KR20210030401A - 글리코실화 펩타이드의 검출 및 정량화 - Google Patents

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아브라함 제트. 로젠버그
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리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
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Abstract

글리코펩타이드의 정제 및/또는 분리 및 이의 정량화 방법. 상기 방법은 글리코펩타이드가 친수성 농축 기재에 결합하도록 허용하는 조건 하에 글리코펩타이드를 포함하는 샘플을 친수성 농축 기재에 접촉시키는 것을 포함한다. 글리코펩타이드는 수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 아세토니트릴(ACN)을 사용하여 친수성 농축 기재로부터 용리되어 농축된 글리코펩타이드 샘플을 생성하고, 이는 특정 글리코펩타이드를 식별하기 위해 분석을 거칠 수 있다.

Description

글리코실화 펩타이드의 검출 및 정량화
본 발명은 생체의약품에 관한 것으로, 치료용 항체 및 이의 단편과 같은 단백질의 생체 내 번역 후 글리코실화의 검출 및 정량화에 관한 것이다.
치료용 단일클론 항체(mAb)는 번역 후 변형(post-translational modification, PTM)으로부터 기인하는 변이체를 포함하여 많은 생성물 변이체가 있는 포유동물 세포에서 생성되는 이종 분자이다. N-연결 글리코실화는 치료용 항체에서 주요 PTM이다. 개별 글리코형의 N-연결 글리칸 구조의 특징분석 및 정량화는 의약품의 품질을 정의하고, 로트 간 일관성을 입증하고, 제조 공정의 제어를 보장하기 위해 규제 기관에 의해 요구된다. 전통적으로, 항체 내의 N-연결 글리칸은 항체로부터 글리칸이 효소적으로 방출된 다음 형광 시약으로 라벨링하여 정량화된다. 대안적으로, 글리코실화는 항체의 트립신 분해로부터 생성된 글리코펩타이드 분석에 의해 펩타이드 수준에서 특징분석될 수 있다. 그러나, 이종 글리코형을 보유하는 글리코펩타이드는 흔히 펩타이드 맵핑에 전통적으로 사용되는 역상 기반 액체 크로마토그래피(reverse phase-based liquid chromatography, RPLC)에 의해 잘 분리되지 않는다. 또한, 온라인 질량 분석법(MS) 유도된 글리코펩타이드의 당 사슬의 소스 내 단편화는 절단된 글리코형 인공산물을 생성할 수 있고, 이는 MS를 사용하여 상이한 글리코형의 상대적인 풍부함의 정확한 정량화와 타협한다.
발명의 간단한 요약
한 양태에서, 본 발명은 글리코펩타이드의 정제 및/또는 분리 방법을 제공하고, 여기서 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 글리코펩타이드가 친수성 농축 기재에 결합하도록 허용하는 조건 하에서 글리코펩타이드를 포함하는 샘플을 친수성 농축 기재에 접촉시키는 단계; (b) 친수성 농축 기재를 세척하여 친수성 농축 기재로부터 비-글리코펩타이드 오염물을 제거하는 단계; 및 (c) 수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 아세토니트릴(ACN)로 친수성 농축 기재로부터 글리코펩타이드를 용리하여, 농축된 글리코펩타이드 샘플을 생성하는 단계. 선택적으로, 상기 방법은 농축된 글리코펩타이드 샘플을 분리 컬럼에 적용하고 글리코펩타이드를 분리 컬럼으로부터 용리시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 고체상 추출(solid phase extraction, SPE) 크로마토그래피 기재를 포함한다.
일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 실리카 기반 아미노프로필 흡착제 물질을 포함한다.
일부 구체예에서, 수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 ACN은 물에서 약 100-400 mM 암모늄 포르메이트 및 약 2.5% 내지 약 10% ACN을 포함한다.
일부 구체예에서, 암모늄 포르메이트 ACN 용액은 물에서 200 mM 암모늄 포르메이트 및 5% ACN을 포함한다.
일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 나머지 물과 함께 부피로 0.5% 내지 약 5% 포름산 및 부피로 약 85% 내지 약 95% ACN을 포함하는 포름산 및 ACN 수용액으로 세척되어 비-글리코펩타이드 오염물을 제거한다.
일부 구체예에서, 포름산 및 ACN 수용액은 부피로 1% 포름산, 9% H2O, 90% ACN을 포함한다.
일부 구체예에서, 분리 컬럼은 친수성 상호작용(hydrophilic interaction, HILIC) 컬럼을 포함한다.
일부 구체예에서, 분리 컬럼으로부터의 글리코펩타이드 용리는 글리코펩타이드를 하나 이상의 분획으로 분리하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 글리코펩타이드를 하나 이상의 분획으로 분리하는 것은 이동상 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 이동상 구배는 10 mM 암모늄 포르메이트, pH 4.5 내지 10 mM 암모늄 포르메이트 포함 90% ACN, pH 4.5이다.
일부 구체예에서, 이동상 구배는 H2O 중의 0.05% TFA 또는 ACN 중의 0.045% TFA이다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 분획 중 하나 이상에 존재하는 글리코펩타이드 식별을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 분획 중 하나 이상에 존재하는 글리코펩타이드와 관련된 글리칸 식별을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 글리칸은 N-글리칸을 포함한다.
일부 구체예에서, 글리코펩타이드는 단일클론 항체로부터 수득된다.
일부 구체예에서, 단일클론 항체는 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합된 아이소타입이다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 단일클론 항체를 프로테이스로 분해하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 프로테이스는 트립신을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 용리된 글리코펩타이드에 대해 질량 분석을 수행하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 용리된 글리코펩타이드의 글리코펩타이드 수준에서의 글리코실화 프로파일링을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 친수성 농축 기재를 수용액 중의 아세토니트릴(ACN)로 예비 세척하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 글리코펩타이드를 포함하는 샘플을 친수성 농축 기재와 접촉시키기 전에 수용액 중의 ACN에 희석하는 것을 추가로 포함한다.
도 1은 질량 분석법과 결합된 액체 크로마토그래피(LC/MS)에 의한 글리코펩타이드 정량화의 현재 표준 방법을 도시하는 개략적 워크-플로우 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 방출된 글리칸의 정량화와 비교하여; 즉, 하나는 글리코펩타이드의 검출에 기초하고 다른 하나는 방출된 글리칸의 검출에 기초하여 도 1의 워크-플로우에 나타난 글리코펩타이드 정량화 방법의 결과를 나타내는 표를 나타낸다.
도 3은 글리코펩타이드에 의한 글리코형 정량화와 방출된 글리칸 방법 간(도 2 참조)의 불일치가 절단된 글리칸 인공산물(즉 G0F-GlcNAc 및 G1F-GlcNAc)의 증가 및 주요 글리칸(즉 G0F 및 G1F)의 감소를 야기하는, 글리코펩타이드 분석에서 MS에 의한 당 뼈대의 소스 내 단편화로 인한 것임을 보여주는 질량 스펙트럼을 나타낸다. 방출된 글리칸 방법은 MS 신호가 아닌 방출된 글리칸에 결합된 표지의 형광에 의해 글리코형을 정량화한다.
도 4는 본원에 개시된 글리코펩타이드 정량화 방법에 대한 워크-플로우 다이어그램을 나타낸다.
도 5는 두 가지 상이한 방법에 의해 트립신 분해로부터 수득된 mAb1 펩타이트 분리의 결과를 나타내는 일련의 mAb1 펩타이드의 HILIC-UV 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 방법 #2가 더 우수한 분리, 더 날카로운 피크, 및 더 큰 S/N 비율을 가짐을 보여주는 도 5에 나타난 추적의 글리코펩타이드 부분의 클로즈업을 나타낸다.
도 7은 글리코펩타이드를 확대한 mAb1 글리코펩타이드의 일련의 HILIC-TIC 크로마토그램을 나타낸다. 나타난 바와 같이, 방법 #2는 더 큰 MS 신호의 S/N 비율을 가졌다.
도 8A 및 8B는 mAb1 글리코펩타이드(M2+ 이온)의 MS1 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 HILIC 컬럼에서의 글리코펩타이드 분리에 의한 글리코형 정량화와 방출된 글리칸 분석의 비교를 나타내는 일련의 추적 및 표이다.
도 10은 펩타이드 분해물 건조가 글리코펩타이드 농축에 도움을 줄 수 있지만 UV 신호 및 글리칸의 상대 %PA에 영향을 미치지 않음을 보여주는 일련의 추적 및 표를 나타낸다.
도 11은 물 및 ACN 각각에서의 0.05% 및 0.045% TFA를 사용하여 이동상 제조를 단순화하고 피크 적분을 개선하기 위해 이루어진 변경을 도시하는 일련의 추적을 나타낸다 (RP-LC 펩타이드 맵핑 이동상).
도 12A, 12B, 12C 및 12D는 이동상 변화가 글리코펩타이드(M2+ 이온)의 MS 신호에 영향을 미치지 않음을 보여주는 일련의 질량 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 13은 80% ACN에 희석된 mAb1 글리코펩타이드의 용액 안정성을 보여주는 일련의 추적을 나타낸다.
도 14는 미스 컷 글리코펩타이드가 있는 분해물이 UV에 의한 글리코펩타이드의 정량화를 복잡하게 함을 보여주는 일련의 추적을 나타낸다.
도 15는 온라인 MS 데이터로써 EIC가 글리코형 정량화를 돕기 위해 각각의 피크에서 미스 컷 글리코펩타이드의 백분율을 찾기 위해 사용될 수 있음을 보여주는 일련의 추적 및 표를 나타낸다.
도 16은 트립신을 사용한 mAb2의 재분해가 글리코형 정량화를 돕기 위해 미스 컷 글리코펩타이드를 제거함을 보여주는 일련의 추적 및 표를 나타낸다.
도 17은 암모늄 포르메이트가 HILIC SPE로부터의 글리코펩타이드 용리를 현저히 향상시켰음을 보여주는 일련의 추적을 나타낸다.
도 18은 건조 또는 SPE 세척/건조가 mAb1 글리코펩타이드 정량화에 영향을 미치지 않음을 보여주는 일련의 추적 및 표를 나타낸다.
도 19는 글리코펩타이드 및 방출된 글리칸 분석에 의한 유사한 mAb3 글리코형 정량화를 보여주는 일련의 추적 및 표를 나타낸다.
도 20A 및 20B는 글리코펩타이드 및 방출된 글리칸 분석에 의해 환원 및 비-환원 mAb3 트립신 분해를 사용하는 유사한 글리코형 정량화를 보여주는 일련의 추적 및 표를 나타낸다.
도 21은 푸코실화 유무에 따른 IgG1 및 IgG4 글리코펩타이드의 분리의 비교를 도시하는 일련의 추적을 나타낸다.
도 22는 본원에 개시된 방법을 포함하는 글리코펩타이드 정량화 방법을 도시하는 개략적 워크-플로우 다이어그램을 나타낸다.
본 발명이 설명되기 전에, 방법 및 조건이 달라질 수 있기 때문에 본 발명이 설명된 특정 방법 및 실험 조건에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본 발명에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하려는 목적을 위한 것이며, 제한하려는 의도가 아님을 또한 이해해야 한다. 임의의 구체예 또는 구체예의 특징은 서로 결합될 수 있고, 그러한 조합은 본 발명의 범위 내에 명시적으로 포함된다.
달리 정의되지 아는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 용어 "약"은, 특정한 인용된 수치 값과 관련하여 사용될 때, 상기 값이 인용된 값으로부터 1% 이하만큼 변할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용된 표현 "약 100"은 99 및 101 그리고 그 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등을 포함한다)
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 방법 및 물질이 이제 설명된다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 간행물은 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본원에서 사용된 약어
PTM: 번역 후 변형
RP-LC-MS/MS: 역상 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법
mAb: 단일클론 항체
IgG: 면역글로불린 G
LC: 경쇄
HC: 중쇄
MS: 질량 분석법
SPE: 고체상 추출
HILIC: 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피
UV: 자외선
TFA: 트리플루오로아세트산
ACN: 아세토니트릴
정의
본원에서 사용된 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 서로 연결된 두 개의 중쇄(H) 및 두 개의 경쇄(L)인 네 개의 폴리펩타이드 사슬 (즉, "전체 항체 분자"), 그뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어 IgM) 또는 이의 항원-결합 단편으로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭하도록 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "VH") 및 중쇄 불변 영역(도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성됨)으로 구성된다. 다양한 구체예에서, 중쇄는 IgG 아이소타입일 수 있다. 일부 경우에, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 중쇄는 아이소타입 IgG1 또는 IgG4이고, 선택적으로 아이소타입 IgG1/IgG2 또는 IgG4/IgG2의 키메라 힌지 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR 또는 "VL") 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(framework region, FR)으로 명명되는 더 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로 명명되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 다음 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성된다. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화 및 비-글리코실화 면역글로불린 모두에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질 주입된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 항체 구조에 대한 검토에 대해, Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003); 및 M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983)을 참조하라.
용어 항체는 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함하는 "이중특이적 항체"를 또한 포함한다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄 및 여섯 개의 CDR을 포함하는 이중특이적 항체의 절반은 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하고, 항체의 다른 절반은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 동일한 항원이지만, 상이한 에피토프 또는 비-중첩 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체의 두 반쪽은 이중 특이성을 유지하면서 동일한 경쇄를 갖는다. 이중특이적 항체는 미국 특허 공개공보 제2010/0331527호(2010년 12월 30일)에 일반적으로 설명된다.
용어 항체 (또는 "항체 단편")의 "항원-결합 부분"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 합성 링커에 의해 결합되어, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 사슬을 형성하는, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH로 구성된 scFv를 포함한다. 다른 형태의 단일 사슬 항체, 예컨대 디아바디(diabody)가 또한 용어 "항체"에 포함된다 (예를 들어, Holliger et at. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448; 및 Poljak et at. (1994) 2 Structure 1121-1123 참조).
더욱이, 항체 및 이의 항원-결합 단편은 당해 분야에서 일반적으로 공지인 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다 (Sambrook et al., 1989 참조).
용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 mAb는 예를 들어 CDR 및 특히 CDR3에서 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 위치-특이적 돌연변이 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 유도된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종(예를 들어, 마우스)의 생식계열로부터 유래한 CDR 서열이 인간 FR 서열에 그래프트된 mAb를 포함하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 용어는 비-인간 포유동물에서 또는 비-인간 포유동물의 세포에서 재조합으로 생성된 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상으로부터 단리되거나 인간 대상에서 생성된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "글리코펩타이드/당단백질"은 합성 동안 또는 후 공유적으로 결합된 탄수화물 또는 글리칸으로 변성된 펩타이드/단백질이다. 특정 구체예에서, 글리코펩타이드는 단일클론 항체로부터, 예를 들어, 단일클론 항체의 프로테이스 분해로부터 수득된다.
본원에서 사용된 용어 "글리칸"은 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal), 만노스(Man), 푸코스(Fuc), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸뉴라민산 (NeuNAc)을 일반적으로 포함하는 하나 이상의 당 단위를 포함하는 화합물이다 (Frank Kjeldsen, et al. Anal. Chem. 2003, 75, 2355-2361). 단일클론 항체와 같은 당단백질의 글리칸 모이어티는 이의 기능 또는 세포 위치 식별을 위한 중요한 특질이다. 예를 들어, 특이적 단일클론 항체는 특이적 글리칸 모이어티로 변성된다.
용어 "친수성 상호작용 크로마토그래피" 또는 HILIC는 친수성 화합물이 소수성 화합물보다 더 오래 유지되는, 친수성 고정상 및 소수성 유기 이동상을 사용하는 과정을 포함하도록 의도된다. 특정 구체예에서, 상기 과정은 수-혼화성 용매 이동상을 사용한다.
본원에서 사용된 용어 "샘플"은 예를 들어, 분리, 분석, 추출, 농축 또는 프로파일링을 포함하는 본 발명의 방법에 따라 조작을 거치는 적어도 하나의 분석물 분자, 예를 들어, 단일클론 항체로부터 수득된 것과 같은 글리코펩타이드를 포함하는 분자의 혼합물을 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "분석(analysis)" 또는 "분석(analyzing)"은 상호 교환적으로 사용되고 관심 분자(예를 들어, 당단백질)를 분리, 검출, 단리, 정제, 가용화, 검출 및/또는 특징분석하는 임의의 다양한 방법을 지칭한다. 예는 고체상 추출, 고체상 마이크로 추출, 전기영동, 질량 분석법, 예를 들어, SPE HILIC, MALDI-MS 또는 ESI, 액체 크로마토그래피, 예를 들어, 고성능, 예를 들어, 역상, 정상, 또는 크기 배제, 이온 쌍 액체 크로마토그래피, 액체-액체 추출, 예를 들어, 가속 유체 추출, 초임계 유체 추출, 마이크로파-보조 추출, 막 추출, 속슬렛 추출, 침전, 정화, 전기화학적 검출, 염색, 원소 분석, 에드문드 분해, 핵자기 공명, 적외선 분석, 유동 주입 분석, 모세관 전기크로마토그래피, 자외선 검출, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용된 용어 "프로파일링"은 샘플 중 글리코펩타이드의 함량, 조성, 또는 특징 비율을 제공하기 위해 조합으로 사용되는 임의의 다양한 분석 방법을 지칭한다.
본원에서 사용된 "친수성 농축 기재"은 결합을 허용하는 조건, 예를 들어 pH, 이온 강도 등 하에 친수성 물질에 선호적으로 결합하는 크로마토그래피 물질이다. 일부 구체예에서, 친수성 농축 기재가 SPE를 위해 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "크로마토그래피 표면"은 샘플 또는 분석물에 노출되는 표면을 포함한다. 크로마토그래피 표면은 화학적으로 변성, 관능화 또는 활성화될 수 있거나 미세구조, 예를 들어 기공을 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 크로마토그래피 표면은 소수성, 친수성 (극성) 또는 이온성일 수 있다. 다른 구체예에서, 크로마토그래피 표면은 완전 다공성, 표면 다공성 또는 비-다공성이다.
본원에서 사용된 용어 "크로마토그래피 코어"는 입자, 모노리스 또는 본 발명의 물질의 내부 부분을 형성하는 또 다른 적합한 구조 형태의, 실리카와 같은 유기 물질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 크로마토그래피 물질을 포함한다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 코어의 표면은 크로마토그래피 표면을 나타내거나, 본원에 정의된 바와 같이 크로마토그래피 표면에 의해 둘러싸인 물질을 나타낸다. 크로마토그래피 표면 물질은 이산적 또는 별개의 전이가 인식될 수 있는 방식으로 크로마토그래피 코어에 배치 또는 결합될 수 있거나, 크로마토그래피 코어의 표면과 블렌딩되는 방식으로 크로마토그래피 코어에 결합될 수 있어 물질의 구배가 발생하고 별개의 내부 코어 표면이 없다. 특정 양태에서, 크로마토그래피 표면 물질은 크로마토그래피 코어의 물질과 동일하거나 상이할 수 있고, 기공 부피, 표면적, 평균 기공 직경, 탄소 함량 또는 가수분해 pH 안정성을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 크로마토그래피 코어와 상이한 물리적 또는 생리화학적 특성을 나타낼 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "친수성"은 물에 대한 친화성, 유인성, 흡착성 또는 흡수성을 갖는 것을 설명한다.
본원에서 사용된 용어 "소수성"은 물에 대한 친화성 결여, 반발성, 또는 물 흡착 또는 흡수 실패를 설명한다.
"고체상 추출" 또는 "SPE"는 정량 화학 분석, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 또는 기체 크로마토그래피(GC)가 흔히 함께 사용되는 크로마토그래피 기술이다. SPE의 목적은 원하지 않는 오염물을 함유하는 복합 샘플 매트릭스로부터 표적 분석물을 단리하는 것이다. 단리된 표적 분석물은 정량 분석과 호환성인 용액에서 회수된다. 이러한 표적 화합물을 함유하는 최종 용액은 분석을 위해 직접 사용되거나 표적 화합물을 추가로 농축할 목적을 위해 증발되고 더 작은 부피의 또 다른 용액으로 재구성되어, 검출 및 측정을 더욱 용이하게 할 수 있다.
본원에 사용된 "크로마토그래피"는 혼합물, 예를 들어 글리코펩타이드 함유 혼합물 분리 과정을 지칭한다. 혼합물을 고정상에 통과시키는 것을 포함하는데, 이는 혼합물 중의 다른 분자로부터 관심 분자를 분리하고 하나 이상의 관심 분자를 단리시킨다. 크로마토그래피 분리 방법에 예는 모세관 작용 크로마토그래피, 예컨대 종이 크로마토그래피, 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC), 컬럼 크로마토그래피, 고속 단백질 액체 크로마토그래피(fast protein liquid chromatography, FPLC), 나노-역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 예컨대 겔 여과 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC), 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(hydrophilic interaction liquid chromatography, HILIC), 및 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reverse phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC) 등을 포함한다.
본원에서 사용된 "접촉"은 용액 또는 고체상에서 적어도 두 가지의 물질을 모으는 것, 예를 들어 크로마토그래피 물질의 고정상을 샘플과 접촉시키는 것을 포함한다.
일반적 설명
단일클론 항체(MAb)는 표적 항원에 대한 이러한 약물의 특이성으로 인해, 예를 들어, 면역 체계를 활성화시켜 종양 세포를 죽이고, 증식하기 위한 종양 세포의 신호 전달을 차단하고, 약물을 종양 세포에 또는 방사선 표적으로서 전달함에 의해, 암 및 기타 만성 질환을 위한 효과적인 생체의약품으로 부상했다. 면역글로불린의 글리코실화는 생리화학적 특성 및 보체 결합 및 활성화와 같은 세포 매개 효과인자 기능에 영향을 미친다. 이러한 생물학적 기능은 N-연결 올리고당의 존재 또는 부재뿐만 아니라 올리고당의 특정 구조에 의존할 수 있다. 또한, 항체의 N-글리코실화가 생체의약품의 제조에서 일반적으로 특징분석된다. 특히, 단일클론 항체의 글리칸 프로파일은 효능, 면역원성, 및 제조 조건의 척도가 될 수 있기 때문에 때때로 중요한 품질 속성으로 정의된다. 그러므로 글리칸 분석을 위한 접근이 상세한 특징분석을 용이하게 하기 위한 높은 민감성을 나타내는 것이 중요하다. 치료용 단일클론 항체의 제조에서, 위치-특이적 N-글리코실화 및 N-글리칸 위치 점유의 평가가 중요하다. 따라서, 단일클론 항체로부터 수득된 글리코펩타이드를 분리하기 위한 고효율/고분해능 방법이 필요하다. 개시된 발명은 요구를 충족시킨다.
글리코실화 및 비-글리코실화 트립신 펩타이드를 분리하기 위해 고체상 추출(SPE)이 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피(HILIC) 컬럼과 결합되는 글리코펩타이드 분석 및 정량화를 위한 신규한 방법이 본원에 개시된다. 다양한 구체예에서, 이러한 분리 기술은 글리칸 구조를 설명하기 위해 자외선(UV) 검출 및 온라인 질량 분석법(MS) 검출과 결합된다. 일부 방법에서, 글리칸 특징분석은 펩타이드 사슬로부터글리칸이 방출된 다음 펩타이드로부터 이들을 별도로 분석하는 것에 의존한다 (예를 들어, 도 1-3 참조). 글리칸은 UV 검출에 적합하지 않기 때문에, 방출된 글리칸은 흔히 형광 검출 검출을 위해 형광단 태그, 예를 들어 안트라닐아미드, 안트라닐산 또는 2-아미노피리딘 또는 MS 검출을 가능하게 하는 상당한 염기성을 갖는 분자, 예를 들어 프로카인아미드로 표지된다. 그러나, 글리칸 분석에 대한 이러한 접근법은 글리코실화에 대한 전체적인 평가만을 제공한다. 특히, 방출 절차에 의존하는 이러한 워크플로우로 인해 글리칸에 대한 위치-특이적 정보가 손실된다. 대조적으로, 개시된 방법에서, 단리된 글리코펩타이드는 동일한 크로마토그래피 분리 내에서 글리코형 구조의 차이에 기반하여 분리된다. 또한, HILIC 컬럼을 사용하여 달성된 여러 상이한 글리칸 이성질체가 있는 글리코펩타이드의 분리는 표준 RP-LC 방법을 사용하여 관찰되지 않았다 (예를 들어, 도 1-3 참조). 희석, 진공 건조 및/또는 고체상 추출(SPE)을 포함하는 HILIC를 위한 샘플 제조 조건 최적화에 의해, 여러 상이한 유형의 펩타이드 맵핑 샘플 제조로부터 글리코펩타이드의 분석을 가능하게 하는 워크플로우가 개발되었다 (예를 들어, 도 22 참조). 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 상기 방법 및 워크플로우가 온라인 MS 검출과 결합된 UV 검출을 사용하여 펩타이드 수준에서 항체에서의 개별 글리코형의 상대적 수준의 식별 및 정량화에 적합함을 입증했다 (예를 들어, 도 4 및 22 참조).
본원에 개시된 방법은 글리코펩타이드, 예를 들어, 단일클론 항체, 예컨대 하나 이상의 프로테이스로 분해된 항체로부터 수득된 글리코펩타이드의 정제 및/또는 분리 및/또는 분석을 포함한다. 개시된 방법은 개선된 분리 및 분석 결과 및 항체 단편에 여전히 공유적으로 연결되어 있는 동안 글리칸을 연구할 능력을 제공한다. 이러한 글리코형의 펩타이드-수준 분석은, 단일 샘플이 역상 펩타이드 맵핑, 예를 들어 트립신 분해물, 및 HILIC 기반 글리코펩타이드 맵핑을 위해 사용될 수 있다는 점에서, 생체의약품 특징분석에 이점을 또한 제공한다. 또한, 글리칸과 펩타이드/단백질 사이의 연결 보존은 글리코펩타이드의 단백질 성분에 기초한 UV 및 MS 검출을 용이하게 하고, 예를 들어, 유리된 글리칸 표지의 필요를 제거한다.
특정 구체예에서, 상기 방법은 글리코펩타이드가 친수성 농축 기재에 결합하도록 허용하고 및/또는 야기하는 조건 하에 글리코펩타이드를 포함하는 샘플을 친수성 농축 기재와 접촉시키는 것을 포함한다. 샘플이 친수성 농축 기재에 로딩되면, 일련의 맞춤형 세척 및 용리 용액이 친수성 농축 기재를 통과하여 글리코펩타이드로부터 오염물을 분리하고, 이후 추가의 분석을 위해 글리코펩타이드를 수집할 수 있다. 일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 샘플로부터 비-글리코펩타이드 오염물을 제거하기 위해 세척된다. 따라서, 글리코펩타이드가 친수성 농축 기재에서, 예컨대 친수성 농축 기재의 크로마토그래피 표면에서 상당한 정도까지 농축된다. 특정 구체예에서, 친수성 농축 기재는 실리카 기반 아미노프로필 흡착제 물질을 포함한다. 특정 구체예에서, 친수성 농축 기재는 고체상 추출(SPE)을 위해 구성된다.
SPE를 위해 설계된 장치는 전형적으로 크로마토그래피 흡착제(예를 들어, 친수성 농축 기재, 예컨대 실리카 기반 아미노프로필 흡착제)를 포함하고 이는 사용자가 표적 성분, 이 경우에 글리코펩타이드를 선호적으로 보유할 수 있게 한다. SPE 장치는 전형적으로 샘플 보관 저장소, 흡착제 함유를 위한 수단, 및 유체 도관, 또는 장치에서 나오는 유체를 적합한 수집 용기로 보내기 위한 스파우트(spout)를 포함한다. SPE 장치는 소수의 샘플을 준비하기에 편리하고 비용 효율적인 단일 웰 형식, 또는 동시에 다수의 샘플을 준비하기에 적합한 다중-웰 형식일 수 있다. 다중 웰 형식은 일반적으로 로봇 유체 디스펜싱 시스템과 함께 사용된다. 전형적인 다중 웰 형식은 48-, 96-, 및 384-웰 표준 플레이트 형식을 포함한다. 유체는 일반적으로 특수하게 설계된 진공 매니폴드를 사용하여 장치에 걸쳐 진공을 끌어들이거나, 원심력 또는 중력을 사용하여 SPE 장치를 통해 수집 용기로 강제 이동된다. 원심력은 SPE 장치를, 적절한 수집 트레이와 함께, 의도된 목적을 위헤 특별히 설계된 원심분리기에 배치하여 생성된다. SPE 장치가 넓은 범위의 크로마토그래피 극성의 표적 화합물이 체류하기 위한 고용량을 갖고, 샘플 오염물이 폐기물로 세척되면서 표적 화합물 체류를 유지할 수 있고, 이후 가능한 한 작은 용리 부피에서 표적 화합물을 용리하는 능력을 제공하고, 이에 의해 SPE 동안 수득된 표적 화합물 농축 정도를 최대화하는 것이 유리하다.
다양한 고체상 추출 장치가 개시된 방법에 따라 사용될 수 있다. 한 구체예에서, SPE 장치는 마이크로 용리 플레이트, 크로마토그래피 컬럼, 박막 플레이트, 샘플 세정 장치, 주입 카트리지, 마이크로타이터 플레이트 및 크로마토그래피 준비 장치로 이루어진 군으로부터 선택된다.
SPE 물질을 포함하는 실리카 기반 아미노프로필 흡착제 물질이 당해 분야에 공지이고, 예를 들어 Waters Corporation로부터, 예컨대 GlycoWorks HILIC SPE 플레이트의 형태로 상업적으로 획득할 수 있다 (예를 들어 미국 특허 제6,723,236호, 제7,052,611호, 및 제7,192,525호). 일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 세척, 예를 들어 예비 세척 단계에 의해 샘플의 첨가를 위해 준비된다. 일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 글리코펩타이드 샘플과 접촉하기 전에 세척된다. 일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 물(H2O) 및/또는 ACN 용액(예를 들어 물 중의 ACN), 예컨대 부피로 약 60% 내지 약 95% ACN 용액, 예를 들어 부피로 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% ACN 용액과 나머지 물로 세척된다.
다양한 구체예에서, 친수성 농축 기재는 농축을 위해 글리코펩타이드 함유 샘플과 접촉된다. 샘플 용액과 관련하여, 이는 글리코펩타이드가 가용성이고, 글리코펩타이드가 친수성 농축 기재에 결합할 것인 용매에 용해된 글리코펩타이드를 포함할 것이다. 바람직하게는, 결합이 강하여, 글리코펩타이드의 상당 부분의 결합을 야기한다. 일부 경우에, 실질적으로 모든 글리코펩타이드가 결합될 것이다. 다양한 구체예에서, 용매는 전형적으로 글리코펩타이드를 가용화 및 안정화하기 위한 버퍼, 염, 및/또는 계면활성제를 함유하는 수용액이다. 일부 구체예에서, 글리코펩타이드 샘플은 부피로 약 0.1% 내지 약 0.5% TFA를 포함하는 약 60% ACN 내지 90% ACN 및 10% 내지 약 40% 물의 용액, 예컨대 0.2% TFA를 포함하는 약 80:20 ACN:물 (v/v)이다. 매우 유기성인 용매에서 펩타이드 용해도를 유지시키기 위해 낮은 pH, 예를 들어 약 6.5 미만, 예컨대 약 6.5, 6.0, 5.5, 5.0, 4.5, 4.0, 3.5 또는 3.0 미만의 pH를 갖는 용액이 사용될 수 있다.
이후 친수성 농축 기재가 세척되어 친수성 농축 기재에 상당하게 결합하지 않는 비-글리코실화 펩타이드와 같은 오염물이 제거된다. 그러한 오염물은 폐기될 수 있다. 일부 구체예에서, 친수성 농축 기재는 물(H2O) 용액 중의 산 및 아세토니트릴(ACN), 예컨대 물(H2O) 용액 중의 포름산 및/또는 트리플루오로아세트산(TFA) 및 아세토니트릴(ACN)로 세척된다. 특정 구체예에서, 수용액 중의 포름산 및 ACN은 나머지 물과 함께 부피로 약 0.5% 내지 약 5% 포름산 및 부피로 약 85% 내지 약 95% ACN, 예를 들어 부피로 약 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 또는 5.0% 포름산 및 부피로 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% ACN을 포함한다. 특정 구체예에서, 수용액 중의 TFA 및 ACN은 나머지 물과 함께 부피로 약 0.5% 내지 약 5% TFA 및 부피로 약 85% 내지 약 95% ACN, 예를 들어 부피로 약 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 또는 5.0% TFA 및 부피로 약 80%, 85%, 90%, 또는 95% ACN을 포함한다. 특정 예에서, 수용액은 부피로 1% 포름산, 9% H2O, 90% ACN 용액이다. 특정 예에서, 수용액은 부피로 1% TFA, 9% H2O, 90% ACN 용액이다.
오염물이 제거되면, 친수성 농축 기재가 용리 용액과 접촉하여 친수성 농축 기재로부터 글리코펩타이드가 용리된다. 실리카 기반 아미노프로필 흡착제는 약염기성 표면 및 음이온 교환 가능성을 보유한다. 그러나, 실리카 기반 아미노프로필 흡착제로부터의 글리코펩타이드의 상대적 및 전체 회수는 용리 조건에 특히 민감할 수 있다. 편향된 회수 또는 종분화는 샘플 제조 절차에 문제가 될 수 있다. 샘플에 존재하는 종의 정확한 표면을 제공하지 않는 것 이외에도, 이는 견고하지 않은 방법을 나타낼 수 있고, 획득된 상대적인 풍부도 프로파일이, 특히 가장 미흡하게 회수된 종과 관련하여 재현 가능하게 결정되지 않을 수 있음을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 유도체화된 글리칸의 회수를 위해, 본 개시의 주제인 글리코펩타이드와 대조적으로, ACN 중의 암모늄 아세테이트가 용리 용액으로서 사용되는 것이 권장된다. 그러나, 글리코펩타이드의 경우에, ACN 중의 암모늄 아세테이트가 우수한 결과를 산출하지 못한다. 따라서, 특정 구체예에서, 글리코펩타이드가 수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 ACN을 사용하여 실리카 기반 아미노프로필 흡착제로부터 용리된다. 일부 구체예에서, 수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 ACN은 약 100-400 mM 암모늄 포르메이트 및 약 2.5 내지 약 10% ACN, 예컨대 약 100 mM 암모늄 포르메이트, 약 150 mM 암모늄 포르메이트, 약 200 mM 암모늄 포르메이트, 약 250 mM 암모늄 포르메이트, 약 300 mM 암모늄 포르메이트, 약 350 mM 암모늄 포르메이트, 또는 약 400 mM 암모늄 포르메이트 및 약 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0% 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 또는 10.0%, ACN을 포함한다. 특정 예에서 수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 ACN은 약 200 mM 암모늄 포르메이트 및 약 5% ACN을 포함한다.
글리코펩타이드가 친수성 농축 기재로부터 용리되면, 생성된 농축된 글리코펩타이드 샘플이 추가의 분리 및 분석, 예를 들어 크로마토그래피 및/또는 질량 분석을 거칠 수 있다. 구체예에서, 농축된 글리코펩타이드 샘플이 분리 컬럼에 적용되고 이후 예를 들어 글리코펩타이드의 개별 종을 분할하기 위해 이동상 구배를 사용하여 분리 컬럼으로부터 용리된다.
일부 구체예에서, 분리 컬럼으로부터 글리코펩타이드를 용리 및/또는 분리하기 위해 용매 구배, 단계 용리 및/또는 다차원 용리가 수행된다. 구배의 사용은 크로마토그래피 분야에서 공지이다. 기본 원리는 분석물을 분리 컬럼에 흡착시킨 다음 탈착 용매 구배로 용리하는 것을 포함한다. 구배는 용매의 적어도 하나의 특징 변화, 예를 들어, 결합 상호작용의 강도에 영향을 미치는 일부 제제의 pH, 이온 강도, 극성, 또는 농도 변화를 지칭한다.
사용된 구배는 점진적일 수 있거나 단계로 추가될 수 있다. 한 구체예에서, 하나 이상의 치수가 다른 둘 이상의 탈착 용매의 볼루스가 사용된다. 예를 들어, 둘 이상의 볼루스(bolus)는 pH, 이온 강도, 소수성 등이 다를 수 있다. 수용액은, 사용될 경우, 결합된 글리코펩타이드에 최소의 손실 또는 손상으로 바람직하지 않은 오염물을 제거하도록 선택될 수 있다. 수용액의 특성은 샘플 및 탈착 용액의 특성 사이의 중간일 수 있다. 예를 들어 용리 구배에서의 용매는 글리코펩타이드 및 최후의 검출 방법과 호환되도록 선택된다. 일반적으로, 사용된 용매는 공지된 통상적인 용매이다. 다양한 구체예에서, 그 중에서 적합한 용매를 선택할 수 있는 용매는 암모늄 하이드록사이드, 트리에틸아민, 디암모늄 포스페이트, 메틸렌 클로라이드, 아세토니트릴 (소량의 염기성 또는 산성 개질제 포함 또는 미포함), 메탄올 (더 많은 양의 개질제, 예를 들어 아세트산 또는 트리에틸아민, 또는 메탄올 또는 아세토니트릴과 물의 혼합물 포함), 에틸 아세테이트, 클로로포름, 헥산, 이소프로판올, 아세톤, 알칼라인 버퍼, 고 이온 강도 버퍼, 산성 버퍼, 강산, 강염기, 산/염기, 산성 또는 염기성 메탄올과의 유기 혼합물, 테트라하이드로푸란 및 물을 포함한다.
HPLC를 포함하는 액체 크로마토그래피가 글리코펩타이드와 같은 구조를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피, 역상 HPLC, 크기 배제 크로마토그래피, 고성능 음이온 교환 크로마토그래피, 및 NP-HPLC를 포함하는 정상(NP) 크로마토그래피를 포함하여 다양한 형태의 액체 크로마토그래피가 이들 구조를 연구하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, Alpert et al., J. Chromatogr. A 676:191-202 (1994) 참조). 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)는 부분적으로 수성인 이동상으로써 수행될 수 있는 NP-HPLC의 변형으로, 펩타이드, 탄수화물, 핵산, 및 여러 단백질의 정상 분리를 허용한다. HILIC의 용리 순서는 역상 HPLC에서와 반대로 최소 극성으로부터 최대 극성이다. HPLC는 예를 들어 Waters(예를 들어, Waters 2695 Alliance HPLC 시스템), Agilent, Perkin Elmer, Gilson 등의 HPLC 시스템에서 수행될 수 있다.
NP-HPLC, 바람직하게는 HILIC는 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 HPLC의 특히 유용한 형태이다. NP-HPLC는 분석물과 고정상(예를 들어, 기재) 간의 극성 상호작용에 기초하여 분석물을 분리한다. 극성 분석물은 극성 고정상과 결합하고 이에 의해 유지된다. 흡착 강도는 분석물 극성 증가에 따라 증가하고, 극성 분석물과 (이동상에 비해) 극성 고정상 간의 상호작용은 용리 시간을 증가시킨다. 이동상에서 더욱 극성인 용매의 사용은 분석물의 체류 시간을 감소시킬 것인 반면 더욱 소수성 용매는 체류 시간을 증가시키는 경향이 있다.
실리카, 아미노, 아미드, 셀룰로스, 사이클로덱스트린 및 폴리스타이렌 기재를 포함하는 다양한 유형의 기재가 NP-HPLC와 함께, 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피에서 사용될 수 있는 유용한 기재의 예는: 폴리설포에틸 아스파트아미드 (예를 들어, PolyLC로부터), 설포베타인 기재, 예를 들어, ZIC®-HILIC (예를 들어, SeQuant로부터), POROS®HS (예를 들어, Applied Biosystems로부터), POROS®S (예를 들어, Applied Biosystems로부터), 폴리하이드로에틸 아스파트아미드 (예를 들어, PolyLC로부터), Zorbax 300 SCX (예를 들어, Agilent로부터), PolyGLYCOPLEX®(예를 들어, PolyLC로부터), Amide-80 (예를 들어, Tosohaas로부터), TSK GEL®Amide-80 (예를 들어, Tosohaas로부터), 폴리하이드록시에틸 A (예를 들어, PolyLC로부터), Glyco-Sep-N (예를 들어, Oxford GlycoSciences로부터), 및 Atlantis HILIC (예를 들어, Waters로부터)를 포함한다. 개시된 방법에서 사용될 수 있는 컬럼은 다음의 작용기: 카르바모일 기, 설포프로필 기, 설포에틸 기 (예를 들어, 폴리 (2-설포에틸 아스파트아미드)), 하이드록시에틸 기 (예를 들어, 폴리 (2-하이드록시에틸 아스파트아미드)) 및 방향족 설폰산 기 중 하나 이상을 사용하는 컬럼을 포함한다.
사용된 이동상은 이온 짝지음제(ion pairing agent), 예를 들어, 아세토니트릴 및 물이 있는 및 없는 버퍼를 포함할 수 있다. 이온 짝지음제는 포르메이트, 아세테이트, TFA 및 염을 포함한다. 버퍼의 구배가 사용될 수 있고, 예를 들어, 두 가지 버퍼가 사용되는 경우, 제1 버퍼의 농도 또는 백분율이 감소할 수 있는 반면 제2 버퍼의 농도 또는 백분율이 크로마토그래피 실행 과정에 걸쳐 증가한다. 예를 들어, 제1 버퍼의 백분율은 크로마토그래피 실행 과정에 걸쳐 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45%, 또는 약 40%로부터 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 또는 약 40%까지 감소할 수 있다. 또 다른 예로서, 제2 버퍼의 백분율은 동일한 실행 과정에 걸쳐 약 0%, 약 1%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 또는 약 40%로부터 약 100%, 약 99%, 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 50%, 약 45%, 또는 약 40%까지 증가할 수 있다. 선택적으로, 제1 및 제2 버퍼의 농도 및 백분율은 크로마토그래피 실행의 종료시에 시작 값으로 돌아갈 수 있다. 예로서, 제1 버퍼의 백분율은 다섯 단계에서 85%로부터 63%로 59%로 10%로 85%로 변화할 수 있는 한편; 제2 버퍼의 백분율은 동일 단계에서 15%로부터 37%로 41%로 90%로 15%로 변화한다. 백분율은 선형 구배로서 또는 비선형(예를 들어, 단계적) 방식으로 점진적으로 변할 수 있다. 예를 들어, 구배는 다상, 예를 들어, 이상, 삼상 등일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 이온 짝지음제의 사용 없이 이동상의 극성 증가에 상응하는 감소하는 아세토니트릴 버퍼 구배를 사용한다.
컬럼 온도는 크로마토그래피 실행 전반에 걸쳐, 예를 들어, 상용 컬럼 히터를 사용하여 일정 온도로 유지될 수 있다. 일부 구체예에서, 컬럼은 약 18℃ 내지 약 70℃, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 60℃, 약 40℃ 내지 약 50℃, 예를 들어, 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃의 온도에서 유지된다. 바람직한 온도는 약 45℃이다.
이동상의 유량은 약 0 내지 약 100 ml/분일 수 있다. 분석 제안을 위해, 유량은 전형적으로 분취용 HPLC에 대해 0 내지 10 ml/분 범위이고, 100 ml/분 초과의 유량이 사용될 수 있다. 예를 들어, 유량은 약 0.5, 약 1, 약 1.5, 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 또는 약 5 ml/분일 수 있다. 동일한 패킹, 동일한 길이, 그러나 더 작은 직경을 갖는 컬럼 대체는 더 넓은 직경의 컬럼으로써 나타나는 것과 같은 피크에 대해 동일한 체류 시간 및 분해능을 유지하기 위해 유량 감소를 필요로 한다. 바람직하게는, 유량은 4.6×100 mm에서 약 1 ml/분에 상응하고, 5 μm 컬럼이 사용된다.
실행 시간은 약 15 내지 약 240 분, 예를 들어, 약 20 내지 약 70 분, 약 30 내지 약 60 분, 약 40 내지 약 90 분, 약 50 분 내지 약 100 분, 약 60 내지 약 120 분, 약 50 내지 약 80 분일 수 있다.
NP-HPLC는 예를 들어 약 75 μm의 내경을 갖는 컬럼을 사용하여 나노스케일에서 수행되도록 조정될 수 있다 (예를 들어, Wuhrer et al., Anal. Chem. 76:833-838 (2004); Wuhrer et al., Internat. J. Mass. Spec. 232:51-57 (2004) 참조).
특정 구체예에서, 분리 컬럼은 친수성 상호작용(HILIC) 분리 컬럼이고, 글리코펩타이드는 이후 HILIC 분리 컬럼으로부터, 예를 들어 글리코펩타이드의 개별 종을 분할하기 위해 이동상 구배를 사용하여 용리되고, 이에 의해 샘플 중의 글리코펩타이드를 정제하고 분리한다. 특정 예에서, HILIC로부터 용리된 글리코펩타이드는 하나 이상의 분획으로 분리된다. 그러한 분획은 MS 분석과 같은 후속 분석에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 분획 중 하나 이상에 존재하는 글리코펩타이드 및/또는 글리칸을 식별하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 글리칸은 N-글리칸이다. 특정 구체예에서, 이동상 구배는 10 mM 암모늄 포르메이트, pH 4.5 내지 10 mM 암모늄 포르메이트 포함 90% ACN, pH 4.5이다. 특정 구체예에서, 이동상 구배는 H2O 중의 0.1% TFA 내지 ACN 중의 0.1% TFA이다.
글리코펩타이드는 글리코실화 단백질, 예컨대 단일클론 항체로부터 수득된다. 글리코실화 단일클론 항체는 환원, 효소 분해, 변성, 단편화, 화학적 절단 및 이들의 조합에 의해 제조될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 임의의 항체 아이소타입, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합된 아이소타입에 적용 가능하다.
환원은 3-차원 단백질, 예컨대 단일클론 항체에서 디설파이드 결합을 두 개의 티올로 환원시키는 것이다. 환원은 환원제, 예를 들어 TCEP-HCl의 존재에서 열 변성, 계면활성제 첨가, 또는 변성제, 예를 들어, 구아니딘 HCl (6M) 첨가에 의해 수행될 수 있다. 효소 분해는 프로테이스, 예를 들어, 트립신 또는 아크로모박터(Achromobacter) 프로테이스 I (Lys-C)를 사용하는 단백질의 분해이다. 또한, 당단백질은 열 또는 화학물질, 또는 이들의 조합에 의해 변성될 수 있다. 단편화는 단일 또는 다중-서브유닛 단백질, 예컨대 단일클론 항체의 단백질 부분을, 물리적, 생물학적 또는 화학적 방법으로 절단하는 것을 포함한다. 예를 들어, S. 피오젠(IdeS)으로부터의 면역글로불린 분해 효소가 항체 서브유닛 단편화에 일반적으로 사용된다.
다양한 구체예에서, 샘플 중의 항체는 친수성 농축 기재와 접촉시키기 전에 환원, 효소 분해, 변성 또는 단편화에 의해 처리 및 준비될 수 있다. 상기 방법은 단편, 및 펩타이드-수준 HILIC-UV-MS 분석에 의해 단백질, 예를 들어, 단일클론 항체(mAb) 치료제의 글리코실화를 특징분석하는 신규한 크로마토그래피 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 임의의 중간 단계에서 샘플이 농축, 탈염 등이 될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 방법은, 예를 들어 글리코펩타이드의 펩타이드 부분으로부터의 UV 신호를 사용하여 글리코펩타이드를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 이는 샘플의 분획에 대해 수행될 수 있고 추가의 분석, 예를 들어 질량 분석법 (MS) 분석을 위한 특정 분획의 선택을 허용한다. 따라서, 추가의 구체예에서, 검출 단계는 질량 분석법 또는 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)을 포함한다. 생체분자의 분석을 위한 질량 분석법의 적용에서, 분자는 액체상 또는 고체상으로부터 기체상 및 진공상으로 이동된다. 많은 생체분자가 크고 취약하므로 (단백질이 주요 예임), 진공 단계로 전달하기 위한 가장 효과적인 방법 중 두 가지는 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI) 또는 전기분무 이온화(electrospray ionization, ESI)이다. 이러한 방법의 사용의 양태 및 샘플 제조 요건은 당업자에게 공지이다. 일반적으로, ESI가 더 민감한 한편, MALDI가 더 신속하다. 중요하게는, 일부 펩타이드가 ESI에서보다 MALDI 모드에서 더 잘 이온화되며, 그 반대의 경우도 있다 (Genome Technology, June 220, p 52). 본 발명의 추출 채널 방법 및 장치는 MS 방법을 위한 샘플, 특히 글리코펩타이드와 같은 생체분자 샘플 준비에 특히 적합하다. 본 발명의 중요한 장점은, 예를 들어, 농축 또는 탈염과 같은 중간의 공정 단계의 필요 없이 직접 분석될 수 있는 농축된 샘플의 제조를 허용한다는 것이다.
ESI는 샘플을 휘발성 산 및 유기 용매와 혼합하고 이를 고전압으로 충전된 전도성 바늘을 통해 주입하여 수행된다. 바늘 끝에서 분사(또는 분출)된 하전된 액적은 질량 분석계로 유도되고, 날아가면서 열과 진공에 의해 건조된다. 액적이 건조된 후, 나머지 하전된 분자는 전자기 렌즈에 의해 질량 검출기로 유도되고 질량 분석된다. 한 구체예에서, 용리된 샘플은 모세관으로부터 전기분무 노즐로 직접 침착되며, 예를 들어, 모세관이 샘플 로더로서 기능을 한다. 또 다른 구체예에서, 모세관 자체가 추출 장치 및 전기분무 노즐 모두로서 기능한다.
MALDI의 경우, 분석물 분자(예를 들어, 단백질)가 금속 표적에 침착되고 유기 매트릭스와 함께 공결정화된다. 샘플은 건조되고 질량 분석기에 삽입되며, 전형적으로 비행 시간(time-of-flight, TOF) 검출을 통해 분석된다. 한 구체예에서, 용리된 샘플은 모세관으로부터 금속 표적으로 직접 침착되며, 예를 들어, 모세관 자체가 샘플 로더로서 기능을 한다. 한 구체예에서, 추출된 분석물이 MALDI 표적에 침착되고, MALDI 이온화 매트릭스가 첨가되고, 샘플이 예를 들어 TOF 검출에 의해 이온화 및 분석된다.
일부 구체예에서, 다른 이온화 모드, 예를 들어 ESI-MS, 터보분무 이온화 질량 분석법, 나노분무 이온화 질량 분석법, 열분무 이온화 질량 분석법, 음파 분무 이온화 질량 분석법, SELDI-MS 및 MALDI-MS가 사용된다. 일반적으로, 이러한 방법의 장점은 샘플의 "적시(just-in-time)" 정제 및 이온화 환경으로의 직접 도입을 허용한다는 것이다. 다양한 이온화 및 검출 모드가 사용된 탈착 용액의 성질에 대한 자체 제약을 도입함에 유념하는 것이 중요하고, 탈착 용액이 둘 모두와 호환성인 것이 중요하다. 예를 들어, 여러 응용분야에서 샘플 매트릭스는 낮은 이온 강도를 가져야 하거나, 특정 pH 범위 내에 있어야 한다. ESI에서, 샘플 중의 염은 이온화를 낮추거나 노즐을 막아 검출을 방해할 수 있다. 이 문제는 분석물을 저염에 제시하여 및/또는 휘발성 염을 사용하여 해결된다. MALDI의 경우에, 분석물은 표적의 스포팅(spotting) 및 사용된 이온화 매트릭스와 호환성인 용매 중에 있어야 한다.
실시예
다음의 예는 본 발명의 방법을 만들고 사용하는 방법에 대한 완전한 개시 및 설명을 당업자에게 제공하기 위해 제시된 것이며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 일부 실험적 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 달리 지시되지 않으면, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨이고, 실온은 약 25℃이고, 압력은 대기압이거나 그 근처이다.
실시예 1: 글리코펩타이드 및 방출된 글리칸의 RPLC-UV-MS에 기반한 이전 방법의 비교.
도 1은 현재의 글리코펩타이드 정량화 방법을 도시하는 개략적 워크-플로우 다이어그램이다. 치료용 항체는 변성, 환원 및 알킬화된 후 트립신으로 분해되었다. 글리코펩타이드 질량 피크의 피크 강도(높이)에 의해 상대 정량화가 수행되었다. 방출된 글리칸 방법은 MS 신호가 아닌 방출된 글리칸에 결합된 표지의 형광에 의해 글리코형을 정량화한다. 도 2는 방출된 글리칸(형광 시약, Waters의 RapiFluor-MS로 표지됨) 및 글리코펩타이드에 의해 정량화된 각각의 글리코형의 상대 정량화의 비교를 나타내는 표이다. 방법 간의 주요 정량화 차이가 3, 5, 7 및 8 행에 나타난다. 도 3은 글리코펩타이드에 의한 글리코형 정량화와 방출된 글리칸 방법 간의 불일치가 절단된 글리칸 인공산물(즉 G0F-GlcNAc 및 G1F-GlcNAc)의 증가 및 주요 글리칸(즉 G0F 및 G1F)의 감소를 야기하는, 글리코펩타이드 분석에서 MS에 의한 당 뼈대의 소스 내 단편화로 인한 것임을 보여주는 질량 스펙트럼이다. 이 결과는 펩타이드 수준에서의 글리칸 분석을 위해 신규하고 개선된 방법이 필요함을 입증한다.
실시예 2: HILIC-UV-MS를 사용하는 신규한 글리코펩타이드 분석 방법.
치료용 항체로부터의 펩타이드는 일상적으로 수행되는 환원 또는 비-환원 펩타이드 맵핑 방법에 의해 제조되었다. 이후 HILIC-UV-MS 분석 전에 분해물이 80% ACN 최종 (v/v)으로 희석되었다.
LC 시스템: PDA (UV) 검출기를 구비한 Waters ACQUITY I-Class UPLC® 시스템
MS 시스템: Waters XEVO G2-S QTof 또는 Thermo Scientific Q Exactive Plus
컬럼: Waters ACQUITY UPLC® Glycan BEH 아미드 HILIC 컬럼
도 5는 두 가지 상이한 방법에 의해 트립신 분해로부터 수득된 mAb1 펩타이트 분리의 결과를 나타내는 일련의 mAb1 펩타이드의 HILIC-UV 크로마토그램이다. 방법 #1은 암모늄 포르메이트를 사용하는 한편 방법 #2는 TFA를 사용한다. 온라인 MS 검출과 함께 PDA 검출기를 사용하여 상이한 글리코형의 상대적 수준이 UV에 의해 정량화되었다. 도 6은 방법 #2가 더 우수한 분리, 더 날카로운 피크, 및 더 큰 S/N 비율을 가짐을 보여주는 도 5에 나타난 추적의 글리코펩타이드 부분의 클로즈업이다. 도 7은 글리코펩타이드 부분을 확대한 mAb1 글리코펩타이드의 일련의 HILIC-TIC 크로마토그램이다. 나타난 바와 같이, 방법 #2는 더 큰 MS 신호의 S/N 비율을 가졌다. 도 8A 및 8B는 mAb1 글리코펩타이드(M2+ 이온)의 MS1 스펙트럼이다. 글리칸의 MS 소스 내(in-source) 단편화는 UV에 의한 글리코형 정량화의 요소가 아니다. 도 9는 HILIC 컬럼에서의 글리코펩타이드 분리와 방출된 글리칸 분석의 비교를 나타내는 일련의 추적 및 표이다. 글리코펩타이드 및 방출된 글리칸 분석에 의한 유사한 글리코형 정량화가 mAb1에 대해 관찰되었다. 중요하게는, 두 방법 사이의 글리코형 정량화에서 큰 차이가 관찰되지 않았으며, HILIC 컬럼 분리가 글리코펩타이드 분석을 위해 실행 가능함을 보여주었다. 또한, 총 푸코실화 및 갈락토실화 수준이 두 분석 간에 일치했다. 절단된 글리칸 인공산물은 HILIC-UV에 의한 글리코펩타이드 정량화에 영향을 미치지 않는다. 이는 이전의 RPLC 분석에 의해 관찰된 인공산물이 MS에 의해 유도된 글리칸의 소스 내 단편화로 인한 것임을 암시한다.
희석된 분해물은 건조와 함께 농축될 수 있다: 분해물이 <0.5 mg/mL의 농도를 갖는 경우, 샘플은 진공 건조되고 건조된 펩타이드를 0.2% TFA 포함 80:20 ACN:물 (v/v)에 재현탁시켜 0.5 mg/mL 이상까지 농축될 수 있다. 매우 유기성인 용매에서 펩타이드 용해도를 유지시키기 위해 낮은 pH가 요구된다. 도 10은 펩타이드 건조가 펩타이드 농축에 도움이 되었고 여러 상이한 샘플 양(예를 들어 5-20 μg, 좌측 상단)을 사용하여 일관성이 있지만, UV 신호(좌측 하단) 및 글리칸의 상대 %PA(우측 표)에 영향을 미치지 않음을 보여주는 일련의 추적 및 표이다. 도 11은 이동상 제조를 단순화하고 피크 적분을 개선하기 위해 이루어진 변경을 나타내는 일련의 추적이다. 이동상은 물 / ACN 중의 0.1% TFA로부터 펩타이드 맵핑에 사용되는 동일한 이동상 버퍼(물 및 ACN 각각에서 0.05% 및 0.045% TFA)로 변화했다. 도 12A, 12B, 12C 및 12D는 이동상 변화가 글리코펩타이드(M2+ 이온)의 MS 신호에 영향을 미치지 않음을 나타내는 일련의 질량 스펙트럼 결과이다. 도 13은 80% ACN에 희석된 mAb1 글리코펩타이드의 용액 안정성을 보여주는 일련의 추적이다.
미스 컷 글리코펩타이드의 식별: 도 14는 미스 컷 글리코펩타이드가 있는 분해물이 UV에 의한 글리코펩타이드의 정량화를 복잡하게 함을 나타내는 일련의 추적이다. 도 15는 온라인 MS 데이터로써 추출 이온 크로마토그래피(EIC)가 각각의 피크에서 미스 컷 글리코펩타이드의 백분율을 찾기 위해 사용될 수 있음을 보여주는 일련의 추적 및 표이다. 온라인 MS 검출로부터의 EIC가 각각의 공용리 피크에서 미스 컷 펩타이드(들) 대 일반 트립신 글리코펩타이드(들)의 비율을 계산하고 글리코형 정량화에 대한 미스 컷으로 인한 UV 신호를 걸러내기 위해 사용되었다. 대안적으로, 분해물(digest)이 트립신으로 재분해되어 미스 컷(miss-cut)이 규칙적인 트립신 글리코펩타이드으로 전환될 수 있다.
재분해를 위해, 다음의 프로토콜이 사용되었다: 분해물의 pH를 3 M Tris 염기로써 ~8.0로 상승시킨다; 1:5 E:S 비율 (w/w)의 트립신을 첨가하고, 50℃에서 1 시간 동안 인큐베이션한다; 0.2% TFA (최종)를 첨가하고 HILIC 방법을 위해 80% ACN (최종)까지 희석한다. 도 16은 트립신을 사용한 mAb2의 재분해가 글리코형 정량화를 위해 미스 컷 글리코펩타이드 간섭을 제거함을 보여주는 일련의 추적 및 표이다.
시약 오염된 분해물은 고체상 추출로 세정되고 건조로 농축될 수 있다: 분해물이 <0.5 mg/mL의 농도를 갖는 경우, 이는 진공 건조되고 건조된 펩타이드를 0.2% TFA 포함 80:20 ACN:물 (v/v)에 재현탁시켜 0.5 mg/mL 이상까지 농축될 수 있다. 매우 유기성인 용매에서 펩타이드 용해도를 유지시키기 위해 낮은 pH가 요구된다.
분해물은 고체상 추출(SPE)에 의해 염, 시약, 또는 세제로부?? 세정된 다음 진공 건조될 수 있다.
Waters GlycoWorks HILIC μElution 플레이트 (부품 번호 186002780): 물, 이후 80:15 ACN:물 (v/v)로 세척한다; 펩타이드 분해물(80% ACN, v/v로 희석됨)을 첨가한다; 1:9:90 포름산물:ACN (v/v)으로 두 번 세척한다; 200 mM 암모늄 포르메이트, 5% ACN으로 용리한다; 용리된 글리코펩타이드를 진공 건조한다; 0.2% TFA를 포함하는 80:20 ACN:물 (v/v)에 0.5 mg/mL까지 재현탁한다.
도 17은 암모늄 포르메이트가 HILIC SPE로부터의 글리코펩타이드 용리를 현저히 향상시킴을 보여주는 일련의 추적이다.
도 18은 건조 또는 SPE 세척/건조가 mAb1 글리코펩타이드 정량화에 영향을 미치지 않음을 보여주는 일련의 추적 및 표이다.
도 19는 글리코펩타이드 및 방출된 글리칸 분석에 의한 유사한 mAb3 글리코형 정량화를 보여주는 일련의 추적 및 표이다.
도 20A 및 20B는 글리코펩타이드 및 방출된 글리칸 분석에 의해 환원 및 비-환원 mAb3 트립신 분해를 사용하는 유사한 글리코형 정량화를 보여주는 일련의 추적 및 표이다.
도 21은 푸코실화 유무에 따른 IgG1 및 IgG4 글리코펩타이드의 분리의 비교를 나타내는 일련의 추적이다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 설명된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 속하도록 의도된다.

Claims (23)

  1. 다음 단계를 포함하는 글리코펩타이드 분리 방법:
    글리코펩타이드가 친수성 농축 기재에 결합하도록 허용하는 조건 하에 글리코펩타이드를 포함하는 샘플을 친수성 농축 기재에 접촉시키는 단계.
    친수성 농축 기재를 세척하여 친수성 농축 기재로부터 비-글리코펩타이드 오염물을 제거하는 단계;
    수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 아세토니트릴(ACN)을 사용하여 친수성 농축 기재로부터 글리코펩타이드를 용리하여 농축된 글리코펩타이드 샘플을 생성하는 단계;
    농축된 글리코펩타이드 샘플을 분리 컬럼에 적용하는 단계; 및
    분리 컬럼으로부터 글리코펩타이드를 용리하고, 이에 의해 샘플 중의 글리코펩타이드를 분리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 친수성 농축 기재는 고체상 추출(SPE) 크로마토그래피 기재를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 친수성 농축 기재는 실리카 기반 아미노프로필 흡착제 물질을 포함하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액 중의 암모늄 포르메이트 및 ACN은 물 중에 약 100-400 mM 암모늄 포르메이트 및 약 2.5% 내지 약 10% ACN을 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 암모늄 포르메이트 ACN 용액은 물 중에 약 200 mM 암모늄 포르메이트 및 약 5% ACN을 포함하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 농축 기재는 나머지 물과 함께 부피로 약 0.5% 내지 약 5% 포름산 및 부피로 약 85% 내지 약 95% ACN을 포함하는 포름산 및 ACN 수용액으로 세척되어 비-글리코펩타이드 오염물을 제거하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 포름산 및 ACN 수용액은 부피로 약 1% 포름산, 약 9% H2O, 및 약 90% ACN을 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 컬럼은 친수성 상호작용 (HILIC) 컬럼을 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 컬럼으로부터의 글리코펩타이드 용리는 글리코펩타이드를 하나 이상의 분획으로 분리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코펩타이드를 하나 이상의 분획으로 분리하는 것은 이동상 구배를 분리 컬럼에 적용하는 것을 포함하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 이동상 구배는 약 10 mM 암모늄 포르메이트, pH 4.5 내지 약 90% ACN과 10 mM 암모늄 포르메이트, pH 4.5를 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 이동상 구배는 H2O 중의 약 0.05% TFA 또는 ACN 중의 약 0.045% TFA를 포함하는 방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 분획 중 하나 이상에 존재하는 글리코펩타이드를 식별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 분획 중 하나 이상에 존재하는 글리코펩타이드와 관련된 글리칸을 식별하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 글리칸은 N-글리칸을 포함하는 방법.
  16. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 글리코펩타이드는 단일클론 항체로부터 수득되는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단일클론 항체는 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합된 아이소타입인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 단일클론 항체를 프로테이스로 분해하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 프로테이스는 트립신을 포함하는 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 용리된 글리코펩타이드에 대해 질량 분석을 수행하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 용리된 글리코펩타이드의 글리코펩타이드 수준에서의 글리코실화 프로파일링을 추가로 포함하는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 수용액 중의 아세토니트릴(ACN)로 친수성 농축 기재를 예비 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 친수성 농축 기재와 접촉시키기 전에 글리코펩타이드를 포함하는 샘플을 수용액 중의 ACN에 희석하는 것을 추가로 포함하는 방법.
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