CN116813920A - β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β‑环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，通过2,3,4‑三羟基苯甲醛和对邻苯二甲醛上的醛基与七(6‑氨基‑6‑去氧)倍他环糊精上的氨基之间的醛亚胺缩合反应，构建β‑CD‑COF层，一步法制备出一种β‑环糊精共价有机骨架复合材料，该复合材料对于磷酸肽具有很好的富集能力，有利于净化提取，在质谱检测和分离外泌体等方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及先进纳米材料技术领域，尤其涉及一种β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法及应用。
背景技术
外泌体是一种微小的双层磷脂膜囊泡(通常大小为30-150纳米)。外泌体越来越多地被认为是细胞间通讯，肿瘤发生，信号转导和免疫反应的重要载体，已成为发现生物标志物的一个很有前途的来源。随着外泌体研究的深入，有证据表明外泌体参与了多种疾病的病理过程，甚至成为某些疾病的重要标志物，为这些疾病的早期发现提供了可能。为了更好地利用外泌体的这些独特特性进行疾病诊断和治疗，从生物样品中分离和捕获外泌体至关重要。超速离心是一种较为传统的分离方法，但存在操作繁琐、耗时长、效率低等问题。因此，样品中外泌体的分离方法仍需进一步完善，迫使探索低成本、高效分离捕获外泌体的创新方法。
外泌体中的蛋白质可以在很大程度上反映原始细胞的生理和病理状态，而蛋白质翻译后修饰(PTMs)的状态是细胞生理的关键决定因素。外泌体中PTMs的综合表征对早期诊断和疾病状态监测特别有价值。蛋白质磷酸化是真核生物中最常见和最重要PTMs之一。它们调节多种细胞反应，包括信号转导，免疫反应和细胞增殖。然而，由于复杂生物样本中外泌体数量有限，磷酸化蛋白质含量低，以及磷酸化的蛋白质相对于普通蛋白具有低丰度和高动态性特点，因此对磷酸化蛋白质组学样品进行高特异性富集，是降低样品复杂程度、提高磷酸化位点鉴定数目至关重要的一步。到目前为止，分离和富集磷酸肽最常用的是固定化金属离子亲和色谱(Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)。IMAC运用于磷酸肽的分离和富集是基于磷酸化肽上的磷酸基团与固定金属离子之间的螯合作用。IMAC的一个显著的缺点是，一些带有酸性氨基酸残基的肽段同时也会被保留从而干扰磷酸肽的检测，因此，迫切需要一种分离富集外泌体及磷酸肽的创新方法来促进全面研究。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷，提供一种基于Ti4+的功能化β-CD-COF材料，可以应用于磷酸肽特异性富集和外泌体分离。
实现本发明目的的技术方案是供一种β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，包括以下步骤：
S1、在一定温度下，将2,3,4-三羟基苯甲醛(THBA)，对邻苯二甲醛(TPA)和七(6-氨基-6-去氧)倍他环糊精作为配体，形成β-CD-COF层；
S2、在一定温度下，将步骤S1所得产物分散到硫酸钛溶液中进行反应；
S3、将步骤S2所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，并真空干燥，即制得β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料。
进一步的，所述S1中反应温度为25℃，反应时间为50h。
进一步的，所述S2中反应温度为25℃，反应时间为4～6h。
进一步的，所述步骤S1中2,3,4-三羟基苯甲醛(THBA)，对邻苯二甲醛(TPA)和七(6-氨基-6-去氧)倍他环糊精的质量比为1:(1.0～1.2):(1.4～1.5)。
一种β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在质谱检测中的应用，所述β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料用于磷酸化肽段选择性富集。
进一步的，包括以下步骤：
A、将β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有磷酸化肽、0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；
B、用0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的缓冲液充分洗涤，并离心分离；
C、用10μL的0.4M氨水洗脱15min，取1μL洗脱液点靶，进行MALDI TOF MS质谱分析。
一种β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在血清外泌体分离中的应用，所述β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料用于捕获分离外泌体。
进一步的，包括以下步骤：
(1)、将β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料分散到10μL含有血清的离心管中，4℃富集45min；
(2)、用PBS溶液充分洗涤；
(3)、用20μL 0.4M氨水洗脱30min，得到的洗脱液，进行相关分析。
进一步的，步骤(3)中所述相关分析为蛋白印迹法分析。
采用上述技术方案后，本发明具有以下积极的效果：
(1)本发明制得β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料采用一步法合成功能化探针，方便高效。
(2)本发明制得β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料通过2,3,4-三羟基苯甲醛和对邻苯二甲醛上的醛基与七(6-氨基-6-去氧)倍他环糊精上的氨基之间的醛亚胺缩合反应，构建β-CD-COF层。使得材料具有较大的比表面积以及可调控的孔径。通过羟基对Ti离子的螯合能力，使得Ti成功接枝。
(3)本发明制备方法步骤简单，反应温和可控，制得的材料对于磷酸肽具有很好的富集能力，有利于净化提取。
(4)本发明通过优化原料浓度，可以调整β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的微观形貌和尺寸，从而获得性能最佳的材料，大大提高富集磷酸肽能力。
(5)本发明制备的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在质谱检测和分离外泌体应用中操作简单、耗时短，检测结果准确、特异性好，具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1为实施例1制备的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例1制备的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的红外光谱图；
图3为实施例1制备的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的元素分析图；
图4为实施例2制备的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料富集β-casein中的磷酸化肽的质谱图；
图5为实施例2制备的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料富集磷酸化肽段检测限(0.5fmol)的质谱图；
图6为实施例3的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料富集混合蛋白(非磷酸化蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein＝1000:1)中的磷酸化肽的质谱图；
图7为实施例4的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料富集复杂生物样本人血清中磷酸化肽的质谱图；
图8为实施例5的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料捕获血清外泌体的透射电子显微镜照片；
图9为实施例5的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料捕获血清外泌体的蛋白质印迹结果。
具体实施方式
实施例1β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备
包括以下步骤：
S1、将2,3,4-三羟基苯甲醛(THBA)，对邻苯二甲醛(TPA)和七(6-氨基-6-去氧)倍他环糊精以质量比1:(1.0～1.2):(1.4～1.5)作为配体，在25℃通过醛亚胺缩合反应50h，形成β-CD-COF层；
S2、保持25℃条件下将步骤S1所得产物分散到硫酸钛溶液中反应6h；
S3、将步骤S2所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，并真空干燥，即制得β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料。
制备得到的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的扫描电子显微镜照片(20KV，飞利浦XL30电子显微镜，荷兰)如图1所示，SEM图像显示出最终产物是一种400-500nm尺寸均匀的球体，使得材料具有较大的比表面积以及可调控的孔径。傅里叶红外变换光谱图(赛默飞NIcoletiS10，美国)如图2所示，2,3,4-三羟基苯甲醛(THBA)的红外光谱由于C＝O的伸缩振动在1785cm-1处有条带出现，而在2775cm-1和2810cm-1处的振动与醛基的-CH拉伸有关。FT-IR的光谱显示对邻苯二甲醛(TPA)因为C＝O的伸缩振动在1693cm-1和1769cm-1处有吸收峰出现。β-CD COF的红外光谱在1597cm-1和3322cm-1处显示了新的吸收峰，验证了材料配体之间的化学反应。通过上述分析，证明了该材料的化学修饰过程。元素分析图如图3所示，观察到C、N、O和Ti元素的存在，这表明成功合成了β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料。
实施例2β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在富集β-酪蛋白中的磷酸化肽的应用
具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：β-casein(β-酪蛋白)在25mmol/L NH4HCO3溶液中37℃酶解16h。
(2)富集：0.5mg实施例1所得的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL的0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的离心管中，再加入1μL步骤(1)制备的样品，在37℃富集45min；用0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的缓冲液洗涤并分离3次；10μL 0.4M的氨水洗脱30min，分离获取上清液。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的上清液点靶，进行质谱分析，质谱图如图4所示，加入1μL的β-casein进行富集时，可以捕获到13根属于磷酸肽的峰。为了进一步探索材料对磷酸肽的检测限性能，在实验中通过改变β-casein的浓度来探索，图5是β-环糊精功能化共价有机骨架富集β-casein中的磷酸化肽段检测限(0.5fmol)，即当β-casein的浓度为0.5fmol时仍然可以检测到1根属于磷酸肽的峰。这个实验结果表明，合成的IMAC亲和材料对磷酸肽具有良好的富集能力和亲和性。
实施例3β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在富集混合蛋白中磷酸化肽的应用
具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：牛血清白蛋白(BSA)先用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化，然后在37℃酶解16h；β-casein在25mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16h；将牛血清白蛋白(BSA)和β-casein以1000:1摩尔比加到含有0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的离心管中。
(2)富集：0.5mg实施例1所得的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有步骤(1)的磷酸化肽的0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；用0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的缓冲液洗涤并分离3次；10μL0.4M体积比的氨水洗脱30min。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料混合蛋白(非磷酸蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein＝1000:1)中的磷酸化肽的质谱图如图6所示，在有干扰蛋白的存在下β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料仍然可以捕获到属于磷酸化蛋白的肽段的信号，该结果表明材料对磷酸肽具有出色的选择性。
实施例4β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在富集人血清中的磷酸化肽的应用
具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：获得的人血清(1.5mL)加入0.2％TFA和37％盐酸(0.1mL/0.1mL,v/v)的混合溶液中，然后以3000rpm离心7min收集上清液；收集的上清液(1.5mL)用去离子水(3mL)进一步稀释，保存在-20℃。
(2)富集：0.5mg实施例1所得的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有步骤(1)的磷酸化肽的0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；用0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的缓冲液洗涤并分离3次；10μL0.4M体积比的氨水洗脱30min。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，质谱图如图7所示，选择人血清作为实际样品，来验证材料是否可以分析复杂生物样品。经过材料的富集，在人血清中捕获了到了四个特征性磷酸肽的峰，可以说明该材料在实际应用潜力巨大。
实施例5β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在捕获分离外泌体中应用
具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：用等体积的PBS缓冲溶液稀释血清样品以降低粘度；然后将稀释的血清样品在4℃下以3000×g离心3分钟；将上清液转移到离心管中，并在4℃下以12000×g离心45分钟；再用0.22μm过滤器过滤上清液。
(2)富集：3mg实施例1所得的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料中加入10μL的血清；将混合物在4℃下振荡45min；用PBS溶液充分洗涤，最后加入20μL 0.4M NH3·H2O在4℃下洗脱30min；复合材料捕获血清外泌体的透射电子显微镜照片如图8所示，TEM图像显示外泌体呈直径约为30-150nm的囊泡状，说明β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料对外泌体的成功捕获分离。
蛋白印迹法分析：首先，在Hepes-Tris凝胶中使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离三个相同的含外泌体洗脱液样品，然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)微孔膜上。然后将膜切成3片，每片1个样品，用阻断剂处理1h。1×TBST清洗后，将3片膜分别放入CD9、CD63、TSG101三种一抗稀释液中孵育过夜。然后用稀释后的Tris缓冲盐水1×TBST冲洗四次，所有的膜置于二抗(即用山根过氧化物酶标记的抗兔抗体)的稀释液中孵育2小时。最后用电化学发光(ECL)发光试剂处理得到的膜，通过ChemiDocTM触摸成像系统(Bio-Rad Laboratories)成像。得到蛋白质样品的印迹如图9所示，通过用材料捕获分离后，可以清晰的观察到外泌体标记蛋白条带TSG101、CD63和CD9，为其开发新颖便捷的分离策略提供了实用途径。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在一定温度下，将2,3,4-三羟基苯甲醛(THBA)，对邻苯二甲醛(TPA)和七(6-氨基-6-去氧)倍他环糊精作为配体，形成β-CD-COF层；
S2、在一定温度下，将步骤S1所得产物分散到硫酸钛溶液中进行反应；
S3、将步骤S2所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，并真空干燥，即制得β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料。
2.根据权利要求1所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，所述S1中反应温度为25℃，反应时间为50h。
3.根据权利要求1所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，所述S2中反应温度为25℃，反应时间为4～6h。
4.根据权利要求1所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中2,3,4-三羟基苯甲醛(THBA)，对邻苯二甲醛(TPA)和七(6-氨基-6-去氧)倍他环糊精的质量比为1:(1.0～1.2):(1.4～1.5)。
5.一种如权利要求1所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在质谱检测中的应用，其特征在于，所述β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料用于磷酸化肽段选择性富集。
6.根据权利要求5所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在质谱检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
A.将β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有磷酸化肽、0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；
B.用0.5％体积比三氟乙酸和49.5％体积比乙腈的缓冲液充分洗涤，并离心分离；
C.用10μL的0.4M氨水洗脱15min，取1μL洗脱液点靶，进行MALDI TOFMS质谱分析。
7.一种如权利要求1所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在血清外泌体分离中的应用，其特征在于，所述β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料用于捕获分离外泌体。
8.根据权利要求7所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在血清外泌体分离中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料分散到10μL含有血清的离心管中，4℃富集45min；
(2)用PBS溶液充分洗涤；
(3)用20μL0.4M氨水洗脱30min，得到的洗脱液，进行相关分析。
9.根据权利要求8所述的β-环糊精功能化共价有机骨架复合材料在血清外泌体分离中的应用，其特征在于，步骤(3)中所述相关分析为蛋白印迹法分析。
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