CN113304708A

CN113304708A - 介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法

Info

Publication number: CN113304708A
Application number: CN202110650914.2A
Authority: CN
Inventors: 刘照胜; 袁芳芳; 黄艳萍
Original assignee: Tianjin Medical University
Current assignee: Tianjin Medical University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-06-11
Also published as: CN113304708B

Abstract

本发明涉及一种介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法。该法以SBA‑15介孔分子筛为载体，2,3‑二氟‑4‑甲酰基苯硼酸为单体，以N‑乙酰神经氨酸为片段模板制备基于分子筛的表面定向印迹聚合物（SBA‑15@MIP）。该微反应器利用尺寸排阻作用提取样品中的蛋白质，基于纳米限域作用快速酶解蛋白质，以分子印迹的特异性识别作用选择性富集含糖链的肽段。本发明方法使用材料廉价易得，易于制备，操作简便，可以集成蛋白质提取，蛋白质快速酶解以及糖肽富集这三个样品预处理过程，可有效缩短糖蛋白组学样品前处理的时间。

Description

介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法

技术领域

本发明属于糖蛋白组学分析领域，具体涉及一种介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法。本发明能完成快速蛋白质提取，酶解和糖肽富集这三个样品预处理过程，与目前常用的N-糖蛋白组学分析方法相比，具有较少的样品损失和更高的分析灵敏度，且能显著地缩短从血清样品中获取糖肽所需的时间，具有快速、简便、样品损失低等特点。

背景技术

糖基化是最常见的蛋白质翻译后修饰（Protein translational modifications，PTMs）之一，是哺乳动物生存所必需的。据估计，大约50%的人类蛋白质发生糖基化。异常的糖基化现象与人类疾病如炎症疾病密切相关，如类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病以及癌症。因此，糖蛋白可以作为疾病检测的有效生物标志物，也可作为药物和疫苗开发的靶点。然而，由于聚糖的异质性，糖蛋白的低丰度和动态性，基于质谱的鸟枪法分析复杂生物样品中的糖蛋白信息仍具有很大的挑战性。因此，对蛋白样品进行前处理使糖肽达到质谱的检测水平是糖蛋白质组研究首先要解决的一个重要问题。

糖蛋白组学的样品预处理通常包括三个部分：蛋白质提取浓缩，蛋白酶解，糖肽富集。传统的预处理方法通常只针对其中一个步骤或者三部分分开逐步进行，每步之间均需要进行样品转移，并且当两步骤之间的溶剂条件不匹配时还需要对样品进行除盐、冻干等操作，这极易导致样品损失，因此不适合用于微量蛋白样品的处理。

蛋白质微反应器（Proteomic reactor）作为一种有前途的蛋白质分析技术出现，其是将蛋白质提取浓缩，酶解和脱盐等多步骤集成到一个材料上的新型微反应器，无需多步转移，具有快速、简便、样品损失低、灵敏度高、易于自动化的优势。糖蛋白微反应器（Glycoproteomic reactor）是在蛋白质微反应器的基础上发展而来，专门用于处理和鉴定糖蛋白，实现糖蛋白样品前处理的新型材料。然而，由于蛋白酶解基质和糖肽富集基质存在的较大差异，制备同时具有酶解和富集功能的糖蛋白微反应器仍具有一定的难度，导致糖蛋白微反应器的研究较少，发展相对缓慢。目前现存的糖蛋白微反应器多是通过两种或两种以上功能材料的耦合制备，制备过程繁琐；或是将蛋白质脱糖处理后基于非共价作用结合糖链，而无法进行特异性N-糖基化肽的富集（中国专利CN 201811243022.5）。

CN107189011A公开了一种中空分子印迹聚合物、固相萃取柱，它是以介孔分子筛MCM-48为基质，以3-氨基苯硼酸为修饰剂，对甲基丙烯酸单体进行化学修饰，使得甲基丙烯酸表面修饰有对核苷具有硼亲和作用的苯硼酸结构。该固相萃取柱需要采用氢氟酸腐蚀掉基质介孔分子筛MCM-48，制得中空分子印迹聚合物。该固相萃取柱与高效液相色谱检测方法结合，在药品中检测含有顺式二醇结构的核苷类物质含量的应用。

迄今为止，尚无涉及基于分子印迹技术特异性识别糖肽的糖蛋白微反应器的文献报道，特别是提供一种集成蛋白质提取和酶解并特异性富集N-糖肽功能的糖蛋白微反应器的制备方法，具体为以SBA-15（SBA系列，Santa Barbara Amorphous）介孔分子筛为载体，2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸为单体，以N-乙酰神经氨酸为片段模板制备基于分子筛的表面定向印迹聚合物（SBA-15@MIP）。该方法将有利于实现复杂生物样品中N-糖肽的快速前处理，高选择性富集和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质组学的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法，可以克服现有的N-糖蛋白组学质谱分析前样品处理方法存在的缺陷，提供一种成本低廉，操作方便、快速高效的实现N-糖蛋白样品前处理过程的糖蛋白微反应器的制备方法，具体涉及完成快速蛋白提取，酶解和糖肽富集这三个样品预处理过程的操作方法。

本发明提供的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法包括的步骤：

1）SBA-15分子筛的酸化预处理活化以获得更多的羟基，室温下将SBA-15分散到6M HCl，通过磁力搅拌器搅拌10-12小时，离心，水洗至上清液的pH为中性，室温下真空干燥，之后继续在100-110℃下真空干燥4-6小时。

2）SBA-15介孔分子筛材料的氨基功能化，将活化后SBA-15均匀分散在无水乙醇的溶液中，然后与含有3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）的无水乙醇溶液均匀混合，混合物在氮气（N₂）下50-60℃搅拌10-12小时，离心，收集氨基功能化的SBA-15（SBA-15-NH₂）并用无水乙醇溶液洗涤，在45-50℃下真空干燥4-5小时。

3）SBA-15介孔分子筛材料的硼酸功能化，将氨基功能化的SBA-15介孔分子筛乙醇分散液中加入2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸（FPBA）和氰基硼氢化钠，室温下反应20-24 h，离心，收集获得的硼酸功能化的SBA-15（SBA-15-N-FPBA），然后分别用无水乙醇和水洗涤3次。

4）SBA-15的表面定向印迹聚合物SBA-15@MIP的制备，将硼酸功能化的SBA-15加入到含N-乙酰神经氨酸的pH 9.0磷酸盐缓冲液中，孵育20-30 min，离心收集结合N-乙酰神经氨酸的SBA-15；并重新分散于无水乙醇中，然后加入包含氨水和硅酸四乙酯（TEOS）的无水乙醇溶液中，反应20 -30 min，反应混合物离心，并收集制备的SBA-15@MIP；45-50℃下真空干燥4-6小时；最后，使用模板洗脱溶剂1 M的HAc溶液在室温下震荡洗涤产物，直到在电化学检测器上电流值不再改变。

除不加入模板（N-乙酰神经氨酸）外，非印迹的SBA-15聚合物（SBA-15@NIP）的制备与SBA-15@MIP的所有制备步骤均相同。

步骤2）中，3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和SBA-15分子筛分散液体积比例为1:150，SBA-15分子筛分散液的浓度3.31 mg/mL。

步骤3）中，SBA-15-NH₂、FPBA、氰基硼氢化钠和乙醇的质量体积比例为10 mg :15-35 mg : 15-35 mg : 3 mL。

步骤3）中，优选反应温度为20-30℃，时间为24小时。

步骤4）中，SBA-15-N-FPBA，磷酸盐缓冲液，模板单糖N-乙酰神经氨酸，氨水，TEOS和无水乙醇的质量体积比例为30 mg: 1mL: 30 mg: 0.7 mL: 22.4 μL: 50 mL，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为100 mM，pH为9.0。

本发明提供了上述制备方法得到的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器及其应用于N-糖蛋白组学的分析。

本发明提供的SBA-15@MIP糖蛋白微反应器用于N-糖蛋白组学的分析包括以下步骤：

（1）将基于SBA-15@MIP的糖蛋白微反应器置于离心管中，加入血清样品，再加入pH为8.0的Tris-HCl的缓冲液使材料浸润。之后，通过在室温下震荡使溶液中的蛋白质基于尺寸排阻作用完全吸附在SBA-15@MIP的孔径内。之后，通过离心（室温）使材料与未吸附的溶液分离。所述的SBA-15@MIP的含量与蛋白质含量的比例为1.5 -12 mg: 100-140 μg，所述的缓冲液浓度为50 mM；

（2）向已经吸附有蛋白质的SBA-15@MIP糖蛋白微反应器中依次加入尿素溶液，其浓度为8 M，体积为12 μL。加入DTT（DL-1,4-二硫代苏糖醇）溶液，混合均匀后置于水浴锅中，反应温度为50℃，反应时间为20 min。DTT的浓度为40 mM，体积为3 μL。冷却至室温后加入IAA（碘乙酰胺）溶液，其浓度为40 mM，体积为3 μL，在黑暗处进行反应，反应时间为20min。按照蛋白质/酶的比例为25/1加入胰蛋白酶（4.8 μg），在37摄氏度下进行酶解，酶解时间为10-60分钟，使蛋白质酶解为肽段；

（3）往酶解后的溶液中加入磷酸缓冲液，其pH为7.4，浓度为50 mM，体积为504 μL，缓慢震荡，时间为1 h，温度为室温；使溶液中的糖肽被选择性吸附在SBA-15@MIP的特异性空穴中；

（4）使用pH为7.4的磷酸缓冲盐，浓度为50 mM，体积为1000 μL，对吸附有糖肽的SBA-15@MIP进行洗涤，清洗3次；离心将淋洗溶液和SBA-15@MIP分离；

（5）用HAc溶液进行糖肽的洗脱，在室温下震荡30 min，收集含有糖肽的洗脱液。HAc溶液的浓度为1 M，体积为1000 μL，洗脱温度为室温，洗脱时间为30 min。洗脱溶液将吸附的糖肽洗脱进行质谱分析。

本发明采用表面定向硼亲和分子印迹技术制备了SBA-15@MIP糖蛋白微反应器，利用其独特的孔径大小、纳米限域作用和表面定向分子印迹技术产生的特异性空穴实现蛋白质样品的N-糖肽的选择性富集。

本发明提供的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法是以SBA-15介孔分子筛为载体，2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸为单体，以N-乙酰神经氨酸为片段模板，通过表面定向分子印迹技术制备。本发明利用介孔分子筛SBA-15的独特孔径（6-11nm），与蛋白尺寸相近，可以通过尺寸排阻快速提取浓缩液体中的蛋白质；SBA-15的纳米限域作用可以显著提高蛋白酶解效率，从而使酶解过程加快；SBA-15@MIP表面的印迹空穴能够特异性富集糖肽，非糖肽等干扰物质可通过适合的淋洗溶剂从材料上淋洗除去，被材料捕获的糖肽可使用HAc溶液洗脱以便后续质谱分析。蛋白提取，酶解和糖肽富集这三个样品预处理总时间约3小时。该方法无需多种性能材料的耦合，可以通过印迹作用选择性吸附糖肽，从而实现N-糖蛋白样品的高效前处理。

附图说明

图1为本发明制备的SBA-15@MIP糖蛋白微反应器的扫描电镜图。

图2 为本发明制备的基于SBA-15的表面定向印迹聚合物对血清中N-乙酰神经氨酸固相微萃取的结果。

图3为本发明制备的SBA-15@MIP糖蛋白微反应器考察加入质量对蛋白质吸附量百分率的影响。

图4为正常人血清通过本发明制备的SBA-15@MIP糖蛋白微反应器处理前后，通过质谱鉴定到糖肽数量，独特糖肽数量，唾液酸化糖肽数量，糖基化位点肽段数量及糖蛋白的数量对比。

图5为正常人血清通过本发明制备的SBA-15@MIP糖蛋白微反应器处理前后，通过质谱鉴定到独特糖肽数量对比韦恩图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

介孔分子筛硼亲和表面印迹聚合物（SBA-15@MIP）的制备，该实施例包括以下五步：

（1）SBA-15分子筛的预处理

SBA-15（上海阿拉丁试剂有限公司）在HCl溶液中活化以获得更多的羟基。具体操作如下，将200 mg SBA-15分散到8 mL的6 M HCl中，在室温下搅拌10小时。然后，通过离心弃去上清液，用去离子水洗涤SBA-15五次，直至上清液的pH为中性。其次，将酸化处理的SBA-15在室温下真空干燥，之后继续在110℃下真空干燥6小时。

（2）SBA-15介孔分子筛材料的氨基功能化

使用APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）制备氨基功能化的SBA-15。首先，将200 mgSBA-15均匀分散在含有50 mL乙醇的100 mL玻璃烧瓶中，然后，将10 mL含有0.4 mL APTES的乙醇溶液缓慢滴入到烧瓶中。混合物在氮气（N₂）下60℃搅拌12小时。之后，通过离心回收制备的氨基功能化的SBA-15并用无水乙醇洗涤3次。最后，在50℃下真空干燥4小时。

（3）SBA-15介孔分子筛材料的硼酸功能化

将100 mg 氨基功能化的SBA-15介孔分子筛均匀分散在30 mL无水乙醇中，然后加入250 mg FPBA和 250 mg氰基硼氢化钠。室温反应24 h后，通过离心收集获得的硼酸功能化的SBA-15，然后分别用无水乙醇和水洗涤3次。

（4）片段模板在硼酸功能化的SBA-15上的锚定

为了进行定向印迹，将30 mg硼酸功能化的SBA-15加入到1 mL含30 mg / mL N-乙酰神经氨酸的磷酸盐缓冲液（100 mM，pH 9.0）中。孵育30 min后，通过离心收集结合N-乙酰神经氨酸的SBA-15，并重新分散于40 mL乙醇中，然后加入包含0.7 mL氨水和22.4 μL TEOS（C₈H₂₀O₄Si）的10 mL乙醇溶液。室温反应20 min后，将反应混合物离心并收集制备的SBA-15@MIP。最后，在50℃下真空干燥4小时。

（5）片段模板的去除

随后使用1 M的HAc溶液在室温下震荡洗涤产物，直到在电化学检测器上电流值不再改变。

除不加入模板外，非印迹的SBA-15聚合物（SBA-15@NIP）的制备与SBA-15@MIP的所有制备步骤均相同。

实施例2

SBA-15@MIP在实际样品中对模板分子的萃取性能，如图2。

为了进一步评估所得介孔分子筛硼亲和表面印迹聚合物（SBA-15@MIP）在真实样品中对模板分子的萃取性能，SBA-15@MIP被使用来检测正常人血清样品中的N-乙酰神经氨酸的萃取回收率。本发明对加入不同浓度的N-乙酰神经氨酸的正常人血清样品进行了萃取性能考察。具体操作步骤如下：

（1）同上述方法（实施例1）合成SBA-15@MIP。

（2）本实验使用滴涂法将SBA-15@MIP涂覆于玻碳电极（GCE）表面，具体步骤如下：首先，分别用1.0、0.3和0.05 μM的GCE氧化铝水浆在抛光布上对玻碳电极进行抛光，然后用硫酸溶液（1 M）、去离子水和无水乙醇分别超声清洗10分钟。之后，将2 mg印迹聚合物加入到1 mL壳聚糖溶液（0.5%wt，含20 μL的乙酸）中，再加入50 μL（1 mg/mL）的多壁碳纳米管DMF溶液以增加导电性。为了使聚合物和多壁碳纳米管均匀分散，将配置的混合物（室温）超声处理混合5分钟。最后，将10 μL 该混合物滴到GCE的表面，并置于50℃烘箱中干燥20min。获得位于电极表面的SBA-15@MIP（MWCNT /SBA-15@ MIP / GCE）。为了去除内腔模板和表面吸附的物质，将MWCNT /SBA-15@ MIP / GCE置于1 M的乙酸溶液中清洗（室温）30 min。最终，获得具有特定识别空腔的MWCNT /SBA-15@ MIP / GCE。

（3）电化学阻抗法对MWCNT /SBA-15@ MIP / GCE的萃取性能考察。

选择0.1 mol/L KCl的5×10^-3mol/L K₃[Fe(CN)₆] / K₄ [Fe(CN)₆]的溶液作为电解液，并通过电化学阻抗法来考察印迹聚合物的萃取性能。电化学测量流程如下，首先，将具有特定识别空腔的MWCNT /SBA-15@ MIP / GCE放入含N-乙酰神经氨酸的正常人血清样品中进行孵育（室温）。之后，为了去除表面的非特异性吸附，将载药的SBA-15@MIP放入磷酸缓冲盐（pH 7.4, 50 mM）中5 min。最后，将吸附完成的SBA-15@MIP置于电解液中，室温平衡5 min后通过差分脉冲伏安法（DPV）测量电传感器的电流响应。本实验中所有测试平行测量三次。电传感器吸附性能由电流的变化表征，电流变化量的计算是按照公式（1）

(1)

其中I₀和I_e（μA）分别代表初始电流和吸附后电流。

结果表明，介孔分子筛硼亲和表面印迹聚合物（SBA-15@MIP）成功的应用于实际样品中N-乙酰神经氨酸的固相微萃取。（见图2）。

实施例3

SBA-15@MIP的加入量对血清样品中蛋白吸附的影响，如图3。具体步骤如下：

（1）称取1.5-12 mg SBA-15@MIP，置于离心管中。之后，加入待处理的血清2μL，并加入48 μL Tris-HCl溶液（pH 8.0，50 mM）使材料润湿，震荡（室温）后通过离心获得上清液。

（2）根据Bradford方法进行定量分析。将染料考马斯蓝G-250与待测样品以10：1的体积比混合，然后在室温下温育2分钟以便于充分混合，再通过UV-3310分光光度计在595nm处测量吸光度，记录。最后，通过蛋白质的标准曲线计算吸附的蛋白质百分率。

根据所得到的数据，画出对应的图3。当加入2 μL人血清样品时，随着SBA-15@MIP加入量的增加，蛋白质的吸附率不断提高。当SBA-15@MIP的质量为12 mg时，能吸附血清样品中99.51%的蛋白质。

实施例4

SBA-15@MIP糖蛋白微反应器对复杂样品人血清样品的处理，如图4、5。

（1）蛋白质提取浓缩。称取12 mg SBA-15@MIP置于离心管底部，加入2μL待处理的血清，再加入48 μL Tris-HCl溶液（pH 8.0，50 mM）稀释，震荡（室温）5 min使血清中的蛋白质被SBA-15@MIP吸附。

（2）蛋白质变性及酶解。依次加入12 μL的8 M尿素，3 μL 40 mM的DTT（DL-1,4-二硫代苏糖醇）溶液，混合均匀后置于50℃反应20 min，冷却至室温后加入3 μL的IAA（碘乙酰胺）溶液（40 mM），在黑暗处（室温）反应20 min。然后，加入28 μL Tris-HCl溶液（pH 8.0，50mM）使尿素的浓度稀释为1 M。之后，按照蛋白质/酶的比例为25/1加入胰蛋白酶（4.8 μg），在37℃水浴锅中酶解1 h。

（2）糖肽特异性富集。特异性富集糖肽的流程如下：酶解完成后，加入504 μL 磷酸缓冲盐（pH 7.4，50 mM）将蛋白浓度稀释为200 μg/mL；将含有SBA-15@MIP的人血清酶解液缓慢震荡（室温）1 h，使SBA-15@MIP特异性捕获酶解液中的糖肽；为了去除非特异性吸附，使用磷酸缓冲盐（pH 7.4，50 mM）淋洗（室温）材料3次，离心去除溶液；使用1 M的HAc溶液在室温下震荡30 min，释放富集的糖肽。

结果如图4所示，SBA-15@ MIP糖蛋白微反应器处理后鉴定到609个糖肽，308个独特糖肽，其中有157个唾液酸糖肽，139个糖基化位点，对应73个糖蛋白。与未经处理的溶液酶解只能鉴定到196个糖肽，110个独特糖肽，其中有64个唾液酸糖肽，55个糖基化位点，对应32个糖蛋白。糖肽鉴定能力提高了2.1倍，唾液酸化糖肽鉴定能力提高了1.5倍。根据所得到的数据，画出对应的图5。韦恩图结果表明，经SBA-15@ MIP糖蛋白微反应器处理后，可以额外鉴定到249个独特糖肽，证明了SBA-15@ MIP糖蛋白微反应器的在实际样品中的处理能力。

Claims

1.一种介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）SBA-15分子筛的酸化预处理活化以获得更多的羟基，室温下将SBA-15分散到6 MHCl中，通过磁力搅拌器搅拌10-12小时，离心，水洗至上清液的pH为中性，室温下真空干燥，之后继续在100-110℃下真空干燥4-6小时；

2）SBA-15介孔分子筛材料的氨基功能化，将活化后SBA-15均匀分散在无水乙醇的溶液中，然后与含有3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）的无水乙醇溶液均匀混合，混合物在氮气（N₂）下50-60℃搅拌10-12小时，离心，收集氨基功能化的SBA-15（SBA-15-NH₂）并用无水乙醇溶液洗涤，在45-50℃下真空干燥4-5小时；

3）SBA-15介孔分子筛材料的硼酸功能化，将氨基功能化的SBA-15介孔分子筛乙醇分散液中加入2,3-二氟-4-甲酰基苯硼酸（FPBA）和氰基硼氢化钠，室温下反应20-24 h，离心，收集获得的硼酸功能化的SBA-15（SBA-15-N-FPBA），然后分别用无水乙醇和水洗涤3次；

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2）中，3-氨丙基三乙氧基硅烷和SBA-15分子筛分散液体积比例为1:150；SBA-15分子筛分散液的浓度3.31 mg/mL。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3）中，SBA-15-NH₂、FPBA、氰基硼氢化钠和乙醇的质量体积比例为10 mg :15-35 mg :15-35 mg : 3 mL。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3）中，反应温度为20-30℃，时间为24小时。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤4）中，SBA-15-N-FPBA，磷酸盐缓冲液，模板单糖N-乙酰神经氨酸，氨水，TEOS和乙醇溶液质量体积比例为30 mg: 1mL: 30 mg:0.7 mL: 22.4 μL: 50 mL，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为100 mM，pH为9.0。

6.权利要求1-5任一所述的制备方法得到的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器。

7.权利要求6所述的介孔分子筛硼亲和表面印迹的糖蛋白微反应器应用，其应用于N-糖蛋白组学的分析。

8.按照权利要求7所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

（1）将基于SBA-15@MIP的糖蛋白微反应器置于离心管中，加入血清样品，再加入pH为8.0的Tris-HCl的缓冲液使材料浸润；通过在室温下震荡使溶液中的蛋白质基于尺寸排阻作用完全吸附在SBA-15@MIP的孔径内，通过离心（室温）使材料与未吸附的溶液分离；所述的SBA-15@MIP的含量与蛋白质含量的比例为1.5 -12 mg: 100-140 μg，所述的缓冲液浓度为50 mM；

（2）向已经吸附有蛋白质的SBA-15@MIP糖蛋白微反应器中依次加入尿素溶液，其浓度为8 M，体积为12 μL；加入DTT（DL-1,4-二硫代苏糖醇）溶液，混合均匀后置于水浴锅中，反应温度为50℃，反应时间为20 min，DTT的浓度为40 mM，体积为3 μL；冷却至室温后加入IAA（碘乙酰胺）溶液，其浓度为40 mM，体积为3 μL，在黑暗处进行反应，反应时间为20 min；按照蛋白质/酶的比例为25/1加入胰蛋白酶，在37摄氏度下进行酶解，酶解时间为10-60分钟，使蛋白质酶解为肽段；

（3）往酶解后的溶液中加入磷酸缓冲液，其pH为7.4，浓度为50 mM，体积为504 μL，缓慢震荡，温度为室温，时间为1 h；使溶液中的糖肽被选择性吸附在SBA-15@MIP的特异性空穴中；

（4）使用磷酸缓冲盐的pH为7.4，浓度为50 mM，体积为1000 μL，对吸附有糖肽的SBA-15@MIP进行洗涤，清洗3次；离心将淋洗溶液和SBA-15@MIP分离；

（5）用HAc溶液进行糖肽的洗脱，在室温下震荡30 min，收集含有糖肽的洗脱液；HAc溶液的浓度为1 M，体积为1000 μL，洗脱温度为室温，洗脱时间为30 min；洗脱溶液将吸附的糖肽洗脱进行质谱分析。