CN106925241A - 一种利用5‑磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种将螯合剂5‑磷酸吡哆醛用于制备固定金属亲合材料的方法，及该固定金属亲合材料在样品前处理中的应用。本发明首先选取几种常用的纳米材料Y进行化学修饰，制备氨基修饰的纳米材料，得到Y‑NH2；再将5‑磷酸吡哆醛接到Y‑NH2上，得到表面修饰磷酸根的Y‑NH2‑PLP；最后在磷酸根上固载金属离子，得到Y‑NH2‑PLP‑Mn+。本发明的修饰方法简单、省时，且不会破坏基底材料的形貌特征，而且该修饰对基底材料进行功能化，增加了基底材料的实用性。Y‑NH2‑PLP‑Mn+可直接作为萃取材料，用于复杂生物样品的样品前处理，萃取过程中，通过离心或外磁场作用，达到材料与样品分离的目的，目前已成功地应用于标准多肽混合液、牛奶酶解液、人类血清样品、鼠脑裂解液中磷酸化多肽的萃取等领域。

Description

一种利用5-磷酸吡哆醛制备固定金属亲合材料的方法
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种将5-磷酸吡哆醛用于制备固定金属亲合材料的方法，及其在样品前处理中的应用。
背景技术
蛋白质磷酸化是一种可逆的转录后修饰，在各种生理功能中都有重要的作用。目前，质谱技术由于其高灵敏度、高通量被广泛用于磷酸化多肽的研究中。然而由于磷酸化蛋白在生物样品里的含量低，并且磷酸化多肽在质谱中的离子化效率比非磷酸化多肽要低，使得我们难以对其进行直接分析。因此，在质谱分析前对样品中的磷酸化多肽进行富集显得十分重要。
固定金属亲合色谱(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)作为一种快速、简单易用和经济的纯化技术，近年来被研究者广泛应用于磷酸化肽的富集。其基本原理是将金属离子固定于一定的配体上，然后利用金属离子与磷酸根基团之间的配位作用来萃取磷酸化多肽。吸附到材料上的磷酸化多肽可以通过磷酸盐或者碱性溶液解吸下来。其中，研究最多的配体为亚氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)和磷酸根基团等，且磷酸根基团修饰的多孔硅胶比传统的IMAC材料体现出更好的选择性。因此，在接下来的几年中，人们制备了一系列含磷酸根基团的材料，并将其用于复杂生物样品中磷酸化多肽的分离和富集，然而，在制备含磷酸根基团的材料的过程中，经常需要用到一些毒性较大的试剂，并且合成过程较为复杂。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明引入一种新的配体—5-磷酸吡哆醛(Pyridoxal5′-phosphate,PLP)，它是维生素B6在体内的活性型代谢产物，且具有双功能反应基团，分别是醛基和磷酸根。
本发明提供的技术方案具体如下：
一种固定金属亲合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)将活化过的纳米材料Y分散在乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷进行搅拌，得到氨基修饰的纳米材料Y，即Y-NH2；所述的纳米材料Y为纳米SiO2、Fe3O4@SiO2纳米微球或碳纳米管；
(2)向步骤(1)得到的Y-NH2中加入pH＝7.4的磷酸缓冲液，然后加入5-磷酸吡哆醛和NaBH3CN，室温反应，Y-NH2表面被磷酸根修饰，将所得固体产物清洗后室温干燥，得到Y-NH2-PLP；
(3)向金属盐溶液中加入Y-NH2-PLP，室温震荡5-10h，所得固体产物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金属亲合材料，即Y-NH2-PLP-Mn+。
所述步骤(1)中，纳米SiO2或Fe3O4@SiO2纳米微球的活化方式为：将纳米SiO2或Fe3O4@SiO2纳米微球分散在盐酸中室温静置0.5h以上；碳纳米管的活化方式为：将碳纳米管分散在浓硫酸、浓硝酸体积比为3:2的混合液中50℃搅拌20h以上。
所述步骤(1)中，纳米SiO2或Fe3O4@SiO2纳米微球与3-氨丙基三乙氧基硅烷一起进行搅拌的温度为室温；碳纳米管与3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)一起进行搅拌的温度为70℃。
所述步骤(2)中，固体产物的洗涤方式为：依次用乙醇、二次水和丙酮清洗。
步骤(2)中，所述的金属盐为硫酸钛、氯化镓、氯化铁中的一种。
一种固定金属亲合材料，由上述制备方法制备得到。
上述固定金属亲合材料在样品前处理中的应用。
本发明的原理如下：
本发明通过席夫碱反应在氨基化纳米材料(Y)表面修饰磷酸根基团，得到Y-NH2-PLP；继而在磷酸根基团上修饰金属离子，得到Y-NH2-PLP-Mn+固定金属亲和色谱(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)吸附剂，该吸附剂的螯合剂为5-磷酸吡哆醛。
本发明通过改变纳米材料Y，分别选择二氧化硅(SiO2)，氧化碳纳米管(OCNT)和包硅磁颗粒(Fe3O4@SiO2)制备了三种不同基地材料的Y-NH2-PLP(Y＝SiO2、OCNT或Fe3O4@SiO2)。
本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明的修饰方法简单、省时，且不会破坏基底材料的形貌特征，而且该修饰对基底材料进行功能化，增加了基底材料的实用性。
(2)本发明制备的固定金属亲合材料Y-NH2-PLP-Mn+可作为IMAC吸附剂，利用金属离子与磷酸根的亲和作用，应用于生物样品中磷酸化肽的选择性富集，成功地应用于标准多肽混合液、牛奶酶解液、人类血清样品、鼠脑裂解液中磷酸化多肽的萃取等领域。
附图说明
图1为Y-NH2-PLP-Mn+(以Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+为例)制备的流程图。
图2为β-酪蛋白和牛血清蛋白(BSA)酶解混合液(1:500)的质谱图；其中，图2(a)表示直接分析；图2(b)表示经过Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后；图2(c)表示经过SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后；图2(d)表示经过CNT-NH2-PLP-Ti4+萃取后；磷酸化多肽用其m/z值标记。
图3为β-酪蛋白和牛血清蛋白(BSA)酶解混合液(1:500)的质谱图；其中，图3(a)表示经过Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ga3+萃取后；图3(b)表示经过Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Fe3+萃取后；磷酸化多肽用其m/z值标记。
图4为β-酪蛋白和BSA酶解混合液(1:1000)的质谱图；其中，图4(a)表示直接分析；图4(b)表示经过Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后；磷酸化多肽用其m/z值标记。
图5为血清和脱脂牛奶酶解液的质谱图；其中，图5(a)表示直接分析的血清样品；图5(b)表示Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后的血清样品；图5(c)表示直接分析的脱脂牛奶酶解液样品；图5(d)表示Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+萃取后的脱脂牛奶酶解液样品。
图6为鼠脑裂解液中磷酸化多肽的情况分析图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明，并不能限制本发明的范围。
实施例1
首先制备氨基修饰的纳米材料，得到Y-NH2；再将5-磷酸吡哆醛接到Y-NH2上，得到表面修饰磷酸根的Y-NH2-PLP；最后在磷酸根上固载金属离子，得到Y-NH2-PLP-Mn+。
1.氨基修饰的纳米材料(Y-NH2)的制备，根据纳米材料不同，其制备方法如下：
①SiO2-NH2的制备：将0.5g纳米SiO2分散在25mL 1M的HCl水溶液中活化30min；经水及乙醇清洗后，将其分散在50mL乙醇中；在上述悬浮液中加入2mLAPTES，室温下搅拌3h，得到氨基键合硅胶纳米颗粒。
②Fe3O4@SiO2-NH2的制备：将2.0gFeCl2·4H2O和5.4g FeCl3·6H2O溶解在2M HCl水溶液中，通入氮气除去溶解氧，然后加入30mL浓氨水(25wt％)，搅拌30min，得到Fe3O4纳米颗粒；将Fe3O4纳米颗粒经反复磁分离及水洗后，分散于50mL水中待用。
取5mL Fe3O4纳米颗粒悬浮液，用乙醇清洗后，分散于40mL乙醇中，并超声1h；之后加入1.5mL浓氨水，6mL水以及1.5mL TEOS，并在40℃下搅拌2h。最后所得的Fe3O4@SiO2纳米颗粒经去离子水及乙醇清洗后，置于60℃真空干燥箱中烘干待用。将0.5g Fe3O4@SiO2分散在25mL 1M的HCl水溶液中活化30min；经水及乙醇清洗后，将其分散在50mL乙醇中；在上述悬浮液中加入2mLAPTES，并在室温下搅拌3h，得到氨基键合硅胶纳米颗粒。
③OCNT-NH2的制备：将碳纳米管(CNT)分散于300mL浓硫酸、浓硝酸体积比为3:2的混合液中，在50℃搅拌20h，然后将所得溶液过滤，并用水和丙酮清洗，在100℃真空条件下干燥24h，将所得产物氧化碳纳米管(OCNT)分散于50mL乙醇中，超声30min。随后加入2mLAPTES于70℃搅拌4h，得到氨基键合的氧化碳纳米管，即OCNT-NH2。
2.Y-NH2-PLP的制备：称取0.4g Y-NH2于50mL圆底烧瓶中，加入40mL 0.1M的磷酸缓冲液(pH 7.4)，再加入0.2g PLP和0.2g氰基硼氢化钠(NaBH3CN)，25℃反应5h。产物依次用乙醇、二次水和丙酮清洗，室温干燥过夜，即得到Y-NH2-PLP。
3.Y-NH2-PLP-Mn+的制备：配制三份硫酸钛水溶液(0.1M)20mL，分别加入0.2g Y-NH2-PLP；分别配制氯化镓水溶液(0.1M)、氯化铁水溶液(0.1M)各20mL，分别向这两份溶液中加入0.2gFe3O4@SiO2-NH2-PLP，室温震荡5h，产物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金属亲合材料，即Y-NH2-PLP-Mn+。
实施例2
为了考察三种不同纳米材料修饰钛离子(Y-NH2-PLP-Ti4+)对磷酸化肽的萃取效果，从而选出一种最优的基底材料，我们比较了三种Y-NH2-PLP-Ti4+(Y＝SiO2、OCNT或Fe3O4@SiO2)在β-酪蛋白和BSA酶解混合液中对磷酸化多肽的萃取效果：
将β-酪蛋白用100mM Tris-HCl(pH＝8.5)缓冲液配制成浓度为1mg/mL的溶液；在上述溶液中按照酶与底物比为1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反应16h。酶解后的多肽产物经真空离心浓缩仪抽干后存放在-20℃的冰箱中备用。
称取1mgBSA溶于100μL含8M尿素及100mM Tris-HCl的变性缓冲液(pH＝8.5)中，然后加入5μL 100mM三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐溶液(三羧甲基磷酸，TCEP)，并在室温下反应20min以还原蛋白质中的二硫键，继续加入5μL 100mM碘乙酰胺(IAA)溶液，并在避光条件下，室温下反应30min使被还原的巯基烷基化。经还原及烷基化的蛋白质用300μL 100mMTris-HCl(pH 8.5)稀释后，按照酶与底物比为1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反应16h。酶解后的多肽产物抽干后存放在-20℃的冰箱中备用。
为了比较基于三种不同基底材料Y-NH2-PLP-Ti4+(Y＝SiO2、OCNT或Fe3O4@SiO2)对磷酸化肽段的富集能力，将磷酸化蛋白(β-酪蛋白)与非磷酸蛋白(BSA)酶解产物的混合物作为分析物(β-酪蛋白：BSA＝1:500)。
分别称取10mg Y-NH2-PLP-Ti4+分散于1mL水中，混合均匀后，取20μL分散液，用上样液(5％TFA-50％ACN(v/v))平衡，然后将其加入100μL含多肽混合物的上样液中，涡旋3min，离心或磁分离，经过上样液清洗两遍之后，材料上的分析物用100μL解吸液(0.4MNH3·H2O)解吸到离心管中。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，加入1.2μL基质溶液(20mg/mL2,5-DHB于50％ACN，1％H3PO4的水溶液中)溶解多肽，全部样品点在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。
所有的质谱分析都采用日本Shimadzu公司的AximaTOF2型基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF MS)。MALDI MS分析时采用波长为337nm的氮气激光器，其脉冲宽度为3ns；采用20kV的加速电压，在正离子反射模式下进行检测。每张谱图是200次激光扫描的平均结果。
检测结果如图2所示：当β-酪蛋白酶解物未经富集直接经MALDI MS分析时，谱图中存在大量非磷酸化多肽的峰，没有磷酸化多肽的峰(图2(a))。经过三种Y-NH2-PLP-Ti4+分别处理之后，解吸液中分别可检测到6、4、2个磷酸化多肽的信号峰(图2(b)，图2(c)，图2(d))，而绝大多数非磷酸化多肽的信号被有效地消除，表明这三种Y-NH2-PLP-Ti4+对磷酸化多肽均表现出一定的选择性。从质谱图中磷酸化多肽个数和杂峰情况来看，以Fe3O4@SiO2为基底的材料富集效果最好，所能检测到的磷酸化多肽的信息如表1所示。推测的原因是，相比于磁纳米颗粒，硅胶颗粒粒径更大，分散性较差，吸附量较小，且分离需要离心，操作不方便；而碳纳米管表面具有一定的疏水性，会增加对非磷酸化多肽的非特异性吸附。
实施例3
为了考察三种常用金属离子(Ti4+，Ga3+，Fe3+)对磷酸化肽的萃取效果，从而选出一种最优的金属离子以获得最优的材料，我们比较了Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Mn+(M＝Ti4+、Ga3+或Fe3+)在β-酪蛋白和BSA酶解混合液中对磷酸化多肽的萃取效果：
为了比较三种键合不同金属离子的Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Mn+(M＝Ti4+、Ga3+或Fe3+)对磷酸化肽段的富集能力，将磷酸化蛋白(β-酪蛋白)与非磷酸蛋白(BSA)酶解产物的混合物作为分析物(β-酪蛋白：BSA＝1:500)。
分别称取10mg Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Mn+分散于1mL水中，混合均匀后，取20μL分散液，用上样液(5％TFA-50％ACN(v/v))平衡，然后将其加入100μL含多肽混合物的上样液中，涡旋3min，离心或磁分离，经过上样液清洗两遍之后，材料上的分析物用100μL解吸液(0.4MNH3·H2O)解吸到离心管中。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，加入1.2μL基质溶液(20mg/mL 2,5-DHB于50％ACN，1％H3PO4的水溶液中)溶解多肽，全部样品点在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。
检测结果如图3所示：Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Fe3+和Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ga3+这两种材料对磷酸化多肽也表现出一定的选择性，尤其是多磷酸化多肽。从质谱图中磷酸化多肽个数和杂峰情况来看，Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+表现得最好(图2(b))。推测原因是，Fe3+和Ga3+相比于Ti4+与磷酸化多肽的相互作用力更弱，因此损失大量的单磷酸化多肽。
实施例4
为了进一步评价Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+对磷酸化多肽的萃取能力，我们将Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+应用于更复杂的β-酪蛋白和BSA酶解混合液中磷酸化多肽的萃取，同时继续提高磷酸化蛋白(β-酪蛋白)与非磷酸蛋白(BSA)酶解产物的混合物中BSA的比例。
称取10mg Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+分散于1mL水中，混合均匀后，取20μL分散液，用上样液(5％TFA-50％ACN(v/v))平衡，然后将其加入100μL含多肽混合物的上样液中，涡旋3min，离心或磁分离，经过上样液清洗两遍之后，材料上的分析物用100μL解吸液(0.4MNH3·H2O)解吸到离心管中。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，加入1.2μL基质溶液(20mg/mL2,5-DHB于50％ACN，1％H3PO4的水溶液中)溶解多肽，全部样品点在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。
检测结果如图4所示：当β-酪蛋白酶解物和BSA酶解物的比例为1:1000时，在未经过前处理的谱图中只能看到大量的非磷酸化肽信号(图4(a))；经过Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4 +处理之后，谱图中可以看到6个磷酸化肽的峰，而且大量的非磷酸化肽信号被去除(图4(b))，说明Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+对磷酸化肽有极好的选择性。
实施例5：Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+应用于血清中内源性磷酸化多肽的富集
正常人的血清样品通过标准的临床渠道从武汉大学校医院获得，采集到的血清保存在-20℃冰箱中。
称取10mg Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+分散于1mL水中。混合均匀后，取20μL，用上样液(5％TFA-50％ACN(v/v))平衡后，进行萃取。萃取磷酸化多肽时，血清(2μL)需要用上样液稀释50倍再进行萃取。上样液和解吸液分别为100μL 5％TFA-50％ACN(v/v)和0.4M氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液进行冷冻旋干，1.2μL基质溶液(20mg/mL2,5-DHB in 50％(v/v)ACN,1％(v/v)H3PO4)溶解多肽，全部样品点在MALDI靶上用于MALDI-TOF MS分析。
检测结果如图5所示：血清未经过材料处理直接进样时，质谱图中只能非磷酸多肽的信号(图5(a))；经过材料处理之后，质谱图中清晰的呈现着4个磷酸化多肽，而且几乎看不到非磷酸化肽的信号(图5(b)，附表2)，表明材料适用于高蛋白生物样品的分析。
实施例6：Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+应用于脱脂牛奶酶解物中磷酸化多肽的选择性富集
脱脂牛奶购买自武汉大学某超市。牛奶的酶解过程如下：取100μL低脂牛奶经真空离心浓缩仪抽干后复溶于100μL含8M尿素及100mM Tirs-HCl的变性缓冲液(pH 8.5)中。上述溶液经10mM二硫苏糖醇(DTT)于37℃下反应30min以还原蛋白质中的二硫键，之后在20mM碘乙酰胺(IAA)中于避光条件下，室温下反应30min使被还原的巯基烷基化。经还原及烷基化的蛋白质用300μL 100mM Tris-HCl(pH 8.5)稀释后，按照酶与底物比为1:50(w/w)的比例加入胰蛋白酶，并在37℃反应16h。所有的酶解物保存在-20℃冰箱中备用。酶解后的多肽样品稀释500倍后用于材料的选择性评价。
称取10mg Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+分散于1mL水中，混合均匀后，取20μL分散液，用上样液(5％TFA-50％ACN(v/v))平衡后，进行萃取。萃取磷酸化多肽时，牛奶酶解物用上样液稀释500倍再进行萃取。上样液和解吸液分别为100μL 5％TFA-50％ACN(v/v)和0.4M氨水水溶液。萃取完成之后，解吸液进行冷冻旋干，1.2μL基质溶液(其中，2,5-DHB浓度为20mg/mL，50％(v/v)ACN，1％(v/v)H3PO4)溶解多肽，全部样品点在MALDI靶上用于MALDI-TOFMS分析。
检测结果如图5所示：牛奶酶解物未经过材料处理直接进样时，质谱图中只能看到7个磷酸化多肽以及大量的非磷酸化肽(图5(c))；经过材料处理之后，质谱图中清晰的呈现着20个磷酸化多肽(图5(d)，附表3)，表明材料可用于实际样品分析。
实施例7：Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+应用于鼠脑裂解液中磷酸化多肽的富集
斯普拉格(SD)雌性大鼠由湖北省疾控中心提供，年龄3～4个月，体重250～300g。鼠脑被取下后，清洗干净，切碎。取0.5g鼠脑组织，用匀浆管研碎，加入1mLRIPA裂解液(含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂)。在冰浴中裂解30分钟后，于4℃下12000rpm离心30min，收集上清液。利用BCA方法对上述上清液中的蛋白进行定量。往上述上清液中加入3体积的丙酮/乙醇/乙酸混合液(50/50/0.1,v/v/v)进行蛋白沉淀。之后4℃下4000rpm离心30min；去除上清液后，得到蛋白质，在空气中晾干。蛋白质用含8M尿素和0.2M Tris、4mM CaCl2的溶液复溶后同上述步骤进行酶解。酶解后的多肽产物经C18柱脱盐并抽干后存放在-20℃的冰箱中备用。
称取10mg Fe3O4@SiO2-NH2-PLP-Ti4+分散于1mL水中，混合均匀后，取20μL分散液，用上样液(5％TFA-50％ACN(v/v))平衡后，进行萃取。萃取鼠脑裂解液样品时，鼠脑蛋白的用量为0.5mg。上样液和解吸液分别为100μL 5％TFA-50％ACN(v/v)和0.4M氨水水溶液。解吸液经真空离心浓缩仪抽干后，用C18柱SPE脱盐，然后用反相液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)分析。
经富集后的细胞裂解物酶解产物采用nanoRPLC-ESI-MS/MS(TripleTOF 5600+，ABSciex)进行质谱分析。多肽首先被结合到CapTrap柱(5μm,5×0.3mm,AgilentTechnologies)上，然后被洗脱到反相C18分析柱(75μm×150mm,3μmparticle size,poresize,Eksigent)上。液相色谱的流动相分别为溶液A(3％DMSO,97％H2O,0.1％甲酸)和溶液B(3％DMSO,97％ACN,0.1％甲酸)，其梯度设置如表3-1所示，流速为300nL/min。一级质谱扫描范围从400到1800amu，250ms累积时间。每个完整的一级质谱扫描包括40次二级质谱分析，扫描范围从350到1500amu，离子的带电量为+2到+5价。二级质谱分析阀值设为120，18秒内排除相同质荷比离子。
检测结果如图6所示：该方法在0.5mg鼠脑裂解液中共检测到3014个磷酸化多肽，其中单磷酸化多肽有2848个，多磷酸化多肽有166个，对磷酸化多肽的特异性为88.1％(图6)。结果表明该材料在复杂生物样品的分析中表现良好，有望用于磷酸化蛋白组的全分析。
表1β-酪蛋白酶解液中鉴定到的磷酸化多肽的详情
“_”表示磷酸化位点
表2人类血清中鉴定到的磷酸化多肽的详情
“_”表示磷酸化位点。
表3脱脂牛奶酶解液中鉴定到的磷酸化多肽的详情
“_”表示磷酸化位点。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种固定金属亲合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将纳米材料Y分散在乙醇中，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷进行搅拌，得到氨基修饰的纳米材料Y，即Y-NH2；所述的纳米材料Y为纳米SiO2、Fe3O4@SiO2纳米微球或氧化碳纳米管；
(2)向步骤(1)得到的Y-NH2中加入pH＝7.4的磷酸缓冲液，然后加入5-磷酸吡哆醛和NaBH3CN，室温反应，Y-NH2表面被磷酸根修饰，将所得固体产物清洗后室温干燥，得到Y-NH2-PLP；
(3)向金属盐溶液中加入Y-NH2-PLP，室温震荡5-10h，所得固体产物依次用乙醇、水和丙酮清洗，60℃真空干燥，得到固定金属亲合材料，即Y-NH2-PLP-Mn+。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所采用的纳米SiO2或Fe3O4@SiO2纳米微球在使用前分散在盐酸中室温活化0.5h以上。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的氧化碳纳米管通过以下方式制备得到：将碳纳米管分散在浓硫酸、浓硝酸体积比为3:2的混合液中50℃搅拌20h以上，即得到氧化碳纳米管。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，纳米SiO2或Fe3O4@SiO2纳米微球与3-氨丙基三乙氧基硅烷一起进行搅拌的温度为室温；氧化碳纳米管与3-氨丙基三乙氧基硅烷一起进行搅拌的温度为70℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，固体产物的洗涤方式为：依次用乙醇、二次水和丙酮清洗。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的金属盐为硫酸钛、氯化镓、氯化铁中的一种。
7.一种固定金属亲合材料，其特征在于：由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到。
8.权利要求7所述的固定金属亲合材料在样品前处理中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108181475A (zh) * 2017-12-27 2018-06-19 湖北普罗金科技有限公司 一种磷酸化蛋白质富集修饰的方法和试剂盒
CN111617746A (zh) * 2020-06-22 2020-09-04 宁波大学 聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用
CN111644163A (zh) * 2020-06-22 2020-09-11 宁波大学 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用
CN111690006A (zh) * 2020-06-22 2020-09-22 宁波大学 一种基于咪唑基离子液体材料及其制备方法及其用于磷酸化肽富集

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102760543A (zh) * 2011-04-25 2012-10-31 中国科学院大连化学物理研究所 亲水性金属离子固定化亲和磁球及其制备和应用
CN104949864A (zh) * 2014-03-25 2015-09-30 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸化蛋白质组样品快速处理方法
CN106474473A (zh) * 2016-10-12 2017-03-08 湖北工业大学 一种基于钆修饰的Fe3O4@PDA纳米材料的光热诊疗剂的制备

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102760543A (zh) * 2011-04-25 2012-10-31 中国科学院大连化学物理研究所 亲水性金属离子固定化亲和磁球及其制备和应用
CN104949864A (zh) * 2014-03-25 2015-09-30 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸化蛋白质组样品快速处理方法
CN106474473A (zh) * 2016-10-12 2017-03-08 湖北工业大学 一种基于钆修饰的Fe3O4@PDA纳米材料的光热诊疗剂的制备

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
武维新等: "磷酸化蛋白质组学富集策略进展及其在疾病研究中的应用", 《中国药科大学学报》 *
龙星宇等: "基于质谱技术的磷酸化蛋白／ 多肽分离富集、鉴定及组学研究", 《色谱》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108181475A (zh) * 2017-12-27 2018-06-19 湖北普罗金科技有限公司 一种磷酸化蛋白质富集修饰的方法和试剂盒
CN108181475B (zh) * 2017-12-27 2021-04-09 湖北普罗金科技有限公司 一种磷酸化蛋白质富集修饰的方法和试剂盒
CN111617746A (zh) * 2020-06-22 2020-09-04 宁波大学 聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用
CN111644163A (zh) * 2020-06-22 2020-09-11 宁波大学 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用
CN111690006A (zh) * 2020-06-22 2020-09-22 宁波大学 一种基于咪唑基离子液体材料及其制备方法及其用于磷酸化肽富集
CN111617746B (zh) * 2020-06-22 2023-03-31 宁波大学 聚离子液体改性纳米材料及其制备方法及其在富集磷酸化肽中的应用
CN111644163B (zh) * 2020-06-22 2023-04-07 宁波大学 一种用于富集磷酸化多肽的三足离子液体材料及其制备方法及其应用
CN111690006B (zh) * 2020-06-22 2023-07-14 宁波大学 一种基于咪唑基离子液体材料及其制备方法及其用于磷酸化肽富集

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