CN115124722B - 磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料及其制备方法和应用，利用Fe3O4作为磁芯，通过合成后修饰方法制备出一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料，该复合材料对于磷酸肽具有很好的富集能力，且具有优越的磁性能，有利于净化提取，在质谱检测和分离外泌体等方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及先进纳米材料技术领域，尤其涉及一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
由细胞分泌的外泌体含有复杂RNA、脂质和蛋白质的膜泡，这些特殊的膜囊泡天然存在于不同的体液中，被认为参与细胞间通讯、信号转导和免疫调节等生理反应。随着外泌体研究的深入，有证据表明外泌体参与了多种疾病的病理过程，甚至成为某些疾病的重要标志物，为这些疾病的早期发现提供了可能。为了更好地利用外泌体的这些独特特性进行疾病诊断和治疗，从生物样品中分离和捕获外泌体至关重要。超速离心是一种较为传统的分离方法，但存在操作繁琐、耗时长、效率低等问题。因此，样品中外泌体的分离方法仍需进一步完善，迫使探索低成本、高效分离捕获外泌体的创新方法。
蛋白磷酸化作为一种常见的翻译后修饰，调节细胞间通讯、神经活动和免疫调节，磷酸化蛋白已成为许多疾病甚至癌症的特异性标志物。磷酸化不仅影响外泌体的生物发生，而且几乎参与了外泌体参与的所有生物活动。因此，研究与外泌体相关的磷酸化对于阐明相关疾病的发病机制和病理过程具有非凡的价值。目前富集磷酸肽的方法包括免疫沉淀、化学沉积、亲和层析等。其中，胍基作为一种有效的亲和基团，与磷酸基团具有很强的非共价相互作用，但目前还没有一种利用胍基选择性分离磷酸肽的技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于胍基的功能化材料，可以应用于磷酸肽特异性富集和外泌体分离。
为实现上述目的，本发明第一方面提供一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，包括以下步骤：。
S1、溶剂热法制备得到Fe3O4；
S2、将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和2,5-二乙烯基对苯二甲醛作为配体，以步骤S1所得Fe3O4作为磁芯，形成多孔COF层；
S3、通过沉降法使AuNPs接枝在步骤S2所得产物表面；
S4、将步骤S3所得产物分散到PEI溶液中进行反应；
S5、将步骤S4所得产物分散于含有O-甲基异脲硫酸盐的水溶液中进行反应；
S6、将步骤S5所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，并真空干燥，即制得磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料。
相对于现有技术，上述制备方法可以制得磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料，采用对磁芯进行逐层修饰的方法，在定制官能化探针的同时保证了材料良好的磁性，方便操作；通过2,5-二乙烯基对苯二甲醛上的醛基与1,3,5-三(4-氨基苯基)苯上的氨基之间的醛亚胺缩合反应，构建COF层，使得材料具有较大的比表面积以及可调控的孔径；通过沉降法将金纳米颗粒引入磁性COF表面，负载了大量兼容性良好的金颗粒；通过Au-N键，使得PEI成功接枝，而PEI的接枝则增强了材料的亲水能力，而且为胍基的接入提供了丰富的活性位点。该制备方法步骤简单，反应温和可控，制得的材料对于磷酸肽具有很好的富集能力，且具有优越的磁性能，有利于净化提取。
进一步地，所述S4中反应温度为10～30℃，反应时间为4～8h。
进一步地，所述S5中反应温度为50～80℃，反应时间为20～30h。
进一步地，所述步骤S2中，Fe3O4、1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、2,5-二乙烯基对苯二甲醛和质量比为1:(0.65～0.9):(0.5～0.6)。
通过优化反应时间和原料浓度，可以调整磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的微观形貌和尺寸，从而获得性能最佳的材料，大大提高富集磷酸肽能力。
本发明第二方面提供一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料，由上述的制备方法制得。
本发明第三方面提供一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在质谱检测中的应用，所述磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料用于磷酸化肽段选择性富集，具体包括以下步骤：将磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有磷酸化肽、1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；之后用1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的缓冲液充分洗涤，并磁性分离；然后用10μL的10％氨水洗脱15min，取1μL洗脱液点靶，进行MALDI TOF MS质谱分析。
本发明第四方面提供一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在在血清外泌体分离中的应用，所述磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料用于捕获分离外泌体，具体包括以下步骤：将磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料分散到10μL含有血清的离心管中，4℃富集45min，之后用PBS溶液充分洗涤；然后用20μL 0.4M氨水洗脱30min，得到的洗脱液，进行相关分析。
磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在质谱检测和分离外泌体应用中操作简单、耗时短，检测结果准确、特异性好，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1制备的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的扫描电子显微镜照片；
图2为实施例1制备的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的红外光谱图；
图3为实施例1制备的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的元素分析图；
图4为实施例2磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料富集β-casein中的磷酸化肽的质谱图；
图5为实施例2磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料富集磷酸化肽段检测限(0.02fmol)的质谱图；
图6为实施例3磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料富集混合蛋白(非磷酸化蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein＝10000:1)中的磷酸化肽的质谱图；
图7为实施例4磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料富集人血清中磷酸化肽段(◆代表磷酸化肽)。
图8为实施例5磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料捕获血清外泌体的透射电子显微镜照片；
图9为实施例5磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料捕获血清外泌体的蛋白质印迹结果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
以下将通过具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的制备，包括以下步骤：
S1、溶剂热法制备得到Fe3O4。
S2、将20mg Fe3O4和14.1mg 1,3,5-三(4-氨基苯基)苯添加到5mL的乙酸中，然后添加11.2mg 2,5-二乙烯基对苯二甲醛和乙酸(0.7mL,12M)，将混合物放置24小时；将所得到的产物用甲醇和四氢呋喃洗涤，并在真空干燥器中60℃干燥过夜。
S3、将步骤S2得到的产物跟20mL AuNPs添加到烧瓶中，超声处理30分钟后机械搅拌1小时，用去离子水和乙醇洗涤，并在真空干燥器中60℃干燥24小时。
S4、将步骤S3得到的产物添加到12mL含有PEI(150mg)的去离子水中，振荡6小时后，用去离子水充分洗涤，在真空干燥器中50℃干燥24小时。
S5、将步骤S4得到的产物分散到50mL含有O-甲基异脲硫酸盐(150mg)的去离子水中；用氢氧化钠调节pH为11，在60℃下搅拌24小时后，添加1.65mL TFA终止反应，用水和乙醇充分洗涤，并在真空干燥器中25℃过夜，即制得磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料。
制备得到的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的扫描电子显微镜照片(20KV，飞利浦XL30电子显微镜，荷兰)如图1所示，SEM图像显示出最终产物是一种尺寸均匀且表面粗糙的球体。傅里叶红外变换光谱图(赛默飞NIcoletiS10，美国)如图2所示，在1618cm-1处显示出一个吸收带，这是由于COF中的C＝N的伸缩振动；在2935cm-1和1455cm-1处显示出的吸收带证明了PEI的成功修饰；而1114cm-1处的吸收带归因于胍基的C-N键，证明了材料的成功合成。元素分析图如图3所示，观察到C、N、O、Fe和Au元素的存在，这表明成功合成了磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料。
实施例2
磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在富集β-酪蛋白中的磷酸化肽的应用，具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：β-casein(β-酪蛋白)在25mmol/L NH4HCO3溶液中37℃酶解16h。
(2)富集：0.5mg实施例1所得的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL的1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的离心管中，再加入1μL步骤(1)制备的样品，在37℃富集45min；用1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的缓冲液洗涤并分离3次；10μL 10％的氨水洗脱30min，分离获取上清液。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的上清液点靶，进行质谱分析，质谱图如图4所示，加入1μL的β-casein进行富集时，可以捕获到11根属于磷酸肽的峰。为了进一步探索材料对磷酸肽的检测限性能，在实验中通过改变β-casein的浓度来探索，图5是磁性胍基功能化共价有机骨架富集β-casein中的磷酸化肽段检测限(0.02fmol)，即当β-casein的浓度为0.02fmol时仍然可以检测到1根属于磷酸肽的峰。这个实验结果表明，合成的胍基亲和材料对磷酸肽具有良好的富集能力和亲和性。
实施例3
磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在富集混合蛋白中磷酸化肽的应用，具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：牛血清白蛋白(BSA)先用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化，然后在37℃酶解16h；β-casein在25mM NH4HCO3溶液中37℃酶解16h；将牛血清白蛋白(BSA)和β-casein以10000:1摩尔比加到含有1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的离心管中。
(2)富集：0.5mg实施例1所得的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有步骤(1)的磷酸化肽的1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；用1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的缓冲液洗涤并分离3次；10μL 10％体积比的氨水洗脱30min。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料混合蛋白(非磷酸蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein＝10000:1)中的磷酸化肽的质谱图如图6所示，在有干扰蛋白的存在下磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料仍然可以捕获到属于磷酸化蛋白的肽段的信号，该结果表明材料对磷酸肽具有出色的选择性。
实施例4
磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在富集人血清中的磷酸化肽的应用，具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：获得的人血清(1.5mL)加入0.2％TFA和37％盐酸(0.1mL/0.1mL,v/v)的混合溶液中，然后以3000rpm离心7min收集上清液；收集的上清液(1.5mL)用去离子水(3mL)进一步稀释，保存在-20℃。
(2)富集：0.5mg实施例1所得的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有步骤(1)的磷酸化肽的1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；用1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的缓冲液洗涤并分离3次；10μL 10％体积比的氨水洗脱30min。
(3)质谱分析：取1μL步骤(2)所得的洗脱液点靶，用DHB作为基质进行质谱分析，质谱图如图7所示，选择人血清作为实际样品，来验证材料是否可以分析复杂生物样品。经过材料的富集，在人血清中捕获了到了四个特征性磷酸肽的峰，可以说明该材料在实际应用潜力巨大。
实施例5
磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在捕获分离外泌体中应用，具备包括以下步骤：
(1)试样的准备：用等体积的PBS缓冲溶液稀释血清样品以降低粘度；然后将稀释的血清样品在4℃下以3000×g离心3分钟；将上清液转移到离心管中，并在4℃下以12000×g离心45分钟；再用0.22μm过滤器过滤上清液。
(2)富集：3mg实施例1所得的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料中加入10μL的血清；将混合物在4℃下振荡45min；用PBS溶液充分洗涤，最后加入20μL 0.4M NH3·H2O在4℃下洗脱30min；复合材料捕获血清外泌体的透射电子显微镜照片如图8所示，TEM图像显示外泌体呈直径约为30-150nm的囊泡状，说明磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料对外泌体的成功捕获分离。
(3)蛋白印迹法分析：得到外泌体的洗脱液后，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行测定；接上电极，首先电压为90V，当样品到达分离胶时，电压升高到110V，当样品离下端1cm-1时，电压关闭；将得到的PVDF膜用考马斯亮蓝染色约3h，然后用脱色液脱色，得到蛋白质样品的印迹如图9所示，可以看到在使用材料分离前可以观察到一条UMOD的清晰条带，而外泌体标记蛋白仅观察到微弱的条带。通过用材料捕获分离后，可以清晰的观察到外泌体标记蛋白条带TSG101和CD9，为其开发新颖便捷的分离策略提供了实用途径。
虽然本发明公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员，在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、溶剂热法制备得到Fe3O4；
S2、将1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和2,5-二乙烯基对苯二甲醛作为配体，以步骤S1所得Fe3O4作为磁芯，形成多孔COF层；
S3、通过沉降法使AuNPs接枝在步骤S2所得产物表面；
S4、将步骤S3所得产物分散到PEI溶液中进行反应；
S5、将步骤S4所得产物分散于含有O-甲基异脲硫酸盐的水溶液中进行反应；
S6、将步骤S5所得的产物用去离子水和乙醇充分洗涤，并真空干燥，即制得磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料。
2.根据权利要求1所述的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，所述S4中反应温度为10～30℃，反应时间为4～8h。
3.根据权利要求1所述的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，所述S5中反应温度为50～80℃，反应时间为20～30h。
4.根据权利要求1所述的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，Fe3O4、1,3,5-三(4-氨基苯基)苯、2,5-二乙烯基对苯二甲醛和质量比为1:(0.65～0.9):(0.5～0.6)。
5.一种磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料，其特征在于，由如权利要求1所述的制备方法制得。
6.一种如权利要求5所述的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在质谱检测中的应用，其特征在于，所述磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料用于磷酸化肽段选择性富集。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料分散到100μL含有磷酸化肽、1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的离心管中，37℃富集45min；之后用1M乙醇酸、1％体积比三氟乙酸和50％体积比乙腈的缓冲液充分洗涤，并磁性分离；然后用10μL的10％氨水洗脱15min，取1μL洗脱液点靶，进行MALDI TOF MS质谱分析。
8.一种如权利要求5所述的磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料在血清外泌体分离中的应用，其特征在于，所述磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料用于捕获分离外泌体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将磁性胍基功能化共价有机骨架复合材料分散到10μL含有血清的离心管中，4℃富集45min，之后用PBS溶液充分洗涤；然后用20μL 0.4M氨水洗脱30min，得到的洗脱液，进行相关分析。
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