CN116940594A - 可用于分析含有抗体的样品的组合物、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

在一些方面，本公开涉及样品处理方法，该方法包括：使不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的酸性洗脱溶液与具有结合的靶抗体的吸附剂接触，并将该洗脱溶液与该吸附剂分离，从而从该吸附剂释放结合的靶抗体，并形成包含洗脱溶液和释放的靶抗体的第一收集流份；使该吸附剂与不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的中和缓冲溶液接触，并将该中和缓冲溶液与该吸附剂分离，从而形成包含该中和缓冲溶液的第二收集流份；以及形成包含该第一收集流份和该第二收集流份的中和的溶液。在其它方面，本公开涉及用于进行此类样品处理方法的试剂盒。

Description

可用于分析含有抗体的样品的组合物、试剂盒和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2021年2月26日并且标题为“PROTEIN APROTOCOL”的美国临时申请序列号No.63/154,126的权利，其公开内容以引用方式并入本文。
技术领域
本公开涉及样品处理的方法，其中将靶抗体从样品流体中分离并经受另外的加工步骤，其可以包括聚糖标记。本公开还涉及用于进行此类方法的组合物和试剂盒。
背景技术
亲和层析是用于捕获和纯化生物样品诸如免疫球蛋白、多克隆和单克隆抗体以及抗体片段的公认方法。样品可以例如来自天然或重组来源，并且可以包含在多种样品基质中，包括例如人和动物全血、血浆和血清样品、以及细胞培养物上清液。用于通过亲和捕获进行分离和纯化的常见色谱吸附剂包括亲和捕获蛋白与其共价连接的颗粒。常见示例包括基于蛋白A和蛋白G的吸附剂，其在药物开发、制造和生物分析测试期间在捕获和纯化样品中具有效用。
典型的亲和纯化程序包括多个步骤。例如，该程序可包括第一步骤，其中用结合缓冲液洗涤吸附剂颗粒，所述结合缓冲液增强靶分析物与亲和吸附剂的结合。然后引入样品并将靶分析物结合到吸附剂颗粒上。结合后，洗涤吸附剂颗粒以移除未结合的物质，同时留下与吸附剂颗粒结合的靶分析物。然后通常在较低pH下进行洗脱步骤，以释放和收集纯化的靶分析物用于进一步测量和表征。
然而，目前的亲和纯化程序通常产生纯化的靶分析物溶液，其含有显著量的强亲核试剂，特别是伯胺和/或仲胺，其可干扰随后的加工步骤，包括其中标记试剂与含胺分析物反应的反应等等。当前亲和纯化程序的这些和其它缺点由本公开解决。
发明内容
在各个方面，本公开提供了样品处理方法，所述方法包括以下步骤：(a)使含有靶抗体的样品流体与对所述靶抗体具有亲和力的吸附剂接触，并将所述样品流体与所述吸附剂分离，从而形成具有结合的靶抗体的吸附剂；(b)使洗涤溶液与所述具有结合的靶抗体的吸附剂接触，并将所述洗涤溶液与所述具有结合的靶抗体的吸附剂分离，从而从吸附剂中移除未结合的分子，同时留下与吸附剂结合的靶抗体；(c)使酸性洗脱溶液与所述吸附剂接触并将所述洗脱溶液与所述吸附剂分离，从而从所述吸附剂释放结合的靶抗体并形成包含所述洗脱溶液和释放的靶抗体的第一收集流份，所述酸性洗脱溶液不含强亲核试剂，特别是具有伯胺基团、仲胺基团或硫醇基团的分子；(d)使所述吸附剂与中和缓冲溶液接触并将所述中和缓冲溶液与所述吸附剂分离，从而形成包含所述中和缓冲溶液的第二收集流份，所述中和缓冲溶液不含强亲核试剂，特别是具有伯胺基团、仲胺基团或硫醇基团的分子；(e)形成包含所述第一收集流份和所述第二收集流份的中和的溶液，所述中和的溶液包含释放的靶抗体、所述洗脱溶液和所述中和缓冲溶液(注意，所述第二收集流份可以在形成时直接加入到所述第一收集流份中，而不单独收集作为不同实体的第二收集流份)；以及(f)使所述中和的溶液经受另外的加工步骤，所述加工步骤包括与胺反应性试剂的化学反应。
在一些实施方案中，靶抗体选自免疫球蛋白、多克隆抗体、单克隆抗体、多价抗体、抗体片段、抗体-药物缀合物或寡核苷酸-抗体缀合物。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，洗脱溶液具有1至5范围内的pH。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，洗脱溶液还不含羟基基团。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，洗脱溶液包含选自羧酸和膦酸的有机酸。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，中和缓冲液具有7至14范围内的pH。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，中和缓冲液还不含羟基基团。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，中和缓冲液包含硼酸根阴离子。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，吸附剂包含选自蛋白质、抗体、适体、affimer和类肽的亲和配体。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，在使样品流体与吸附剂接触之前，该方法还包括使结合缓冲溶液与吸附剂接触并将结合缓冲溶液与吸附剂分离，其中结合缓冲溶液不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团。在这些实施方案中的一些中，结合缓冲溶液具有5至9范围内的pH，结合缓冲溶液还不含羟基基团和/或结合缓冲液包含选自羧酸根和膦酸根的有机酸阴离子。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，使中和的溶液经受另外的加工步骤，所述加工步骤包括用去糖基化酶使释放的靶抗体去糖基化以形成去糖基化的靶抗体和包含释放的糖基胺的释放的聚糖；以及使所述释放的聚糖与标记试剂反应以形成标记的聚糖。
在一些实施方案中，在使靶抗体去糖基化之前使靶抗体变性。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，标记试剂包含MS活性部分、荧光部分和与释放的聚糖反应的部分。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，该方法还包括使标记的聚糖经受液相色谱以分离标记的聚糖。
在可与上述方面和实施方案结合使用的一些实施方案中，所述方法还包括使标记的聚糖经受质谱分析和/或测量标记的聚糖的荧光信号。
在其它方面，本公开提供了用于处理含有靶抗体的样品流体的试剂盒，所述试剂盒包括以下：(a)对所述靶抗体具有亲和力的吸附剂，(b)用于容纳所述吸附剂的装置，(c)具有1至5范围内的pH并且不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的酸性溶液或用于形成不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的酸性溶液的浓缩物，(d)具有7至14范围内的pH并且不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的中和缓冲溶液或用于形成不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的中和缓冲溶液的浓缩物，和(e)任选的不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的结合缓冲溶液或用于形成不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的结合缓冲溶液的浓缩物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含下列中的一种或多种：(a)去糖基化酶，(b)标记试剂，和(c)变性试剂。
附图说明
图1A是显示基于未进行蛋白A纯化而产生的完整单克隆抗体(mAb)质量检查标准的聚糖谱的色谱图。图2A是图1A的色谱图的低丰度干扰峰(<5Eu)的放大比例。
图1B是显示基于用蛋白A纯化产生的完整mAb质量检查标准的聚糖谱的色谱图。图2B是图1B的色谱图的低丰度干扰峰(<5EU)的放大比例。
图1C是使用水作为空白方法产生的色谱图。图2C是图1C的色谱图的低丰度干扰峰(<5EU)的放大比例。
具体实施方式
本公开涉及处理含有至少一种靶抗体的样品的方法，包括分离、纯化、分离和/或分析一种或多种靶抗体的方法。
与本公开结合使用的样品包括生物流体，诸如全血、血浆、血清、尿、唾液、伤口渗出液、细胞裂解物、细胞培养物上清液和药物制剂等。
样品中的靶抗体可以广泛变化，并且包括免疫球蛋白、多克隆抗体、单克隆抗体，包括单特异性单克隆抗体和多特异性单克隆抗体(例如双特异性单克隆抗体、三特异性单克隆抗体等)、多价抗体、抗体片段、抗体-药物缀合物和寡核苷酸-抗体缀合物等。
在本公开的方法中，使含有至少一种靶抗体的样品流体与对至少一种靶抗体和样品流体具有亲和力的吸附剂接触，从而提供具有结合的靶抗体的吸附剂。接触可以例如通过使样品流体流经吸附剂或通过将吸附剂分散在样品流体内来进行。在任一情况下，将样品流体(在与吸附剂接触后，现在至少一种靶抗体被耗尽)与吸附剂分离。
结合本公开使用的对靶抗体具有亲和力的吸附剂包括包含选自蛋白质、抗体、适体、affimer和类肽的亲和配体的吸附剂。对靶抗体具有亲和力的吸附剂的具体示例包括包含亲和配体的吸附剂，所述亲和配体选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、蛋白A/G/L、木菠萝凝集素(jacalin)及其工程化同系物。结合本公开使用的吸附剂包括包含固体载体的那些吸附剂，所述固体载体可选自无机材料诸如二氧化硅、有机材料诸如聚合物、或杂化有机-无机材料。许多聚合物包括交联琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯或包含疏水单体(例如，二乙烯基苯、苯乙烯等)和亲水单体(例如，乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺等)的共聚物。
在与样品流体和本文所述的其它流体(即，洗涤溶液、洗脱溶液、中和缓冲溶液、任选的结合缓冲溶液)接触期间，可将吸附剂置于合适的分离装置中。存在可用于本公开的方法中的多种装置形式。装置包括分散装置和流通装置。
在分散装置中，本文所述的样品流体和其它流体可与吸附剂颗粒浆化并使其平衡。搅拌可通过摇动、搅拌或封盖/倒转装置所需的时间来提供，之后吸附剂颗粒和流体可在进行下一步骤之前分离。分离通常通过过滤(其可以通过重力、正压或抽吸来辅助)、通过离心来实现，或者如果使用磁性吸附珠，则通过将珠拉向磁体并移除液体部分来实现。分散方法的优点是可以容易地控制结合、洗涤和洗脱期间的接触时间。
流通装置可被视为小规模色谱柱，其中样品流体和本文所述的其它流体流经装置，其中吸附剂在单个步骤中与样品流体和本文所述的其它流体接触并与其分离。本文所述的样品流体和其它流体可以以预定流速泵送通过流通装置。可控制流速以适应结合、洗涤和洗脱动力学，其通常是时间依赖性的。此类装置的优点是它们允许使用相对小体积的洗脱流体进行有效的样品洗脱。低洗脱流体体积对于增加纯化样品浓度用于进一步分析或加工是有利的。
分离装置通常包括具有用于接收和保持吸附剂的腔室的壳体。在各种实施方案中，壳体可设置有入口和出口。用于壳体的构造材料包括无机材料，例如，金属诸如不锈钢和陶瓷诸如玻璃，以及合成聚合物材料诸如聚乙烯、聚丙烯、聚醚醚酮(PEEK)或聚碳酸酯。
在某些实施方案中，装置可包括用于将吸附剂保持在壳体中的一个或多个过滤器。示例性过滤器可为例如膜、筛网、玻璃料或球形多孔过滤器的形式。
在一些实施方案中，容纳在壳体中的样品流体或其它溶液(例如，洗涤溶液、洗脱溶液、中和缓冲溶液等)可以例如经由毛细管作用自发地流入吸附剂中。另选地，可通过外力(诸如重力或离心)或者通过向壳体的出口施加真空和/或向壳体的入口施加正压力来产生穿过吸附剂的流。
用于本公开的装置的具体示例包括例如注射器，注射筒，柱(例如，微孔柱、毛细管柱或纳米柱)，多孔装置诸如4孔至8孔支架、4孔至8孔条带、48孔至96孔板、96孔至384孔微洗脱板，微洗脱尖端装置(包括4至8尖端微洗脱条带、96至384微洗脱尖端阵列、单个微洗脱移液管尖端)、薄层板，微量滴定板，旋转管或其它旋转容器。多孔形式通常与机器人流体分配系统一起使用。典型的多孔形式包括48孔、96孔和384孔标准板形式，但其他形式显然也是可能的。
如前所述，在本公开的方法中，使含有至少一种靶抗体的样品流体与对所述至少一种靶抗体具有亲和力的吸附剂接触，并将所述样品流体与所述吸附剂分离，从而提供具有结合的靶抗体的吸附剂(和耗尽所述至少一种靶抗体的样品流体)。该步骤在本文中也可称为加载步骤。
在加载步骤之后，使洗涤溶液与具有结合的靶抗体的吸附剂接触，并且将洗涤液与吸附剂分离，从而从吸附剂移除未结合的分子，同时留下结合到吸附剂的靶抗体。洗涤溶液不含强亲核试剂，特别是具有伯胺基团、仲胺基团或硫醇基团的分子。在各种实施方案中，洗涤溶液也不含弱亲核试剂，特别是具有羟基基团的分子。合适的洗涤溶液包括水和包含1mM至200mM缓冲剂且pH值范围为5至10的水性缓冲液。
在进行至少一个此类洗涤步骤之后，使所述吸附剂与酸性洗脱溶液接触，并将所述酸性洗脱溶液与所述吸附剂分离。与酸性洗脱溶液的接触导致结合的靶抗体从吸附剂中释放，并且形成包含洗脱溶液和释放的靶抗体的收集流份。
酸性洗脱溶液的pH范围为1至5，并且更典型地pH范围为2至4。酸性洗脱溶液不含强亲核试剂，特别是具有伯胺基团、仲胺基团或硫醇基团的分子。在一些实施方案中，酸性洗脱溶液也不含弱亲核试剂，特别是具有羟基基团的分子。
在特定实施方案中，洗脱溶液含有至少一种有机酸，其不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团，并且其还可以不含羟基基团。所述至少一种有机酸可以例如以0.005M或更小至0.5M或更大的浓度存在，例如以0.005M至0.01M至0.025M至0.05M至0.1M至0.25M至0.5M的浓度存在(换句话说，在任何两个或前述数值之间的范围内)。
有机酸可选自例如羧酸和膦酸。羧酸的示例包括甲酸、乙酸、二氟乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、戊二酸和柠檬酸。膦酸的示例包括依替膦酸和亚甲膦酸。
在进行至少一个此类洗脱步骤之后，通过使吸附剂与中和缓冲溶液接触来进行中和步骤，并且将中和缓冲溶液与吸附剂分离，从而形成包含中和缓冲溶液的收集流份。
中和缓冲溶液的pH范围为7至14，更典型地pH范围为8至12。中和缓冲溶液不含强亲核试剂，特别是具有伯胺基团、仲胺基团或硫醇基团的分子。在一些实施方案中，中和缓冲溶液也不含弱亲核试剂，特别是具有羟基基团的分子。
在特定实施方案中，洗脱溶液含有硼酸根阴离子，不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团，并且还可以不含羟基基团。硼酸根阴离子可以以0.05M或更小至2M或更大的浓度存在，例如以0.05M至0.1M至0.25M至0.5M至1.0M至2.0M的浓度存在。除了硼酸根阴离子之外，中和缓冲液还包含合适的阳离子，例如IA族金属阳离子(即锂、钠、钾等)、叔胺阳离子或季胺阳离子。
在某些实施方案中，中和缓冲液也不含磷酸根阴离子。
在进行至少一个此类中和步骤后，通过合并以下组分形成包含纯化的靶抗体的中和的溶液：(a)来自洗脱步骤的收集流份，其包含酸洗脱溶液和释放的靶抗体，和(b)来自中和步骤的收集流份，其包含中和缓冲溶液。然后使该中和的溶液经受另外的加工步骤，该加工步骤可包括与胺反应性试剂的化学反应，如以下进一步描述的。
在一些实施方案中，在使样品流体与吸附剂接触之前，任选地通过使吸附剂与结合缓冲溶液接触来预处理吸附剂。结合缓冲溶液可以具有5至9范围内的pH，更典型地6至8范围内的pH。结合缓冲溶液不含强亲核试剂，特别是具有伯胺基团、仲胺基团或硫醇基团的分子。在一些实施方案中，结合缓冲溶液也不含弱亲核试剂，特别是具有羟基基团的分子。
在特定实施方案中，结合缓冲溶液含有一种或多种有机酸阴离子，其不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团，并且其还可以不含羟基基团。所述一种或多种有机酸阴离子可以以1mM至1000mM，更典型地2mM至200mM的浓度存在。有机酸阴离子可选自例如羧酸阴离子和膦酸阴离子。羧酸阴离子的示例包括甲酸根、乙酸根、二氟乙酸根、三氟乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、丙二酸根、琥珀酸根、马来酸根、戊二酸根和柠檬酸根阴离子。膦酸阴离子的示例包括依替膦酸根和亚甲膦酸根阴离子。
如前所述，上述处理方法产生含有纯化的靶抗体的中和的溶液。因为该中和的溶液不含强亲核试剂(除了可能存在于纯化的靶抗体中的那些以外)，所以可用于其中进行与胺反应性试剂进行化学反应的步骤的后续程序中。
此类后续程序的一个示例是其中使中和的溶液经受另外的加工步骤的程序，所述另外的加工步骤包括用去糖基化酶使靶抗体去糖基化以形成去糖基化的靶抗体和包括释放的糖基胺的释放的聚糖；以及使释放的聚糖与标记试剂反应以形成包括标记的糖基胺的标记的聚糖。
在各种实施方案中，所述去糖基化酶是内切糖苷酶。内切糖苷酶的示例包括糖肽酶F和糖肽酶A等。
在使靶抗体去糖基化之前，可通过使靶抗体经受合适的变性条件来使靶抗体变性。此类条件可以例如通过加入合适的变性剂来建立，所述变性剂的示例包括脲、胍、表面活性剂和溶剂诸如甲醇、丙酮、2-丙醇、乙腈等。变性条件也可以通过升高温度来实现。温度可以与一种或多种合适的变性剂一起使用以实现组合效果。
在一个实施方案中，变性剂包含质谱(“MS”)相容的表面活性剂或者另外称为“可裂解的表面活性剂”。可裂解的表面活性剂通过裂解(通常在酸性条件下)变得没有活性，以便选择性地移除裂解产物。可裂解表面活性剂的一个示例是酸不稳定的阴离子表面活性剂3-[(2-甲基-2-十一烷基-1,3-二氧戊环-4-基)甲氧基]-1-丙磺酸钠(也称为“ALS”)。ALS可在低pH条件下快速降解，并且消除表面活性剂引起的干扰。ALS的酸不稳定性性质可实现在MS分析之前的样品净化，通常不会损害该分析的质量。ALS由Waters Corporation(Millford MA，USA)作为产品RapiGestTMSF(有时也称为RapiGest表面活性剂)销售。其它酸不稳定表面活性剂在美国专利8,232,423中有所描述。在本公开中可使用的不是酸不稳定的其它类型的表面活性剂包括诸如Invitrosol(IVS)(一种均相表面活性剂)、脱氧胆酸钠(“SDC”)、蛋白酶MAXTM(3-((1-(呋喃-2-基)十一烷氧基)羰基氨基)丙-1-磺酸钠的商标名称)、正辛基葡萄糖苷(“OG”)、Triton X-100、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(“CHAPS”)和十二烷基硫酸钠(“SDS”)的产品。
在从靶抗体释放聚糖后，释放的聚糖可以与合适的标记试剂反应。在一些实施方案中，标记试剂包含MS活性部分、荧光部分和与释放的聚糖反应的反应性部分。
在一些实施方案中，标记试剂的MS活性部分可以是叔氨基或季氨基或其它MS活性基团，其可以使用质谱法分析。质谱法的特定示例包括电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、基质辅助激光解吸/电离质谱法(MALDI-MS)和飞行时间质谱法(TOFMS)等。
在一些实施方案中，标记试剂的荧光部分可以是荧光杂环芳族部分、荧光碳环芳族部分或其它荧光部分。当某些分子吸收特定波长的光时发生荧光，从而促进分子达到更高的能态。当它们返回到它们的正常能态时，“激发的”分子将它们吸收的能量作为光子释放。荧光可以例如用扫描荧光检测器测量，该检测器用高强度光照射样品，然后检测器测量由样品发射的低水平荧光。发射的光通常被滤波、放大并转换成可被记录和分析的电信号。
在一些实施方案中，可以与释放的聚糖反应的标记试剂的反应性部分可以选自异氰酸酯、异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、琥珀酰亚胺氨基甲酸酯、羧酸、胺、醛、酯、二烯、烯和炔等等。
在一些实施方案中，与释放的聚糖反应的标记反应性部分是与存在于释放的糖基胺上的伯胺和/或仲胺基团反应的部分。在某些有益的实施方案中，反应性部分可以选自例如异氰酸酯部分、硫代异氰酸酯部分、琥珀酰亚胺酯部分或琥珀酰亚胺氨基甲酸酯部分等。
在一些实施方案中，与释放的聚糖反应的标记反应性部分是与存在于释放的聚糖上的醛基团和/或酮基团反应的部分。在某些有益的实施方案中，所述反应性部分可以是胺基团。胺基团可通过还原胺化提供聚糖的有效标记。
标记试剂的具体示例包括RapiFluor-MSTM(Waters Corporation)、InstantProcaine(InstantPCTM)(Prozyme,Inc.,Hayward,CA,USA)和Instant ABTM(Prozyme,Inc.)。
因为进行前述加工步骤以确保强亲核试剂(除了存在于释放的糖基胺上的那些)大部分或完全不存在，所以对于标记试剂与聚糖之间的期望反应几乎不存在不想要的竞争。
在多个实施方案中，本公开的方法包括使标记的聚糖经受液相色谱以分离标记的聚糖。合适类型的液相色谱包括反相色谱和亲水相互作用色谱(HILIC)。
反相色谱法通常包括使用极性流动相，例如水或者水或缓冲液与极性溶剂诸如甲醇、乙腈、异丙醇或四氢呋喃的混合物，和非极性固定相，例如与二氧化硅结合的烃(例如购自Waters Corporation的SunFireTMC8或C18柱或者SymmetryTMC8或C18柱)或与混合材料结合的烃(例如购自Waters Corporation的XBridgeTMBEH C8或C18柱、或XTerraTMC8、C18和苯基柱)。在一些实施方案中，可以使用混合模式、反相色谱分离，在这种情况下，固定相可以是离子交换剂，例如，反相/阴离子交换(AX)柱(例如，购自Waters Corporation的AtlantisTMPremier BEH C18 AX柱)。在反相色谱法中使用的梯度方法通常从较高的水含量(包括100％水含量)渐进地移动到较低的水含量(或者相反地，从较低的有机物含量(包括0％有机物含量)到较高的有机物含量)。在混合模式分离中，通常还存在缓冲液浓度和/或pH的梯度。
亲水-相互作用色谱(HILIC)可被视为正相色谱向含水流动相领域的延伸。流动相通常是水或缓冲液(<40％)与极性有机溶剂的混合物。典型的流动相包括乙腈(ACN)与少量的水。然而，可以使用与水混溶的任何非质子溶剂作为极性非质子溶剂，包括乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二噁烷和二甲醚等。固定相通常是非常亲水的极性固定相，诸如二氧化硅、极性结合相、极性聚合物相和离子交换剂(例如，混合模式分离，其中HILIC分离还包括阴离子交换保留机制)，这种亲水性极性固定相的示例包括购自Waters Corporation的Atlantis、CORTECSTM、XBridge和ACQUITYTM产品家族的成员。所有这些固定相的共同特征是它们可以容易地吸附水，因此归类为“亲水性”。在HILIC模式中采用的梯度方法通常与在反相模式中采用的那些相反，初始条件通常包括高有机物含量，典型地约95％有机物含量，并且渐进地移动到更高的水含量。在混合模式分离中，通常还存在缓冲液浓度和/或pH的梯度。
在各种实施方案中，本公开的方法还包括另外加工来自色谱柱的洗脱液，例如，以鉴定、定量或以其它方式加工核酸组分化合物。在一些实施方案中，对洗脱液进行质谱(MS)分析。在一些实施方案中，对洗脱液进行荧光分析。另选地或除此之外，可使洗脱液经受其它分析技术，包括红外分析、紫外分析和核磁共振分析等。
本公开的其它实施方案涉及用于处理含有至少一种靶抗体的样品流体的试剂盒。该试剂盒可包括：(a)对靶抗体具有亲和力的吸附剂，其可选自上文所述的那些等，(b)用于容纳吸附剂的装置，其可选自上文所述的那些等，(c)酸性洗脱溶液，其可选自上文所述的那些等，或用于形成此种酸性洗脱溶液的浓缩物，诸如液体浓缩物或粉末，和(d)中和缓冲溶液，其可选自上文所述的那些等，或用于形成此种中和缓冲溶液的浓缩物，诸如液体浓缩物或粉末。在一些实施方案中，该试剂盒还可包含下列中的一种或多种：(e)去糖基化酶，其可以选自上述那些等，(f)标记试剂，其可以选自上述那些等，和(g)变性试剂，其可以选自上述那些等。
实施例1.糖蛋白的纯化和富集
在实施例1中使用以下溶液：
●结合缓冲液：水或20mM乙酸钠，pH 7.4
●洗涤缓冲液：水
●洗脱缓冲液：1％乙酸
●中和缓冲液：50mM硼酸钠，pH 9
在实施例1中使用以下纯化步骤：
●用400μL结合缓冲液调节蛋白A孔(UniMabTM50，Suzhou Nanomicro TechnologyCo.,Ltd.,Suzhou,China)。利用正压歧管驱动流动(约1.5psi)。重复2次。
●含有完整mAb质量检查标准(Waters Corporation)的加载样品(例如，对于0.1mg/mL的2mg蛋白)：
○将蛋白A板与新收集板连接，加载400μL蛋白溶液，并通过抽吸充分混合。
○在室温下温育4分钟，以约650rpm振荡。
○如果在收集板中存在穿透溶液，转移回蛋白A板，然后利用正压歧管驱动流动。
○如果需要，收集流经的流份以检查板的结合效率。否则，丢弃流经的流份。
○根据需要重复前面的步骤，直到所有样品已经加载到板上。
●用400μL水洗涤蛋白A板。用正压歧管驱动流动。重复2次。
●洗脱捕获的mAb：
○将蛋白A板与新收集板连接，通过加入50μL 1％乙酸从板上洗脱mAb，并通过抽吸充分混合。
○利用正压歧管的驱动流动。
○保持相同的收集板，重复前面的两个步骤。
○保持相同的收集板，加入200μL中和缓冲液，并且利用正压歧管驱动流动。
○保存来自收集板的洗脱流份作为富集的mAb样品。如果需要，检查蛋白浓度。
实施例2.使用富集的糖蛋白的样品制备。
在该实施例中使用以下程序来快速去糖基化富集的mAb样品：
●通过将1瓶(3mg)RapiGest的内容物溶解在60μL 5xGlycoWorksTM快速缓冲液中来制备5％(w/v)RapiGest缓冲溶液(购自Waters Corporation)。涡旋混合。
●将15μg富含蛋白A的mAb溶液转移至1mL管中。
●加入6μL含有5％(w/v)RapiGest SF的缓冲溶液。抽吸并分配以充分混合。
●向1mL管中加入18.2MΩ的水以使样品混合物的总体积达到28.8μL，通过抽吸和分配混合。
●将该1mL管转移到至少90℃的预热加热块中。加热使该混合物变性3分钟。在变性期间确保溶液温度保持在不低于90℃。
●从加热块中移除1mL管，使混合物溶液冷却3分钟。
●加入1.2μL GlycoWorks快速糖肽酶F酶溶液(购自Waters Corporation)。抽吸并分配以混合。
●在另一个预热的加热块中以50℃温育混合物5分钟。在消化期间将溶液温度保持在50℃。
●从加热块中移除1mL管，使所得去糖基化混合物在室温下冷却3分钟。
在该实施例中使用以下程序来快速标记通过先前的去糖基化程序产生的糖基胺：
●在用于去糖基化的温育步骤期间制备标记试剂。加入131μL GlycoWorks试剂溶剂无水DMF(购自Waters Corporation)以溶解一小瓶9mg RapiFluor-MS试剂。抽吸并分配溶液5次至10次以确保试剂完全溶解。另选地，盖上盖子并用手短暂摇动试剂小瓶的内容物。
●将12μL新鲜制备的RapiFluor-MS试剂溶液(购自Waters Corporation)加入1mL管中的去糖基化混合物中。
●抽吸并分配试剂溶液5次以确保混合。
●使标记反应在室温下进行5分钟。
●通过向样品混合物中加入5μL 1M乙酸铵(pH约7)骤冷剩余的RapiFluor-MS试剂。使骤冷反应在室温下进行5分钟。
●在制备HILIC固相萃取(SPE)净化时，用358μL乙腈稀释骤冷的样品混合物。
在该实施例中使用以下程序用于来自先前快速标记程序的经标记糖基胺的HILICSPE净化：
●制备用于HILIC SPE净化的溶液：
○平衡溶液：15:85水/乙腈(v/v)
○洗涤溶液：1:9:90甲酸/水/乙腈(v/v/v)
●设置GlycoWorks HILICμElutionTM板(购自Waters Corporation)，其中废液托盘在真空歧管上(真空度设置为2.5-4Hg以驱动流经)。另选地，可将正压歧管用于SPE净化步骤(约3psi)。
●利用200μL 18.2MΩ水调节待在μElution板上使用的孔。
●用200μL 15:85水/乙腈(v/v)溶液平衡孔。
●将全部约400μL乙腈稀释的样品加载到调节孔上。
●用两个600μL体积的1:9:90甲酸/水/乙腈(v/v/v)洗涤孔。
●将废液托盘更换为96孔收集板。
●用三个30μL体积的GlycoWorks SPE洗脱缓冲液(购自Waters Corporation)(在5％乙腈中的200mM乙酸铵)洗脱聚糖。
●保存SPE洗脱液用于液相色谱-荧光-质谱(LC-FLR-MS)分析
实施例3.液相色谱分离、荧光分析和质谱分析
以下条件用于来自以上实施例2的净化后RapiFluor-MS标记的聚糖的液相色谱(LC)分离、荧光(FLR)分析以及质谱(MS)分析：
表1.LC-FLR条件。
表2.MS条件。
MS系统： Waters XevoTMG2-XS QTof
电离模式： ESI，阳性
获取范围： 300Da至3000Da
毛细管电压： 2.2kV
源补偿： 50V
碰撞能量： 关
锥电压： 75V
去溶剂气体： 600L/hr
源温度： 120℃
去溶剂化温度： 500℃
扫描速率： 2Hz
实施例1至3产生的色谱图示于图1B和图2B(放大比例)中。
由实施例2和实施例3(即，使用实施例2中未纯化的完整mAb，而不进行实施例1的蛋白A纯化和富集步骤)产生的色谱图显示于图1A和图2A(放大比例)中。通过比较图1A-2A和图1B-2B可以看出，程序A的纯化和富集步骤显著降低了基质干扰。
最后，作为对照，使用水作为空白方法进行上述实施例1至3，并且所得色谱图示于图1C和图2C(放大比例)中。

Claims (42)

1.一种样品处理方法，包括：
(a)使含有靶抗体的样品流体与对所述靶抗体具有亲和力的吸附剂接触，并将所述样品流体与所述吸附剂分离，从而形成具有结合的靶抗体的吸附剂；
(b)使不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的洗涤溶液与所述具有结合的靶抗体的所述吸附剂接触，并将所述洗涤溶液与所述具有结合的靶抗体的吸附剂分离，从而从所述具有结合的靶抗体的吸附剂中移除未结合的分子，同时留下结合至所述吸附剂的靶抗体；
(c)使不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的酸性洗脱溶液与所述吸附剂接触，并将所述洗脱溶液与所述吸附剂分离，从而从所述吸附剂释放结合的靶抗体，并形成包含所述洗脱溶液和释放的靶抗体的第一收集流份；
(d)使所述吸附剂与不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的中和缓冲溶液接触，并将所述中和缓冲溶液与所述吸附剂分离，从而形成包含所述中和缓冲溶液的第二收集流份；
(e)形成包含所述第一收集流份和所述第二收集流份的中和的溶液，所述中和的溶液包含所述释放的靶抗体、所述洗脱溶液和所述中和缓冲溶液；以及
(f)使所述中和的溶液经受另外的加工步骤，所述加工步骤包括与胺反应性试剂的化学反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶抗体选自免疫球蛋白、多克隆抗体、单克隆抗体、多价抗体、抗体片段、抗体-药物缀合物或寡核苷酸-抗体缀合物。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述样品流体选自全血、血浆、血清、尿、唾液、伤口渗出液、细胞裂解物、细胞培养物上清液和药物制剂。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述洗脱溶液具有1至5范围内的pH。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述洗脱溶液还不含羟基基团。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述洗脱溶液包含选自羧酸和膦酸的有机酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述有机酸选自甲酸、乙酸、二氟乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、戊二酸、柠檬酸、依替膦酸和亚甲膦酸。
8.根据权利要求6至7中任一项所述的方法，其中所述有机酸以0.005M至0.5M的浓度存在。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述中和缓冲液具有7至14范围内的pH。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述中和缓冲液还不含羟基基团。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述中和缓冲液包含硼酸根阴离子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述中和缓冲液包含IA族金属阳离子、叔胺阳离子或季胺阳离子。
13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中所述硼酸根阴离子以0.05M至2M的浓度存在。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述吸附剂包含选自蛋白质、抗体、适体、affimer和类肽的亲和配体。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述吸附剂包含选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白A/G、蛋白A/G/L、木菠萝凝集素(jacalin)及其工程化同系物的亲和配体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述吸附剂包括固体载体。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述固体载体包含有机材料、无机材料或杂化有机-无机材料。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述固体载体包含二氧化硅或交联聚合物。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述固体载体包含选自琼脂糖、纤维素、葡聚糖、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯和包含疏水性单体和亲水性单体的共聚物的交联聚合物。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中，在使所述样品流体与所述吸附剂接触之前，所述方法还包括使结合缓冲溶液与所述吸附剂接触并使所述结合缓冲溶液与所述吸附剂分离，其中所述结合缓冲溶液不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述结合缓冲溶液具有5至9范围内的pH。
22.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述结合缓冲溶液还不含羟基基团。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述结合缓冲液包含选自羧酸根和膦酸根的有机酸阴离子。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述有机酸阴离子选自甲酸根、乙酸根、二氟乙酸根、三氟乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、丙二酸根、琥珀酸根、马来酸根、戊二酸根、柠檬酸根、依替膦酸根和亚甲膦酸根。
25.根据权利要求23至24中任一项所述的方法，其中所述有机酸阴离子以0.005M至0.5M的浓度存在。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中使所述中和的溶液经受另外的加工步骤，所述加工步骤包括用去糖基化酶使所述释放的靶抗体去糖基化以形成去糖基化的靶抗体和包括释放的糖基胺的释放的聚糖；以及使所述释放的聚糖与标记试剂反应以形成标记的聚糖。
27.根据权利要求26所述的方法，还包括在使所述靶抗体去糖基化之前使所述靶抗体变性。
28.根据权利要求27所述的方法，其中使用变性表面活性剂、脲、胍、溶剂和/或加热使所述靶抗体变性。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述去糖基化酶为内切糖苷酶。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述内切糖苷酶选自糖肽酶F和糖肽酶A。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的方法，其中标记试剂包含MS活性部分、荧光部分和与所述释放的聚糖反应的部分。
32.根据权利要求31所述的方法，其中与所述释放的聚糖反应的所述部分是与伯胺和/或仲胺反应的部分。
33.根据权利要求32所述的方法，其中与所述释放的聚糖反应的所述部分选自异氰酸酯部分、硫代异氰酸酯部分、琥珀酰亚胺酯部分或琥珀酰亚胺氨基甲酸酯部分。
34.根据权利要求31所述的方法，其中与所述释放的聚糖反应的所述部分是与醛基团和/或酮基团反应的部分。
35.根据权利要求34所述的方法，其中与所述释放的聚糖反应的所述部分是胺部分。
36.根据权利要求26至35中任一项所述的方法，还包括使所述标记的聚糖经受液相色谱法以分离所述标记的聚糖。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述液相色谱选自反相色谱和亲水相互作用色谱(HILIC)。
38.根据权利要求26至37中任一项所述的方法，还包括使所述标记的聚糖经受质谱分析和/或测量所述标记的聚糖的荧光信号。
39.一种样品处理方法，包括：
(a)使含有靶抗体的样品流体与对所述靶抗体具有亲和力的吸附剂接触，并将所述样品流体与所述吸附剂分离，从而形成具有结合的靶抗体的吸附剂；
(b)使不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的洗涤溶液与所述具有结合的靶抗体的所述吸附剂接触，并将所述洗涤溶液与所述具有结合的靶抗体的吸附剂分离，从而从所述具有结合的靶抗体的吸附剂中移除未结合的分子，同时留下结合至所述吸附剂的靶抗体；
(c)使不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团和羟基基团的酸性洗脱溶液与所述吸附剂接触，并将所述洗脱溶液与所述吸附剂分离，从而从所述吸附剂释放结合的靶抗体，并形成包含所述洗脱溶液和释放的靶抗体的第一收集流份，其中洗脱溶液具有1至5范围内的pH并且包含选自羧酸和膦酸的有机酸；
(d)使所述吸附剂与不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团和羟基基团的中和缓冲溶液接触，并将所述中和缓冲溶液与所述吸附剂分离，从而形成包含所述中和缓冲溶液的第二收集流份，其中中和缓冲溶液具有7至14范围内的pH并且包含硼酸根阴离子和选自IA族金属阳离子、叔胺阳离子和季胺阳离子的阳离子；
(e)形成包含所述第一收集流份和所述第二收集流份的中和的溶液，所述中和的溶液包含所述释放的靶抗体、所述洗脱溶液和所述中和缓冲溶液；
(f)使所述中和的溶液经受另外的加工步骤，所述加工步骤包括用去糖基化酶使所述中和的溶液中的所述释放的靶抗体去糖基化以形成去糖基化的靶抗体和包含释放的糖基胺的释放的聚糖；以及
(g)使所述释放的聚糖与标记试剂反应以形成标记的聚糖。
40.一种用于处理含有靶抗体的样品流体的试剂盒，所述试剂盒包括下列中的一种或多种：(a)对所述靶抗体具有亲和力的吸附剂，(b)用于容纳所述吸附剂的装置，(c)具有1至5范围内的pH并且不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的酸性溶液或用于形成不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的酸性溶液的浓缩物，(d)具有7至14范围内的pH并且不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的中和缓冲溶液或用于形成不含伯胺基团、仲胺基团、硫醇基团的中和缓冲溶液的浓缩物，和(e)任选的不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的结合缓冲溶液或用于形成不含伯胺基团、仲胺基团和硫醇基团的结合缓冲溶液的浓缩物。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，所述试剂盒还包含下述物质中的一种或多种：(a)去糖基化酶，(b)标记试剂，和(c)变性试剂。
42.根据权利要求40至41中任一项所述的试剂盒，其中所述装置选自注射器、注射药筒、多孔装置、微洗脱尖端装置、薄层板、旋转管或柱。
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