CN112513640B - 糖基化肽的检测和定量 - Google Patents

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Abstract

一种纯化和/或分离糖肽以及定量所述糖肽的方法。所述方法包括在允许糖肽结合至亲水性富集底物的条件下使包含所述糖肽的样品与所述亲水性富集底物接触。用甲酸铵和乙腈(ACN)的水溶液将所述糖肽从所述亲水性富集底物洗脱以产生富集的糖肽样品，可对所述富集的糖肽样品进行分析以鉴定特定糖肽。

Description

糖基化肽的检测和定量
技术领域
本发明涉及生物药物，并且涉及蛋白质如治疗性抗体及其片段的体内翻译后糖基化的检测和定量。
背景技术
治疗性单克隆抗体(mAb)是在哺乳动物细胞中产生的具有许多产物变体的异质分子，所述变体包括由翻译后修饰(PTM)产生的变体。N-连接的糖基化是治疗性抗体中的主要PTM。监管机构要求对N-连接的聚糖结构的表征和对个别糖型的定量以定义药物产品的质量、展现批次间的一致性并确保对制造过程的控制。传统上，通过从抗体中酶促释放聚糖、然后用荧光试剂标记来定量抗体内的N-连接的聚糖。或者，可通过分析由抗体的胰蛋白酶消化产生的糖肽来在肽水平下表征糖基化。然而，具有异质糖型的糖肽通常不能通过传统上用于肽作图的基于反相的液相色谱法(RPLC)良好地分离。此外，在线质谱法(MS)诱导的糖肽中糖链的源内断裂可产生截短的糖型伪影，所述糖型伪影使得使用MS对不同糖型的相对丰度的准确定量折衷。
发明内容
在一个方面，本发明提供了一种纯化和/或分离糖肽的方法，其中所述方法包括：(a)在允许糖肽结合至亲水性富集底物的条件下使包含所述糖肽的样品与所述亲水性富集底物接触；(b)洗涤所述亲水性富集底物以从所述亲水性富集底物中除去非糖肽污染物；以及(c)用甲酸铵和乙腈(ACN)的水溶液将所述糖肽从所述亲水性富集底物洗脱，从而产生富集的糖肽样品。任选地，所述方法包括将所述富集的糖肽样品施加至分离柱，并且将所述糖肽从所述分离柱洗脱。
在一些实施方案中，所述亲水性富集底物包括固相萃取(SPE)色谱底物。
在一些实施方案中，所述亲水性富集底物包含基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂材料。
在一些实施方案中，所述甲酸铵和ACN的水溶液包含在水中的约100-400mM甲酸铵和约2.5％至约10％ACN。
在一些实施方案中，所述甲酸铵ACN溶液包含在水中的200mM甲酸铵和5％ACN。
在一些实施方案中，用甲酸和ACN洗涤溶液洗涤所述亲水性富集底物以除去非糖肽污染物，所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计0.5％至约5％的甲酸和按体积计约85％至约95％的ACN，其余为水。
在一些实施方案中，所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计1％的甲酸、9％的H2O、90％的ACN。
在一些实施方案中，所述分离柱包括亲水性相互作用(HILIC)柱。
在一些实施方案中，将所述糖肽从所述分离柱洗脱还包括将所述糖肽分离成一个或多个级分。
在一些实施方案中，将所述糖肽分离成一个或多个级分包括向所述分离柱施加流动相梯度。
在一些实施方案中，所述流动相梯度是10mM pH 4.5的甲酸铵至含有10mM pH 4.5的甲酸铵的90％ACN。
在一些实施方案中，所述流动相梯度是在H2O中的0.05％TFA或在ACN中的0.045％TFA。
在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定所述级分中的一个或多个中存在的糖肽。
在一些实施方案中，所述方法还包括鉴定与所述级分中的一个或多个中存在的糖肽相关的聚糖。
在一些实施方案中，所述聚糖包括N-聚糖。
在一些实施方案中，所述糖肽获自单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述单克隆抗体具有同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。
在一些实施方案中，所述方法还包括用蛋白酶消化所述单克隆抗体。
在一些实施方案中，所述蛋白酶包括胰蛋白酶。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述洗脱的糖肽进行质谱分析。
在一些实施方案中，所述方法还包括在所述洗脱的糖肽的糖肽水平下的糖基化谱分析。
在一些实施方案中，所述方法还包括用乙腈(ACN)的水溶液预洗涤所述亲水性富集底物。
在一些实施方案中，所述方法还包括在与所述亲水性富集底物接触之前，将包含糖肽的样品稀释于ACN的水溶液中。
附图说明
图1示出示意性工作流程图，其示出通过与质谱结合的液相色谱(LC/MS)进行糖肽定量的当前标准方法。
图2示出表，所述表示出与释放的聚糖的定量相比，图1的工作流程中所示的糖肽定量方法结果；即，一种是基于糖肽的检测并且另一种是基于释放的聚糖的检测。
图3示出质谱，所述质谱证明通过糖肽和释放的聚糖方法进行的糖型定量之间的差异(参见图2)可能是由于糖肽分析中MS对糖主链的源内裂解、从而引起截短的聚糖伪影(即，G0F-GlcNAc和G1F-GlcNAc)增加以及主要聚糖(即，G0F和G1F)减少所致。所释放的聚糖方法通过与释放的聚糖结合的标记的荧光而不是MS信号来定量糖型。
图4示出如本文公开的糖肽定量的方法的工作流程图。
图5示出mAb1肽的一组HILIC-UV色谱图，所述色谱图示出通过两种不同的方法从胰蛋白酶消化物获得的mAb1肽分离的结果。
图6示出图5中所示的迹线的糖肽部分的特写图，其证明方法#2具有更好的分离、更尖锐的峰和更大的S/N比。
图7示出在糖肽上放大的mAb1糖肽的一组HILIC-TIC色谱图。如所示，方法#2具有更大的MS信号S/N比。
图8A和8B示出mAb1糖肽(M2+离子)的MS1光谱。
图9示出一组迹线和表，其示出通过HILIC柱上的糖肽分离进行的糖型定量与释放的聚糖分析的比较。
图10示出一组迹线和表，其证明干燥肽消化物可帮助浓缩糖肽，但不影响UV信号和聚糖的相对％PA。
图11示出一组迹线，其示出通过分别使用水和ACN中的0.05％和0.045％TFA(RP-LC肽作图流动相)来简化流动相制备和提高峰积分所做出的变化。
图12A、12B、12C和12D示出一组质谱结果，其证明流动相变化对糖肽(M2+离子)的MS信号没有影响。
图13示出一组迹线，其证明稀释至80％ACN的mAb1糖肽的溶液稳定性。
图14示出一组迹线，其证明具有漏切(miss-cut)糖肽的胰蛋白酶消化物使通过UV定量糖肽变得复杂。
图15示出一组迹线和表，其证明通过在线MS数据，EIC可用于查找每个峰中漏切糖肽的百分比，以帮助糖型定量。
图16示出一组迹线和表，其证明用胰蛋白酶再消化mAb2除去漏切糖肽，以便有助于糖型定量。
图17示出一组迹线，其证明甲酸铵显著改进从HILIC SPE洗脱糖肽。
图18示出一组迹线和表，其证明干燥或SPE净化/干燥对mAb1糖肽定量没有影响。
图19示出一组迹线和表，其证明通过糖肽和释放的聚糖分析的相似mAb3糖型定量。
图20A和20B示出一组迹线和表，其示出通过糖肽和释放的聚糖分析使用还原的和未还原的mAb3胰蛋白酶消化物进行的相似糖型定量。
图21示出一组迹线，其说明在有和无岩藻糖基化的情况下IgG1和IgG4糖肽分离的比较。
图22示出示意性工作流程图，其说明糖肽定量的方法，所述方法包括本文公开的方法。
具体实施方式
在描述本发明之前，应了解，本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可有所改变。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并且并不意图是限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求限制。任何实施方案或实施方案的特征可彼此组合，并且此类组合明确地涵盖在本发明的范围内。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如本文中所用，术语“约”在用于提及特定引述的数值时，是指所述值可从所引述值变化不大于1％。例如，如本文中所用，表述“约100”包括99和101以及介于之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料可用于本发明的实践或测试中，但现在描述优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均以引用的方式整体并入本文。
本文中使用的缩写
PTM：翻译后修饰
RP-LC-MS/MS：反相液相色谱串联质谱
mAb：单克隆抗体
IgG：免疫球蛋白G
LC：轻链
HC：重链
MS：质谱
SPE：固相萃取
HILIC：亲水相互作用液相色谱
UV：紫外线
TFA：三氟乙酸
ACN：乙腈
定义
如本文所用，术语“抗体”意指包含四个多肽链，即通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链(即，“全抗体分子”)的免疫球蛋白分子，以及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。每条重链包含重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(包含结构域CH1、CH2和CH3)。在各种实施方案中，所述重链可以是IgG同种型。在一些情况下，所述重链选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些实施方案中，所述重链具有同种型IgG1或IgG4，任选地包括同种型IgG1/IgG2或IgG4/IgG2的嵌合铰链区。每条轻链包含轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可进一步细分为称为互补决定区(CDR)的具有高变性的区，其间散布有更保守的区，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括提及任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化的免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体分子，如从转染以表达所述抗体的宿主细胞中分离的抗体。关于抗体结构的综述，参见Lefranc等人,IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cellreceptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,27(1)Dev.Comp.Immunol.55-77(2003)；和M.Potter,Structural correlates ofimmunoglobulin diversity,2(1)Surv.Immunol.Res.27-42(1983)。
术语抗体还涵盖双特异性抗体，所述双特异性抗体包括可结合至多于一种不同表位的异四聚体免疫球蛋白。包含单一重链和单一轻链以及六个CDR的双特异性抗体的一半结合至一种抗原或表位，并且所述抗体的另一半结合至不同的抗原或表位。在一些情况下，所述双特异性抗体可结合同一抗原，但结合在不同的表位或非重叠表位处。在一些情况下，双特异性抗体的两半具有相同的轻链，同时保留双重特异性。双特异性抗体总体描述于美国专利申请公布号2010/0331527(2010年12月30日)中。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指保留特异性地结合至抗原的能力的抗体的一个或多个片段。涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，其为由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其为包含由在铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人(1989)Nature241:544-546)；(vi)分离的CDR；以及(vii)scFv，其由通过合成接头连接以形成单一蛋白链的Fv片段的两个结构域VL和VH组成，其中所述VL和VH区配对以形成单价分子。术语“抗体”还涵盖其他形式的单链抗体，如双抗体(参见例如，Holliger等人(1993)90PNAS U.S.A.6444-6448；和Poljak等人(1994)2Structure 1121-1123)。
此外，可使用本领域公知的标准重组DNA技术获得抗体及其抗原结合片段(参见Sambrook等任，1989)。
术语“人抗体”意图包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)，例如在CDR中并且尤其在CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不意图包括来源于另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的CDR序列移植至人FR序列上的mAb。所述术语包括在非人类哺乳动物中或非人类哺乳动物的细胞中重组产生的抗体。所述术语不意图包括从人受试者中分离或在人受试者中产生的抗体。
如本文所用的术语“糖肽/糖蛋白”是在其合成期间或之后具有共价键合的碳水化合物或聚糖的经修饰的肽/蛋白质。在某些实施方案中，糖肽获自单克隆抗体，例如获自单克隆抗体的蛋白酶消化物。
如本文所用的术语“聚糖”是包含一个或多个糖单元的化合物，所述糖单元通常包括葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)(Frank Kjeldsen,等人Anal.Chem.2003,75,2355-2361)。糖蛋白中的聚糖部分(如单克隆抗体)是鉴定其功能或细胞位置的重要特征。例如，特定单克隆抗体用特定聚糖部分进行修饰。
术语“亲水相互作用色谱法”或HILIC意图包括使用亲水性固定相和疏水性有机流动相的方法，其中亲水性化合物的保留时间比疏水性化合物更长。在某些实施方案中，所述方法利用水混溶性溶剂流动相。
如本文所用，术语“样品”是指包含至少一种分析物分子的分子混合物，所述分析物分子例如糖肽，如获自单克隆抗体并根据本发明方法进行操作，包括例如分离、分析、萃取、浓缩或谱分析。
如本文所用，术语“分析(analysis)”或“分析(analyzing)”可互换使用并且是指分离(separating)、检测、分离(isolating)、纯化、增溶、检测和/或表征目标分子(例如糖蛋白)的各种方法中的任一种。实例包括但不限于固相萃取、固相微萃取、电泳、质谱(例如SPE HILIC、MALDI-MS或ESI)、液相色谱(例如，高效液相色谱，例如反相、正相或尺寸排阻液相色谱、离子对液相色谱)、液-液萃取(例如，加速流体萃取、超临界流体萃取)、微波辅助萃取、膜萃取、索氏萃取、沉淀、澄清、电化学检测、染色、元素分析、埃德蒙降解、核磁共振、红外分析、流动注射分析、毛细管电色谱、紫外检测以及它们的组合。
如本文所用，术语“谱分析”是指组合使用以提供样品中的糖肽的含量、组成或特征比的多种分析方法中的任一种。
如本文所用，“亲水性富集底物”是在允许结合的条件(例如pH、离子强度等)下优先结合亲水性材料的色谱材料。在一些实施方案中，亲水性富集底物用于SPE。
如本文所用，术语“色谱表面”包括暴露于样品或分析物的表面。色谱表面可进行化学修饰、功能化或活化，或者具有微观结构，例如孔。在某些实施方案中，色谱表面可以是疏水性的、亲水性的(极性的)或离子的。在其他实施方案中，色谱表面是完全多孔的、表面多孔的或无孔的。
如本文所用，术语“色谱核心”包括色谱材料，包括但不限于呈颗粒、整料或另一种合适结构形式的有机材料(如二氧化硅)，其形成本发明的材料的内部部分。在某些方面，如本文所定义，色谱核心的表面代表色谱表面，或代表被色谱表面包裹的材料。色谱表面材料可以使得离散或明显迁移可辨别的方式设置在色谱核心上、与色谱核心键合或退火，或者可以与色谱核心的表面掺混、从而产生材料的分级且没有离散的内部核心表面的方式结合至色谱核心。在某些方面，色谱表面材料可与色谱核心的材料相同或不同，并且可表现出与色谱核心不同的物理或物理化学性质，包括但不限于孔体积、表面积、平均孔直径、碳含量或水解pH稳定性。
如本文所用，术语“亲水性的”描述对水具有亲和力、吸引水、吸附水或吸收水。
如本文所用，术语“疏水性的”描述对水缺乏亲和力、排斥水或不能吸附或吸收水。
“固相萃取”或“SPE”是通常与定量化学分析，例如高效液相色谱(HPLC)或气相色谱(GC)结合使用的色谱技术。SPE的目标是从含有不想要的污染物的复杂样品基质中分离目标分析物。所述分离的目标分析物回收在与定量分析相容的溶液中。这种含有目标化合物的最终溶液可直接用于分析或蒸发，并在较小体积的另一溶液中重构，以进一步浓缩目标化合物，从而使其更易于检测和测量。
如本文所用，“色谱法”是指分离混合物，例如含有糖肽的混合物的过程。它涉及使混合物通过固定相，所述固定相使目标分子与混合物中的其他分子分离，并允许分离一种或多种目标分子。色谱分离方法的实例包括毛细管作用色谱法如纸色谱法、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法、快速蛋白质液相色谱法(FPLC)、纳米反相液相色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法如凝胶过滤色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、高效液相色谱法(HPLC)、亲水相互作用液相色谱法(HILIC)和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)等。
如本文所用，“接触”包括将溶液或固相中的至少两种物质聚集在一起，例如使色谱材料的固定相与样品接触。
总体说明
由于这些药物对靶抗原的特异性，单克隆抗体(MAb)已成为癌症和其他慢性疾病的有效生物药物，例如，通过活化免疫系统以杀死肿瘤细胞、阻断肿瘤细胞增殖的信号转导、携带药物至肿瘤细胞或作为放射靶。免疫球蛋白的糖基化影响它们的物理化学性质和它们的细胞介导的效应子功能，如补体结合和活化。这些生物学功能可能不仅取决于N-连接的寡糖的存在与否，而且取决于寡糖的具体结构。此外，抗体的N-糖基化通常在生物药物的制造中进行表征。特别地，有时将单克隆抗体的聚糖谱定义为关键的质量属性，因为它可以是功效、免疫原性和制造条件的量度。因此，重要的是用于聚糖分析的方法表现出高灵敏度以有助于详细表征。在治疗性单克隆抗体的制造中，位点特异性N-糖基化和N-聚糖位点占用的评估是重要的。因此，需要高效率/高分辨率方法来分离从单克隆抗体获得的糖肽。所公开的发明满足了所述需求。
本文公开了一种用于糖肽分析和定量的新方法，其中将固相萃取(SPE)与亲水相互作用液相色谱(HILIC)柱联接以分离糖基化和非糖基化胰蛋白酶肽。在各种实施方案中，这些分离技术与紫外线(UV)检测和在线质谱(MS)检测结合以阐明聚糖结构。在一些方法中，聚糖表征依赖于从肽链中释放聚糖，然后将所述聚糖与肽分开进行分析(参见例如，图1-3)。因为聚糖不适合进行UV检测，所以释放的聚糖通常用荧光团标签(例如，邻氨基苯甲酰胺、邻氨基苯甲酸或2-氨基吡啶)标记以用于荧光检测，或者用具有显著碱度的分子(例如普鲁卡因胺)标记以便能够进行MS检测。然而，这种聚糖分析方法只能给出糖基化的整体评估。特别地，由于这种工作流程依赖于释放程序，所以丢失了有关聚糖的位点特异性信息。相比之下，在所公开的方法中，分离的糖肽是基于同一色谱分离内的糖型结构的差异来分离。此外，使用标准RP-LC方法未观察到使用HILIC柱实现的具有不同聚糖异构体的糖肽的分离(参见例如，图1-3)。通过优化HILIC的样品制备条件(包括稀释、真空干燥和/或固相萃取(SPE))，开发了一种工作流程，所述工作流程能够分析来自不同类型的肽作图样品制剂的糖肽(例如，参见图22)。如本文所公开的，发明人已经证明，所述方法和工作流程适用于使用与在线MS检测结合的UV检测，在肽水平下鉴定和定量抗体中个别糖型的相对水平(参见例如图4和22)。
本文公开的方法包括糖肽的纯化和/或分离和/或分析，所述糖肽例如是获自单克隆抗体(如已经用一种或多种蛋白酶消化的抗体)的糖肽。所公开的方法提供改进的分离和分析结果，以及在聚糖仍与它们的抗体片段共价连接时研究聚糖的能力。糖型的这种肽水平分析还在生物药物表征中提供益处，因为单一样品可用于反相肽作图(例如胰蛋白酶消化)和基于HILIC的糖肽作图。此外，保留聚糖与肽/蛋白质之间的键联有助于基于糖肽的蛋白质组分进行UV和MS检测，例如消除了标记游离聚糖的必要性。
在某些实施方案中，所述方法包括在允许和/或引起糖肽结合至亲水性富集底物的条件下，使包含所述糖肽的样品与所述亲水性富集底物接触。一旦将样品负载到亲水性富集底物上，就可使一系列定制的洗涤溶液和洗脱溶液通过亲水性富集底物以使污染物与糖肽分离，然后收集糖肽用于进一步分析。在一些实施方案中，洗涤亲水性富集底物以从样品中除去非糖肽污染物。因此，在显著程度上，糖肽富集在亲水性富集底物上，如富集在亲水性富集底物的色谱表面上。在某些实施方案中，亲水性富集底物包含基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂材料。在某些实施方案中，亲水性富集底物被配置用于固相萃取(SPE)。
设计用于SPE的装置通常包括色谱吸附剂(例如，亲水性富集底物，如基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂)，其允许使用者优先保留目标组分(在这种情况下为糖肽)。SPE装置通常包括样品保持储库、用于容纳吸附剂的构件以及用于将离开装置的流体引导至合适的收集容器中的流体导管或喷口。SPE装置可呈单孔形式(其对于制备少量样品而言方便且成本有效)，或多孔形式(其非常适合于并行制备大量样品)。多孔形式通常用于机器人流体分配系统。典型的多孔形式包括48孔、96孔和384孔标准板形式。通常，通过使用专门设计的真空歧管跨SPE装置抽真空或通过使用离心力或重力来迫使流体通过所述装置并进入收集容器。离心力是通过将SPE装置与合适的收集托盘一起放入专门为预期目的而设计的离心机中而产生。对于SPE装置而言有利地是具有高容量来保留具有广泛范围的色谱极性的目标化合物，当样品污染物被洗涤为废物后能够保持目标化合物保留，以及提供以尽可能小的洗脱体积洗脱目标化合物、从而使SPE过程中获得的目标化合物浓度程度最大化的能力。
根据所公开的方法，可使用多种固相萃取装置。在一个实施方案中，SPE装置选自由以下组成的组：微洗脱板、色谱柱、薄层板、样品净化装置、注射筒、微量滴定板和色谱制备装置。
基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂材料(包括SPE材料)在本领域中是已知的，并且可例如以GlycoWorks HILIC SPE板的形式从Waters Corporation商购获得(参见例如美国专利号6,723,236、7,052,611和7,192,525)。在一些实施方案中，制备亲水性富集底物以通过洗涤(例如预洗涤步骤)来添加样品。在一些实施方案中，在与糖肽样品接触之前洗涤亲水性富集底物。在一些实施方案中，用水(H2O)和/或ACN溶液(例如，水中的ACN)，如按体积计约60％至约95％的ACN溶液，例如按体积计约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的ACN溶液(其余为水)洗涤亲水性富集底物。
在各种实施方案中，使亲水性富集底物与含有糖肽的样品接触以进行富集。关于样品溶液，其将包括溶解在溶剂中的糖肽，在所述溶剂中糖肽可溶并且糖肽将结合至亲水性富集底物。优选地，结合是强的，从而使得大部分糖肽结合。在一些情况下，基本上所有糖肽都将被结合。在各种实施方案中，所述溶剂是水溶液，通常含有缓冲剂、盐和/或表面活性剂以使糖肽溶解并稳定。在一些实施方案中，糖肽样品是按体积计含有约0.1％至约0.5％TFA的约60％ACN至90％ACN和10％至约40％水的溶液，如含有0.2％TFA的约80:20ACN:(v/v)。低pH可用于维持高度有机溶剂中的肽溶解度，所述有机溶剂是例如pH低于约6.5，如低于约6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或3.0的溶液。
然后洗涤亲水性富集底物以除去污染物，如未显著结合至亲水性富集底物的非糖基化肽。此类污染物可被丢弃。在一些实施方案中，将亲水性富集底物用酸和乙腈(ACN)的水(H2O)溶液洗涤，如甲酸和/或三氟乙酸(TFA)和乙腈(ACN)的水(H2O)溶液洗涤。在某些实施方案中，甲酸和ACN的水溶液包含按体积计约0.5％至约5％的甲酸和按体积计约85％至约95％的ACN，其余为水，例如按体积计约0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％的甲酸和按体积计约80％、85％、90％或95％的ACN。在某些实施方案中，TFA和ACN的水溶液包含按体积计约0.5％至约5％的TFA和按体积计约85％至约95％的ACN，其余为水，例如按体积计约0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5.0％的TFA和按体积计约80％、85％、90％或95％的ACN。在某个实例中，洗涤溶液是按体积计1％的甲酸、9％的H2O、90％的ACN溶液。在某个实例中，洗涤溶液是按体积计1％的TFA、9％的H2O、90％的ACN溶液。
一旦除去了污染物，就使亲水性富集底物与洗脱溶液接触，以将糖肽从所述亲水性富集底物洗脱。基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂具有弱碱性表面和阴离子交换的潜力。然而，来自基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂的糖肽的相对和总回收量可能对洗脱条件特别敏感。偏向回收或物种形成可能对样品制备程序造成问题。除了不能提供样品中存在的种类的准确表示，它还可指示一种方法，所述方法不够稳健并且可能无法再现性地确定所获得的相对丰度谱，尤其是对于回收最差的种类而言。例如，与为本公开的主题的糖肽相反，为了回收衍生化的聚糖，建议将ACN中的乙酸铵用作洗脱溶液。然而，在糖肽的情况下，ACN中的乙酸铵不能产生良好的结果。因此，在某些实施方案中，用甲酸铵和ACN的水溶液将糖肽从基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂洗脱。在一些实施方案中，甲酸铵和ACN的水溶液包含约100-400mM甲酸铵和约2.5％至约10％ACN，如约100mM甲酸铵、约150mM甲酸铵、约200mM甲酸铵、约250mM甲酸铵、约300mM甲酸铵、约350mM甲酸铵或约400mM甲酸铵和约2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或10.0％ACN。在一个具体实例中，甲酸铵和ACN的水溶液包含约200mM甲酸铵和约5％ACN。
一旦糖肽从亲水性富集底物洗脱，就可对所得富集的糖肽样品进行进一步分离和分析，例如色谱和/或质谱分析。在实施方案中，将富集的糖肽样品施加至分离柱，且随后例如使用流动相梯度从分离柱洗脱以解析糖肽的单个种类。
在一些实施方案中，进行溶剂梯度、步骤洗脱和/或多维洗脱以从分离柱洗脱和/或分离糖肽。梯度的使用在色谱领域是众所周知的。基本原理涉及将分析物吸附至分离柱上，然后用解吸溶剂梯度洗脱。梯度是指溶剂的至少一种特征的变化，例如影响结合相互作用强度的一些剂的pH、离子强度、极性或浓度的变化。
所用的梯度可以是渐变的，或者可逐步添加。在一个实施方案中，采用在一维或多维中变化的两个或更多个解吸溶剂大丸剂。例如，两个或更多个大丸剂的pH、离子强度、疏水性等可变化。可选择洗涤溶液(如果使用)，以使得其将除去非所需污染物，并且对结合的糖肽的损失或损害最小。洗涤溶液的性质可介于样品和解吸溶液的性质之间。例如以洗脱梯度选择溶剂以与糖肽和最终检测方法相容。通常，所用的溶剂是已知的常规溶剂。在各种实施方案中，可从中选择合适的溶剂的溶剂包括氢氧化铵、三乙胺、磷酸二铵、二氯甲烷、乙腈(有或没有少量的碱性或酸性改性剂)、甲醇(含有大量的改性剂，例如乙酸或三乙胺，或水与甲醇或乙腈的混合物)、乙酸乙酯、氯仿、己烷、异丙醇、丙酮、碱性缓冲剂、高离子强度缓冲剂、酸性缓冲剂、强酸、强碱、含酸/碱的有机混合物、酸性或碱性甲醇、四氢呋喃和水。
液相色谱(包括HPLC)可用于分析结构，如糖肽。可使用各种形式的液相色谱法来研究这些结构，包括阴离子交换色谱法、反相HPLC、尺寸排阻色谱法、高效阴离子交换色谱法和正相(NP)色谱法，包括NP-HPLC(参见例如，Alpert等人,J.Chromatogr.A 676:191-202(1994))。亲水相互作用色谱法(HILIC)是NP-HPLC的变型，其可使用部分水性流动相进行，从而允许肽、碳水化合物、核酸和许多蛋白质的正相分离。HILIC的洗脱顺序是极性最小到极性最大，这与反相HPLC中的洗脱顺序相反。HPLC可例如在来自Waters的HPLC系统(例如，Waters 2695Alliance HPLC系统)、Agilent、Perkin Elmer、Gilson等上进行。
NP-HPLC(优选HILIC)是可用于本文所述的方法中的特别有用形式的HPLC。NP-HPLC基于分析物与固定相(例如，底物)之间的极性相互作用来分离分析物。极性分析物与极性固定相缔合并由所述极性固定相保留。吸附强度随着分析物极性的增加而增加，并且极性分析物与极性固定相(相对于流动相)之间的相互作用使洗脱时间增加。在流动相中使用更多极性溶剂将减少分析物的保留时间，而更多的疏水性溶剂倾向于增加保留时间。
各种类型的底物可用于NP-HPLC(例如用于柱色谱法)，包括二氧化、氨基、酰胺、纤维素、环糊精和聚苯乙烯底物。有用的底物的实例，例如可用于柱色谱法中的底物包括：聚磺基乙基天冬酰胺(例如，来自PolyLC)；磺基甜菜碱底物，例如-HILIC(例如，来自SeQuant)；/>HS(例如，来自Applied Biosystems)；/>S(例如，来自Applied Biosystems)；聚羟乙基天冬酰胺(例如，来自PolyLC)；Zorbax 300SCX(例如，来自Agilent)；/>(例如，来自PolyLC)；Amide-80(例如，来自Tosohaas)；TSK/>酰胺-80(例如，来自Tosohaas)；聚羟乙基A(例如，来自PolyLC)；Glyco-Sep-N(例如，来自Oxford GlycoSciences)；以及Atlantis HILIC(例如，来自Waters)。可在所公开的方法中使用的柱包括利用一种或多种以下官能团的柱：氨基甲酰基、磺丙基、磺乙基(例如，聚(2-磺乙基天冬酰胺))、羟乙基(例如，聚(2-羟乙基天冬酰胺))和芳族磺酸基团。
所用的流动相可包括有或没有离子配对剂(例如，乙腈和水)的缓冲液。离子配对剂包括甲酸酯、乙酸酯、TFA和盐。可使用缓冲液的梯度，例如，如果使用两种缓冲液，则在色谱运行过程中，在第二缓冲液的浓度或百分比增加时，第一缓冲液的浓度或百分比可降低。例如，在色谱运行过程中第一缓冲液的百分比可从约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％降低至约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％。作为另一个示例，在同一运行过程中第二缓冲液的百分比可从约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％增加至约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％。任选地，在色谱运行结束时，第一缓冲液和第二缓冲液的浓度或百分比可返回其起始值。作为一个实例，第一缓冲液的百分比可在五个步骤中从85％到63％到59％到10％到85％变化；而在相同步骤中第二缓冲液的百分比从15％到37％到41％到90％到15％变化。百分比可作为线性梯度或以非线性(例如，逐步的)方式逐渐改变。例如，梯度可以是多相的，例如，双相的、三相的等。在优选的实施方案中，本文所述的方法使用减少的乙腈缓冲液梯度，其对应于在不使用离子配对剂的情况下增加流动相的极性。
可在整个色谱运行中将柱温度保持在恒定温度，例如使用市售柱加热器。在一些实施方案中，将柱保持在介于约18℃至约70℃之间的温度，例如约30℃至约60℃、约40℃至约50℃，例如约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃或约70℃。优选的温度是约45℃。
流动相的流速可介于约0至约100ml/min之间。对于分析目的，流速通常在0至10ml/min的范围内，对于制备型HPLC，可使用超过100ml/min的流速。例如，流速可以是约0.5、约1、约1.5、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5或约5ml/min。替换具有相同填充量、相同长度但较小直径的色谱柱需要降低流速，以保留如在较大直径的色谱柱情况下观察到的相同保留时间和峰分辨率。优选地，在4.6×100mm，5μm柱中使用约1ml/min的流速。
运行时间可介于约15至约240分钟之间，例如，约20至约70分钟、约30至约60分钟、约40至约90分钟、约50分钟至约100分钟、约60至约120分钟、约50至80分钟。
可将NP-HPLC调节为在纳米级上进行，例如使用具有约75μm内径的柱(参见例如，Wuhrer等人,Anal.Chem.76:833-838(2004)；Wuhrer等人,Internat.J.Mass.Spec.232:51-57(2004))。
在某些实施方案中，分离柱是亲水相互作用(HILIC)分离柱，并且随后从所述HILIC分离柱洗脱糖肽，例如使用流动相梯度来解析糖肽的单个种类，从而纯化和或分离样品中的糖肽。在某些实例中，从HILIC洗脱的糖肽被分离成一个或多个级分。此类级分可用于后续分析，如MS分析。在某些实施方案中，所述方法包括鉴定所述级分中的一个或多个中存在的糖肽和/或聚糖。在某些实施方案中，聚糖是N-聚糖。在一些实施方案中，流动相梯度是10mM pH 4.5的甲酸铵至含有10mM pH 4.5的甲酸铵的90％ACN。在某些实施方案中，流动相梯度是在H2O中的0.1％TFA至在ACN中的0.1％TFA。
糖肽获自糖基化蛋白，如单克隆抗体。糖基化的单克隆抗体可通过还原、酶消化、变性、片段化、化学裂解以及它们的组合来制备。本文公开的方法适用于任何抗体同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。
还原是将3维蛋白质(如单克隆抗体)中的二硫键还原为两个硫醇。可通过在还原剂(例如TCEP-HCl)存在下热变性、添加表面活性剂或添加变性剂(例如盐酸胍(6M))来进行还原。酶降解是用蛋白酶(例如，胰蛋白酶或无色杆菌蛋白酶I(Lys-C))消化蛋白质。另外，可通过加热或化学品或它们组合使糖蛋白变性。片段化涉及通过物理、生物或化学方法裂解单或多亚基蛋白质(如单克隆抗体)的蛋白质部分。例如，来自酿脓链球菌(IdeS)的免疫球蛋白降解酶通常用于抗体亚基片段化。
在各种实施方案中，可在与亲水性富集底物接触之前通过还原、酶降解、变性或片段化来处理和制备样品中的抗体。所述方法提供新颖的色谱方法来通过片段和肽水平的HILIC-UV-MS分析而表征蛋白质(例如单克隆抗体(mAb)治疗剂)的糖基化。在某些实施方案中，在任何中间步骤的样品可进行浓缩、脱盐等。
在一些实施方案中，所述方法还包括例如使用来自糖肽的肽部分的UV信号来检测糖肽。可对样品的级分进行这种操作，并允许选择特定级分用于进一步分析，例如质谱(MS)分析。因此，在其他实施方案中，检测步骤包括质谱或液相色谱-质谱(LC-MS)。在用于分析生物分子的质谱应用中，将分子从液相或固相转移至气相和真空相。由于许多生物分子大且脆弱(蛋白质是主要实例)，因此将它们转移至真空相的最有效方法中的两种是基质辅助激光解吸电离(MALDI)或电喷雾电离(ESI)。这些方法的使用的方面以及样品制备要求是本领域普通技术人员已知的。一般来说，ESI更加灵敏，而MALDI更快。值得注意的是，一些肽在MALDI模式下比在ESI更好离子化，反之亦然(Genome Technology，六月220，第52页)。本发明的萃取通道方法和装置特别适合于制备用于MS分析的样品，特别是生物分子样品，如糖肽。本发明的重要优点在于，它允许制备可直接分析的富集的样品，而无需干预过程步骤(例如浓缩或脱盐)。
通过将样品与挥发性酸和有机溶剂混合并通过高压充电的导电针注入样品来进行ESI。从针头端喷出(或喷射)的带电液滴直接进入质谱仪，并在所述液滴飞入时通过加热和真空使其干燥。在液滴干燥后，剩余的带电分子被电磁透镜引导至质量检测器中并进行质量分析。在一个实施方案中，洗脱的样品直接从毛细管沉积到电喷雾喷嘴中，例如，毛细管充当样品负载器。在另一个实施方案中，毛细管本身充当萃取装置和电喷雾嘴两者。
对于MALDI，将分析物分子(例如蛋白质)沉积在金属靶上，并与有机基质共结晶。将样品干燥并插入质谱仪中，并且通常经由飞行时间(TOF)检测进行分析。在一个实施方案中，将洗脱的样品直接从毛细管沉积到金属靶上，例如毛细管本身充当样品负载器。在一个实施方案中，将萃取的分析物沉积在MALDI靶上，添加MALDI电离基质，并且将样品电离并例如通过TOF检测进行分析。
在一些实施方案中，使用其他电离模式，例如ESI-MS、涡轮喷雾电离质谱、纳米喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、SELDI-MS和MALDI-MS。一般来说，这些方法的优点是它们允许“即时”纯化样品并直接引入电离环境。重要的是要注意，各种电离和检测模式对所使用的解吸溶液的性质引入它们自己的约束，并且重要的是解吸溶液必须与两者相容。例如，在许多应用中，样品基质必须具有较低的离子强度，或存在于特定pH范围内，等等。在ESI中，样品中的盐可通过降低电离或堵塞喷嘴而阻止检测。通过以低盐形式提供分析物和/或通过使用挥发性盐可解决这一问题。对于MALDI，分析物应在与在靶标上点样和所用的电离基质相容的溶剂中。
实施例
提出下列实施例以为本领域普通技术人员提供如何制造并使用本发明的方法的完整公开内容和描述，但不意图限制发明人所认为的发明范围。虽然已尽力确保就所用数字(例如量、温度等)来说的准确性，但仍应考量一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，室温是约25℃，并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1：糖肽和释放的聚糖的基于RPLC-UV-MS的先前方法的比较。
图1是示出当前糖肽定量方法的示意性工作流程图。在变性、还原和烷基化后，用胰蛋白酶消化治疗性抗体。通过糖肽质量峰的峰强度(高度)进行相对定量。释放的聚糖方法通过与释放的聚糖结合的标记的荧光而不是MS信号来定量糖型。图2是示出通过释放的聚糖(用荧光试剂，来自Waters的RapiFluor-MS标记)和糖肽定量的每种糖型的相对定量的比较的表。第3、5、7和8行中示出方法之间定量的主要差异。图3是质谱，所述质谱证明通过糖肽和释放的聚糖方法进行的糖型定量之间的差异可能是由于糖肽分析中MS对糖主链的源内裂解、从而引起截短的聚糖伪影(即，G0F-GlcNAc和G1F-GlcNAc)增加以及主要聚糖(即，G0F和G1F)减少所致。这一结果表明，在肽水平进行聚糖分析需要新的和改进的方法。
实施例2：使用HILIC-UV-MS进行糖肽分析的新方法。
可通过常规进行的还原或非还原肽作图方法来制备来自治疗性抗体的肽。然后在HILIC-UV-MS分析之前，将消化物稀释至最终80％ACN(v/v)。
LC系统：具有PDA(UV)检测器的Waters ACQUITY I-Class系统
MS系统：Waters XEVO G2-S QTof或Thermo Scientific Q Exactive Plus
柱：Waters ACQUITY聚糖BEH酰胺HILIC柱
图5是mAb1肽的一组HILIC-UV色谱图，所述色谱图示出通过两种不同的方法从胰蛋白酶消化物获得的mAb1肽分离的结果。方法#1使用甲酸铵，而方法#2使用TFA。使用PDA检测器与在线MS检测，通过UV定量不同糖型的相对水平。图6是图5中所示的迹线的糖肽部分的特写图，其证明方法#2具有更好的分离、更尖锐的峰和更大的S/N比。图7是在所述糖肽部分上放大的mAb1糖肽的一组HILIC-TIC色谱图。如所示，如所示，方法#2具有更大的MS信号S/N比。图8A和8B是mAb1糖肽(M2+离子)的MS1光谱。聚糖的MS源内裂解不是通过UV定量糖型中的因素。图9是一组迹线和表，其示出HILIC柱上的糖肽分离与释放的聚糖分析的比较。对于mAb1，观察到通过糖肽和释放的聚糖分析进行的相似糖型定量。重要的是，在两种方法之间未观察到糖型定量的主要差异，从而证明HILIC色谱柱分离对于糖肽分析是可行的。另外，在两次分析之间总岩藻糖基化和半乳糖基化水平是一致的。截短的聚糖伪影不会影响通过HILIC-UV进行的糖肽定量。这表明通过以前的RPLC分析观察到的伪影是由于MS诱导的聚糖的源内裂解所致。
稀释的消化液可通过干燥进行浓缩：如果消化物具有<0.5mg/mL的浓度，则样品可通过真空干燥并且将干燥的肽重悬在含有0.2％TFA的80:20ACN:水(v/v)中至0.5mg/mL或更高来浓缩。需要低pH值以保持高度有机溶剂中的肽溶解度。图10是一组迹线和表，其证明干燥肽有助于使肽浓缩，并且使用不同的样品量(例如5-20μg，左上)是一致的，但不影响UV信号(左下)和相对聚糖的％PA(右表)。图11是一组迹线，其示出为简化流动相制备和改进峰积分而进行的变化。流动相从水/ACN中的0.1％TFA变为用于肽作图的相同流动相缓冲液(分别在水和ACN中的0.05％和0.045％TFA)。图12A、12B、12C和12D是一组质谱结果，其示出流动相变化对糖肽(M2+离子)的MS信号没有影响。图13是一组迹线，其证明稀释至80％ACN中的的mAb1糖肽的溶液稳定性。
漏切糖肽的鉴定：图14是一组迹线，其示出具有漏切糖肽的消化物使通过UV定量糖肽变得复杂。图15是一组迹线和表，其证明通过在线MS数据，萃取离子色谱(EIC)可用于查找每个峰中漏切糖肽的百分比。来自在线MS检测的EIC用于计算每个共洗脱峰中的漏切肽与一种或多种常规胰蛋白酶糖肽的比率，并过滤掉由于漏切而产生的UV信号用于糖型定量。或者，可用胰蛋白酶对消化物进行重新消化，以将漏切物转化为常规胰蛋白酶糖肽。
对于再消化，使用以下方案：用3M Tris碱将消化物的pH值升高至约8.0；添加1:5E:S比率(w/w)的胰蛋白酶，在50℃下孵育1小时；并且添加0.2％TFA(最终)并稀释至80％ACN(最终)用于HILIC分析。图16是一组迹线和表，其证明用胰蛋白酶再消化mAb2消除对于糖型定量的漏切糖肽影响。
受试剂污染的消化物可用固相萃取净化，并且通过干燥浓缩：如果消化物具有<0.5mg/mL的浓度，则其可通过真空干燥并将干燥的肽重悬在含有0.2％TFA的80:20ACN:水(v/v)中至0.5mg/mL或更高来进行浓缩。需要低pH值以保持高度有机溶剂中的肽溶解度。
可通过固相萃取(SPE)将消化物中的盐、试剂或洗涤剂清洗干净，然后真空干燥。
Waters GlycoWorks HILICμ洗脱板(零件号186002780)：用水、然后80:15ACN:水(v/v)洗涤；添加肽消化物(稀释至80％ACN，v/v)；用1:9:90甲酸水:ACN(v/v)洗涤两次；用200mM甲酸铵；5％ACN洗脱；真空干燥所洗脱的糖肽；并重悬于含有0.2％TFA的80:20ACN:水(v/v)中至0.5mg/mL。
图17是一组迹线，其证明甲酸铵显著改进从HILIC SPE洗脱糖肽。
图18是一组迹线和表，其证明干燥或SPE净化/干燥对mAb1糖肽定量没有影响。
图19是一组迹线和表，其证明通过糖肽和释放的聚糖分析的相似mAb3糖型定量。
图20A和20B是一组迹线和表，其示出通过糖肽和释放的聚糖分析使用还原的和未还原的mAb3胰蛋白酶消化物进行的相似糖型定量。
图21是一组迹线，其示出在有和无岩藻糖基化的情况下IgG1和IgG4糖肽分离的比较。
本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制。实际上，除了本文描述的那些，根据前面的描述和附图，本发明的多种修改对于本领域技术人员是显而易见的。此类修改意图属于所附权利要求的范围之内。

Claims (23)

1.一种分离糖肽的方法，所述方法包括：
在允许糖肽结合至亲水性富集底物的条件下使包含所述糖肽的样品与所述亲水性富集底物接触；
洗涤所述亲水性富集底物以从所述亲水性富集底物中除去非糖肽污染物；
用甲酸铵和乙腈(ACN)的水溶液将所述糖肽从所述亲水性富集底物洗脱，以产生富集的糖肽样品；
将所述富集的糖肽样品施加至分离柱；以及
将所述糖肽从所述分离柱洗脱，从而分离所述样品中的糖肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述亲水性富集底物包括固相萃取(SPE)色谱底物。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述亲水性富集底物包括基于二氧化硅的氨基丙基吸附剂材料。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述甲酸铵和ACN的水溶液包含在水中的100-400mM甲酸铵和2.5％至10％ACN。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述甲酸铵ACN溶液包含在水中的200mM甲酸铵和5％ACN。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中用甲酸和ACN洗涤溶液洗涤所述亲水性富集底物以除去非糖肽污染物，所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计0.5％至5％的甲酸和按体积计85％至95％的ACN，其余为水。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述甲酸和ACN洗涤溶液包含按体积计1％的甲酸、9％的H2O和90％的ACN。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述分离柱包括亲水性相互作用柱。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中将所述糖肽从所述分离柱洗脱还包括将所述糖肽分离成一个或多个级分。
10.如权利要求9所述的方法，其中将所述糖肽分离成一个或多个级分包括向所述分离柱施加流动相梯度。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述流动相梯度包括10mM pH 4.5的甲酸铵至含有10mM pH 4.5的甲酸铵的90％ACN。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述流动相梯度包括在H2O中的0.05％TFA或在ACN中的0.045％TFA。
13.如权利要求9至12中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定所述级分中的一个或多个中存在的所述糖肽。
14.如权利要求9至13中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定与所述级分中的一个或多个中存在的所述糖肽相关的聚糖。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述聚糖包括N-聚糖。
16.如权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述糖肽获自单克隆抗体。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述单克隆抗体具有同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。
18.如权利要求16或17所述的方法，所述方法还包括用蛋白酶消化所述单克隆抗体。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述蛋白酶包括胰蛋白酶。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述洗脱的糖肽进行质谱分析。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述洗脱的糖肽的水平下的糖基化谱分析。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，所述方法还包括用乙腈(ACN)水溶液预洗涤所述亲水性富集底物。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，所述方法还包括在与所述亲水性富集底物接触之前，将所述包含糖肽的样品稀释于ACN水溶液中。
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