CN108387424B - 一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的制备方法，步骤：1)制备多孔硅微粒；2)对多孔硅微粒进行表面化学修饰；制得的孔道表面有修饰基团的多孔硅材料具有微米尺度的颗粒，内含高密度纳米尺度垂直孔道，孔道表面具有修饰基团。这种用于生物样本预处理的多孔硅材料，用于分离和富集蛋白、多肽和核酸，结合质谱检测、PCR或电泳检测获得蛋白、多肽和核酸生物信息，实现疾病的诊断、肿瘤标志物的发现和生物分子的分析。本发明的一种用于生物样本预处理的多孔硅材料用于处理复杂生物样本时，可高效去除高分子量高丰度蛋白，根据分子量范围、电荷特性、亲和特性选择性捕获目标生物分子，进而提高目标生物分子的检测灵敏度。

Description

一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于新材料与生物技术领域和质谱检测技术领域，尤其涉及一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的制备方法及其应用。

背景技术

目前，生物样本预处理技术主要包括液相色谱分离、透析、离心、萃取等技术，上述技术存在操作过程繁琐、费用高、效果差、易导致生物分子丢失与降解等不足。目前常用的生物样本预处理材料包括碳材料、磁珠等。磁珠具有易分离的优势，然而在去除高丰度蛋白时，需要磁珠量较高；在富集低丰度蛋白时，受磁珠表面修饰分子的亲和力影响明显，并且难以按照分子量范围进行多种蛋白的分离富集，导致磁珠分离富集生物分子效率较低，。碳材料具有易修饰的特点，然而仍然存在与磁珠相似的缺点，此外碳材料的非特异吸附力过强，影响目标分子捕获的选择性。已有文献报道介孔氧化硅材料通过孔道排阻效应可去除高丰度杂蛋白。然而介孔氧化硅通常采用胶束模板法制备，孔道直径可调控范围小，且难以实现大面积有序垂直孔道的制备。

多孔硅材料是一种具有大量纳米级孔道的半导体材料，是近年来迅速兴起的新型纳米结构材料。多孔硅材料具有热导率低、比表面积大及吸附容量高等独特性质，同时其孔形与孔径均一且有序排列，孔径与厚度在一定范围内通过电化学刻蚀参数精确调节。因而，多孔硅材料被广泛应用于光催化、生物与化学传感器、药物递送、复杂生物样本预处理等多个领域。

发明内容

本发明提供一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的制备方法及其应用，目的在于针对目前生物样本预处理的要求和现有技术与材料的不足，提供一种成本低、制备简便的多孔硅材料，实现快速、简单、高效的选择性分离和富集不同生物样本中的蛋白、多肽和核酸的作用。

本发明的一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的制备方法，包括如下步骤：

1)制备多孔硅微粒：将P型硼掺杂硅片于电解池内进行直流电解蚀刻和剥离，得到多孔硅层，洗净后超声粉碎并干燥，得到未经修饰的多孔硅微粒；

2)对多孔硅微粒进行表面化学修饰：表面化学修饰所用试剂包括末端烯键化学试剂、硅烷化化学试剂和生物亲和试剂，将多孔硅微粒根据需要进行末端烯键化学试剂表面修饰、硅烷化化学试剂表面修饰或生物分子表面修饰，得到孔道表面有修饰基团的多孔硅材料；

制得的孔道表面有修饰基团的多孔硅材料具有微米尺度的颗粒，内含高密度纳米尺度垂直孔道，孔道表面具有修饰基团。

进一步的，所述步骤1)具体为：将P型硼掺杂硅片固定在聚四氟乙烯电解池中，加入按体积比为1：0.05-1：6的比例加入乙醇和重量浓度为40％-80％的氢氟酸作为电解液，以硅片为阳极，铂电极为阴极，进行直流电解蚀刻和剥离，设置电流强度为10-100mA，蚀刻时间为1-10min，设置合适的电流强度和蚀刻时间，蚀刻剥离后的多孔硅层用乙醇冲洗干净后超声粉碎1-10min，真空干燥后得到孔道孔径在1-30nm、厚度在1-100μm、微粒直径在10-100μm的未经修饰的多孔硅微粒。

进一步的，所述步骤2)中，多孔硅微粒进行末端烯键化学试剂表面修饰的方法为：利用化学修饰法将步骤1)的多孔硅微粒浸泡在质量分数10％的末端烯键化学试剂与有机溶剂的混合溶液中，加热反应2h，然后用乙醇浸泡洗净，真空干燥后获得末端烯键试剂修饰的多孔硅材料。

进一步的，所述步骤2)中，多孔硅微粒进行硅烷化化学试剂表面修饰的方法为：将步骤1)的多孔硅微粒氧化后，浸泡在体积浓度为1％的硅烷化化学试剂和有机溶剂的混合液中，反应1-2h后干燥，然后用乙醇浸泡洗净，真空干燥后获得硅烷化试剂修饰的多孔硅材料。

进一步的，所述步骤2)中，多孔硅微粒进行生物分子表面修饰的方法为：将硅烷化试剂修饰的多孔硅材料与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合，随后加入生物亲和试剂，振荡反应2h后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和去离子水清洗，干燥后得到生物分子表面修饰的多孔硅材料。

进一步的，所述末端烯键化学试剂和硅烷化化学试剂均包括阳离子交换基团、阴离子交换基团、亲水基团和疏水基团，所述生物亲和试剂包括生物分子和生物亲和基团。

本技术方案中，阳离子交换试剂采用丙烯酸、3-丁烯酸、10-十一烯酸等其中一种，其中阳离子交换官能团为羧酸基、酰胺基、磺酸基、次甲磺酸基等其中一种，修饰基团为末端烯键或硅烷化基团；阴离子交换试剂采用N,N-二乙基-3-氨丙基三甲氧基硅烷、二甲基烯丙基胺等其中一种，其中阴离子交换试剂官能团为三甲胺基、二甲基-β-羟基乙基胺基、伯胺、仲胺等其中一种，修饰基团为末端烯键或硅烷化基团。亲水基团采用N-烯丙基甲酰胺等，修饰基团为末端烯键或硅烷化基团；疏水基团采用10-十一烯-1-醇等，修饰基团为末端烯键或硅烷化基团。生物分子为Aptamer、寡核苷酸等其中一种；生物亲和基团为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸等其中一种。

一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的应用，用于分离和富集蛋白、多肽和核酸，结合质谱检测、PCR或电泳检测获得蛋白、多肽和核酸生物信息，实现疾病的诊断、肿瘤标志物的发现和生物分子的分析。

进一步的，所述分离和富集蛋白、多肽和核酸的操作步骤包括：

a)将孔道表面有修饰基团的多孔硅材料加入待检生物样本溶液中，低温振荡吸附，充分作用后静置，利用自然沉降作用收集吸附后的多孔硅材料；

b)利用磷酸盐缓冲液和去离子水清洗吸附后的多孔硅材料，将多孔硅材料中非特异性吸附的蛋白、多肽与核酸洗去；

c)再经乙腈和三氟乙酸制成的洗脱液进行洗脱或经碱性物质进行溶解操作，将多孔硅材料中捕获的蛋白、多肽和核酸释放至溶液中得到上清液。

进一步的，所述步骤a)的生物样本溶液为血液、血清、血浆、尿液、脑脊液、乳液、细胞裂解液、细胞培养液、腹水唾液和汗液其中的至少一种，根据所述生物样本溶液中的蛋白、多肽和核酸的理化性质决定选用的多孔硅材料采用的修饰方法。

进一步的，所述质谱检测、PCR或电泳检测的目标溶液为所述步骤c)中的上清液。

多孔硅材料的孔道结构具有体积排阻效应，可以作为固相微萃取吸附剂，分离和富集复杂生物样本中的蛋白、多肽、核酸、多糖、脂类、生物代谢小分子等，减少生物大分子的干扰。同时，在多孔硅材料表面易于进行化学修饰(阴离子、阳离子、亲水和疏水等)和生物化学修饰(Aptamer、核酸等)，使其具有电荷排阻效应和生物亲和效应，实现对特定理化性质分子的分离和富集。因此，多孔硅可作为复杂生物样本预处理的理想材料，在基因组学、蛋白组学、肽组学、代谢组学等研究领域具有重要应用。

本发明的一种用于生物样本预处理的多孔硅材料的制备方法及其应用具有以下有益效果：

1、本发明制备的多孔硅材料的孔径和厚度可以通过电化学蚀刻条件达到精确控制，根据所筛选目标分子的体积，制备相应孔道孔径、厚度的多孔硅材料，通过表面修饰技术可以选择性的分离、富集生物分子，并且能够排阻高分子量蛋白酶，从而减少目标分子降解和非特异性分子干扰；

2、本发明制备的多孔硅材料应用范围广，能够直接对血液、血清、血浆、尿液、脑脊液、乳液、细胞裂解液、细胞培养液、腹水、唾液或汗液等生物样本进行预处理；

3、本发明制备的多孔硅材料可以修饰不同的化学基团，通过体积排阻效应，亲疏水效应，电荷排阻效应，生物亲和效应实现特定蛋白，多肽及核酸的多维度富集与捕获，分离富集特异性高；

4、被捕获在本发明所述的多孔硅孔道中的蛋白、多肽与核酸能被洗脱液充分洗脱。也可用碱性物质快速溶解多孔硅，使得被捕获的目标蛋白、多肽或核酸完全释放。操作简便迅速，能够减少目标分子的损失。

附图说明

图1是多孔硅材料的扫描电镜图片；

图2是多孔硅材料的傅里叶变换红外光谱图；

图3是多孔硅材料去除血清高丰度蛋白的SDS-PAGE电泳图；

图4是多孔硅材料去除血清高丰度蛋白的LC-MS分析结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1)将P型硼掺杂〈100〉晶型硅片固定于电解池中，加入3ml的体积比为1：0.05-1：6的乙醇和40％氢氟酸作为电解液，以硅片为阳极，铂电极为阴极，进行直流电解蚀刻和剥离，设置电流强度为20-50mA·cm2，蚀刻时间为1-4min，蚀刻剥离后的多孔硅层经乙醇冲洗干净后超声粉碎5min，真空干燥后得到孔径在5-15nm、厚度在1-10μm、直径在10-50μm的多孔硅微粒。

2)将1)中多孔硅微粒浸泡在质量分数10％的3-丁烯酸与甲苯溶剂的混合溶液中，加热回流反应2h，然后用乙醇浸泡洗净，真空干燥后获得3-丁烯酸修饰的多孔硅材料。

3)将1)中多孔硅微粒浸泡在质量分数10％的N,N二甲基烯丙基胺与甲苯溶剂的混合溶液中，加热回流反应2h，然后用乙醇浸泡洗净，氮气吹干后获得N,N二甲基烯丙基胺修饰的多孔硅材料。

4)将1)中多孔硅微粒约1g放在臭氧发生器中，在臭氧氛围中氧化处理15-30min，然后立刻将多孔硅微粒加入氨基修饰溶液中，其中含25μL的N,N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷，加入DMSO补齐1mL，浸泡反应15min后用DMSO洗涤多孔硅微粒，将洗涤后的多孔硅微粒加入75％的1-氯丙烷的丙酮溶液中，加热回流3h，除去丙酮和氯丙烷后用乙醇溶液清洗孔道内残余的溶液，氮气吹干后获得N,N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷修饰的多孔硅材料。

5)将1)中多孔硅微粒约1g放在臭氧发生器中，在臭氧氛围中氧化处理15-30min。然后立刻将多孔硅微粒加入含有3％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液中，反应2-3h后，用乙醇清洗孔道内残余的溶液。将3-氨基丙基三乙氧基硅烷修饰多孔硅材料与浓度为2mg/mL的4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐的HEPES缓冲液混合，随后加入巯基修饰的核酸适配体，振荡反应2h后用HEPES缓冲液和去离子水清洗，干燥后得到核酸适配体修饰的多孔硅材料。

6)将制备的多孔硅微粒用扫描电镜进行形貌表征，如图1。

7)将干燥后的3-丁烯酸修饰的多孔硅材料和N,N二甲基烯丙基胺修饰的多孔硅材料进行漫反射傅里叶变换红外光谱检测，如图2。

多孔硅形貌和化学结构表征结果参见图1和图2，图1中扫描电镜图表明：制备的多孔硅微粒具有大量垂直孔道，其孔道孔径在8-15nm，微粒孔隙率为50.4％。由图2可知，与多孔硅材料的红外光谱相比，多孔硅材料经3-丁烯酸修饰后在1719cm-1处出现羧基的C＝O伸缩振动吸收峰，表明多孔硅材料成功修饰3-丁烯酸；多孔硅材料经二甲基烯丙基胺修饰后，在1227cm-1处出现C-N吸收峰，在1448cm-1处存在C-H面内弯曲振动吸收峰，表明多孔硅材料成功修饰二甲基烯丙基胺。

实施例2

本实施例以3-丁烯酸修饰的孔隙率为50.4％的多孔硅材料作为富集材料，对人血清中的高峰度蛋白进行去除，具体步骤如下：

1)、样品吸附

将人血清用去离子水稀释10倍后作为待测溶液。

吸附：在30μL待测溶液中加入10mg经过3-丁烯酸修饰的孔隙率为50.4％的多孔硅材料，在室温下共同振荡孵育1h。将上述悬浊液静置2min，待多孔硅微粒沉降到离心管底部后，用移液枪移除上清液。

清洗：离心管中加入100μL清洗缓冲液(pH7.4的PBS缓冲液)，涡旋振荡后将悬浊液静置2min，用移液枪小心移除上清液。再在离心管中加入100μL去离子水，涡旋振荡后将悬浊液静置2min，用移液枪小心移除上清液。

2、蛋白收集

将吸附蛋白的多孔硅材料加入到洗脱液中(50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸)，振荡孵育20min，同时超声5min，将颗粒上吸附的蛋白洗脱下来。将上述悬浊液静置2min，收集上清液和多孔硅微粒。

3、电泳检测

利用SDS-PAGE电泳技术检测多孔硅材料去除血清中的高丰度蛋白的情况，如图3。

4、质谱检测

将待测溶液及收集的上清液进行胰蛋白酶分解，37℃过夜后进行脱盐处理。待测溶液经电喷雾离子化后直接进入质谱进行分析。电喷雾电压为2.0kV，离子传输管温度为200℃。质谱数据采集采用数据依赖式采集，即一个全离子一级质谱扫描(400-2000m/z)之后，选取一级质谱中信号最强的20个母离子进行MS/MS质谱，MS/MS质谱数据采集的参数如下：离子碎裂碰撞能量：35％；离子强度阈值：2000counts；激活Q值：0.25；激活时间：10ms；动态排除时间：30s。HPLC溶液梯度及质谱扫描功能由XCalibur软件系统控制，如图4。

检测结果参见图3和图4，图3是经多孔硅处理后的血清SDS-PAGE电泳图，其中a是稀释10倍的原始血清，b是多孔硅吸附之后的血清，c是多孔硅第一次洗涤后的上清液，d是多孔硅第二次洗涤后的上清液，e是多孔硅第一次洗脱的上清液，f是多孔硅第二次洗脱的上清液，g是多孔硅第三次洗脱的上清液。与稀释后血清相比，血清经多孔硅处理后分子量在60KDa以上的条带数量明显减少，并且分子量在60KDa以上的条带的灰度明显降低；与稀释后血清相比，血清经多孔硅处理后分子量在60KDa以下的条带的数量和灰度变化不明显。表明制备的多孔硅材料能够有效去除分子量在60KDa以上的蛋白，而保留分子量在60KDa以下的蛋白。图4是经多孔硅处理后的血清的LC-MS分析结果。对LC-MS检测到的蛋白中的前10种得分最高的蛋白分析发现：血清中得分前20的蛋白中未见白蛋白和IgG，血清中得分前20的蛋白中分子量低于60KDa的蛋白高达75％，说明制备的多孔硅材料能够有效去除高丰度蛋白。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种多孔硅材料在制备适用于MS/MS质谱检测方法的生物样本预处理步骤中的试剂中的应用，其特征在于，所述生物样本预处理步骤用于去除生物样本中高丰度蛋白，包括以下步骤：

a)将所述多孔硅材料加入待测生物样本溶液中，低温振荡吸附，充分作用后静置，利用自然沉降作用收集吸附后的多孔硅材料；

b)利用磷酸盐缓冲液和去离子水清洗吸附后的多孔硅材料，将多孔硅材料中非特异性吸附的蛋白洗去；

c)再经50％的乙腈和0.1％的三氟乙酸制成的洗脱液进行洗脱或经碱性物质进行溶解操作，将多孔硅材料中捕获的蛋白释放至溶液中得到上清液，

所述MS/MS质谱检测方法包括：

将待测溶液及收集的上清液进行胰蛋白酶分解，37℃过夜后进行脱盐处理；待测溶液经电喷雾离子化后直接进入质谱进行分析，其中，电喷雾电压为2.0kV，离子传输管温度为200℃，

所述多孔硅材料的孔隙率为50.4％、孔道孔径在8-15nm、厚度在1-100μm、微粒直径在10-100μm，内含高密度纳米尺度垂直孔道，所述多孔硅材料的制备方法包括以下步骤：

1)制备多孔硅微粒：将P型硼掺杂硅片固定在聚四氟乙烯电解池中，加入3ml的体积比为1:0.05-1:6的乙醇和40％氢氟酸作为电解液，以硅片为阳极，铂电极为阴极，进行直流电解蚀刻和剥离，设置电流强度为20-50mA·cm²，蚀刻时间为1-4min，蚀刻剥离后的多孔硅层用乙醇冲洗干净后超声粉碎5min，真空干燥后得到未经修饰的多孔硅微粒；

2)对多孔硅微粒进行表面化学修饰：表面化学修饰所用试剂包括硅烷化化学试剂和生物亲和试剂，将多孔硅微粒进行硅烷化化学试剂表面修饰和生物分子表面修饰，得到孔道表面有修饰基团的多孔硅材料；

制得的孔道表面有修饰基团的多孔硅材料的孔道表面具有修饰基团；

所述步骤2)中，多孔硅微粒进行硅烷化化学试剂表面修饰的方法为：将步骤1)的多孔硅微粒氧化后，浸泡在含有3％的3-氨基丙基三乙基硅烷的乙醇溶液中，反应2-3h后干燥，然后用乙醇浸泡洗净，真空干燥后获得硅烷化试剂修饰的多孔硅材料；

所述步骤2)中，多孔硅微粒进行生物分子表面修饰的方法为：将硅烷化试剂修饰的多孔硅材料与4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠和4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液混合，随后加入生物亲和试剂，振荡反应2h后用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液和去离子水清洗，干燥后得到生物分子表面修饰的多孔硅材料，其中所述生物亲和试剂是指蛋白亲和试剂。

2.根据权利要求1所述的的应用，其特征在于，所述步骤a)的生物样本溶液为血液、血清、血浆、尿液、脑脊髓、乳液、细胞裂解液、细胞培养液、腹水唾液和汗液其中的至少一种。

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