoDscore는 변형 점수, N은 해당 변형의 판단 기준이 되는 이온 피크 후보들의 전체 개수, n은 샘플의 스펙트럼 데이터에서 확인되는 이온의 개수. Ii는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(base peak intensity, BPI)이고,
    상기 당사슬 변형이 시알산의 0-아세틸화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 NeuAC에 대하여 274, 282, 316, 334, 358, 376, 454, 496, 538, 657, 699 및 741이고, NeuGC에 대하여 290, 308, 332, 350, 374, 392, 470, 512, 554, 673, 715 및 757이고,
    상기 당사슬 변형이 시알산의 젖산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 NeuAC에 대하여 274, 292, 347, 365, 454, 527, 657 및 730이고, NeuGC에 대하여 290, 308, 363, 381, 470, 543, 673 및 746이고,
    상기 당사슬 변형이 시알산의 황산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 NeuAC에 대하여 274, 292, 354, 372, 454, 534, 657 및 737이고, NeuGC에 대하여 290, 308, 370, 388, 470, 550, 673 및 753이고,
    상기 당사슬 변형이 GlcNAc의 젖산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 138, 211, 168, 241, 186, 259, 204, 277, 366, 439, 528 및 601이고,
    상기 당사슬 변형이 만노스의 인산화인 경우, 상기 이온 피크 후보들의 질량 대 전하비(m/z)는 145, 225, 163, 243, 528 및 608인 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석장치.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 연산장치는 복수의 옥소늄 이온 피크들(Oxonium ion peaks) 각각에 대하여 아래 수식으로 표현되는 점수를 산출하고, 점수 분포에 대한 가우시안 피팅을 하여 상기 스펙트럼 데이터를 선별하는 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석장치.
    Figure 112022027782475-pat00017
    ,
    Figure 112022027782475-pat00018

    (N은 상기 복수의 옥소늄 이온 피크들의 전체 개수, n은 샘플의 스펙트럼 데이터에서 확인되는 옥소늄 이온의 개수. Ii는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(base peak intensity, BPI), C는 상수값임)
  9. 제7항에 있어서,
    상기 연산장치는 아래 수식으로 산출되는 값이 3 미만인 경우 현재 당펩티드 스펙트로 데이터는 N-연결형 당펩티드로 판단하고, 상기 값이 3이상인 경우 O-연결형 당펩티드로 판단하는 N-연결형 및 O-연결형 당펩티드 통합 분석장치.
    Figure 112022027782475-pat00019
    ,
    Figure 112022027782475-pat00020

    (138, 168, 126 및 144는 특정 피크에 대한 질량 대 전하비(m/z)를 나타내고, Ii는 관찰된 i번째 피크의 강도이고, Imax는 기초 피크 세기(base peak intensity, BPI)이고, C는 상수값임)
  10. 삭제
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