CN113600149A - 一种糖蛋白分离富集材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种糖蛋白分离富集材料，它包括基底及接枝在其表面的均聚物层，所述均聚物的化学结构如下；

Description

一种糖蛋白分离富集材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分析化学和有机化学技术领域，具体涉及一种糖蛋白分离富集材料及其制备方法和应用。
背景技术
蛋白质糖基化是在糖基转移酶的作用下，将糖类转移到蛋白质上，并与蛋白质上的氨基酸残基(如Asn、Ser、Thr)形成糖苷键的翻译后修饰过程。蛋白质糖基化调节着许多生物事件，如分子识别、细胞粘附与信号转导、免疫反应、肿瘤发生与转移等。大量研究表明，异常的蛋白质糖基化与异常的蛋白质功能密切相关，进而导致许多重大疾病(如各种癌症和神经退行性疾病)。因此，糖蛋白被广泛用作诊断和治疗的生物标志物。此外，糖蛋白还可以作为治疗或抑制疾病的靶点。例如，HIV病毒在其表面有大量的高甘露糖型糖蛋白，因此与这些糖蛋白结合的药物可以预防HIV感染。
到目前为止，临床应用的蛋白质70％以上是糖蛋白，如促红细胞生成素、凝血因子以及各种干扰素和糖蛋白疫苗抗体，因此糖蛋白引起了生物学、病理学和诊断学科学家的极大兴趣。然而，由于糖蛋白的丰度极低、非修饰蛋白的强烈干扰、隐藏的糖基化位点、亲水性基团/区域的变化、聚糖固有的复杂性和多样性(如丰富的糖组成、分支结构、而糖苷键同分异构体)则进一步增加了分离和富集难度。因此，在质谱分析之前进行有效的糖蛋白分离富集是非常必要的。
蛋白质糖基化分析一般采用自下而上和自上而下两种策略。目前由于完整糖蛋白分离困难，糖蛋白组学研究主要基于“自下而上”的策略，即先将蛋白无差别酶解成多肽链段，在肽段水平上鉴定其中的磷酸化位点，然后进行搜库、推理和拼接得到完整的糖蛋白信息，这种方法虽然简单易行，但是所得蛋白水平的磷酸化信息离实际生物样品中的真实信息存在很大差距。因此，如何实现在蛋白水平上直接进行分离一直以来是糖蛋白质组学研究者们所努力尝试但仍未解决的难题。
发明内容
本发明的主要目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种糖蛋白分离富集材料，该材料可实现在蛋白水平上直接分离糖蛋白的目的，且涉及的分离效率高，样品损失小，成本较低，适合推广应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：
一种糖蛋白分离富集材料，它包括基底及接枝在其表面的均聚物层，所述均聚物的化学结构式见式I；
Figure BDA0003206222540000021
其中，聚合度n取值20～500；基底为硅球、金、二氧化钛、二氧化锆或四氧化三铁等。
上述方案中，所述均聚物以APE功能单体为主要原料进行自由基聚合而成，其中APE功能单体的结构式见式II；
Figure BDA0003206222540000022
上述方案中，所述APE功能单体以PE和丙烯酰氯为主要原料进行反应而成；PE化学结构式见式III；
Figure BDA0003206222540000023
上述一种糖蛋白分离富集材料的制备方法，采用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制将共聚物接枝到基底表面，具体步骤包括：
1)将APE功能单体溶解于水中，在密封条件下在液氮中冷冻处理一段时间，然后在真空条件下加热溶解(复溶)除氧，重复上述冷冻、复溶步骤，充分出去氧气；
2)在无氧条件下向步骤1)所得混合体系中加入溴化亚铜催化剂和N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)配体，混合搅拌均匀后，将Br修饰的基底材料(如硅球等)浸入前述溶液中，然后在70～90℃条件下进行原子转自由基聚合反应3～12h；再经醇洗和水洗、干燥，得到所述糖蛋白分离富集材料。
上述方案中，所述APE功能单体的制备方法包括如下步骤：将有机碱(如三乙胺或吡啶)溶解在N,N二甲基甲酰胺溶剂中，加入PE单体，在冰浴条件下搅拌溶解，然后滴加丙烯酰氯，继续在冰浴条件下反应0.5～2h，然后在室温条件下反应12～36h；反应完成后，通过旋转蒸发除去溶剂，得APE功能单体。
上述方案中，所述冰浴温度为0℃。
上述方案中，所述PE、有机碱和丙烯酰氯的摩尔比为1:(1～5):(0.8～3)。
上述方案中，所述接枝溴引发剂的基底的制备方法包括如下步骤：
1)室温下将1～3mL氨基改性剂加入50～500mL无水甲苯中，然后加入0.5～3g基底材料，在40～80℃下搅拌反应2～8h；随后过滤收集氨基修饰的基底，再进行清洗；
2)将0.3～3mL有机碱溶解在50～500mL无水二氯甲烷中，同时加入0.3～3mL溴代丁酰溴，搅拌均匀；在冰浴条件下，加入0.5～3g步骤1)所得氨基修饰的基底，继续在冰浴条件下反应0.5～2h，然后在室温条件下反应12～36h；反应完成后，过滤收集溴引发剂修饰的硅胶，进行清洗。
上述方案中，所述氨基改性剂可选用γ-氨基丙基-三乙氧基硅烷或巯基乙胺等。
上述方案中，步骤1)采用的清洗溶剂为甲苯、甲醇或二氯甲烷等溶剂；步骤2)采用的清洗溶剂为二氯甲烷等。
上述方案中，所述有机碱为吡啶或三乙胺等。
上述方案中，所述APE功能单体、溴修饰基底材料、催化剂和配体的质量比为1:(0.3～3):(0.005～0.05):(0.005～0.05)。
将上述方案所得糖蛋白分离富集材料应用于进行糖蛋白分离，包括如下步骤：将糖蛋白分离富集材料与蛋白混合物混合，孵育，然后采用分散固相萃取工艺分离富集非糖蛋白和糖蛋白。
上述方案中，所述蛋白混合物包括糖蛋白和非糖蛋白，糖蛋白与非糖蛋白的质量比为1:(1～200)；其中糖基化蛋白为人免疫球蛋白G或辣根过氧化物酶或胎球蛋白等，非糖蛋白为牛血清蛋白。
上述方案中，所述蛋白分离富集材料与蛋白混合物的质量比为(100～1000):1，孵育温度为20～45℃，孵育时间为0.5～60min。
上述方案中，所述糖蛋分离方法具体包括如下步骤：
1)先采用活化液和平衡液活化及平衡富集材料，将所得富集材料与蛋白混合物混合，孵化；进行分散固相萃取分离，弃上层清液，收集沉淀；
2)采用乙腈与甲酸的混合溶液对沉淀进行清洗，有机溶液与沉淀的体积比是5:1～100:1，进行分散固相萃取分离，收集上层清液，浓缩得到非糖蛋白；
3)将步骤2)收集的沉淀采用有机溶液洗涤，有机溶液与沉淀的体积比是5:1～100:1，进行分散固相萃取分离，收集上层清液，得糖蛋白。
优选的，步骤2)中采用的乙腈与甲酸的混合溶液为含65vol％ACN并利用甲酸调节pH值＝2.8的混合水溶液(在此条件下材料对糖蛋白有强烈吸附，而对非糖蛋白吸附较小)。
优选的，步骤3)中采用的有机溶液为含50vol％ACN并利用三氟乙酸调节pH值＝2的混合溶液(在此条件下材料对糖蛋白的吸附较小，利于洗脱)。
优选的，上述过程的操作温度为37℃。
上述方案中，所述有机溶液、活化液和平衡液均为采用有机溶剂、有机酸和水制备的混合液，其中有机溶剂为乙腈，有机酸为乙酸或三氟乙酸。
上述方案中，所述活化液中有机溶剂体积浓度为10～30％，pH值为5～7。
上述方案中，所述平衡液中有机溶剂体积浓度为30～70％，pH值为0～5。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明充分利用二肽PE对岩藻糖分子强烈的结合能力，由此开发的聚合物修饰的基质材料对富含岩藻糖的糖蛋白可展现出显著的结合；进而在分离富集糖蛋白时，表现出高选择性、高通量、低成本、分离效率高及样品损失小等特点，可实现糖蛋白和非糖蛋白的有效分离；
2)本发明制备的富集材料可直接通过离心模式分离材料与样品底物，操作简单，易于重复；特别适合微量生物样品中糖蛋白的分离富集；
3)本发明富集得到的糖蛋白可通过质谱检测，相比于天然生物样品直接用于质谱解析的方法，经材料富集后更加容易获得糖蛋白的信号。
附图说明
图1为本发明实施例1所得聚合物接枝硅胶富集材料的结构示意图。
图2为本发明所得聚合物分子结构示意图。
图3为APE单体的合成路线示意图。
图4为本发明所得聚合物表面对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白的石英微天平(QCM-D)吸附频率曲线(载液为去离子水)。
图5为本发明所得聚合物表面对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白的石英微天平(QCM-D)耗散曲线(载液为去离子水)。
图6为本发明所得聚合物对人免疫球蛋白G的等温量热滴定及拟合常数曲线(载液为去离子水)，曲线从下至上依次对应的蛋白浓度为2,4,8,16,32μM。
图7为本发明所得聚合物对辣根过氧化物酶的等温量热滴定及拟合常数曲线(载液为去离子水),曲线从下至上依次对应的蛋白浓度为2,4,8,16,32μM。
图8为本发明所得聚合物对牛血清蛋白的等温量热滴定及拟合常数曲线(载液为去离子水),曲线从下至上依次对应的蛋白浓度为2,4,8,16μM。
图9为本发明所得聚合物对人免疫球蛋白G的相互作用响应及平衡解离常数曲线(载液为去离子水)。
图10为本发明所得聚合物对辣根过氧化物酶的相互作用响应及平衡解离常数曲线(载液为去离子水)。
图11为本发明所得聚合物对牛血清蛋白的相互作用响应及平衡解离常数曲线(载液为去离子水)。
图12为富集应用实例中使用固定相结构示意图以及制备路线图。
图13为人免疫球蛋白G和牛血清蛋白1:1、1:10、1:20混合物经富集材料分离后馏分中人免疫球蛋白G的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。
图14为辣根过氧化物酶和牛血清蛋白1:1、1:10、1:20混合物经富集材料分离后馏分中辣根过氧化物酶十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图。
图15为人免疫球蛋白G和牛血清蛋白1:200混合物经富集材料分离后馏分中人免疫球蛋白G质谱图。
图16为辣根过氧化物酶和牛血清蛋白1:200混合物经富集材料分离后馏分中辣根过氧化物酶质谱图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例中，采用的硅胶(球形粒径3～30微米，孔径
Figure BDA0003206222540000061
)由上海月旭公司购得。
溴化亚铜(CuBr，99.999％)、N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)、联吡啶类配体、有机碱、丙烯酰氯、溴乙酰溴、γ-氨基丙基-三乙氧基硅烷、对氨基苯甲酸乙酯以及各种测试用蛋白由Sigma-Aldrich公司购得。
丙酮、甲醇、甲苯、二氯甲烷、N,N二甲基甲酰胺(DMF)、甲酸、乙酸由阿尔法公司购得。其他试剂均使用市售分析纯。
1H spectra在Bruker ARX300 spectrometer检测获得；石英微天平(QCM)吸附数据由Q-Sense E4 system检测获得；MALDI-TOF MS质谱分析结果由Ultraflex III BrukerDaltonics(德国)公司检测获得。
以下实施例中，接枝溴引发剂的硅球(修饰的溴引发剂接枝的硅球)的制备方法包括如下步骤：
1)室温下将1mLγ-氨基丙基-三乙氧基硅烷加入100mL无水甲苯中，然后加入3g基底材料(硅胶)，在60℃下搅拌反应3h；随后过滤收集氨基修饰的基底，再采用甲苯、甲醇或二氯甲烷等溶剂进行清洗；
2)将0.5mL有机碱(吡啶)溶解在100mL无水二氯甲烷中，同时加入0.5mL溴代丁酰溴，搅拌均匀；在冰浴条件下，加入3g步骤1)所得氨基修饰的基底，继续在冰浴条件下反应0.5h，然后在室温条件下反应16h；反应完成后，过滤收集溴引发剂修饰的硅胶，采用二氯甲烷进行清洗。
实施例1
一种糖蛋白分离富集材料，其制备方法包括如下步骤：
1)APE功能单体的制备
向25mL圆底烧瓶中加入2mL干燥的DMF溶液、Et3N(150μL，1.08mmol)和PE(176mg，0.72mmol)，置于冰水浴(0℃条件)中，同时磁力搅拌溶解(搅拌速度为300r/min)；待瓶内外温度接近时，将丙烯酰氯(59μL，0.72mmol)逐滴加入所得混合溶液中，瓶内溶液状态由无色透明逐渐变为白色浊液，继续保持0℃条件反应1h，然后转移至室温条件下反应24h；反应完成后，通过旋转蒸发除去溶剂，接着加少量超纯水溶解，0.2μm水相滤膜过滤，然后在岛津UFLC 20A纯化系统上用X-酰胺柱(粒径：10μm，内孔：
Figure BDA0003206222540000071
10mm×250mm)对粗产品进行纯化；其中，流动相A为水，流动相B为乙腈，流动相的流速保持在3mL·min-1，柱温设定为25℃，梯度条件为0.0–20.0min，80–60％B；纯化后的溶液通过旋转蒸发和冷冻干燥除去乙腈和水，得到128mg淡黄色粉末(APE功能单体)，产率为40％；
2)富集材料的制备
将1.5g所得APE功能单体溶解在含20mL去离子水的具有节门高真空阀门的欣维尔反应茄瓶(欣维尔编号F901425H)中，随后，塞上翻口橡胶塞(欣维尔编号RS111420)，将高真空阀门旋紧，将反应茄瓶置于液氮中冷冻5min，然后打开油泵电源，将其连接抽气管路，随后旋开阀门抽气，与此同时用40℃热水加速溶解除氧；当反应茄瓶中溶液完全融化后，旋紧阀门，拔出油泵管路，关闭油泵电源，此为一次完整的冷冻-溶解除氧循环，重复循环3次，上述反应茄瓶中的溶液在最后一次循环中的冷冻步骤之后，通氮气至橡胶塞膨胀，打开橡胶塞，称量好的溴化亚铜粉末(0.032g)以及80μL配体N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)，塞上橡胶塞再次进行冷冻溶解除氧一次，之后快速加入前面修饰的溴引发剂接枝的硅球(3g)，溶解后通次入适量氮气(用手感知橡胶塞轻微鼓起)，超声30s以促进溴化亚铜的溶解，随之再重复冷冻溶解除气2次；最后待溶液溶解之后，通氮气至橡胶塞轻微鼓起；将所得溶液在70℃条件下搅拌反应6h，反应完成后以7000r/min的转速离心5min，用水和乙醇清洗3次，然后在60℃下干燥过夜，即得所述糖蛋白分离富集材料，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
将本实施例步骤1)所得淡黄色粉末进行核磁氢谱、质谱表征鉴定，其表征数据包括：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ(ppm):6.14,6.34(m,J1＝10.2Hz,J2＝10.1Hz,2H,C＝CH2),4.27,4.34(d,J＝4.3Hz,1H,CH2),3.20-3.44(m,3H,CH,CH2),2,45-1.80(m,6H,*CH2).ESI-HRMS(m/z):calcd for C13H19N2O6:298.12；found:299.12[M+H+]；表征数据表明成功制备了目标功能单体。
本实施例所得富集材料采用的基底材料为硅胶，所得均聚物接枝的硅胶产物的结构示意图见图1，共聚物结构示意图见图2；APE功能单体的合成路线图见图3.
实施例2
采用QCM-D吸附量测定方法，测试本发明所述富集材料的均聚物表面对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白的不同吸附行为，具体步骤包括：参照实施例1所述方法将该聚合物接枝到QCM-D金片表面(制备方法与实施例1大致相同，不同之处在于利用QCM-D金片替代硅胶，同时通过巯基乙胺代替γ-氨基丙基-三乙氧基硅烷修饰金片表面，随后用溴代丁酰溴与氨基反应得到溴引发剂修饰的QCM-D金片，后续聚合方法与实施例1相同)，然后在控温25℃条件下，以去离子水为载液分别对人免疫球蛋白G(IgG)、辣根过氧化物酶(HRP)和牛血清蛋白(BSA)进行吸附实验，蛋白的浓度均为10μmol·L–1。
图4和图5分别为本实施例所得聚合物表面对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白的石英微天平(QCM-D)吸附频率曲线和耗散曲线，结果表明，本发明所得均聚物表面对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白不同的吸附行为，进而表现出对糖蛋白的特异性吸附性能。
实施例3
采用等温滴定量热法(ITC)，测试本发明所述共聚物表面对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白不同的表观热效应行为以及拟合结合常数；具体步骤包括：
参照实施例1所述聚合方法制备APE功能单体，将1.5g所得APE功能单体溶解在含20mL去离子水的具有节门高真空阀门的欣维尔反应茄瓶(欣维尔编号F901425H)中，随后，塞上翻口橡胶塞(欣维尔编号RS111420)，将高真空阀门旋紧，将反应茄瓶置于液氮中冷冻5min，然后打开油泵电源，将其连接抽气管路，随后旋开阀门抽气，与此同时用40℃热水加速溶解除氧；当反应茄瓶中溶液完全融化后，旋紧阀门，拔出油泵管路，关闭油泵电源，此为一次完整的冷冻-溶解除氧循环，重复循环3次，上述反应茄瓶中的溶液在最后一次循环中的冷冻步骤之后，通氮气至橡胶塞膨胀，打开橡胶塞，称量好的溴化亚铜粉末(0.032g)以及80μL配体N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺(PMDETA)，塞上橡胶塞再次进行冷冻溶解除氧一次，之后快速加入溴丁酸(0.05g)，溶解后通次入适量氮气(用手感知橡胶塞轻微鼓起)，超声30s以促进溴化亚铜的溶解，随之再重复冷冻溶解除气2次；最后待溶液溶解之后，通氮气至橡胶塞轻微鼓起；将所得溶液在70℃条件下搅拌反应6h，反应完成后将反应液导入石油醚中，将析出的沉淀用水和乙醇清洗3次，将沉淀转至透析袋中，用水透析三天，收集透析袋内的液体，冷冻干燥得到白色聚合物粉末。
依次在样品池中装入200μL0.1mmol·L-1的polyPE水溶液，注射器中注入40μL糖蛋白的水溶液(25mmol·L-1)；整个ITC测试过程包括连续的18次滴定，每次滴定体积为2μL，滴定持续时间为4s，两次注射间隔为3min；通过糖蛋白溶液(人免疫球蛋白G或辣根过氧化物酶)或非糖蛋白溶液(牛血清蛋白)滴定Poly PE溶液过程中的热功率与时间曲线的自动峰值积分，确定每次进样的表观热效应，对应于样品池中滴定溶液的摩尔浓度的变化。
图6～8分别为本发明所得聚合物(polyPE)对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白的等温量热滴定及拟合常数曲线(载液为去离子水)；结果表明，所得共聚物表面人与免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白可形成不同的相互作用力，充分展现出了此类共聚物特异性吸附糖蛋白的能力，在糖蛋白的选择性分离领域具有非常广阔的应用前景。
实施例4
通过生物膜干涉仪(Bio-layer Interferometry(BLI))，测试本发明所述共聚物的共聚物探针对人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白不同的作用力响应以及平衡解离常数，具体步骤包括：
首先将Fortebio探针泡在包含200μL 0.1mmol·L-1APE功能单体以及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺(3mg)和N-羟基丁二酰亚胺(2mg)的水溶液中，静置过夜，随后用水冲洗探针，以除去未反应的原料，得到polyPE聚合物修饰的探针。将IgG、HRP和BSA分别制备成3种浓度梯度(1.0×10-2、1.0×10-3和1.0×10-4mol·L-1)的客体水溶液；不同浓度(浓度由低到高，2μM、4μM、8μM、16μM和32μM)的客体溶液依次加入探针中，用分子相互作用仪在20℃下测定响应值。
由图9-11可以观察到该共聚物探针在浸泡人免疫球蛋白G、辣根过氧化物酶和牛血清蛋白溶液后发生了不同程度的响应变化，说明该共聚物对糖蛋白具有特殊响应性，能够应用于区分糖蛋白和非糖蛋白。
实施例5
将本发明所述糖蛋白分离富集材料应用于进行糖蛋白分离，包括如下步骤：
1)参考实施例1所述方法将共聚物接枝到多孔硅胶表面得到富集材料，固定相结构合成线路示意图见图12；
2)富集材料的活化与平衡：将1.0mg的富集材料装入离心管中，加入100μL活化液中(乙腈含量为30vol％的水溶液，同时采用甲酸调节pH值至5)，采用涡旋、振荡的方式使富集材料完全分散于该溶液中，静置10分钟后离心，弃上清液，收集沉淀；然后加入100μL含30％乙腈的平衡液(添加甲酸调整pH值至5)，采用涡旋、振荡的方式使富集材料完全分散于该溶液中，静置10分钟后离心，清液，收集沉淀；经过两次洗涤步骤，实现对富集材料的充分浸润活化。
分别取四份2μL(80pmol/L)人免疫球蛋白G或辣根过氧化物酶溶液溶于50μL乙腈水溶液中(乙腈与水的体积比为70:30，通过NaOH稀溶液将pH值调节至10～11)，然后分别加入2μL、20μL、40μL(80pmol/L)和40μL(800pmol/L)的牛血清蛋白溶液，混合均匀得到六份蛋白混合物样品；将这六份样品分别与1mg经上述活化和平衡处理的富集材料混合，孵化15min，离心后弃上清液，在此情况下蛋白均吸附至富集材料上；
将富集材料再用50μL乙腈水溶液(乙腈的体积浓度为65％，并采用0.1％乙酸将pH值调节至2.8)的溶液孵化15min，离心后收集上清液，重复此孵化和离心步骤两遍后合并两次上清液；在此情况下，上清液收集得到的是牛血清白蛋白，糖蛋白吸附在材料表面上；
接着将离心收集得到的材料与50μL水溶液(乙腈的体积浓度为50％，并采用1％三氟乙酸将溶液的pH值调节至2)的溶液混合孵化15min，离心后收集上清液，重复此孵化和离心步骤两遍后合并两次上清液，收集得到的即为糖蛋白。
各收集的上清液直接按照上述方法进入SDS-PAGE和质谱分析。由图13可见，泳道1为Marker，泳道2，5，8分别为辣根过氧化物酶和牛血清蛋白以1：1，1:10，1:20摩尔比混合的原样条带；泳道3，4，6，7，9，10为蛋白混合物经材料PolyPE@SiO2富集洗脱后条带；经材料富集后洗脱液中均只有辣根过氧化物酶的条带，无牛血清蛋白的条带。
由图14可见，人免疫球蛋白G与牛血清蛋白混合蛋白的富集结果图，泳道1为Marker，泳道2，5，8分别为人免疫球蛋白G和牛血清蛋白以1：1，1:10，1:20摩尔比混合的原样条带；泳道3，4，6，7，9，10为蛋白混合物经材料PolyPE@SiO2富集洗脱后条带；富集前有三条条带，包括牛血清蛋白的一条带，人免疫球蛋白G的一条重链条带和一条轻链条带，经材料富集后洗脱液中只有人免疫球蛋白G的两条条带，无牛血清蛋白的条带。结果表明，在糖蛋白和非糖蛋白(BSA)以1:1、1:10、1:20的摩尔比混合条件下，材料PolyPE@SiO2仍有较好的富集效果。
由图15-16可见，人免疫球蛋白G或辣根过氧化物酶与牛血清蛋白按1:200的摩尔比混合后，采用本发明所述共聚物修饰的硅胶材料富集后得到的蛋白样品，通过SDS-PAGE和质谱分析可以获得清晰的糖蛋白的检测峰。说明该富集材料能选择性地分离糖蛋白。
综上所述，本发明所得富集材料对于糖蛋白和非糖蛋白具有很好的区分能力，和常规的金属氧化物相比，聚合物修饰硅胶材料分离糖蛋白时具有更高选择性，更高的回收率和更好的重复性。同时与传统的免疫共沉淀方法相比具有成本低廉，高通量的优点；可应用于复杂体系中实现大规模、高通量的糖蛋白的选择性分离，结合质谱检测手段，在糖蛋白质组学研究等领域具有广阔的应用前景。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种糖蛋白分离富集材料，其特征在于，它包括基底及接枝在其表面的均聚物层，所述均聚物的化学结构式见式I；
Figure FDA0003206222530000011
其中，聚合度n取值20～500。
2.根据权利要求1所述的糖蛋白分离富集材料，其特征在于，所述基底为硅球、金、二氧化钛、二氧化锆或四氧化三铁。
3.根据权利要求1所述的糖蛋白分离富集材料，其特征在于，所述均聚物以APE功能单体为主要原料进行自由基聚合而成，其中APE功能单体的结构式见式II；
Figure FDA0003206222530000012
4.根据权利要求3所述的糖蛋白分离富集材料，其特征在于，所述APE功能单体以PE和丙烯酰氯为主要原料进行反应而成；PE化学结构式见式III；
Figure FDA0003206222530000013
5.权利要求1～4任一项所述糖蛋白分离富集材料的制备方法，其特征在于，采用表面引发-原子转移自由基聚合反应机制将均聚物接枝到基底表面，具体步骤包括：
1)将APE功能单体溶解于水中，在密封条件下在液氮中冷冻处理一段时间，然后在真空条件下加热溶解除氧，重复上述冷冻、加热溶解步骤，充分去除氧气；
2)在无氧条件下向步骤1)所得混合体系中加入溴化亚铜和N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺，混合搅拌均匀，将Br修饰的基底材料浸入所得混合溶液中，然后在70～90℃条件下进行原子转自由基聚合反应12～36h；再经醇洗和水洗、干燥，得到所述糖蛋白分离富集材料。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述APE功能单体、溴修饰基底材料、溴化亚铜和N,N,N’,N”,N”-五甲基二亚乙基三胺的质量比为1:(0.3～3):(0.005～0.05):(0.005～0.05)。
7.权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述APE功能单体的制备方法包括如下步骤：将有机碱溶解在N,N二甲基甲酰胺溶剂中，加入PE单体，在冰浴条件下搅拌溶解，然后滴加丙烯酰氯，继续在冰浴条件下反应0.5～2h，再在室温条件下反应12～36h；反应完成后，旋转蒸发除去溶剂，得APE功能单体。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述接枝溴引发剂的基底的制备方法包括如下步骤：
1)室温下将氨基改性剂加入无水甲苯中，然后加入基底材料，在40～80℃下搅拌反应2～8h；随后过滤收集氨基修饰的基底，再进行清洗；
2)将有机碱溶解于无水二氯甲烷，同时加入溴代丁酰溴，搅拌均匀；在冰浴条件下，加入步骤1)所得氨基修饰的基底，继续在冰浴条件下反应0.5～2h，然后在室温条件下反应12～36h；反应完成后，过滤收集溴引发剂修饰的硅胶，进行清洗。
9.根据权利要求1所述糖蛋白分离富集材料在糖蛋白分离领域中的应用，其特征在于，包括如下步骤：将糖蛋白分离富集材料与蛋白混合物混合，孵育，然后采用分散固相萃取工艺分离富集非糖蛋白和糖蛋白。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述蛋白混合物包括糖蛋白和非糖蛋白，糖蛋白与非糖蛋白的质量比为1:(1～200)；其中糖蛋白为人免疫球蛋白G或辣根过氧化物酶或胎球蛋白等，非糖蛋白为牛血清蛋白。
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