CN108906007A - 一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法及其应用，可有效解决糖蛋白分离富集效率低、种类少、操作繁琐、选择性与富集容量较低的问题，技术方案是首先采用溶剂热合成制备纳米四氧化三铁为磁性核心；然后对磁球表面进行双键功能化，使其表面修饰活性双键基团；再以氨基葡萄糖与丙烯酰氯为原料制备双键修饰葡萄糖，以其作为后续聚合反应的功能单体；最后采用蒸馏沉淀聚合反应，以双键修饰葡萄糖为单体，于磁球表面形成糖基亲水复合物；本发明制备方法简单，成本较低，节能环保，反应条件温和，易于生产，能够高效高选择性的分离富集糖蛋白/糖肽，并可以应用于复杂生物样品中糖肽或糖蛋白的富集，经济和社会价值显著。

Description

一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及化学、材料与生物学科交叉领域，特别是一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法及其应用。
背景技术
蛋白的糖基化是重要的蛋白翻译后修饰之一，根据Swiss-Prot数据库的记录和预测，人类蛋白中约有一半以上的蛋白质发生了糖基化。糖基化蛋白在细胞活动中扮演重要的角色，蛋白糖基化程度及糖链结构的异常是癌症及其他疾病发生的标志。临床研究表明，绝大多数的癌症临床标志物都是糖蛋白，癌症的糖蛋白主要表现糖基化异常。因此对糖蛋白组学的研究有助于探究癌症的发生机理，对于癌症的发现、防治有重要意义。目前以软生物质谱为工具shotgun策略是使用最为广泛的蛋白组学分析策略，主要包括：获得生物样品，对生物样品进行提取、标记、酶解、分离富集等，对肽段进行质谱鉴定，获得质谱数据进行分析。由于复杂的生物样品中，蛋白表达的动态范围非常宽，高丰度非糖基化蛋白的存在会大大抑制低含量的糖基化蛋白的质谱信号，因此对生物样品中糖基化蛋白进行选择性富集分离是糖蛋白组学研究的关键问题。
近年来，科学家已经发展了不同糖蛋白的分离富集方法，其中基于组分油-水两相分配比不同的亲水色谱，展现出操作简单、广谱富集及良好的质谱兼容性等优点。目前已有不同种类的功能材料用于亲水色谱基质的载体，例如硅球表面修饰羟基、氨基、磺酸等极性基团可以作为亲水色谱的基质，例如琼脂糖、亲水聚合物已经用于糖肽的分离富集。但是不能满足对于糖蛋白组分析的需求，且存在种类少、制备条件苛刻、操作繁琐、选择性与富集容量较低等问题有待解决。
功能化磁性复合微球由于其独特的磁感应性，可以在外加磁场作用下从生物样品中分离富集蛋白质/多肽等生物大分子，特别适用于蛋白质组学研究中。可以通过对磁球核心表面进行功能化修饰实现对目标物的选择性分离富集。因此，需要开发功能化磁性复合物，提高功能材料的性能，并建立高效的糖蛋白分离富集方法。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明的目的就是提供一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法及其应用，可有效解决糖蛋白分离富集效率低、种类少、制备条件苛刻、操作繁琐、选择性与富集容量较低的问题。
本发明解决的技术方案是，一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法：首先采用溶剂热合成制备纳米四氧化三铁为磁性核心；然后对磁球表面进行双键功能化，使其表面修饰活性双键基团；再以氨基葡萄糖与丙烯酰氯为原料制备双键修饰葡萄糖，以其作为后续聚合反应的功能单体；最后采用蒸馏沉淀聚合反应，以双键修饰葡萄糖为单体，于磁球表面形成糖基亲水复合物；
具体包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0-3.0g六水合三氯化铁溶解于70-140ml乙二醇，超声5-30min，得到黄色透明状液体，再加入7.0-8.0g乙酸铵与0.6-1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1-3h，将所得均匀溶液置于150-190℃油浴中搅拌1-2h，加热至160-200℃，反应12-24h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水清洗，于40-60℃下干燥10-14h得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取0.4-1.0g四氧化三铁磁性纳米微球分散于50-80ml乙醇、10-16ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8-1.5ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5-2.0ml浓氨水，于40-80℃下反应20-30h，所得产物用无水乙醇清洗，于40-60℃下干燥10-14h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取0.5-1.0 mL丙烯酰氯和0.5-1.0 mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应3-6h，得反应液A；另取1.0-1.5g 氢氧化钠，加入20-30mL甲醇超声溶解，再加入2.0-3.0g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.2-0.3g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌3-6h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应3-6h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取40-60mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入30-60mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为2-20%，超声分散均匀；然后加入100-300 mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、25-75 mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺和2-7 mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，15-30min由室温至沸腾，蒸馏出15-30ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次，55-65℃下干燥10-15h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
本发明制备的糖基亲水磁性复合物微球作为亲水色谱基质在糖肽或糖蛋白的分离富集中的应用。
本发明将亲水微球与目标蛋白分散于含有75-90%乙腈和0.1-2%三氟乙酸上样液中，振摇孵育5-30min，用含有0-30%乙腈和0.1三氟乙酸溶液洗脱，然后进行MALDI-TOF MS或者LC-MSMS分析。
本发明制备方法简单，成本较低，节能环保，反应条件温和，易于生产，能够高效高选择性的分离富集糖蛋白/糖肽，并可以应用于复杂生物样品中糖肽或糖蛋白的富集，制备出的糖基亲水磁性复合物微球具有良好亲水性与生物兼容性，聚合物层明显，聚合物有大量的葡萄糖，对糖蛋白/糖肽的富集容量高，经济和社会价值显著。
附图说明
图1为本发明制备的糖基亲水磁性复合物微球的透射电镜照片（a是磁球核心，b是糖基亲水磁性复合物微球）。
图2为本发明制备的糖基亲水磁性复合物微球分离非糖蛋白牛血清（BSA）与糖蛋白卵清蛋白（OVA）混合样品的凝胶电泳图片，泳道3为BSA与OVA混合样直接上样，泳道4为BSA与OVA混合样经过糖基亲水磁性复合物微球分离后上样。
图3为本发明制备的糖基亲水磁性复合物微球富集分离IgG酶解样品质谱图，（a）为IgG酶解样品直接上样分析，（b）为经过糖基亲水磁性复合物微球富集分离后，再用PNGase F酶切除糖链后上样分析，（c）为经过糖基亲水磁性复合物微球富集分离后上样分析，*表示为糖肽。
图4为本发明制备的糖基亲水磁性复合物微球富集分离BSA与IgG混合酶解样品质谱图，（a）为BSA与IgG酶解蛋白混合样直接质谱分析，（b）为经过糖基亲水磁性复合物微球分离富集后质谱分析图，*表示为糖肽。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，是由以下实施例实现。
实施例1
一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0g六水合三氯化铁溶解于70ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.0g乙酸铵与0.6g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于150℃油浴中搅拌2h，加热至160℃，反应24h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水清洗，于40℃下干燥14h得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取0.4g四氧化三铁磁性纳米微球分散于50ml乙醇、10ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于40℃下反应30h，所得产物用无水乙醇清洗，于40℃下干燥14h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取0.5mL丙烯酰氯和0.5mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应3h，得反应液A；另取1.0g氢氧化钠，加入20mL甲醇超声溶解，再加入2.0g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.2g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌3h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应3h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取40mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入30mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为2%，超声分散均匀；然后加入100mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、25mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺和2mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，15min由室温至沸腾，蒸馏出15ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次，55℃下干燥15h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
实施例2
一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.7g六水合三氯化铁溶解于100ml乙二醇，超声20min，得到黄色透明状液体，再加入7.7g乙酸铵与0.8g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌2h，将所得均匀溶液置于170℃油浴中搅拌1.5h，加热至180℃，反应16h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水清洗，于50℃下干燥12h得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取0.7g四氧化三铁磁性纳米微球分散于60ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.8ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗，于50℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取0.8 mL丙烯酰氯和0.8 mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应5h，得反应液A；另取1.2g 氢氧化钠，加入25mL甲醇超声溶解，再加入2.5g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.25g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌4h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应4h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取50mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入50mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为10%，超声分散均匀；然后加入200 mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、50 mgN，N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，25min由室温至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次，60℃下干燥12h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
实施例3
一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取3.0g六水合三氯化铁溶解于140ml乙二醇，超声30min，得到黄色透明状液体，再加入8.0g乙酸铵与1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌3h，将所得均匀溶液置于190℃油浴中搅拌1h，加热至200℃，反应12h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水清洗，于60℃下干燥10h得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取1.0g四氧化三铁磁性纳米微球分散于80ml乙醇、16ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入1.5ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和2.0ml浓氨水，于80℃下反应20h，所得产物用无水乙醇清洗，于60℃下干燥10h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取1.0 mL丙烯酰氯和1.0 mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应6 h，得反应液A；另取1.5g 氢氧化钠，加入30mL甲醇超声溶解，再加入3.0g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.3g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌6h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应6h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取60mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入60mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为20%，超声分散均匀；然后加入300 mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、75 mgN，N-亚甲基双丙烯酰胺和7 mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，30min由室温至沸腾，蒸馏出30ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次， 65℃下干燥10h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
本发明方法经多次反复实验均取得了一致的结果，相关应用试验资料如下：
实验1
将上述实施例2制备的糖基亲水磁性复合物微球，用透射电镜表征如图1所示，图1a为四氧化三铁磁性核心，图1b为磁性核心外层包覆葡萄糖聚合物，电镜照片表明磁性核心与外层亲水聚合物差异显著，呈明显核壳结构。
实验2
将制得的糖基亲水磁性复合物微球用于分离非糖蛋白牛血清（BSA）与糖蛋白卵清蛋白（OVA）混合样品：
（1）取糖基亲水磁性复合物微球0.2mg，用上样溶液（乙腈/水/三氟乙酸，80:19.99:0.01）洗三次，移去上清。
（2）加入含有BSA与OVA各20μg上样液0.2ml，室温孵育15min。
（3）磁性分离弃上清，用上样液洗涤3次。
（4）用50μL洗脱液30%乙腈洗脱液（乙腈/水/三氟乙酸，30:69.99:0.01）洗脱两次，合并洗脱液。
（5）将上述洗脱液真空冻干，加入20μL电泳上样液，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，如图2所示。泳道3为BSA与OVA标准对照，泳道4为BSA与OVA混合样经过糖基亲水磁性复合物微球分离后上样，结果差异显著，经亲水复合物微球分离后BSA的条带消失，而OVA的电泳条带显著，证明糖基亲水磁性复合物微球可以选择性分离糖蛋白。
实验3
将制得的糖基亲水磁性复合物微球用于亲水色谱固定相分离富集糖蛋白人血清免疫球蛋白（IgG）酶解液中糖肽：
（1）标准蛋白IgG在50 mM碳酸氢铵（pH=8.3）溶液中胰蛋白酶酶解16h。
（2）取亲水磁性纳米微球300 µg用上样液（ACN/H2O/TFA, 88 : 11.9 : 0.1, v/v/v）洗涤两次，然后加入200 μL上样液（含有2 µg IgG 酶解液），室温孵育30 min，磁铁回收材料，依次用上样液（100μL）洗涤3次，除去非糖肽异吸附。然后加入20 μL洗脱液（ACN/H2O/TFA, 30 : 69.9 : 0.1, v/v/v）室温孵育10 min，洗脱被吸附糖肽。
（3）收集洗脱液用MALDI-TOF MS分析。分析结果：如图3（a）所示，IgG酶解样品直接上样分析，人血清免疫球蛋白酶解液中存在大量非糖肽，糖肽峰质谱信号被高丰度非糖肽峰质谱信号所抑制和掩盖，MALDI-TOF MS质谱图中仅有两个糖肽可以清晰鉴定。用糖基亲水磁性纳米微球富集后如图3（c），绝大多数非糖肽信号消除，糖肽信号显著增强，可以定性鉴别到20个特征糖肽，覆盖率为83%。如图3（b）是经过PNGase F酶切除糖链后的质谱图，显示为IgG的特征肽段序列。结果证明本发明所制备的糖基亲水磁性纳米微球对糖肽有显著性选择富集性能。
实验4
将制得的糖基亲水磁性复合物微球用于亲水色谱固定相分离富集高丰度BSA与IgG混合样品中糖肽：
（1）将酶解的BSA与IgG蛋白样品按照质量比（50：1）混合，配置成上样溶液。
（2）按照实验3步骤（2）中操作进行，收集洗脱液。
（3）收集洗脱液用MALDI-TOF MS分析。分析结果：如图4（a）所示，为BSA与IgG酶解蛋白混合样直接质谱分析，非糖肽信号强度很高，图4（b）为经过糖基亲水磁性复合物微球分离富集后质谱分析图，非糖肽干扰大部分消除掉，糖肽信号显著增强，结果证明本发明所制备糖基亲水磁性复合物微球在高强度干扰下对糖肽仍然表现出较好的选择性分离富集能力。
实验5
将制得的糖基亲水磁性复合物微球用于亲水色谱固定相分离富集HepG2细胞蛋白样品中糖肽：
（1）将HepG2细胞提取蛋白溶于8 M 尿素的100 mM 碳酸氢铵缓冲液（pH 8.3），经过DTT与IAA处理后，稀释至1M尿素，加入胰蛋白酶酶解16h，然后经固相萃取小柱除盐后分装冻干备用。
（2）按照实验3步骤（2）中操作进行，上样50µg细胞酶解样品，洗脱液20μL洗脱三次，合并洗脱液冻干，复溶于150 μL NH4HCO3（pH8.3），加入适量的PNGF酶（10 μg蛋白需要1U的PNGF酶 ），37 ℃孵育10 h。冻干后复溶于50μL0.1%甲酸溶液。
（3）将上述样品进行LC-MS/MS分析，上样5μg，质谱数据进行Uniprot数据库检索，根据肽段序列匹配鉴别N糖基化肽段，若肽段序列为NXS/T且X不为脯氨酸，则认证为N糖基化肽段。三次实验重复总共鉴定到187个N糖基化位点、239条糖肽和130个糖蛋白。
本发明以氨基葡萄糖为单体，用蒸馏沉淀聚合制备的糖基亲水磁性复合物微球有以下特点：（1）复合物微球呈明显的核壳结构，结构较为规则，微球粒径主要在100-200nm，亲水壳层约30nm；（2）其核心为四氧化三铁纳米簇，复合物微球超顺磁性且具有较高的磁感应性，在外磁场作用下30s从溶液中完全分离，分离过程操作简单、不需要离心等高耗能操作，分离过程绿色环保；（3） 糖基亲水磁性复合物微球外壳为葡萄糖聚合物，使得复合物微球具有良好亲水性与生物兼容性，聚合物层明显，聚合物有大量的葡萄糖，对糖蛋白/糖肽的富集容量分别达到100μg/mg与40μg/mg；（4）糖基亲水磁性复合物微球，采用蒸馏沉淀聚合方法，在常压下用普通蒸馏装置制备仪器，制备过程无需搅拌、无水无氧条件，蒸馏溶剂可以回收再利用，制备方法简单，成本较低，每克产品小于300元。
本发明制备方法简单，成本较低，节能环保，反应条件温和，易于生产，能够高效高选择性的分离富集糖蛋白/糖肽，并可以应用于复杂生物样品中糖肽或糖蛋白的富集，制备出的糖基亲水磁性复合物微球具有良好亲水性与生物兼容性，聚合物层明显，聚合物有大量的葡萄糖，对糖蛋白/糖肽的富集容量高，经济和社会价值显著。

Claims (5)

1.一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法，其特征在于，首先采用溶剂热合成制备纳米四氧化三铁为磁性核心；然后对磁球表面进行双键功能化，使其表面修饰活性双键基团；再以氨基葡萄糖与丙烯酰氯为原料制备双键修饰葡萄糖，作为后续聚合反应的功能单体；最后采用蒸馏沉淀聚合反应，以双键修饰葡萄糖为单体，于磁球表面形成糖基亲水复合物；
具体包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0-3.0g六水合三氯化铁溶解于70-140ml乙二醇，超声5-30min，得到黄色透明状液体，再加入7.0-8.0g乙酸铵与0.6-1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1-3h，将所得均匀溶液置于150-190℃油浴中搅拌1-2h，加热至160-200℃，反应12-24h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水各清洗1-3次，于40-60℃下干燥10-14h，得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取0.4-1.0g四氧化三铁磁性纳米微球分散于50-80ml乙醇、10-16ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8-1.5ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5-2.0ml浓氨水，于40-80℃下反应20-30h，所得产物用无水乙醇清洗，于40-60℃下干燥10-14h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取0.5-1.0 mL丙烯酰氯和0.5-1.0 mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应3-6h，得反应液A；另取1.0-1.5g 氢氧化钠，加入20-30mL甲醇超声溶解，再加入2.0-3.0g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.2-0.3g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌3-6h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应3-6h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取40-60mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入30-60mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为2-20%，超声分散均匀；然后加入100-300 mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、25-75 mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺和2-7 mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，15-30min由室温至沸腾，蒸馏出15-30ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次，55-65℃下干燥10-15h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
2.根据权利要求1所述的一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.0g六水合三氯化铁溶解于70ml乙二醇，超声5min，得到黄色透明状液体，再加入7.0g乙酸铵与0.6g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌1h，将所得均匀溶液置于150℃油浴中搅拌2h，加热至160℃，反应24h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水各清洗1次，于40℃下干燥14h，得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取0.4g四氧化三铁磁性纳米微球分散于50ml乙醇、10ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入0.8ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.5ml浓氨水，于40℃下反应30h，所得产物用无水乙醇清洗，于40℃下干燥14h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取0.5mL丙烯酰氯和0.5mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应3h，得反应液A；另取1.0g氢氧化钠，加入20mL甲醇超声溶解，再加入2.0g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.2g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌3h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应3h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取40mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入30mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为2%，超声分散均匀；然后加入100mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、25mg N，N-亚甲基双丙烯酰胺和2mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，15min由室温至沸腾，蒸馏出15ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次，55℃下干燥15h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
3.根据权利要求1所述的一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取2.7g六水合三氯化铁溶解于100ml乙二醇，超声20min，得到黄色透明状液体，再加入7.7g乙酸铵与0.8g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌2h，将所得均匀溶液置于170℃油浴中搅拌1.5h，加热至180℃，反应16h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水各清洗2次，于50℃下干燥12h，得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取0.7g四氧化三铁磁性纳米微球分散于60ml乙醇、12.5ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入1.0ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和1.8ml浓氨水，于60℃下反应24h，所得产物用无水乙醇清洗，于50℃下干燥12h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取0.8 mL丙烯酰氯和0.8 mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应5h，得反应液A；另取1.2g 氢氧化钠，加入25mL甲醇超声溶解，再加入2.5g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.25g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌4h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应4h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取50mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入50mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为10%，超声分散均匀；然后加入200 mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、50 mgN，N-亚甲基双丙烯酰胺和5mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，25min由室温至沸腾，蒸馏出20ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次，60℃下干燥12h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
4.根据权利要求1所述的一种糖基亲水磁性复合物微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）溶剂热法合成四氧化三铁磁性纳米微球：
取3.0g六水合三氯化铁溶解于140ml乙二醇，超声30min，得到黄色透明状液体，再加入8.0g乙酸铵与1.0g柠檬酸三钠，室温下机械搅拌3h，将所得均匀溶液置于190℃油浴中搅拌1h，加热至200℃，反应12h，冷却至室温得磁性微球，依次用无水乙醇和水各清洗3次，于60℃下干燥10h，得四氧化三铁磁性纳米微球；
（2）磁性纳米微球表面双键修饰：
取1.0g四氧化三铁磁性纳米微球分散于80ml乙醇、16ml水的混合溶液中，超声分散均匀，机械搅拌下，逐滴加入1.5ml甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷和2.0ml浓氨水，于80℃下反应20h，所得产物用无水乙醇清洗，于60℃下干燥10h，得到双键修饰磁性纳米微球；
（3）氨基葡萄糖的双键修饰：
取1.0 mL丙烯酰氯和1.0 mL质量浓度为0.1M的硫酸混合，磁力搅拌反应6 h，得反应液A；另取1.5g 氢氧化钠，加入30mL甲醇超声溶解，再加入3.0g氨基葡萄糖超声溶解，最后加入0.3g氰基硼氢化钠超声溶解，磁力搅拌6h，得反应液B，将反应液A、B混合，氮气保护，室温磁力搅拌反应6h，真空减压抽滤，甲醇洗涤3次，真空干燥即得双键修饰葡萄糖；
（4）亲水复合物制备：
取60mg步骤（2）制备的双键修饰磁性纳米微球，加入60mL乙腈-水混合液，其中水的体积百分比为20%，超声分散均匀；然后加入300 mg 步骤（3）制备的双键修饰葡萄糖、75 mgN，N-亚甲基双丙烯酰胺和7 mg 偶氮二异丁腈，超声分散后在油浴中加热，30min由室温至沸腾，蒸馏出30ml溶液停止反应，回收材料，依次用乙醇和水各洗涤3次， 65℃下干燥10h，即得糖基亲水磁性复合物微球。
5.权利要求1或2-4任一项所述方法制备的糖基亲水磁性复合物微球作为亲水色谱基质在糖肽或糖蛋白的分离富集中的应用。
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