CN102495204A

CN102495204A - 小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析方法

Info

Publication number: CN102495204A
Application number: CN2011103993826A
Authority: CN
Inventors: 刘曙照; 冯大和
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2011-12-06
Filing date: 2011-12-06
Publication date: 2012-06-13

Abstract

小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析方法，涉及快速检测小分子有机物的纳米荧光探针标记直接竞争免疫分析技术领域。以高效水溶性量子点作为纳米荧光探针标记目标分析物半抗原，将抗目标分析物抗体固定于水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，封闭微球表面未结合抗体的位点后分散于水相中，加入含目标分析物的标样或待测样品及对应量子点标记目标分析物半抗原，待竞争性免疫反应平衡后在磁场中将聚苯乙烯磁性微球与液相迅速分离，对液相进行荧光检测，依据液相中量子点标记半抗原的荧光强度与对应目标分析物的浓度在一定范围内成正比的规律，建立高灵敏度快速检测目标小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析技术。

Description

小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析方法

技术领域

本发明涉及小分子有机物（农药、药物、环境内分泌干扰物）的纳米荧光探针标记半抗原直接竞争免疫分析新技术领域。

背景技术

环境和农畜产品中农药、药物、环境内分泌干扰物的残留超标，对环境和环境生物构成一定威胁，影响食品安全和人类健康。加强环境和食品安全监测，需要高效快速的分析技术。

目前已报道的农药、药物、环境内分泌干扰物残留的检测方法主要有色谱法和色质联用法。采用这些方法需要昂贵的仪器设备、专业化的实验室和训练有素的专门人才，样品前处理要求高、过程复杂、速度慢，检测成本高，特异性不强，难以适应大量样品和现场快速检测的要求。现有小分子有机物的酶联免疫吸附分析（ELISA），通常采用聚苯乙烯微孔板固定抗体或抗原，免疫反应在固相和液相界面进行，需要通过洗涤方式将固、液两相分离，加入酶的底物进行显色反应后检测，步骤多，操作复杂；放射性同位素标记免疫分析方法趋向于淘汰；以有机荧光分子作标记物的荧光免疫分析存在稳定性差、易发生光漂白等问题，与化学发光免疫分析类似，经典的荧光免疫分析容易受背景的干扰。

发明内容

本发明的目的是以高效水溶性量子点作为纳米荧光探针，建立一种特异性强、灵敏度高、简便高效、用于小分子有机物（农药、药物、环境内分泌干扰物）快速检测的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析新技术。

本发明的技术方案是：采用混合酸酐法或碳二亚胺法，将激发波长宽、发射波长窄、荧光量子效率高、稳定性好、表面具有活性氨基的核壳结构水溶性量子点与含活性羧基末端的目标分析小分子有机物（农药、药物、环境内分泌干扰物）半抗原共价偶联制备量子点标记半抗原；将对目标分析小分子有机物具特异性亲和力的抗体固定在水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，并封闭水分散性聚苯乙烯磁性微球表面未结合所述抗体的位点；将适量固定有抗目标分析物抗体并经过封闭处理的聚苯乙烯磁性微球、目标分析物的量子点标记半抗原和目标分析物标样在水相中混匀，室温下进行竞争性免疫反应至平衡，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样设置样品和空白对照反应体系；将平衡后的反应体系在磁场中使聚苯乙烯磁性微球与液相分离，对液相进行荧光检测；在条件优化的基础上，依据标样体系的荧光强度F_S与空白对照的荧光强度F₀之比F_S/F₀与目标分析物浓度在一定范围内成正比（聚苯乙烯磁性微球上结合的量子点标记半抗原的量与目标分析物浓度在一定范围内成反比）的规律以及待测样品的F_S/F₀，计算待测样品中小分子有机物的含量，建立高灵敏度快速检测目标分析小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析方法。

本发明综合利用免疫分析特异性强，量子点荧光性能优异、聚苯乙烯磁性微球可在水相中分散且可在磁场中与液相迅速分离等优势，免疫反应在水分散体系中进行，平衡时间短，省去了洗涤和显色反应步骤，分析时间约为常规ELISA的1/2~1/4。与常规免疫分析技术相比，本发明所建立的量子点标记小分子有机物（农药、药物、环境内分泌干扰物）半抗原直接竞争免疫分析技术特异性强、灵敏度高，方法简便高效，是对现有小分子有机物免疫分析技术的发展和创新，具有很高的开发应用价值。

附图说明

图1为不同氰戊菊酯浓度时液相中的量子点标记半抗原荧光光谱。

图2为不同诺氟沙星浓度时液相中的量子点标记半抗原荧光光谱。

图3为不同双酚A浓度时液相中的量子点标记半抗原荧光光谱。

具体实施方式

一、量子点标记氰戊菊酯半抗原直接竞争免疫分析技术实施例一：

将氰戊菊酯半抗原

（n=1-5）采用经典的混合酸酐法或碳二亚胺法与表面修饰有活性氨基、荧光发射波长为705nm的水溶性量子点共价偶联制备量子点标记氰戊菊酯半抗原，以pH8.3、含0.5g/L叠氮化钠和1mol/L甜菜碱的0.05mol/L硼酸盐缓冲液定容至1μmol/L（按量子点计），4℃储存备用。

用0.02mol/L、pH7.2 PB将对氰戊菊酯具特异性亲和力的抗体溶解成10 μg/mL，加入等体积浓度为10 mg/mL的水分散性聚苯乙烯磁性微球，4℃吸附8～12小时。用磁性微球分离器将包被有抗氰戊菊酯抗体的聚苯乙烯磁性微球与液相快速分离，固相加原体积2倍的0.02mol/L、pH7.2 PB分散后，再用磁性微球分离器进行固液分离，如此重复2次，然后在固相中加入含NaN₃0.5g/L、浓度为5g/L的明胶溶液，使聚苯乙烯磁性微球在混合体中的含量为1mg/mL，室温放置2小时，封闭微球表面未吸附抗体的位点，4℃储存备用。

用0.02mol/L、pH7.2 PB稀释氰戊菊酯甲醇溶液，配制10～10^-4μg/mL的氰戊菊酯标样系列，以0.02mol/L、pH7.2 PB作空白对照，。

在100μL不同浓度氰戊菊酯标样、待测样品、氰戊菊酯空白对照溶液中分别加入固定有抗氰戊菊酯抗体的聚苯乙烯磁性微球储备液50μL和用0.02mol/L、pH7.2 的PB稀释50倍的量子点标记氰戊菊酯半抗原50μL，在室温下混合反应约20min。反应平衡后用磁性微球分离器进行固液分离，各取150μL液相分别加入荧光微孔板的不同孔内，在235nm激发波长下检测各孔705nm附近的最大荧光强度。

优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择抗体与氰戊菊酯免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、固定有抗体的聚苯乙烯磁性微球和量子点标记半抗原用量少、含氰戊菊酯反应体系的荧光强度(F_S)/空白对照荧光强度（F₀）比值（F_S/F₀)高、背景干扰少的条件组合。

在上述基础上，依据标样体系的荧光强度F_S与空白对照的荧光强度F₀之比（F_S/F₀）与氰戊菊酯浓度在一定范围内成正比（聚苯乙烯磁性微球上结合的量子点标记半抗原的量与氰戊菊酯浓度在一定范围内成反比）的规律（见图1）以及样品的F_S/F₀，计算样品中氰戊菊酯的含量，对待测样品中的氰戊菊酯进行定性定量快速检测，从而建立氰戊菊酯的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析技术。

图1中从a～f 表示氰戊菊酯浓度依次为10～10^-4μg/mL。

二、量子点标记诺氟沙星半抗原直接竞争免疫分析技术实施例二：

将诺氟沙星半抗原采用经典混合酸酐法或碳二亚胺法与表面修饰有活性氨基、荧光发射波长为585nm的水溶性量子点共价偶联制备量子点标记诺氟沙星半抗原，用pH8.3、含0.5g/L叠氮化钠和1mol/L甜菜碱的0.05mol/L硼酸盐缓冲液定容至1μmol/L（按量子点计），4℃储存备用。

用0.02mol/L pH7.2 PB将对诺氟沙星具特异性亲和力的抗体溶解成10μg/mL，加入等体积浓度为10 mg/mL的水分散性聚苯乙烯磁性微球，4℃吸附8～12小时。用磁性微球分离器将包被有抗诺氟沙星抗体的聚苯乙烯磁性微球与液相快速分离，固相加原体积2倍的0.02mol/L、pH7.2 PB分散后，再用磁性微球分离器进行固液分离，如此重复2次，然后在固相中加入含NaN₃0.5g/L、浓度为5g/L的明胶溶液，使聚苯乙烯磁性微球在混合体中的含量为1mg/mL，室温放置2小时，封闭微球表面未吸附抗体的位点，4℃储存备用。

用0.02mol/L、pH7.2 PB稀释1g/L的诺氟沙星甲醇溶液，配置10-10^-4μg/mL的诺氟沙星标样系列，以0.02mol/L、pH7.2 PB作空白对照。

在100μL不同浓度诺氟沙星标样、待测样品和诺氟沙星空白对照溶液中分别加入固定有抗诺氟沙星抗体的聚苯乙烯磁性微球储备液50μL和用0.02mol/L、pH7.2 的PB稀释100倍的量子点标记诺氟沙星半抗原50μL，在室温下混合反应约20min。反应平衡后用磁性微球分离器进行固液分离，各取150μL液相分别加入荧光微孔板的不同孔内，在235nm激发波长下检测各孔585nm附近的最大荧光强度。

优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择抗体与氰戊菊酯免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、固定有抗体的聚苯乙烯磁性微球和量子点标记半抗原用量少、含诺氟沙星反应体系的荧光强度(F_S)/空白对照荧光强度（F₀）的比值（F_S/F₀）高、背景干扰少的条件组合。

在上述基础上，依据诺氟沙星标样体系的荧光强度F_S与空白对照的荧光强度F₀之比F_S/F₀与诺氟沙星浓度在一定范围内成正比（聚苯乙烯磁性微球上结合的量子点标记半抗原的量与诺氟沙星浓度在一定范围内成反比）的规律（见图2）以及样品的F_S/F₀，计算样品中诺氟沙星的含量，对待测样品中的诺氟沙星进行定性定量快速检测，从而建立诺氟沙星的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析技术。

图2中从a～f 表示诺氟沙星浓度依次为10～10^-4μg/mL。

三、量子点标记双酚A半抗原直接竞争免疫分析技术实施例三：

将双酚A半抗原

采用经典的混合酸酐法或碳二亚胺法与表面修饰有活性氨基、荧光发射波长为625nm的水溶性量子点共价偶联制备量子点标记双酚A半抗原，用pH8.3、含0.5g/L叠氮化钠和1mol/L甜菜碱的0.05mol/L硼酸盐缓冲液定容至1μmol/L（按量子点计），4℃储存备用。

将对双酚A具特异性亲和力的抗体用0.02mol/L、pH7.2的PB溶解成10μg/mL，加入等体积浓度为10 mg/mL的水分散性聚苯乙烯磁性微球，4℃吸附8～12小时。然后用磁性微球分离器使包被有抗双酚A抗体的聚苯乙烯磁性微球与液相快速分离，固相用0.02mol/L、pH7.2 PB分散后，再用磁性微球分离器进行固液分离，如此重复2次，然后在固相中加入含NaN₃0.5g/L、浓度为5g/L的明胶溶液，使聚苯乙烯磁性微球的含量为1mg/mL，在4℃环境温度下吸附8～12小时，以封闭微球表面未吸附抗体的位点。

用0.02mol/L、pH7.2 PB稀释双酚A甲醇溶液，配制1～10^-5μg/mL的双酚A标样系列，以0.02mol/L、pH7.2 PB作空白对照。

在100μL不同浓度双酚A标样、待测样品和双酚A空白对照溶液中分别加入固定有抗双酚A抗体的聚苯乙烯磁性微球储备液50μL和用0.02mol/L、pH7.2 的PB稀释200倍的量子点标记双酚A半抗原50μL，在室温下混合反应约20min。反应平衡后用磁性微球分离器进行固液分离，各取150μL液相分别加入荧光微孔板的不同孔内，在235nm激发波长下检测各孔625nm附近的最大荧光强度。

图3中从a～f 表示双酚A浓度依次为1～10^-5μg/mL。

优化反应介质、反应物浓度比、反应温度和时间、激发波长与荧光发射波长等相关条件，选择抗体与双酚A免疫反应速度快、敏感性强、稳定性好、固定有抗体的聚苯乙烯磁性微球和量子点标记半抗原用量少、含双酚A反应体系的荧光强度（F_S）/空白对照荧光强度（F₀）比值高、背景干扰少的条件组合。

在上述基础上，依据双酚A标样体系的荧光强度F_S与空白对照的荧光强度F₀之比F_S/F₀与双酚A浓度在一定范围内成正比（聚苯乙烯磁性微球上结合的量子点标记半抗原的量与双酚A浓度在一定范围内成反比）的规律（见图3）以及样品的F_S/F₀，计算样品中双酚A的含量，对待测样品中的双酚A进行定性定量快速检测，从而建立双酚A的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析技术。

Claims

1.小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析方法，其特征在于：

采用混合酸酐法或碳二亚胺法，将激发波长宽、发射波长窄、荧光量子效率高、稳定性好、表面具有活性氨基的核壳结构水溶性量子点与含活性羧基末端的目标分析小分子有机物半抗原共价偶联制备量子点标记半抗原；将对目标分析小分子有机物具特异性亲和力的抗体固定在水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，并封闭水分散性聚苯乙烯磁性微球表面未结合所述抗体的位点；将固定有抗目标分析物抗体并经过封闭处理的聚苯乙烯磁性微球、目标分析物的量子点标记半抗原及目标分析物标样在水相中混匀，室温下进行竞争性免疫反应至平衡，同样条件下以待测样品和目标分析物空白代替标样，设置样品和空白对照反应体系；将平衡后的反应体系在磁场中使聚苯乙烯磁性微球与液相快速分离，对液相进行荧光检测，依据标样体系的荧光强度F_S与空白对照的荧光强度F₀之比F_S/F₀与目标分析物浓度在一定范围内成正比的规律以及待测样品的F_S/F₀，计算待测样品中小分子有机物的含量，建立高灵敏度快速检测目标分析小分子有机物的量子点标记半抗原直接竞争免疫分析方法。