CN111617746A - 聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用 - Google Patents

聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种聚离子液体改性纳米材料及其制备方法，及该材料在含有磷酸化肽的样品中，富集磷酸化肽的应用。制备方法包括以下步骤：(1)将含有乙烯基修饰的基底材料、乙烯基及机膦酸酯功能化离子液体聚合，得到聚有机膦酸酯离子液体功能化的材料；(2)将聚有机膦酸酯离子液体功能化的材料酸化水解后，再与金属离子结合，得到聚有机膦酸功能化离子液体的亲和材料。本发明制备的功能化材料易分离，具有更好的亲水性和固定金属离子的能力、耐酸碱性和稳定性，有良好的特异选择性，适合于复杂生物样品的磷酸化肽的富集纯化。该材料在生物医学领域具有广泛的应用前景。

Description

聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽 中的应用
技术领域
本发明属于功能材料领域，具体涉及一种聚离子液体改性纳米材料，同时还涉及该材料的制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用。
背景技术
1990年启动的人类基因组计划，极大地推动了生命相关学科的发展，导致了1994年蛋白质组学概念的提出。蛋白质组学是研究蛋白质结构特征，表达，修饰以及相关作用等。蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰，对蛋白磷酸化-去磷酸化的机制研究，可以为生理过程，发现临床标志物，疾病的发生和发展，以及药物的开发设计提供有价值的信息。
质谱技术虽然具有高灵敏性，但直接用于生物样品检测和鉴定磷酸化多肽及磷酸化位点，存在较大困难，难于获得准确信息。主要因为蛋白质磷酸化-去磷酸化是一个动态可逆过程，在生物样品中存在大量的非磷酸化蛋白或肽，低丰度的磷酸化肽信号被严重抑制，难于获得有效真实磷酸化肽的信息。因此，在质谱检测前，磷酸化多肽的高效特异性富集，是获得有效信息必不可少的重要预处理步骤。在配位化学基础上发展起来的IMAC技术(immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC)在磷酸化肽富集领域得到广泛应用。通过固定化金属离子与磷酸化肽的磷酸基团特异性结合，可以快速富集磷酸化肽，排除大量非磷酸化的干扰，从而获得磷酸化肽的足够信息。虽然关于IMAC材料研究报道越来越多，大部分工作仍主要集中在对现有材料的模仿和简单修饰。在材料的设计理论和制备方法方面，缺少多学科的交叉渗透，指导理论发展缓慢。现有材料在磷酸化肽富集过程中的特异选择性、富集容量、耐酸碱稳定性、抗干扰性及重复使用性方面，仍不能完全满足从复杂样品中富集磷酸化肽的需要。
发明内容
基于现有技术中所存在的问题，本发明引入一种新的配体—聚有机膦功能化离子液体(PPFIL)，将有机膦功能化离子液体聚合于基底材料表面，获得一种含高密度膦酸基团的富集材料。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
本申请中的聚离子液体改性纳米材料，通过以下方法制备：(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构纳米二氧化硅(Fe3O4@nSiO2)或介孔二氧化硅包覆的石墨烯(G@mSiO2)；(2)将上述得到的材料E-CH＝CH2分散于氯仿中，然后向其中加入3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐、偶氮二异丁腈，N2氛下搅拌、加热后，材料E-CH＝CH2的表面发生聚合作用，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到聚有机膦离子液体修饰的纳米材料(E-PPFIL)；(3)将得到的材料E-PPFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即E-PPFIL-Ti4+，为聚离子液体改性纳米材料。
本申请中的聚离子液体改性纳米材料的制备方法，包括以下步骤：(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构纳米二氧化硅(Fe3O4@nSiO2)或介孔二氧化硅包覆的石墨烯(G@mSiO2)；(2)将上述得到的材料E-CH＝CH2分散于氯仿中，然后向其中加入3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐、偶氮二异丁腈，N2氛下搅拌、加热后，材料E-CH＝CH2的表面发生聚合作用，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到聚有机膦离子液体修饰的纳米材料(E-PPFIL)；(3)将得到的材料E-PPFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即E-PPFIL-Ti4+，为聚离子液体改性纳米材料。
进一步的，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。
进一步的，所述步骤(2)中，反应的温度为75℃，反应时间为2h。
进一步的，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。
本申请中，聚离子液体改性纳米材料在富集磷酸化肽中的应用：将上述聚离子液体改性纳米材料用于富集磷酸化肽。
本发明通过在基底材料表面发生聚合作用，得到聚有机膦功能化离子液体修饰的纳米材料，即E-PPFIL；在酸化处理后，继而在有机膦酸酸基团上修饰Ti(Ⅳ)离子，得到E-PPFIL-Ti4+固定金属离子亲和色谱材料。
本发明通过改变基底材料E，分别选择纳米二氧化硅、二氧化硅包覆磁球纳米颗粒和介孔二氧化硅包覆石墨烯纳米复合材料，制备了三种不同基底材料的IMAC吸附剂，即E-PPFIL-Ti4+(其中，E＝nSiO2、Fe3O4@nSiO2或G@mSiO2)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明的修饰方法简单，易于操作，并且不会破坏基底材料的基本形貌特征，合成材料表面具有高密度的膦酸基团，可以固定高浓度的金属离子。同时，合成的材料易分离，具有良好的稳定性，以及耐酸碱性，增加了该材料的实用性。(2)本发明中所合成的固定金属离子亲和材料—E-PPFIL-Ti4+作为IMAC吸附剂，利用金属离子和磷酸化肽中磷酸基团间的亲和性，可应用于磷酸化肽的特异性富集，并且成功地将合成的材料用于标准肽、多肽混合液以及人类唾液中磷酸化肽的富集。
附图说明
图1为E-PPFIL-Ti4+(以nSiO2-PPFIL-Ti4+为例)的制备流程图。类似地，以Fe3O4@nSiO2、G@mSiO2为基底材料，可以制备得到相应的聚有机膦功能化离子液体修饰的富集材料。
图2为β-酪蛋白酶解液的质谱图；其中，图2a为β-酪蛋白酶解液的直接检测图；图2b为β-酪蛋白酶解液经过nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2c为β-酪蛋白酶解液经过Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图2d为β-酪蛋白酶解液经过G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图3为β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：1000)的质谱图；其中，图3a为nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图3b为Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图3c为G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图4为β-酪蛋白(1.43pmol)和牛血清蛋白BSA的酶解混合液(摩尔比为1：15000)在G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图，磷酸化肽信号用*表示，去磷酸残基则用#表示。
图5为唾液的质谱图；其中，图5a为唾液样品未经处理直接分析的质谱图；图5b为nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图5c为Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；图5d为G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后的质谱图；磷酸化肽信号用*表示。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
以下实施方式中，自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的原件或具有相同或类似功能的原件，以下通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
实施例1：其中的E＝nSiO2。
实施例2：其中的E＝Fe3O4@nSiO2。
实施例3：其中的E＝G@mSiO2。
以上三种实施方式中，区别在于基底材料E的不同，制备方法相同：首先在基底表面修饰乙烯基单体，再利用3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐和基底材料表面的乙烯基聚合，得到有机膦酸基团修饰的E-PPFIL；酸化处理后，再在有机膦酸基团上固载金属离子，得到固定金属离子亲和吸附剂E-PPFIL-Ti4+。
其制备方法如下。
(1)基底材料表面修饰乙烯基单体：
200mg基底材料分散于20mL无水甲苯，超声分散后，向其中加入220μL的乙烯基三乙氧基硅烷，以及22μL三乙胺，在110℃条件下反应过夜。离心或磁性分离固体材料，乙醇洗涤，烘干。
(2)3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐单体的制备：
40mL无水甲苯中加入4g(3-溴丙基)膦酸酯、1.358g乙烯基咪唑，在130℃条件下反应12h。反应结束后，用甲苯洗涤产物2-3次，然后用乙酸乙酯洗涤3次，旋干待用。
(3)E-PPFIL的制备：
称取100mg乙烯基单体修饰的基底材料于10mL的氯仿中，超声分散，向其中加50mg的3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐和6mg的AIBN。将其置于油浴上，通N2，几秒钟后，开始搅拌，一个小时后开始加热至70℃，反应3h。固体材料分离后，分别用氯仿和乙醇洗涤2次，烘干。
(4)E-PPFIL的酸化处理：
将得到的E-PPFIL分散于5mL的氢溴酸中，在120℃的油浴中搅拌2h。反应结束后，分离固体，用氢氧化钠溶液(pH＝10)洗涤至中性，再用去离子水洗涤数次，去除残余的氢氧化钠和钠盐。
(5)E-PPFIL-Ti4+的制备：
将经过酸处理后的E-PPFIL分散于30mL 0.1M Ti(SO4)2溶液中，室温下震荡2h，离心分离固体后，依次用去离子水和乙醇洗涤，85℃烘干，得到的固体即是E-PPFIL-Ti4+。
实验测试及结合附图进行说明，如下：
(1)为了考察三种不同基底的纳米材料在修饰钛离子(E-PPFIL-Ti4+)后对磷酸化肽的富集效果，从而确定不同基底材料对磷酸化肽富集的影响，我们比较了三种吸附剂E-PPFIL-Ti4+(E＝nSiO2、Fe3O4@nSiO2或G@mSiO2)对标准蛋白β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集效果。
将5mgβ-酪蛋白溶解于1mL 25mM碳酸氢氨缓冲溶液(pH＝8)中；向混合溶液中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与底物的质量比为1：50)，在37℃条件下反应12h。酶解后的产物存放于-20℃的冰箱中待用。
为了比较三种不同基底的吸附剂E-PPFIL-Ti4+(E＝SiO2、Fe3O4@nSiO2或G@nSiO2)对磷酸化肽的富集效果，我们首先选择标准蛋白β-酪蛋白酶解液作为富集的样品。
分别称取5mg三种不同基底的吸附剂于2mL的富集缓冲液(50％ACN，6％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入1μL的标准肽酶解液(200fmol/μL)。然后，将装有混合液的离心管置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心或磁性分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 10％(v/v)的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱检测后，结果如图2所示：图2a为β-酪蛋白酶解液未经处理，直接质谱分析，从图中可以看到没有检测到磷酸化肽的信号；β-酪蛋白酶解液在nSiO2-PPFIL-Ti4+、Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+和G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后，分别可以富集到4、4和5个磷酸化肽以及所对应的去磷酸残基信号，该结果表明吸附剂E-PPFIL-Ti4+(E＝SiO2、Fe3O4@nSiO2或G@mSiO2)对磷酸化肽富集具有很好的特异性，其原因是还有高密度膦酸基团的聚合物配体可以络合更多的金属离子，同时离子型配体可以提高材料的亲水性，因此合成的材料E-PPFIL-Ti4+(E＝SiO2、Fe3O4@nSiO2或G@mSiO2)可以用于磷酸化肽的选择性富集。
(2)为了更好地评估三种不同基底材料E-PPFIL-Ti4+(E＝SiO2、Fe3O4@nSiO2或G@mSiO2)对磷酸化肽的选择性富集能力，选择磷酸化蛋白β-酪蛋白和非磷酸化蛋白牛血清蛋白BSA的酶解混合液作为富集的样品(β-酪蛋白与BSA的摩尔比为1：1000)。
1mg牛血清蛋白溶解在0.1mL 50mM碳酸氢氨变性缓冲液中(包含8M尿素)，变性后加入0.2mL 0.1M二硫苏糖醇(DTT)溶液，并在37℃条件下反应30min，还原蛋白质中的二硫键，然后再加入0.2mL 0.2M碘乙酰胺(IAA)溶液，于室温条件下避光反应30min，使还原的巯基烷基化；将上述产物用50mM碳酸氢氨缓冲溶液(pH＝8.3)稀释至1mL；向混合溶液中加入胰蛋白酶(胰蛋白酶与底物的质量比为1：50)，在37℃条件下反应16h。酶解后的产物存放于-20℃的冰箱中待用。
分别称取5mg三种不同基底的吸附剂于2mL的富集缓冲液(50％ACN，6％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入1μL的β-酪蛋白与BSA的混合液。然后，将装有混合液的离心管置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心或磁性分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 10％(v/v)的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱检测结果如图3所示，混合肽样品在经过nSiO2-PPFIL-Ti4+、Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+和G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后，分别可以检测到1、2和4个磷酸化肽的信号以及1、2和1个去磷酸残基信号，从富集的结果可以看出，G@mSiO2-PPFIL-Ti4+具有较好的选择性，Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+次之，nSiO2-PPFIL-Ti4+的选择性最弱。
(3)为了更好地评估G@mSiO2-PPFIL-Ti4+在更复杂的环境中对磷酸化肽的富集特性，我们采用更为复杂的蛋白酶解液作为吸附样品研究材料的特异性，即提高β-酪蛋白和牛血清蛋白BSA酶解混合液中BSA酶解液的摩尔比(摩尔比为1：15000)。
称取5mg G@mSiO2-PPFIL-Ti4+于2mL的富集缓冲液(50％ACN，6％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入150μL的蛋白酶解混合液(其中，β-酪蛋白的含量1.43pmol)。然后，将混合液置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 10％的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
分析结果如图4所示，在经过G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后，磷酸化肽的信号峰主导整个质谱图，且可以检测到4个磷酸化肽信号以及对于的2个去磷酸残基信号，磷酸化肽的强度较高，结果表明材料G@mSiO2-PPFIL-Ti4+具有良好的特异选择性，可以在更为复杂的环境中有效地富集磷酸化肽。
(4)利用三种不同基底的富集材料E-PPFIL-Ti4+(E＝nSiO2、Fe3O4@nSiO2或G@mSiO2)对唾液中内源性磷酸化肽的富集采集到的正常人的唾液保存在-20℃的冰箱中。
分别称取5mg三种不同基底的吸附剂于2mL的富集缓冲液(50％ACN，6％TFA，v/v)中，超声分散后，取出100μL的分散液用于富集实验，向分散液中加入20μL唾液样品。然后，将装有混合液的离心管置于恒温金属浴中，在37℃条件下震荡30min，离心或磁性分离固体并用富集缓冲液洗涤固体材料三次。最后，用10μL 10％(v/v)的氨水分散洗涤后的固体材料，在37℃条件下震荡15min，离心后取上清液5μL，与5μL基质溶液(饱和DHB溶液，包含50％ACN和0.1％TFA)混合后，取1μL的混合液滴于MALDI的靶板上，在空气中干燥后进行MALDI-TOF MS分析。
质谱检测结果如图5所示，唾液样品未处理直接分析后，结果如图5a所示，非磷酸化肽和杂质信号主导质谱图，检测不到磷酸化肽信号；唾液在经nSiO2-PPFIL-Ti4+、Fe3O4@nSiO2-PPFIL-Ti4+和G@mSiO2-PPFIL-Ti4+处理后(图5b-d)，分别可以检测到的磷酸化肽的信号个数为16、17和22，同时，在谱图中几乎看不到其他杂峰的信号，表明该类配体材料适合于实际生物样品中磷酸化肽的特异选择性富集。
本发明的保护范围包括但不限于以上实施方式，本发明的保护范围以权利要求书为准，任何对本技术做出的本领域的技术人员容易想到的替换、变形、改进均落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.聚离子液体改性纳米材料，其特征在于，所述的材料通过以下方法制备：
(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构纳米二氧化硅(Fe3O4@nSiO2)或介孔二氧化硅包覆的石墨烯(G@mSiO2)；
(2)将上述得到的材料E-CH＝CH2分散于氯仿中，然后向其中加入3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐、偶氮二异丁腈，N2氛下搅拌、加热后，材料E-CH＝CH2的表面发生聚合作用，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到聚有机膦离子液体修饰的纳米材料(E-PPFIL)；
(3)将得到的材料E-PPFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即E-PPFIL-Ti4+，为聚离子液体改性纳米材料。
2.聚离子液体改性纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将基底材料E分散在无水甲苯中，分别加入三乙氧基(乙烯基)硅烷和三乙胺，并进行搅拌、加热，可以得到氨基修饰的纳米材料，即E-CH＝CH2，洗涤、烘干；所述的基底材料为纳米二氧化硅(nSiO2)、磁性核壳结构纳米二氧化硅(Fe3O4@nSiO2)或介孔二氧化硅包覆的石墨烯(G@mSiO2)；
(2)将上述得到的材料E-CH＝CH2分散于氯仿中，然后向其中加入3-(3-(二乙氧基磷酸酯)丙基)-1-乙烯基咪唑溴化盐、偶氮二异丁腈，N2氛下搅拌、加热后，材料E-CH＝CH2的表面发生聚合作用，将固体产物洗涤、干燥后，则可以得到聚有机膦离子液体修饰的纳米材料(E-PPFIL)；
(3)将得到的材料E-PPFIL分散于氢溴酸中，搅拌、加热后，用NaOH溶液(pH＝10)洗涤至中性，烘干；
(4)将步骤(3)得到的材料分散于Ti(SO4)2溶液中，室温下反应2h，将得到的固体用去离子水多次洗涤，烘干后，即可得到固定金属离子的亲和材料，即E-PPFIL-Ti4+，为聚离子液体改性纳米材料。
3.根据权利要求2所述的聚离子液体改性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，反应的温度为110℃，反应时间为24h。
4.根据权利要求2所述的聚离子液体改性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，反应的温度为75℃，反应时间为2h。
5.根据权利要求2所述的聚离子液体改性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中洗涤液均为乙醇。
6.聚离子液体改性纳米材料在富集磷酸化肽中的应用，其特征在于，将权利要求1中的聚离子液体改性纳米材料用于从复杂生物样品中富集磷酸化肽。
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