CN110575825B - 一种磷酸功能化和Ti-IMAC碳材料及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于水热法制备一种磷酸功能化碳材料及其在磷酸化肽富集中的应用。具体制备过程是首先以葡萄糖为碳源、乙烯基磷酸为功能化单体，水作为单一溶剂，通过一步水热反应制备得到表面含有磷酸功能基团的碳材料。然后螯合了钛离子(Ti4+)，制备成一种固定钛金属离子亲和色谱功能化(Ti4+‑IMAC)的碳材料，并将其应用于复杂生物样品中的磷酸化肽富集。本发明所述的Ti4+‑IMAC碳材料对人血清中的内源性肽段具有良好的富集效果。

Description

一种磷酸功能化和Ti-IMAC碳材料及其制备和应用
技术领域
本发明涉及一种基于水热法制备磷酸功能化碳材料及其在磷酸化肽富集中的应用。具体制备过程是首先以葡萄糖为碳源、乙烯基磷酸为功能化单体，水作为单一溶剂，通过一步水热反应制备得到磷酸功能化碳材料。然后螯合了钛离子(Ti4+)，制备成一种固定化钛金属离子亲和色谱(Ti4+-IMAC)功能化碳材料。该材料具有应用于复杂生物样品中的磷酸化肽富集的潜力。
背景技术
近年来，各种形态的碳材料广泛应用于催化、能量存储、水体净化、样品处理以及生物传感等领域，受到了人们越来越多的关注。尽管已经有多种方法可以用于制备碳材料，如高温碳化法、化学气相沉积法以及弧放电法等，但这些方法均需要严格的制备条件，而且所制备的碳材料需要后修饰引入功能基团才可以用于实际应用中。而水热碳化法(Hydrothermal carbonization，HTC)已经证明其可以将生物质转化为具有亲水性的功能化碳材料，并且制备方法简单，无需复杂的制备流程，所制备的球形碳材料具有良好的机械性能和化学稳定性，同时该方法只需要可再生生物质(葡萄糖、蔗糖、纤维素等)作为碳源，水为单一溶剂，少量的水溶性有机试剂作为功能单体，避免了有毒试剂、有机溶剂的使用。目前，通过HTC方法已经制备出多种功能化(羧酸、磺酸、氨基等)的碳材料。
蛋白质磷酸化作为重要的蛋白质翻译后修饰，在细胞代谢调节中具有重要的作用。异常的磷酸化修饰与一些疾病息息相关。目前，基于“鸟枪法”的蛋白质组学分析策略是磷酸化蛋白组学研究当中的主要方法。在这种方法中，蛋白质样品首先被酶解成肽段，然后经过对其中的磷酸化肽段富集后，再进行LC-MS/MS分离分析。由于磷酸化修饰的高度动态范围、磷酸化蛋白质的低丰度以及磷酸化肽段较差的离子化效果，因此，影响整个磷酸化蛋白质组学分析的准确度以及灵敏度的关键步骤就是磷酸化肽段的特异性富集过程。到目前为止，分离和富集磷酸化肽段最常用的是IMAC材料，也是富集效果最好的一种材料。该材料是通过带正电荷的金属离子与磷酸化肽段中磷酸基团的螯合作用和离子相互作用而特异性的分离和富集磷酸化肽段。但目前IMAC材料的制备过程过于繁琐，因此，设计和制备新型的IMAC材料仍然吸引着人们的目光。
发明内容
本发明首先以葡萄糖为碳源、乙烯基磷酸为功能化单体，水作为单一溶剂，通过水热反应得到一种磷酸功能化碳材料，然后与Ti4+进行螯合，最终得到一种对生物样品中磷酸化肽段具有良好富集能力的Ti4+-IMAC碳材料。
具体包括如下内容：
首先配制含有葡萄糖和乙烯基磷酸的水溶液，将混合溶液加入到水热反应釜中，加热得到磷酸功能化碳材料，然后将所得碳材料加入到含有硫酸钛的水溶液中，与Ti4+进行螯合，最终得到Ti4+-IMAC碳材料。
上述反应中葡萄糖的质量百分数为5～30％，乙烯基磷酸的的质量百分数为1～20％。
所述加热温度为160～240℃，反应时间为6～48小时。
所述的含有Ti4+的溶液为硫酸钛水溶液，浓度100mg/mL，碳材料与硫酸钛的质量比为1:100。
所述碳材料通过水热法直接制备，功能基团为磷酸功能基团，其结构示意式如下：
Figure BDA0001689073850000021
所述磷酸功能化碳材料优点在于：
(1)以葡萄糖作碳源，来源广泛，成本低；
(2)所制备得到的Ti4+-IMAC碳材料对磷酸化肽段具有良好的富集性能。
所述磷酸功能化碳材料的制备过程优点在于：
(1)采用水热法只需一步即可制备得到磷酸功能化碳材料，操作过程简单；
(2)以水作溶剂，无毒，环保。
附图说明
图1Ti4+-IMAC碳材料的制备流程示意图。(实施例1和实施例2)
图2Ti4+-IMAC碳材料氦离子扫描电镜图片。从图中可以看出所制备的碳材料的微球直径为1～10μm。(实施例1)
图3Ti4+-IMAC碳材料的接触角。从图中可以看出所制备的碳材料接触角为20～30°，说明该碳材料具有良好的亲水性。(实施例1)
图4β-酪蛋白酶解液经Ti4+-IMAC碳材料富集前后的MADLI TOF-MS分析谱图。从图中可以看出，在未经过富集的β-酪蛋白酶解液样品MDLDI谱图中(图4a)，非磷酸化肽段的质谱信号峰非常强，严重影响了对磷酸化肽段的辨别。而1μg酶解液经过该材料富集以后，从MALDI谱图中(图4b)可以清晰看到磷酸化肽段以及其去磷酸化肽段的信号峰，而且几乎没有出现任何非磷酸化肽段的信号峰，这说明了Ti4+-IMAC碳材料对磷酸化肽段具有高效的富集能力。在此基础上，降低酶解液的上样量至0.1μg(图4c)和0.05μg(图4d)对该材料的检测灵敏度进行了考察。如图所示，成功富集到了0.1μg样品中的3条特征性磷酸化肽段，而对0.05μgβ-酪蛋白酶解液样品进行富集后，仍然能在质谱中检测到1条特征性磷酸化肽段，这说明Ti4+-IMAC碳材料具有良好的富集灵敏度，可以对微量样品实现富集分析。(实施例1)
图5人血清经Ti4+-IMAC碳材料富集前后的MADLI TOF-MS分析谱图。如图5a所示，由于血清的盐浓度较高，并且内源性磷酸化肽段的含量很低，在未经过富集的血清样品质谱谱图中只出现了1条磷酸化肽段的信号峰，其他的信号峰均属于非磷酸化肽段。而2μL血清样品经过该碳材料富集后，从质谱谱图(图5b)中可以清晰地看到非磷酸化肽段的质谱信号峰几乎消失，仅看到了血清中4条内源性磷酸化肽段的信号峰，这说明了该Ti4+-IMAC碳材料能够高效的选择性富集复杂生物样品中的磷酸化肽段。
(实施例2)
具体实施方式
实施例1
将2g葡萄糖溶于17.6mL水中，再加入0.4g乙烯基磷酸，超声混合均匀后，将混合溶液加入到50mL反应釜中，然后将反应釜放入烘箱中，180℃加热6小时，得到的磷酸功能化碳材料依次用水和乙醇洗至上清液无色，于60℃下真空干燥12小时后备用。
称取50mg碳材料于离心管中，然后按照材料与硫酸钛的质量比为1:100，将50mL100mg/mL硫酸钛溶液加入到装有该碳材料的离心管中，再将离心管放在摇床上振荡12h。最后依次用去离子水、200mM NaCl水溶液和乙醇洗涤以除去游离的Ti4+，并在60℃下真空干燥12h，即得到Ti4+-IMAC碳材料。
首先称取5mg Ti4+-IMAC碳材料于离心管中，并采用上样溶液(80％ACN,6％TFA)酸化平衡Ti4+-IMAC碳材料。然后将β-酪蛋白酶解液与上样溶液等体积混合，并转移至装有Ti4 +-IMAC碳材料的离心管中，在室温下振荡30min。随后进行离心(14,000r.p.m)，除去上清溶液后，依次用洗涤溶液A(50％ACN，6％TFA，200mM NaCl)和溶液B(30％ACN，0.1％TFA)洗涤两次以除去非特异性吸附肽段，每次各15min。采用100μL10％(wt％)的氨水洗脱吸附在Ti4 +-IMAC碳材料上的磷酸化肽段2次，并将两次洗脱液混合。最后将0.5μL洗脱液滴加在MADLI靶上，待自然晾干后，再将0.5μL2,5-二羟基苯甲酸溶液(DHB，25mg/mL)覆盖到样品点上，待完全自然晾干后，最后进行质谱分析。
实施例2
将4g葡萄糖溶于14.0mL水中，再加入2.0g乙烯基磷酸，超声混合均匀后，将混合溶液加入到50mL反应釜中，然后将反应釜放入烘箱中，180℃加热6小时，得到的磷酸功能化碳材料依次用水和乙醇洗至上清液无色，于60℃下真空干燥12小时后备用。
称取50mg碳材料于离心管中，然后按照材料与硫酸钛的质量比为1:100，将50mL100mg/mL硫酸钛溶液加入到装有该碳材料的离心管中，再将离心管放在摇床上振荡12h。最后依次用去离子水、200mM NaCl水溶液和乙醇洗涤以除去游离的Ti4+，并在60℃下真空干燥12h，即得到Ti4+-IMAC碳材料。
首先称取5mg Ti4+-IMAC碳材料于离心管中，并采用上样溶液(80％ACN,6％TFA)酸化平衡该碳材料。然后将2μL血清样品加入到200μL上样溶液中，并转移至装有Ti4+-IMAC碳材料的离心管中，在室温下振荡30min。随后进行离心(14,000r.p.m)，除去上清溶液后，依次用洗涤溶液A(50％ACN，6％TFA，200mM NaCl)和溶液B(30％ACN，0.1％TFA)洗涤两次以除去非特异性吸附肽段，每次各15min。采用100μL 10％(wt％)的氨水洗脱吸附在Ti4+-IMAC碳材料上的磷酸化肽段2次，并将两次洗脱液混合。最后将0.5μL洗脱液滴加在MADLI靶上，待自然晾干后，再将0.5μL 2,5-二羟基苯甲酸溶液(DHB，25mg/mL)覆盖到样品点上，待完全自然晾干后，最后进行质谱分析。
结论
采用水热法制备磷酸功能化碳材料，可以将磷酸基团直接接枝到碳材料表面，避免了传统IMAC材料复杂的制备流程，制备方法简单，而且所选用的碳源为葡萄糖，其来源于可再生的生物质，来源广泛，成本低，选用的溶剂为水，避免了造成环境污染。螯合了Ti4+后，所制备的Ti4+-IMAC碳材料对β-酪蛋白酶解液和血清中的磷酸化肽段具有良好的富集能力，说明其具有应用于磷酸化蛋白质组学分析的潜力。

Claims (9)

1.固定化金属离子亲和色谱功能化碳材料的制备方法，其特征在于：
首先配制含有葡萄糖（glucose）和乙烯基磷酸（vinylphosphonic acid）的水溶液，然后将该混合溶液加入到水热反应釜中，并采用水热法制备了一种磷酸功能化的碳材料（IMAC）；
将该碳材料IMAC加入到含有硫酸钛的水溶液中，与Ti4+进行螯合，最终得到Ti4+-IMAC碳材料；
可按如下步骤操作，
所用含有Ti4+的溶液为硫酸钛水溶液，浓度为50～150 mg/mL，碳材料与硫酸钛的质量比为1/50～1/200；在室温下将其振荡反应12～24 h后，材料依次用去离子水、100～300 mMNaCl水溶液和乙醇洗涤后，置于50～100 ℃的真空干燥箱中干燥12～24 h；得产物Ti4+-IMAC碳材料。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作，
（1）表面含磷酸的碳材料的制备：首先配制质量百分数为5.0～30%的葡萄糖与质量百分数为1～20%的乙烯基磷酸水溶液，然后将溶液置入反应釜中密封，反应温度为160～240℃；反应时间为4～48小时；取出球形碳材料用无水乙醇洗涤，然后置于40～80 ℃的真空干燥箱中干燥12～24 h；制备得磷酸功能化的碳材料（IMAC）。
3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作，
（1）表面含磷酸的碳材料的制备：首先配制质量百分数为10%的葡萄糖与质量百分数为5%的乙烯基磷酸水溶液，然后将溶液置入反应釜中密封，反应温度为180℃；反应时间为6小时取出球形碳材料用无水乙醇洗涤，然后置于60℃的真空干燥箱中干燥12～24 h；制备得磷酸功能化的碳材料（IMAC）。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于：可按如下步骤操作，
（2）Ti4+-IMAC碳材料的制备：所用含有Ti4+的溶液为硫酸钛水溶液，浓度为100 mg/g，碳材料与硫酸钛的质量比为1/100；在室温下将其振荡反应12～24 h后，材料依次用去离子水、200 mM NaCl水溶液和乙醇洗涤后，置于50～100 ℃的真空干燥箱中干燥12～24 h；得产物Ti4+-IMAC碳材料。
5.一种权利要求1或2所述的制备方法获得的磷酸功能化碳材料。
6.按照权利要求5所述的材料，其特征在于：其结构示意图如下，
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
7.一种权利要求1所述的制备方法获得的Ti4+-IMAC碳材料。
8.一种权利要求7所述Ti4+-IMAC碳材料的应用，其特征在于：所述Ti4+-IMAC碳材料可以应用于吸附生物样品中的磷酸化肽段。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：所述生物样品为正常人的血清样品。
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