CN107840787B - 一种双酚a半抗原及完全抗原的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种双酚A半抗原及完全抗原的制备方法。本发明以双酚A为原料，在催化剂氢氧化钾/氢氧化钠作用下与一氯乙酸盐反应，乙酸乙酯除去未参与反应的双酚A，然后用盐酸酸化得到产物，过滤洗涤干燥得到双酚A羧基化半抗原；然后利用碳二亚胺法将双酚A半抗原与载体蛋白OVA偶联，制备双酚A完全抗原。本发明的制备方法简便，快速，在保证产物纯度和产率的基础上，大大缩短反应时间，同时无需加热和控制pH，节约工业生产成本。

Description

一种双酚A半抗原及完全抗原的制备方法
技术领域
本发明涉及生物化工及食品检测技术领域，尤其涉及一种双酚A半抗原及完全抗原的制备方法。
背景技术
双酚A(Bisphenol A)，简写为BPA，学名2，2-二(4-羟基苯基)丙烷，简称二酚基丙烷，分子式C15H16O2，纯品为白色晶体，可燃，微带苯酚气味，可溶于醋酸、乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、丙酮、醚、苯及碱性溶液等，微溶于四氯化碳，难溶于水。双酚A属于低毒性化学物质，对呼吸道、皮肤、角膜和消化道都会有中等强度刺激。双酚A具有拟雌激素的特点，能模仿或干扰内源性雌激素，很多的研究已证明它对哺乳动物生物体的生殖系统、免疫系统、神经系统等多方面都会产生一系列的不利影响。双酚A会干扰人体内正常激素的分泌，即便是低剂量染毒，也会导致非常严重的损伤，对于我们的健康存在着较大的风险。
国家制定了严格的双酚A残留标准，以保障食品安全，消除潜在的食品安全隐患。如GB/T 31604-2016《食品接触材料及制品2,2-二(4-羟基苯基)丙烷(双酚A)迁移量的测定》、GB/T 23296-2009《食品接触材料高分子材料食品模拟物中2，2-二(4-羟基苯基)丙烷(双酚A)的测定高效液相色谱法》、SN/T 2282-2009《食品接触材料高分子材料食品模拟物中双酚A的测定高效液相色谱法》、SN/T 4322-2015《食品接触材料高分子材料双酚A残留量的测定酶联免疫法》。目前常用的双酚A残留检测方法有紫外分光光度法、极谱法、荧光法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法及酶联免疫法等。相较而言，紫外分光光度法检测灵敏度相对较低，荧光和极谱法灵敏度较高，色谱法和荧光法的检出限可达到μg/L以下，但是色谱法不能鉴定出分析物的结构，往往还需要与质谱联用的手段确认结构，该方法的样品前处理繁琐，消耗大量溶剂，且依赖于大型仪器和专业技术检测人员。酶联免疫检测方法检测限可达到0.1μg/L以下，具有简单、快速、特异性好、分析容量大、成本低的优点，可以大大简化甚至省去前处理过程，不需要大型仪器，对使用人员的专门技术要求不高，容易普及和推广。开发成测试条、测试卡或是试剂盒，可广泛用于现场样品和大量样品的定性、定量的快速监测。
建立酶联免疫法，首先必须制备出效价高特异性强的抗体。由于许多目标物为小分子，无法引起免疫活性，需要制备半抗原合成完全抗原。同时由于目标物所具有的官能团不同，因此半抗原的设计和合成是完全抗原的关键步骤，决定最终得到抗体表面的抗原决定簇的特性。而从半抗原合成完全抗原的方法相对固定，主要是半抗原合成中所引入的连接臂末端的基团所决定。因此对于完全抗原的合成，其中的半抗原合成是关键步骤。
对于双酚A而言，双酚A是小分子化合物质，本身不具有导免疫系统产生抗体的能力。因此需要进行半抗原的制备。双酚A分子内可在多个不同的位点引进活性功能团：1、在甲基部位接上一个连接臂；2、芳香环或酚羟基接上一个连接臂。不同位点与蛋白质结合制备人工抗原产生的抗体与目标分析物的亲和力差异显著，这是因为不同位点结合导致半抗原空间构型或电子云分布与目标分析化合物有差异及空间位阻效应等。第一种方法采用的半抗原为双酚酸，即4,4-双(4-羟苯基)戊酸。该半抗原已商品化生产，无需进行半抗原制备。第二种方法考虑结构中保留甲基，在芳香环或酚羟基上接上一个带有氨基或羧基的连接臂。
对于双酚A半抗原/完全抗原的合成，国内外已出现多篇报道，大多采用双酚酸作为半抗原，或第二种方法制备双酚A半抗原。Joshua Richard Peterson等人用碳酸钾作为催化剂，与4-溴丁酸乙酯反应，在双酚A侧链的酚羟基上引入羧基制备双酚A半抗原。但半抗原制备需要75℃过夜反应，且需要增加酯水解的反应来获得羧基端，获得的半抗原需要利用硅胶色谱柱进行纯化。郑劼等利用无水三氯化铝为催化剂，采用氯乙酸钠法制备双酚A半抗原，但前期需要冰水浴，反应需要加热回流8小时，获得半抗原。石春红等利用对氨基苯甲酸为原料采用重氮化法在双酚A苯环上引入羧基，制备双酚A的半抗原，但其反应需要两步，第一步需要冰浴，第二步需要控制pH。目前双酚A半抗原的合成方法大多需要耗时较长，操作较为复杂，反应过程对温度和/pH有一定要求，产物纯度不高，导致双酚A半抗原及完全抗原制备较为繁琐，且能耗高。
发明内容
针对目前现有技术方法的不足，本发明提供一种专门针对双酚A的半抗原及完全抗原的合成方案，操作步骤简单有效，无需加热控温和/或控制pH，并且合成时间短，效率高，产物纯度高，安全可行。本发明的半抗原和完全抗原可广泛用于双酚A免疫分析研究中，应用前景广阔。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
首先，本发明公开了一种双酚A半抗原的合成方法，以双酚A为原料，在催化剂氢氧化钾/钠作用下与一氯乙酸盐反应，反应后除去未反应底物然后酸化得到产物。
本发明所述双酚A半抗原的结构式如式I所示，
Figure BDA0001455614410000031
具体的，本发明所述一种双酚A半抗原的合成方法，包括如下步骤：
(1)将双酚A和氢氧化钾/氢氧化钠加入到有机溶剂I中混匀，加入一氯乙酸盐进行反应，加入冰水终止反应；
(2)向步骤(1)中得到的混合物倒入有机溶剂II萃取；
(3)取水相，加入酸进行酸化，出现白色沉淀，得到双酚A半抗原。
本发明所述有机溶剂I提供无水反应环境，有机溶剂I选自二甲基亚砜、二氧六环、四氢呋喃或丙酮中的任意一种或两种以上混合物。
本发明所述有机溶剂II为有机萃取溶剂，主要用于萃取未反应的双酚A。有机溶剂II选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙醚中的一种或几种混合。
本发明通过试验研究发现，特定的针对双酚A这一类物质，通过采用活性较强的催化剂(氢氧化钾/氢氧化钠)，并选用电负性较弱的氯代酸盐作为反应物进行反应，可以有效的控制双酚A酚羟基活化程度(可以有效避免双酚A的两个酚羟基都活化成羧基)，并且整个反应过程无需控温或控制pH，反应时间短，为双酚A抗原的工业化制备提供了有效的途径。
优选的实施方案中，步骤(1)中，双酚A与一氯乙酸盐物质的量之比为1:1，或双酚A稍过量。由于本发明双酚A合成反应为不完全反应，通常情况下本领域技术人员均通过增加更易获得的小分子(氯代或溴代酸，或者氯代或溴代酯)含量来增加产物的得率，但本发明尝试增加双酚A稍过量，不仅有效的提升了得率，而且有效的控制了双酚A半抗原产物的纯度。
优选的，一氯乙酸盐为一氯乙酸钠。
优选，双酚A与一氯乙酸钠物质的量之比为1:0.5-1。更为优选的，双酚A、一氯乙酸钠、氢氧化钾的物质的量之比为1:0.5-1:15-25。优选的，双酚A在有机溶剂I中的浓度为0.183-0.275mol/L。
优选的实施方案中，步骤(1)中加入一氯乙酸钠反应时间为10-35min，温度为10-30℃。
优选的，步骤(1)中有机溶剂I选自二甲基亚砜(DMSO)。选用DMSO不仅有利于半抗原合成体系的稳定，而且利于后续半抗原纯化和完全抗原合成步骤。
优选的实施方案中，步骤(2)中，有机溶剂II选自乙酸乙酯；乙酸乙酯萃取未反应的双酚A，双酚A通过回收，可继续使用，节约反应底物。优选的，乙酸乙酯的量为所用二甲基亚砜的4-6倍，萃取次数为2-3次。
优选的实施方案中，步骤(3)中，酸化所用酸为盐酸，硫酸和硝酸中的一种或几种。更为优选的，酸化所用酸为盐酸，盐酸浓度优选为1.5-2.5mol/L。
优选的，步骤(3)中产生白色沉淀后过滤，将沉淀洗至中性，干燥，得到双酚A半抗原。
此外，本发明还公开了双酚A完全抗原的制备方法，包括上述(1)-(3)步骤外，还包括利用所制备的双酚A半抗原进一步制备双酚A完全抗原的步骤。
所述利用所制备的双酚A半抗原进一步制备双酚A完全抗原的步骤为利用碳二亚胺法将双酚A半抗原与载体蛋白偶联，制备双酚A完全抗原。
双酚A完全抗原，具有以下分子结构式(式II)：
Figure BDA0001455614410000041
具体的，所述利用制备的双酚A半抗原进一步制备双酚A完全抗原的步骤包括：
(4)分别将双酚A半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC)加入有机溶剂I中混匀，将该混匀溶液缓慢滴入含有载体蛋白的缓冲液中，混匀；
(5)透析，冷冻干燥后制成双酚A完全抗原。
优选的实施方案中，步骤(4)中，双酚A半抗原、NHS和EDC的质量比为1:0.4-0.6:0.7-0.9:0.6-10。
优选的实施方案中，载体蛋白包括但不仅限于牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白及多聚赖氨酸。
优选的，双酚A半抗原、NHS和EDC加入有机溶剂I后室温下搅拌混匀约2小时；所用缓冲液为pH为7.0的碳酸盐缓冲液，混匀溶液缓慢滴入含有载体蛋白的缓冲液中后，室温搅拌2小时。
本发明技术方案取得了以下有益效果：
(1)本发明提供了一种双酚A半抗原及完全抗原制备的新方法，最大限度保留了双酚A的化学结构，提高了半抗原的特异性，引入活性基团-COOH，为完全抗原的制备提供连接点，制备得到的半抗原和完全抗原可用于双酚A免疫分析方法研究。
(2)本发明提供一种双酚A半抗原及完全抗原制备的新方法，该方法通过对合成中催化剂、反应物等的优化，在保证产物纯度和产率的基础上，大大缩短反应时间，同时无需加热和控制pH，节约工业生产成本。
(3)本发明所述方法中，利用产物和底物溶解特性不同，利用萃取方法除去未反应的双酚A，同时所得双酚A通过回收，可继续使用，节约反应底物。
(4)本发明所述方法中，最后通过酸化结晶的方法，即可获得高纯度的双酚A半抗原，对于控制反应效率和产物纯度，极为有效。
本发明所述方法整体上具有操作简单，降低能耗，节约成本，产品纯度高等的特点，可广泛用于双酚A免疫分析研究中，对于工业化生产更为适用，应用前景广阔。
附图说明
图1实验例1BPA、BPA半抗原的紫外扫描
图2实验例2BPA、BPA半抗原的紫外扫描
图3实验例2BPA、样品1的薄层色谱图，①为BPA，②为样品1
图4实验例3BPA、DPA、BPA半抗原的紫外扫描
图5实验例3BPA、样品2、DPA的薄层色谱图，①为BPA，②为样品2，③为DPA
图6实验例4BPA、样品3、DPA的薄层色谱图，①为BPA，②为样品3，③为DPA
图7实验例4BPA、DPA、样品的紫外扫描
图8实验例5BPA、样品4、样品5、DPA的薄层色谱图，①为BPA，②为样品1(BPA：一氯乙酸钠＝1:2，反应时间20min)，③为样品2(BPA：一氯乙酸钠＝1:1，反应时间30min)④为DPA
图9实验例5BPA、样品5的红外图
图10实验例5BPA、样品5的质谱图
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
试验材料
Figure BDA0001455614410000061
Figure BDA0001455614410000071
合成产物的鉴定方法
薄层层析分离纯化法：薄层层析展开完成之后，根据高效薄层板上物质的Rf值(Retention Factor Value)来鉴定(肖蕾.17β-雌二醇分子印迹仿生免疫快速检测方法研究[D].山东师范大学,2016)。将硅胶板上的物质及分离，装在合适的EP管中，加适量甲醇溶解，用少量无水Na2SO4脱水处理，室温下10000r/min离心，取上清液，烘干。
紫外分光光度计法(Ultraviolet spectroscopy)：配制50μg/mL的BPA标准溶液及样品溶液，甲醇作为溶剂。测样前用甲醇润洗两次石英比色皿，加入适量待测液进行紫外扫描。
质谱分析：ESI源；负离子模式；雾化气压力25psi；干燥气流量8L/min；干燥气温度350℃。
红外分析：光谱级溴化钾压片，Bruker Tensor II红外光谱仪扫描。
实验例1一氯乙酸钠Na2CO3方法合成双酚A半抗原
称量640mg一氯乙酸钠粉末溶解至4mL水中，得溶液A；称量270mg无水碳酸钠溶解至2mL水中，得溶液B；称量1140mg双酚A颗粒溶解至40mL二氧六环中，得溶液C；首先将溶液A逐滴加入溶液C中，然后将溶液B逐滴加入A与C的混合溶液中，在70℃水浴条件下搅拌9h。过滤除去不溶物，减压蒸发滤液除去溶剂，剩余残渣悬浮于10mL蒸馏水中，用6mol/L的HCl溶液调至pH＝3.6，过滤留沉淀物，溶于适量滚沸的氯仿中，加入少量石油醚，生成白色沉淀，过滤烘干。
BPA标准品(100μg/mL)及半抗原(100μg/mL)的紫外扫描结果见图1。对比两条曲线可以看出BPA标准品和BPA半抗原均在278nm处有特征吸收峰。在紫外扫描图中最大吸收波长没有明显位移，无法明确判断是否合成了BPA半抗原。另外此方法对温度及pH值均有要求，影响因素较多，操作复杂。
实验例2溴丁酸乙酯K2CO3(方法一)合成双酚A半抗原
称取1.14g(5mmol)BPA和828mg(6mmol)无水K2CO3溶于20mL无水丙酮中，加入716μL溴丁酸乙酯，将混合物加热到70℃，回流条件下搅拌8h。冷却反应物，真空条件下旋转蒸发干燥。将10mL甲醇和5mL10％的NaOH溶液混合，旋转蒸发干燥后的固体残渣溶解于上述混合溶液中，加热状态下回流30min。用1:1的HCl溶液调至pH＝2。加适量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相，无水Na2SO4脱水处理，旋转蒸发除去溶剂。
BPA标准品(100μg/mL)及半抗原(100μg/mL)的紫外扫描结果见图2。对比两条曲线可以看出BPA标准品和BPA半抗原均在278nm处有特征吸收峰。在紫外扫描图中可以看出样品较BPA最大吸收波长有一定的蓝移，需进一步鉴定是否合成。
利用石油醚/丙酮/冰乙酸＝3:1:0.02为展开剂对BPA半抗原进行鉴定，薄层色谱如图3所示。BPA半抗原分子结构含有一个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，BPA分子结构中含有两个酚羟基，分子量为228.29，DPA分子结构中含有两个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，三者极性大小顺序为：DPA>BPA半抗原>BPA，在高效薄层层析硅胶板上的Rf值不同，薄层层析结果应为1>Rf(BPA)>Rf(BPA半抗原)>Rf(DPA)。根据结果图3可以看出样品1中出现多种物质，其中c物质与BPA的比移值相近，说明有部分BPA未反应，a与b物质比移值均大于BPA的比移值，考虑为未反应的溴丁酸乙酯及其他杂质，从薄层色谱图中可以判断未生成BPA半抗原。该方法用无水丙酮作为溶剂进行反应，在70℃加热状态下密闭回流8h，由于丙酮沸点较低，在加热回流过程中极易损耗，且此方法操作繁琐，时间较长。
实验例3溴丁酸乙酯K2CO3(方法二)合成双酚A半抗原
称取1.004g(4.4mmol)BPA和1.348g(9.75mmol)无水K2CO3溶于10mL无水DMF得到混合溶液，将697μL(4.87mmol)溴丁酸乙酯逐滴加入上述混合溶液中，密闭条件下75℃搅拌过夜。加入5mL10％的NaOH溶液，加热30min，用1:1的HCl溶液调至pH＝2。混合溶液用乙酸乙酯萃取3次，每次30mL，收集乙酸乙酯相，无水Na2SO4脱水处理，减压蒸发干燥。
BPA标准品(100μg/mL)，DPA标准品(100μg/mL)及BPA半抗原(100μg/mL)的紫外扫描结果见图4。对比三条曲线可以看出BPA标准品，DPA标准品及BPA半抗原在278nm处都有特征吸收峰，在紫外扫描图中三者最大吸收波长没有明显位移。
利用石油醚/丙酮/冰乙酸＝3:1:0.02为展开剂对BPA半抗原进行鉴定，薄层色谱如图5所示。BPA半抗原分子结构含有一个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，BPA分子结构中含有两个酚羟基，分子量为228.29，DPA分子结构中含有两个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，三者极性大小顺序为：DPA>BPA半抗原>BPA，在高效薄层层析硅胶板上的Rf值不同，薄层层析结果应该为薄层层析结果应为1>Rf(BPA)>Rf(BPA半抗原)>Rf(DPA)。根据结果图5可以看出样品2中出现多种物质，其中c物质与BPA的比移值相近，说明有部分BPA未反应，a与b物质比移值均大于BPA的比移值，考虑为未反应的溴丁酸乙酯及其他杂质，从薄层色谱图中可以判断未生成BPA半抗原。本方法用无水DMF代替无水丙酮作为溶剂进行反应，排除了高温会使溶解蒸发的影响，但由于步骤繁琐操作时间较长，对温度及pH等要求过高，不定因素较多，对实验结果容易造成影响。
实验例4溴乙酸KOH方法合成双酚A半抗原
称取251mg(1.1mmol)BPA置于6mL干燥的二甲基亚砜中，将1.0g(18mmol)KOH粉末加入溶液。室温下搅拌5min，加入306mg溴乙酸(2.2mmol)。磁力搅拌2h，反应2h后加入50mL冰水终止反应。加入适量乙酸乙脂萃取，分液漏斗中除去未反应的BPA。搅拌状态下用2mol/L HCl酸化水相，出现白色沉淀。漏斗过滤，用蒸馏水将沉淀物洗至中性,放入烘箱干燥，得白色沉淀(参考戴小华.雌二醇单克隆抗体的制备与酶联免疫检测试剂盒的初步研究[D].新疆农业大学,2005)。
利用石油醚/丙酮/冰乙酸＝3:1:0.02为展开剂对BPA半抗原进行鉴定，薄层色谱如图6所示。BPA半抗原分子结构含有一个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，BPA分子结构中含有两个酚羟基，分子量为228.29，DPA分子结构中含有两个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，三者极性大小顺序为：DPA>BPA半抗原>BPA，在高效薄层层析硅胶板上的Rf值不同，薄层层析结果应该为薄层层析结果应为1>Rf(BPA)>Rf(BPA半抗原)>Rf(DPA)。根据结果图6可以看出样品3中出现上、下两种物质，上下层物质比移值均位于BPA与DPA之间。分析认为溴乙酸的活化性较强且反应时间较长，可将部分双酚A的两个酚羟基都活化成羧基，所以会出现两种物质，本发明将样品中上下层两种物质分离纯化后进行紫外分光光度法鉴定。
BPA标准品，DPA标准品，样品3薄层层析上下层物质紫外扫描结果见图7。对比四条曲线可以看出BPA标准品和DPA标准品均在278nm处有特征吸收峰，样品中的两种物质相对于BPA标品均可看出明显红移，可初步判断有新的物质合成，可见由于溴乙酸活化性较强且反应时间较长导致部分双酚A的两个羟基均被活化成羧基。
实验例5改良合成方法合成双酚A半抗原
在实验例4实验方法的基础上进行优化改良：考虑到溴乙酸的电负性较强，将溴乙酸换成一氯乙酸钠，使反应中BPA过量，调整BPA与一氯乙酸钠比例：1：2，1：1分别实验，反应时间调整为20min，30min分别实验。具体如下：①称取251mg(1.1mmol)BPA置于6mL干燥的二甲基亚砜中，将1.0g(18mmol)KOH粉末加入溶液。室温下5min，加入256mg(2.2mmol)一氯乙酸钠。磁力搅拌20min，反应20min后加入50mL冰水终止反应。加入适量乙酸乙脂萃取，分液漏斗中除去未反应的BPA。搅拌状态下用2mol/L HCl酸化水相，出现白色沉淀。漏斗过滤,用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得白色沉淀；②称取251mg(1.1mmol)BPA置于6mL干燥的二甲基亚砜中，将1.0g(18mmol)KOH粉末加入溶液。室温下5min，加入128mg(1.1mmol)一氯乙酸钠。磁力搅拌30min，反应30min后加入50mL冰水终止反应。加入适量乙酸乙脂萃取，分液漏斗中除去未反应的BPA。搅拌状态下用2mol/L HCl酸化水相，出现白色沉淀。漏斗过滤,用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得白色沉淀。
利用石油醚/丙酮/冰乙酸＝3:1:0.02为展开剂对BPA半抗原进行鉴定，实验方法改良后的薄层层析结果如图8所示。BPA半抗原分子结构含有一个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，BPA分子结构中含有两个酚羟基，分子量为228.29，DPA分子结构中含有两个酚羟基和一个羧基，分子量为286.32，三者极性大小顺序为：DPA>BPA半抗原>BPA，在高效薄层层析硅胶板上的Rf值不同，薄层层析结果应为1>Rf(BPA)>Rf(BPA半抗原)>Rf(DPA)。根据结果图8可以看出样品4中出现a、b两种物质(b含量明显减少)，两种物质比移值均位于BPA与DPA之间。调整反应中BPA过量，样品5中将一氯乙酸钠调整为一氯乙酸钠：BPA＝1:1，明显看出只有一种物质，比移值位于BPA及DPA之间，初步判断为BPA半抗原纯品。为进一步确定该物质，采用质谱法进行鉴定。
BPA标准品及样品5的红外扫描结果图见图9。双酚A半抗原在1700cm-1-1800cm-1的波数范围内出现末端羧基的-C＝O的伸缩振动特征吸收峰。同时由于反应中引入羧基基团，在3000cm-1-3300cm-1处的羟基吸收峰变得宽而钝。因此可以判断双酚A上被成功修饰上羧基。
BPA标准品及样品5的质谱扫描结果图见图10。BPA半抗原分子量为286.32，BPA分子量为228.29，质谱扫描显示BPA、BPA半抗原分子量分别为227.1065、285.1110，扫描结果表明双酚A半抗原的分子量比双酚A的分子量增加58，说明通过此方法已成功合成BPA半抗原。
实施例1：双酚A半抗原制备方法
称取251mg双酚A置于6mL干燥的二甲基亚砜中，将1.540g氢氧化钾加入溶液中，搅拌5min。加入64mg一氯乙酸钠。室温10℃下，磁力搅拌35min后，加入50mL冰水终止反应。加入乙酸乙脂24mL萃取三次，除去未反应的双酚A。搅拌状态下用100mL 1.5mol/L HCl酸化水相，出现白色沉淀。漏斗过滤，用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得到纯品73mg，产率约为28％，纯度约为98％。
反应式为：
Figure BDA0001455614410000111
实施例2：双酚A半抗原制备方法
称取251mg双酚A置于4mL干燥的二甲基亚砜中，将0.924g氢氧化钾加入溶液中，搅拌5min。加入128mg一氯乙酸钠。室温10℃下，磁力搅拌35min后，加入50mL冰水终止反应。加入乙酸乙脂24mL萃取两次，除去未反应的双酚A。搅拌状态下用100mL 2.5mol/L HCl酸化水相，出现白色沉淀。漏斗过滤,用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得到纯品75mg，产率约为30％，纯度约为96％。
实施例3：双酚A半抗原制备方法
称取251mg双酚A置于4mL干燥的二甲基亚砜中，将1.0g氢氧化钠加入溶液中，搅拌5min。加入128mg一氯乙酸钠。室温30℃下，磁力搅拌10min后，加入50mL冰水终止反应。加入乙酸乙脂16mL萃取三次，除去未反应的双酚A。搅拌状态下用100mL 2mol/L HCl酸化水相，出现白色沉淀。漏斗过滤，用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得到纯品73mg，产率约为28％，纯度约为96％。
实施例4：双酚A半抗原制备方法
称取251mg双酚A置于6mL干燥的二甲基亚砜中，将1.0g氢氧化钾加入溶液中，搅拌5min。加入64mg一氯乙酸钠。室温15℃下，磁力搅拌23min后，加入50mL冰水终止反应。加入乙酸乙脂36mL萃取两次，除去未反应的双酚A。搅拌状态下用100mL 2mol/L HCl酸化水相，出现白色沉淀。漏斗过滤，用蒸馏水将沉淀物洗至中性，放入烘箱干燥，得到纯品68mg，产率约为27％，纯度约为98％。
实施例5：双酚A完全抗原的合成
取6.6mg双酚A半抗原，2.64mg的NHS，4.62mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。将3.96mg的卵清蛋白溶解到5mL NaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液。即得到双酚A的完全抗原。
实施例6：双酚A完全抗原的合成
取6.6mg双酚A半抗原，3.96mg的NHS，5.94mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。将66mg的牛血清白蛋白溶解到5mL NaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液。即得到双酚A的完全抗原。
实施例7：双酚A完全抗原的合成
取6.6mg双酚A半抗原，2.9mg的NHS，5.2mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。将29mg的血蓝蛋白溶解到5mL NaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液。即得到双酚A的完全抗原。
实施例8：双酚A完全抗原的合成
取6.6mg双酚A半抗原，2.9mg的NHS，5.2mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。将29mg的人血清白蛋白溶解到5mL NaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液。即得到双酚A的完全抗原。
实施例9：双酚A完全抗原的合成
取6.6mg双酚A半抗原，2.9mg的NHS，5.2mg的EDC，混合加入1mL的二甲基亚砜中搅拌2小时。将29mg的多聚赖氨酸溶解到5mL NaHCO3(0.13mol/L，pH>7)。将上述1mL溶液缓慢滴入该蛋白溶液中，轻轻搅拌2h，维持pH＝7.0左右。将反应后的反应液装入透析袋中，在4℃层析柜中用0.01mol/L的PBS缓冲液在磁力搅拌器上透析三天，每4小时换一次液。即得到双酚A的完全抗原。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (10)

1.一种双酚A半抗原的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将双酚A和氢氧化钾或氢氧化钠加入到有机溶剂I中混匀，加入一氯乙酸盐进行反应，加入冰水终止反应；
(2)向步骤(1)中得到的混合物倒入有机溶剂II萃取；
(3)取水相，加入酸进行酸化，出现白色沉淀，得到双酚A半抗原；
有机溶剂I选自二甲基亚砜、二氧六环、四氢呋喃或丙酮中的任意一种或两种以上混合物；有机溶剂II选自乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙醚中的一种或几种混合；
步骤(1)中，一氯乙酸盐为一氯乙酸钠；加入一氯乙酸盐反应时间为10-35min，温度为10-30℃；
双酚A、一氯乙酸钠、氢氧化钾或氢氧化钠的物质的量之比为1:0.5-1:15-25。
2.根据权利要求1所述双酚A半抗原的合成方法，其特征在于，步骤(1)中，双酚A在有机溶剂I中的浓度为0.183-0.275mol/L。
3.根据权利要求1所述双酚A半抗原的合成方法，其特征在于，步骤(1)中有机溶剂I为二甲基亚砜；步骤(2)中，有机溶剂II为乙酸乙酯；乙酸乙酯的量为二甲基亚砜的4-6倍，萃取次数为2-3次。
4.根据权利要求1所述双酚A半抗原的合成方法，其特征在于，步骤(3)中，酸化所用酸为盐酸、硫酸和硝酸中的一种或几种。
5.双酚A完全抗原的制备方法，其特征在于，包括权利要求1-4中任一项所述双酚A半抗原的合成方法，还包括利用制备的双酚A半抗原进一步制备双酚A完全抗原的步骤。
6.根据权利要求5所述双酚A完全抗原的制备方法，其特征在于，所述利用制备的双酚A半抗原进一步制备双酚A完全抗原的步骤为利用碳二亚胺法将双酚A半抗原与载体蛋白偶联，制备双酚A完全抗原。
7.根据权利要求6所述双酚A完全抗原的制备方法，其特征在于，所述利用制备的双酚A半抗原进一步制备双酚A完全抗原的步骤包括：
(4)分别将双酚A半抗原、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐NHS和N-羟基琥珀酰亚胺EDC加入到如权利要求1所述的有机溶剂I中混匀，将该混匀溶液缓慢滴入含有载体蛋白的缓冲液中，混匀；
(5)透析，冷冻干燥后制成双酚A完全抗原。
8.根据权利要求7所述双酚A完全抗原的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，双酚A半抗原、NHS和EDC的质量比为1:0.4-0.6:0.7-0.9。
9.根据权利要求6所述双酚A完全抗原的制备方法，其特征在于，载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、人血清白蛋白及多聚赖氨酸。
10.根据权利要求7所述双酚A完全抗原的制备方法，其特征在于，双酚A半抗原、NHS和EDC加入有机溶剂I后室温下搅拌混匀约2小时；所用缓冲液为pH为7.0的碳酸盐缓冲液，混匀溶液缓慢滴入含有载体蛋白的缓冲液中后，室温搅拌2小时。
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