CN113828284A - 一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法。具体步骤为：在磁性Fe3O4纳米颗粒表面原位合成亲水金属有机框架(MOF)基质多孔材料，通过金属有机框架材料中亲水配体的氨基与植酸间的静电相互作用引入磷酸根基团，并进一步固载金属离子制备成多金属多功能磁性纳米材料；金属有机框架以锆、钛等过渡金属中的一种或几种为金属中心；通过植酸固载另一种过渡金属离子。金属氧化物核、金属有机框架材料中的金属‑氧簇和植酸固载的金属离子同时提供大量的磷酸化肽亲和位点，氨基、磷酸根等亲水基团的引入可实现糖基化肽的高选择性和高效富集。通过同时捕获、分步选择性洗脱实现磷酸化肽和糖基化肽的同时富集与分离。

Description

一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法
技术领域
本发明涉及色谱分离领域，具体地说，是一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法。
背景技术
蛋白糖基化和磷酸化是两种最常见的蛋白翻译后修饰过程，在蛋白质组学研究中占有重要地位。细胞信号转导、肿瘤发生、神经活动等多种生理和病理过程已被证实与蛋白质糖基化、磷酸化有关。因此，翻译后修饰蛋白的鉴定具有重要意义。近年来，质谱因其高通量、高分辨率和高效率而被广泛用于蛋白质组学中。然而，由于样品中糖基化肽和磷酸肽的丰度较低，且存在大量的干扰物质，质谱直接分析生物样品中的翻译后修饰肽段很难实现。因此，质谱分析前对生物样品进行有效的富集是精确鉴定糖基化肽和磷酸化肽的先决条件。现在已经开发出多种策略富集糖基化肽或者磷酸化肽。在糖基化肽的富集方面，亲水相互作用色谱是糖基化肽富集中应用最广泛的方法。基于亲水相互作用色谱法制备的磁性材料由于具有易分离、高的比表面积、制备简单等优点得到了较快发展。在磷酸肽的富集方面，金属氧化物亲和层析(MOAC)和固定化金属离子亲和色谱(IMAC)占据重要地位，由于磷酸化肽与金属离子和金属氧化物之间具有较强的亲和能力，已成为最常用的磷酸化肽富集方法。铜、锌、铁、镓、铝、钛、锆等金属离子或氧化物均已应用于磷酸化肽选择性富集。不同种类的金属氧化物和金属离子对磷酸肽的亲和力不同。例如，ZrO2和TiO2对单/多磷酸肽表现出不同的富集趋势。为了提高材料对磷酸化肽的选择性，多种形式的双金属氧化物材料被设计合成并应用。
金属有机框架(MOFs)修饰的磁性纳米材料由于具有比表面积大、活性位点多、易于功能化修饰等优点在磷酸化蛋白质组学和糖基化蛋白质组学中得到了广泛应用。金属有机框架中的金属-氧簇提供了大量的磷酸化肽的结合位点。另一方面，选用具有亲水基团的有机配体使金属有机框架具有优异的亲水性，可作为一种亲水性材料与糖基化肽结合。然而，目前的功能性磁性纳米颗粒仅可用于糖基化肽或者磷酸化肽的分离富集，急需发展既能富集糖基化肽又能富集磷酸化肽的多功能磁性纳米材料及相应使用方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法，材料的制备方法为：
(1)在氨基活化的Fe3O4颗粒表面采用层层自组装法制备过渡金属有机框架(MOF)修饰磁性纳米颗粒基质；所述的过渡金属可为锆、钛、铜、锌中的一种或二种以上。
(2)将修饰金属有机框架磁性纳米颗粒分散于5-10mg/mL植酸水溶液中，室温下剧烈搅拌5-8h，产物用水洗涤，在基质表面通过静电相互作用修饰植酸。
(3)将修饰植酸磁性纳米材料分散在过渡金属盐水溶液中，在室温条件下机械搅拌1-2h，反应结束后用去离子水洗涤材料，基于螯合作用通过植酸进一步修饰上过渡金属离子，形成具有磁性内核的MOF架构多金属修饰功能材料。
所述的氨基活化的Fe3O4颗粒为通过化学键和法采用氨基硅烷化试剂在Fe3O4(50-500nm)表面修饰上氨基基团。
步骤(1)的具体做法是：将50-200mg氨基活化的Fe3O4颗粒分散于20-50mL过渡金属盐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中(0.01-0.02mmol/L)，100-120℃机械搅拌30-60min，所得颗粒用DMF清洗，再次分散于20-50mL氨基对苯二甲酸的DMF溶液(0.01-0.02mmol/L)，100-120℃下机械搅拌30-60min，所得颗粒用DMF清洗；如此依次进行分散于过渡金属盐溶液、清洗、分散于氨基对苯二甲酸溶液、清洗的循环操作过程10-20次。层层自组装操作循环操作10-20次后，所述MOF修饰层厚度为2-3纳米；通过控制循环次数控制MOF层厚度。
所述的过渡金属可为锆、钛、铜、锌中的一种或二种以上，且与步骤(1)中的过渡金属不同，即步骤(1)和(3)的过程中互不含有相同的过渡金属；步骤(3)中过渡金属盐水溶液的浓度为0.01-0.02mmol/L；步骤(1)和(3)的过程中过渡金属盐为过渡金属的可溶氯化物、硫酸盐、硝酸盐中的一种或二种以上。
使用具体步骤为：
(1)在包含糖基化肽和磷酸化肽的生物样品中在加入上样液(水-乙腈-三氟乙酸混和液)和多金属多功能磁性纳米材料，在室温下孵育15-30min；
(2)通过外部磁场将磁性纳米材料与溶液分离，弃去上清液，磁性纳米颗粒用水-乙腈-三氟乙酸混和液为清洗液清洗；
(3)先用水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混合液通过苯硼酸与糖肽特异性相互作用洗脱糖基化肽；
(4)然后用精氨酸氨水溶液通过胍基与磷酸基团特异性相互作用洗脱磷酸化肽。
所述样品可为血清、血浆、尿液、蛋白酶解液等中的一种或二种以上各类包含糖基化肽和磷酸化肽的生物样品；用量为1-10μL；所述上样液为水-乙腈-三氟乙酸混和液，其中乙腈体积含量为85-95％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，用量为100-900μL；多金属磁性纳米材料的用量为1-5mg。所述清洗液为水-乙腈-三氟乙酸混和液，其中乙腈体积含量为85-95％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，用量为200-500μL；所述糖基化肽洗脱液为水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混和液，其中乙腈体积含量为20-40％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，苯硼酸体积含量为0.5-1.5％，用量为50-500μL；所述磷酸化肽洗脱液为精氨酸氨水溶液，精胺酸浓度为0.005-0.5mol/L，氨水浓度为0.2-1mol/L，用量为50-500μL。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)本发明所制备翻译后修饰多肽分离用多金属多功能磁性纳米材料的制备在磁性Fe3O4纳米颗粒表面通过层层自组装法合成厚度为几个纳米的金属有机框架，可方便的通过控制循环次数控制MOF层厚度。而层层自组装制备的金属有机框架修饰层通过层与层之间的结构交叉能够赋予分离材料更大的比表面积以提供更多的吸附位点，显著增加整体吸附容量。制备方法简单、成本较低、结构稳定；
(2)所制备的多金属磁性纳米材料，既具备通过磁分离实现固液分离，操作方便的优势，又同时包含三种以上过渡金属离子或氧化物。未被覆盖的残余Fe3O4、MOF材料中的过渡金属-氧簇和通过植酸固定的过渡金属离子同时为磷酸化肽富集提供大量作用位点，通过多种金属离子和氧化物协同作用提高对单磷酸化肽和多磷酸化肽选择性；
(3)所制备的翻译后修饰多肽分离用多金属多功能磁性纳米材料的MOF修饰层和固载的植酸均具有良好的亲水性，可通过亲水相互作用实现糖基化肽的高选择性和高灵敏度富集；
(4)所发展的使用方法通过分步选择性洗脱法实现糖基化肽和磷酸化肽的同时富集和分别洗脱。采用苯硼酸洗脱液选择性洗脱糖基化肽而不影响磷酸化肽的吸附；采用精氨酸(胍基)氨水溶液选择性洗脱磷酸化肽。
附图说明
附图1为一种多金属多功能磁性纳米材料的制备过程示意图；
附图2为制备的Fe3O4@Zr-MOF-NH2@PA-Ti4+透射电镜图；
附图3为翻译后修饰多肽分离用多金属多功能磁性纳米材料的使用方法示意图；
附图4为IgG和α-casein酶解液混合液(5×10-7mol/L，200μL)经Fe3O4@Zr-MOF-NH2@PA-Ti4+富集分步洗脱后洗脱液质谱图。
附图5为0.5mg鼠脑蛋白胰蛋白酶酶解液经Fe3O4@(Zr-Ti-MOF)10-NH2@PA-Zn2+富集分步洗脱后洗脱液质谱图。
具体实施方式
以下提供一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法的具体实施方式。
实施例1
按照附图1所示方法，取750mgFe3O4纳米颗粒(粒径200nm)加入50mL去离子水超声分散，60℃水浴加热，机械搅拌，加0.01mol/LNaOH调节pH为9.8，N2保护下反应1h。反应产物用乙醇清洗三遍后，加入100mL50％体积分数乙醇，加0.01mol/L稀盐酸调节pH至4，超声10min分散均匀。加入3-氨丙基三乙氧基硅烷1mL，60℃水浴加热，氮气保护下缓慢搅拌10h，得到氨基活化Fe3O4纳米颗粒。所得的产物利用磁铁收集，依次用去离子水、乙醇清洗至无油状悬浮物。35℃真空干燥备用。
将氨基活化的Fe3O4颗粒200mg分散于50mL ZrCl4(0.015mmol/mL)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，120℃机械搅拌30min，所得颗粒用DMF清洗3次，再次分散于50mL(0.015mmol/mL)氨基对苯二甲酸的DMF溶液，120℃下机械搅拌60min，所得颗粒用DMF洗3次。如此循环操作15次，通过层层自组装法得到MOF修饰亲水磁性纳米颗粒Fe3O4@(Zr-MOF)15-NH2，MOF修饰层厚度为2.6纳米。
将修饰MOF磁性纳米颗粒分散于100mL植酸(7mg/mL)水溶液中,室温下剧烈搅拌6h，产物用水洗三次。
然后将材料分散在50mL Ti(SO4)2水溶液(0.015mmol/L)中，在室温条件下机械搅拌2h，反应结束后用去离子水洗涤材料三次，获得多金属多功能磁性纳米材料Fe3O4@(Zr-MOF)15-NH2@PA-Ti4+，电镜图如附图2所示。采用能量分散光谱仪表征，材料表面Fe、Zr和Ti元素的质量百分比分别为8.1％，14.07％和6.92％。通过氮气吸附-脱附曲线测定比表面积135.8m2/g，富集容量达到100mg/g。
按照附图3所示方法，在2μL IgG和α-casein胰蛋白酶酶解液混合液(体积比1：1，5×10-5mol/L)酶解液中加入400μL上样液(92％乙腈，1％三氟乙酸，7％水)和2mg多金属多功能磁性纳米材料，在室温下孵育30min。通过外部磁场将磁性材料与溶液分离，弃去上清液，磁性纳米颗粒用400μL清洗液(92％乙腈，0.1％三氟乙酸，7.9％水)清洗3次。先用100μL水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混和液(30％乙腈，1％三氟乙酸,1％苯硼酸，68％水)洗脱糖基化肽，合并3次洗脱液。洗脱液加入19μL 10mmol/L的NH4HCO3，500U PN-Gase F，37℃反应16h，溶液冻干后进行Nano LC-MS MS分析。再用100μL0.05mol/L精氨酸氨水溶液(0.4mol/L)洗脱磷酸化肽，合并3次洗脱液。洗脱液冻干后进行Nano LC-MS MS分析。结果如附图4所示，检测到IgG中24条糖基化肽(a)和α-casein中29条磷酸化肽(b)。
实施例2
称取实施例1制备的200mg氨基活化Fe3O4颗粒，分散于50mL ZrCl4的DMF溶液(0.015mmol mL-1)中，120℃机械搅拌30min，所得颗粒用DMF洗3次去除未反应完的ZrCl4；之后，将得到Fe3O4@Zr继续分散于50mL氨基对苯二甲酸的DMF溶液(0.015mmol mL-1)，120℃机械搅拌1h，DMF清洗3次去除未反应完的氨基对苯二甲酸；得到的Fe3O4@(Zr-MOF)-NH2分散于50mL TiCl4(THF)2的DMF溶液(0.015mmol mL-1)中，120℃机械搅拌30min，DMF清洗3次后重新分散于50mL氨基对苯二甲酸的DMF溶液(0.015mmol mL-1)，120℃机械搅拌1h，所得颗粒用DMF清洗3次，得到Fe3O4@(Zr-Ti-MOF)1-NH2。如此循环操作10次，得到Fe3O4@(Zr-Ti-MOF)10-NH2，MOF修饰层厚度为3纳米。通过氮气吸附-脱附曲线测定比表面积155.8m2/g，富集容量达到130mg/g。
将Fe3O4@(Zr-Ti-MOF)10-NH2分散在100mL植酸水溶液(7mg/mL)中,室温下剧烈搅拌6h，产物用水洗三次。然后将材料分散在50mL ZnSO4水溶液中，在室温条件下机械搅拌2h，反应结束后用H2O洗涤材料三次，得到亲水四金属磁性复合材料Fe3O4@(Zr-Ti-MOF)10-NH2@PA-Zn2+。
按照附图3所示方法，在10μL鼠脑蛋白胰蛋白酶酶解液中加入400μL上样液(92％乙腈，0.1％三氟乙酸，7.9％水)和5mg Fe3O4@(Zr-Ti-MOF)10-NH2@PA-Zn2+，在室温下孵育30min。通过外部磁场将磁性材料与溶液分离，弃去上清液，磁性纳米颗粒用400μL清洗液(92％乙腈，0.1％三氟乙酸，7.9％水)清洗3次。先用100μL水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混和液(30％乙腈，0.1％三氟乙酸,1％苯硼酸，68.9％水)洗脱糖基化肽，合并3次洗脱液。洗脱液加入19μL10mmol/L的NH4HCO3，500U PN-Gase F，37℃反应16h，溶液冻干后进行Nano LC-MS MS分析。再用100μL0.05mol/L精氨酸氨水溶液(0.4mol/L)洗脱磷酸化肽，合并3次洗脱液。洗脱液冻干后进行Nano LC-MS MS分析，结果如附图5所示，检测到来自127个糖蛋白的141个N-糖基化肽(a)和来自397个磷酸化蛋白的918条磷酸化肽(b)。
对比例1
称取实施例1制备的MOF修饰层厚度为2.6纳米的Fe3O4@(Zr-MOF)15磁性纳米颗粒5mg,按照实施例1中应用方法，富集2μL IgG和α-casein胰蛋白酶酶解液混合液中磷酸化肽和糖基化肽。检测到IgG中20条糖基化肽和α-casein中22条磷酸化肽。
对比例2
称取200mg氨基修饰SiO2颗粒(200nm)，按照实施例1方法依次修饰Zr-MOF层、植酸和Ti4+获得SiO2@(Zr-MOF)15-NH2@PA-Ti4+。称取此颗粒5mg,按照实施例1中应用方法，富集2μL IgG和α-casein胰蛋白酶酶解液混合液中磷酸化肽和糖基化肽。所有固液分离均采用离心分离(7000rpm,1min)，检测到IgG中22条糖基化肽和α-casein中24条磷酸化肽。
本发明的优点为：Fe3O4纳米颗粒除可提供材料的磁性，以用于磁分离外，未被覆盖的残余Fe-O簇也可作为辅助结合位点起到富集磷酸化肽的作用；而层层自组装制备的金属有机框架修饰层通过层与层之间的结构交叉能够赋予分离材料更大的比表面积以提供更多的吸附位点，显著增加整体吸附容量。金属氧化物核、金属有机框架材料中的金属-氧簇和植酸固载的金属离子同时提供大量的磷酸化肽亲和位点，而不同金属共存还可提高对单磷酸化肽和多磷酸化肽的分离选择性。此外，氨基、磷酸根等亲水基团的引入可实现糖基化肽的高选择性和高效富集，为发展同时捕获、分步选择性洗脱磷酸化肽和糖基化肽的分离方法提供了一类优良的分离材料。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种多金属多功能磁性纳米材料的制备及其使用方法，其特征在于：
(1)在氨基活化的Fe3O4颗粒表面采用层层自组装法制备过渡金属有机框架(MOF)修饰磁性纳米颗粒基质；所述的过渡金属可为锆、钛、铜、锌中的一种或二种以上；
(2)将修饰金属有机框架(MOF)磁性纳米颗粒分散于5-10mg/mL植酸水溶液中，室温下剧烈搅拌5-8h，产物用水洗涤，在基质表面通过静电相互作用修饰植酸；
(3)将修饰植酸磁性纳米材料分散在过渡金属盐水溶液中，在室温条件下机械搅拌1-2h，反应结束后用去离子水洗涤材料，基于螯合作用通过植酸进一步修饰上过渡金属离子，形成具有磁性内核的MOFs架构多金属修饰功能材料。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的氨基活化的Fe3O4颗粒通过化学键和法采用氨基硅烷化试剂在Fe3O4(50-500nm)表面修饰上氨基基团。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)的具体做法是：将50-200mg氨基活化的Fe3O4颗粒分散于20-50mL过渡金属盐的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中(0.01-0.02mmol/L)，100-120℃机械搅拌30-60min，所得颗粒用DMF清洗，再次分散于20-50mL氨基对苯二甲酸的DMF溶液(0.01-0.02mmol/L)，100-120℃下机械搅拌30-60min，所得颗粒用DMF清洗；如此依次进行分散于过渡金属盐溶液、清洗、分散于氨基对苯二甲酸溶液、清洗的循环操作过程10-20次。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，层层自组装操作循环操作10-20次后，所述MOF修饰层厚度为2-3纳米；通过控制循环次数控制MOF层厚度。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述的过渡金属可为锆、钛、铜、锌中的一种或二种以上，且与步骤(1)中的过渡金属不同，即步骤(1)和(3)的过程中互不含有相同的过渡金属；步骤(3)中过渡金属盐水溶液的浓度为0.01-0.02mmol/L；步骤(1)和(3)的过程中过渡金属盐为过渡金属的可溶氯化物、硫酸盐、硝酸盐中的一种或二种以上。
6.如权利要求1-5所述制备方法制备的任一种多金属多功能磁性纳米材料，并将其应用于生物样品中翻译后修饰多肽分离。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，使用具体步骤为：
(1)在包含糖基化肽和磷酸化肽的生物样品中在加入上样液(水-乙腈-三氟乙酸混和液)和多金属多功能磁性纳米材料，在室温下孵育15-30min；
(2)通过外部磁场将磁性纳米材料与溶液分离，弃去上清液，磁性纳米颗粒用水-乙腈-三氟乙酸混和液为清洗液清洗；
(3)先用水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混合液通过苯硼酸与糖肽特异性相互作用洗脱糖基化肽；
(4)然后用精氨酸氨水溶液通过胍基与磷酸基团特异性相互作用洗脱磷酸化肽。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述样品可为血清、血浆、尿液、蛋白酶解液等中的一种或二种以上各类包含糖基化肽和磷酸化肽的生物样品；用量为1-10μL；所述上样液为水-乙腈-三氟乙酸混和液，其中乙腈体积含量为85-95％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，用量为100-900μL；多金属多功能磁性纳米材料的用量为1-5mg。
9.根据权利要求7所述的应用在步骤(2)中，所述清洗液为水-乙腈-三氟乙酸混和液，其中乙腈体积含量为85-95％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，用量为200-500μL；在步骤(3)中，所述糖基化肽洗脱液为水-乙腈-三氟乙酸-苯硼酸混和液，其中乙腈体积含量为20-40％，三氟乙酸体积含量为0.1-1％，苯硼酸体积含量为0.5-1.5％，用量为50-500μL；在步骤(4)中，所述磷酸化肽洗脱液为精氨酸氨水溶液，精胺酸浓度为0.005-0.5mol/L，氨水浓度为0.2-1mol/L，用量为50-500μL。
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