CN113150062B - 一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法,首先合成葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料,该材料可以利用亲水作用特异性富集糖基化肽段,而将大分子的蛋白排阻在介孔外。本发明方法简单、成本低廉,材料具有较好的亲水性和生物兼容性,实现了对糖基化肽的高灵敏度和高重复性的富集,结合MALDI‑TOF MS或者nano‑LC‑MS/MS能够实现大规模鉴定内源性糖基化肽,在内源性肽组学中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法,具体涉及使用新型磁性亲水性纳米介孔吸附材料分离富集内源性糖基化肽的方法,尤其涉及一种基于葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料选择性富集提纯内源性糖基化肽的方法。
背景技术
人类血清是人体最复杂、最重要的体液之一,携带大量生物学信息,对运输物质,酸碱平衡,细胞免疫等多种生理功能起重要作用。因此,科学家认为血清的变化,包括血清中肽组学的变化,可以对多种疾病进行评估,如乳腺癌、肝癌、肺癌。此外,通过分泌途径,内源性肽可以通过各种翻译后修饰进行加工,包括糖基化、磷酸化和乙酰化。糖基化可以调节细胞粘附,免疫调节和信号转导等生理及病理过程。因此,血清内源性糖基化肽的研究在疾病生物标志物的发现中具有极为重要的前景。然而,在复杂的生物样品中,内源性糖基化肽的丰度低、电离效率差,给直接用质谱法分析内源性糖基化肽带来了很大的挑战。因此,探索高效、特异的内源性糖基化肽富集方法是至关重要的。
到目前为止,已经发展了从复杂生物样品中鉴定糖基化肽的多种富集策略,包括凝集素亲和层析,共价结合法,肼化学法,基于螯合作用富集法,亲水相互作用色谱法(HILIC)。由于糖基化肽具有大量羟基呈现极高亲水性,而非糖基化肽有较高疏水性,在这些策略中, 基于HILIC策略的材料呈现出色的亲水性和无偏性结合糖肽的特点,因此HILIC策略是最常用的策略之一。然而,这些亲水介质由于亲水性程度不同,导致糖基化肽识别的不充分性。因此,发展产生了大量的亲水性材料,提高了对糖基化肽的富集效率,从而使糖基化肽的分析更为全面。在这些材料中,介孔材料由于具有出色的尺寸排阻作用,可从含有高浓度蛋白质的复杂生物样品中选择性富集内源性糖基化肽,而将大分子蛋白排阻在孔道外,对内源糖肽的富集发挥了良好的作用。因此,有必要制备一种既具有高亲水性又具有体积排阻能力的探针,以便于高效鉴定内源性糖基化肽。
发明内容
本发明提出了一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法,制备一种葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料,并将其应用于血清中内源性糖基化肽的富集。制备的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料具有高亲水性、独特的介孔结构和优异的磁响应性。糖基化肽的羟基和葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的羟基可以形成复杂的氢键网络,从而提高了对糖基化肽富集的检测灵敏度。此外,葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料成功地用于富集健康人和乳腺癌患者血清中的内源性糖基化肽,并发现识别到的内源性糖基化肽与不同的生物学过程特异性相关,为进一步通过糖基化肽研究寻找疾病生物标志物开辟了新的途径。这表明其在肽组学研究和疾病诊断方面的巨大潜力。本发明目的在于提供一种葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的合成方法及其在内源性糖基化肽的富集纯化中的应用。
本发明提供一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法,具体步骤如下,将葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料与上样缓冲溶液混合配置成材料分散液;取10-20μL材料分散液和目标糖基化肽溶液加入上样缓冲液中;37℃下孵育30分钟,用上样缓冲液洗涤,加入10μL含有体积比30%乙腈和体积比0.1%三氟乙酸的洗脱缓冲液,37℃下孵育30分钟,将洗脱液点靶,进行质谱分析;
其中,葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料与上样缓冲溶液的重量体积比为10g:1L;
其中,上样缓冲液为含有体积比90%的乙腈和体积比1%的三氟乙酸的缓冲溶液;
其中,葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的合成方法,具体步骤如下:
(1)将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中,至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠,充分搅拌超声后转移至反应釜中,在100-450℃下加热10-20小时,反应完毕后待反应釜冷却至室温,用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物,于40-75℃下真空干燥;
其中,六水合三氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的比为1.35 g:75 mL:3.6 g;
(2)将步骤(1)所得产物与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)均匀分散于去离子水中,将所得混合溶液超声分散,加入碱,在60℃下加热搅拌30分钟,滴加N-(3-三乙氧硅基丙基)葡糖酰胺和正硅酸四乙酯和乙醇混合溶液,在60℃下加热搅拌12小时,反应结束后用水和无水乙醇充分洗涤所得产物,于40-75℃下真空干燥。
本发明中,步骤(2)中的碱为氢氧化钠、碳酸钠、或氨水中的一种或几种。
本发明中,步骤(2)中N-(3-三乙氧硅基丙基)葡糖酰胺和正硅酸四乙酯的体积比为1:5-1:10。
本发明中,目标糖基化肽溶液在NH4HCO3溶液中于37℃下酶解16 小时。
本发明所述的特异性分离富集内源性糖基化肽的方法具有如下优点:
1.葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料具有大比表面积,良好的磁响应性,与糖基化肽具有强亲水相互作用,因此本发明方法可以更灵敏、更有选择性地分离富集内源性糖基化肽。
2.葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的介孔结构有助于目标内源性糖基化肽的捕获和大分子量蛋白质的排阻,因此本发明方法在复杂的生物样品中显示出对内源性糖基化肽良好的富集能力。
3.本发明方法中葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料应用于肽组学的翻译后修饰研究中,通过亲水相互作用色谱法可以更全面,高灵敏度的富集纯化糖基化肽翻译后修饰肽段,结合nano-LC MS/MS可以大规模鉴定血清中的内源性糖基化肽并确定其糖基化位点。
附图说明
图1为实施例1的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的透射电子显微镜照片;
图2为实施例1的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的扫描电子显微镜照片;
图3为实施例1的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的红外谱图;
图4为实施例1的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图;
图5为实施例1的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的接触角图;
图6为实施例2的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料对标准糖基化蛋白HRP酶解液中糖基化肽分离富集的质谱图。图a为未经富集的100 fmol/μL HRP酶解液中糖基化肽的质谱图,图b是本材料富集的100 fmol/μL HRP酶解液中糖基化肽的质谱图;
图7为实施例3的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料对标准糖基化蛋白IgG酶解液中糖基化肽分离富集的质谱图。图a为未经富集的100 fmol/μL IgG酶解液中糖基化肽的质谱图,图b是本材料富集的100 fmol/μL IgG酶解液中糖基化肽的质谱图;
图8为实施例4的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料对标准糖基化蛋白HRP酶解液中糖基化肽分离富集的质谱图。图a是本材料富集的1 fmol/μL HRP酶解液中糖基化肽的质谱图,图b是本材料富集的0.1 fmol/μL HRP酶解液中糖基化肽的质谱图;
图9为实施例5的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料对标准糖基化蛋白HRP酶解液和OVA蛋白混合液的分离富集质谱图。图a为未经富集的HRP酶解液和OVA蛋白质量比(1:100)的质谱图,图b为HRP酶解液和OVA蛋白质量比(1:100)富集后的质谱图, 图c为HRP酶解液和OVA蛋白质量比(1:1000)富集后的质谱图,图d为HRP酶解液和OVA蛋白质量比(1:5000)富集后的质谱图;
图10为实施例6的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料富集HRP酶解液中糖基化肽重复性的质谱图。图a和图b分别为本材料第一次和第八次富集后100 fmol/μL HRP酶解液中糖基化肽的质谱图。
具体实施方式
本发明利用葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料与糖基化肽的相互作用来实现对翻译后修饰肽段的富集,以下介绍具体实施方式。
实施例1:葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的合成。
(1)将1.35 g FeCl3·6H2O在75 mL乙二醇中经磁力搅拌至固体完全溶解后,加入3.6 g NaAc,再经充分搅拌和超声后转移至水热反应釜中,200℃下加热16个小时,待反应釜冷却后,用去离子水和乙醇分别洗涤产物三次,50℃下真空干燥;
(2)将步骤(1)所得产物50 mg与500 mg十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)均匀分散于50 mL去离子水中,将所得混合溶液超声分散,加入400 mL水以及50 mL 0.01 M氢氧化钠水溶液,在60℃下加热搅拌30分钟,滴加2.5 mL(N-(3-三乙氧硅基丙基)葡糖酰胺/正硅酸四乙酯/乙醇=1/10/40)混合溶液,在60℃下加热搅拌12小时,反应结束所得产物用水和无水乙醇分别洗涤三次后,于50℃下真空干燥。
将制得的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料用透射电子显微镜检测,检测条件是:200kV工作电压下,取少量干燥的材料均匀分散于无水乙醇中并用混合液将微栅网浸润,干燥后插入仪器抽真空,在100纳米比例尺下观察投射电子显微镜图。检测结果如图1所示。
图2为葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的扫描电子显微镜照片;
图3为葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的红外谱图;
图4为葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的氮气吸附等温线以及孔径分布图;
图5为实施例1的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的接触角图。
实施例2:将实施例1得到的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于糖蛋白HRP酶解产物中糖基化肽的分离富集。
(1)试样的制备:2 mg HRP在1 mL 50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。
(2)100 μg 葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料分散在100 μL含有100 fmol/μL步骤(1)的HRP酶解产物的上样液(乙腈/水/三氟乙酸=90/9/1)中,37℃孵育30 min。用100 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL 洗脱液(乙腈/水/三氟乙酸=30/69.9/0.1)洗脱30min。
(3)质谱分析:取1 μL步骤(2)中洗脱液混合1 μL DHB基质点靶,自然干燥后进行质谱分析,质谱图如图6所示。
分析结果:由图6可以看出,来自于糖基化蛋白HRP酶解产物的糖基化肽被本材料所捕获,而在原液中非糖基化肽造成的干扰被大幅去除。
实施例3:将实施例1得到的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于糖蛋白IgG酶解产物中糖基化肽的分离富集。
(1)试样的制备:2 mg IgG在1 mL 50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。
(2)100 μg 葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料分散在100 μL含有100 fmol/μL步骤(1)的IgG酶解产物的上样液(乙腈/水/三氟乙酸=90/9/1)中,37℃孵育30 min。用100 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL 洗脱液(乙腈/水/三氟乙酸=30/69.9/0.1)洗脱30min。
(3)质谱分析:取1 μL步骤(2)中洗脱液混合1 μL DHB基质点靶,自然干燥后进行质谱分析,质谱图如图7所示。
分析结果:由图7可以看出,来自于糖基化蛋白IgG酶解产物的糖基化肽被本材料所捕获,而在原液中非糖基化肽造成的干扰被大幅去除。
实施例4:将实施例1得到的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于低浓度糖蛋白HRP酶解产物中糖基化肽的分离富集。
(1)试样的制备:2 mg HRP在1 mL 50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。
(2)100 μg 葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料分别分散在100 μL含有1fmol/μL和0.1 fmol/μL步骤(1)的HRP酶解产物的上样液(乙腈/水/三氟乙酸=90/9/1)中,37℃孵育30 min。用100 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL 洗脱液(乙腈/水/三氟乙酸=30/69.9/0.1)洗脱30 min。
(3)质谱分析:取1 μL步骤(2)中洗脱液混合1 μL DHB基质点靶,自然干燥后进行质谱分析,HRP酶解产物富集后质谱图如图8所示。
分析结果:由图8可以看出,来自于极低浓度糖基化蛋白HRP酶解产物的糖基化肽可被本材料所捕获。
实施例5:将实施例1得到的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料作为固相吸附剂用于糖基化蛋白HRP酶解产物和糖基化蛋白OVA的混合物中糖基化肽的分离富集。
(1)试样的制备:2 mg HRP在1 mL 50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。
(2)100 μg葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料分散在100 μL含有HRP酶解液和OVA质量比(1:100;1:1000;1:5000)的上样液(乙腈/水/三氟乙酸=90/9/1)中,37℃孵育30 min。用100 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL洗脱液(乙腈/水/三氟乙酸=30/69.9/0.1)洗脱30 min。
(3)质谱分析:取1 μL步骤(2)中洗脱液混合1 μL DHB基质点靶点靶,自然干燥后进行质谱分析,质谱图如图9所示。
分析结果:由图9可以看出,在用葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料进行富集之前可以明显地检测到蛋白质峰并检测到非糖基化肽(图9a),这可能归因于OVA蛋白的严重信号干扰。然而,在用葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料处理后,一些高强度的糖基化肽被识别出来且蛋白质信号消失(图9b)。当质量比增加到1:1000和1:5000时,如图9c和图9d所示,仍然可以在没有任何蛋白质信号的情况下识别HRP酶解液中的不同糖基化肽。
实施例6:将实施例1得到的葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料用于富集糖基化蛋白HRP酶解产物中糖基化肽的重复性实验中。
(1)试样的制备:2 mg HRP在1 mL 50 mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16 h。
(2)100 μg葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料分散在100 μL含有100 fmol/μL的HRP酶解产物的上样液(乙腈/水/三氟乙酸=90/9/1)中,37℃孵育30 min。用100 μL上样液冲洗样品三次。用10 μL洗脱液(乙腈/水/三氟乙酸=30/69.9/0.1)洗脱30 min。重复以上步骤八次。
(3)质谱分析:取1 μL步骤(1)中洗脱液混合1 μL DHB基质点靶,自然干燥后进行质谱分析,质谱图如图10所示。
分析结果:由图10可以看出,本材料在多次富集糖基化肽后,糖基化肽的数目及强度均没有明显降低,说明本材料对糖基化肽的富集具有很好的重复性。
Claims (3)
1.一种特异性分离富集内源性糖基化肽的方法,其特征在于具体步骤如下,将葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料与上样缓冲溶液混合配置成材料分散液;取10-20μL材料分散液和目标糖基化肽溶液加入上样缓冲液中;37℃下孵育30分钟,用上样缓冲液洗涤,加入10μL含有体积比30%乙腈和体积比0.1%三氟乙酸的洗脱缓冲液,37℃下孵育30分钟,将洗脱液点靶,进行质谱分析;
其中,葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料与上样缓冲溶液的重量体积比为10g:1L;
其中,上样缓冲液为含有体积比90%的乙腈和体积比1%的三氟乙酸的缓冲溶液;
其中,葡糖酰胺修饰的亲水性磁性介孔硅材料的合成方法,具体步骤如下:
(1)将六水合三氯化铁溶解于乙二醇中,至溶液澄清透明后加入无水醋酸钠,充分搅拌超声后转移至反应釜中,在100-450℃下加热10-20小时,反应完毕后待反应釜冷却至室温,用去离子水和无水乙醇充分洗涤所得产物,于40-75℃下真空干燥;
其中,六水合三氯化铁、乙二醇和无水醋酸钠的比为1.35 g:75 mL:3.6 g;
(2)将步骤(1)所得产物与十六烷基三甲基溴化铵均匀分散于去离子水中,将所得混合溶液超声分散,加入碱,在60℃下加热搅拌30分钟,滴加N-(3-三乙氧硅基丙基)葡糖酰胺和正硅酸四乙酯和乙醇混合溶液,在60℃下加热搅拌12小时,反应结束后用水和无水乙醇充分洗涤所得产物,于40-75℃下真空干燥。
2.根据权利要求1所述的特异性分离富集内源性糖基化肽的方法,其特征在于步骤(2)中的碱为氢氧化钠、碳酸钠或氨水中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的特异性分离富集内源性糖基化肽的方法,其特征在于步骤(2)中N-(3-三乙氧硅基丙基)葡糖酰胺和正硅酸四乙酯的体积比为1:5-1:10。
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基于纳米粒子的糖蛋白/糖肽分离富集方法;丁鹏等;《化学进展》;20151124(第11期);全文 * |
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