CN117554606A - 多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生化传感技术领域的一种多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，包括：提供磁珠、目标分子抗体、多孔滤膜；并且所述磁珠的粒径大于所述多孔滤膜的孔径；将所述磁珠与所述目标分子抗体偶联，得到免疫磁珠；将待测溶液与所述免疫磁珠混合，在适于免疫反应的条件下进行孵育，得到反应后的溶液；用所述多孔滤膜过滤所述反应后的溶液，然后对所述多孔滤膜进行荧光检测，根据检测结果计算待测溶液中目标分子的浓度。本申请的检测方法实验步骤较少、试剂需求量小，极大简化了操作流程，在多孔滤膜辅助下极大提高了目标分子，特别是万古霉素等小分子物质的检测灵敏度，且重复性好、稳定性高。
Description
技术领域
本申请涉及生化传感技术领域，尤其是涉及一种多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法。
背景技术
对血液中一些生化小分子的含量进行监测可以提高临床治疗的有效性，因此对生化小分子浓度的检测具有重要的意义；相关浓度的生物分子或生物标志物相关疾病如癌症、心脏病、炎症和神经疾病可以在许多数量级从μgml-1水平到fgml-1，其中一些可能仍然身份不明；此外，最好利用小样本量对宝贵的生物体液，如呼吸浓缩液、眼液、脑脊液或新生儿或小动物模型的血清进行多路检测，这就需要样品稀释，进一步降低浓度；但是目前的生化标志物分子，特别是低浓度、小分子的生化标志物分子传感方案存在着灵敏度低、操作复杂、试剂需求量大等问题。
发明内容
鉴于背景技术中存在的问题，本申请提供一种多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，该检测方法实验步骤较少、试剂需求量小，极大简化了操作流程，在多孔滤膜辅助下极大提高了目标分子，特别是万古霉素等小分子物质的检测灵敏度，且重复性好、稳定性高。
根据本发明的一个方面，提供一种多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，包括：提供磁珠、目标分子抗体、多孔滤膜；并且所述磁珠的粒径大于所述多孔滤膜的孔径；将所述磁珠与所述目标分子抗体偶联，得到免疫磁珠；将待测溶液与所述免疫磁珠混合，在适于免疫反应的条件下进行孵育，得到反应后的溶液；用所述多孔滤膜过滤所述反应后的溶液，然后对所述多孔滤膜进行荧光检测，根据检测结果计算待测溶液中目标分子的浓度。
在本发明的一些实施方式中，用所述多孔滤膜过滤所述反应后的溶液包括：将所述多孔滤膜平铺于夹具台上；用PBS缓冲液冲洗所述多孔滤膜，并用干燥的滤纸吸收多余的PBS缓冲液；用移液器将所述反应后的溶液点在所述膜反应区的中心位置，过滤后，恒温干燥所述多孔滤膜。
在本发明的一些实施方式中，所述反应后的溶液点在所述膜反应区的中心位置的量为3-5μL。
在本发明的一些实施方式中，所述反应后的溶液点在所述膜反应区的中心位置后静置10-20s。
在本发明的一些实施方式中，所述恒温干燥的温度为37℃，时间为120min-160min。
在本发明的一些实施方式中，所述多孔滤膜的孔径为8μm±300nm。
在本发明的一些实施方式中，所述适于免疫反应的条件为：在37℃孵育15-20min。
在本发明的一些实施方式中，所述磁珠与所述目标分子抗体偶联采用EDC/NHS法。
在本发明的一些实施方式中，所述磁珠与所述目标分子抗体偶联后，首先采用封闭液封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团。
根据本发明的技术方案，该多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法用于非疾病诊断和治疗目的。
与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.将免疫磁珠应用在万古霉素等小分子免疫竞争反应中，既能够快速净化样品，简单快速富集样品中的待测物，有效去除样品的基质干扰，又可以充当标记物的作用，节省了反应时间和步骤，可实现准确度高、特异性强的快速检测。
2.将磁酶免疫(MB-ELISA)检测方法与通过微纳加工而成的多孔滤膜结合，使得检测灵敏度更高。
3.操作简便，减少了操作步骤和样品处理的复杂性，可以很方便地捕获反应完成的磁珠，提高了操作的简便性。
4.试剂需求量少，而且采用微纳加工制备方法，可以大幅降低实验成本，减少试剂和样品的消耗，并缩短实验周期，提高了成本效益。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本申请的限制。在附图中：
图1是本发明免疫磁珠制备的反应原理图和流程图；
图2是万古霉素检测常规流程图和本发明实施例检测流程图；
图3是本发明多孔滤膜的局部放大图；
图4为本发明实施例的标准曲线图；
图5为本发明实施例的磁珠在多孔滤膜上的过滤结果图。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。本领域的技术人员将容易识别多个非关键参数，这些参数可以变化或修改，结果基本上相同。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
纳米科技在除传统电子信息行业以外，在诊断早期疾病的检测技术等方面也有新进展和新突破。因人体细胞或DNA、蛋白质分子的大小就在微米或纳米区间，微纳加工技术被越来越广泛地应用到生命科学研究和生物医学工程研究中。比如现代基因测序得益于微纳加工技术，测序分析的速度和通量得到成千上万倍的提高，使得快速和低成本的基因测序成为可能。随着生命科学单细胞或单分子层面的研究越来越多，微纳加工将在最前沿的生命科学研究中发挥不可替代的重要作用。
对血液中一些生化小分子的含量进行监测可以提高临床治疗的有效性，因此对生化小分子浓度的检测具有重要的意义。相关浓度的生物分子或生物标志物相关疾病如癌症、心脏病、炎症和神经疾病可以在许多数量级从μgml-1水平到fgml-1，其中一些可能仍然身份不明，由于缺乏敏感的生物分析工具。此外，最好利用小样本量对宝贵的生物体液，如呼吸浓缩液、眼液、脑脊液或新生儿或小动物模型的血清进行多路检测，这就需要样品稀释，进一步降低浓度。
一些主要检测方法有基于ELISA检测方法、商用免疫测定：如荧光偏振免疫测定法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法。虽然这些方法显示出良好的灵敏度，但对样品前处理要求较高，流程复杂，试剂需求量大，分析时间较长等。相比之下，免疫学方法具有灵敏度高，特异性强，仪器设备要求低和样本前处理相对简单，能定性及微量、超微量定量分析等优点，适于现场监控和大量样本筛选，特别是酶联免疫吸附试验(ELISA)。但是目前的ELISA检测限是10-50ng/mL，仍不能满足临床监测血药浓度的要求。
免疫磁珠(Immunomagnetic Bead，IMB)具有操作简便、分离效率高、较大的比表面积的优点，是纯化、检测和定量分析的通用工具。磁珠是由聚苯乙烯和Fe3O4磁性材料合成的均一、超顺磁性微球。每个微球体均包被一层多聚材料，作为吸附和结合各种分子的载体。免疫磁珠(Immunomagnetic Bead，IMB)是免疫学和磁载体技术相结合而发展起来的一类新型材料，是一种表面包被有特异性配基(抗体及有活性的化学基团)的磁性微球，可与含有相应抗原的靶物质特异性地结合形成新的复合物，具有操作简便、分离效率高、较大的比表面积的优点，是纯化、检测和定量分析的通用工具。通过外加磁场的作用，使磁珠和溶液快速分离，可以在短时间内得到浓缩、纯净的待测样品。
目前，磁酶免疫(MB-ELISA)检测方法是免疫磁珠在免疫检测领域最主要的应用，其采用免疫磁珠配合常规ELISA方法主要用于免疫检测、细胞和微生物的分离和蛋白质、DNA，RNA以及mRNA等生物大分子纯化检测。磁酶免疫的方法对大分子抗原具有良好的检测效果，但是对有关万古霉素等抗生素小分子的检测实例尚未见报道。发明人通过研究发现，用MB-ELISA检测方法检测灵敏度要比一般的竞争ELISA方法高。
此外，作为生物医学科学和临床研究的基石，基于荧光的生物分析方法被广泛应用于广泛的生物分析物的检测、定量和成像。一些方法，如提高抗体亲和力，降低背景荧光，促进底物转移和增加底物表面积，以提高荧光免疫分析的敏感度。然而，荧光标记的弱荧光信号和相关的差信噪比仍然是一个持续的挑战，限制了当前基于荧光的分析的最终灵敏度。
因此，本申请提供一种多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，该检测方法基于多孔滤膜及免疫磁珠分离，通过免疫磁珠与免疫竞争反应，在多孔滤膜辅助下，来检测样本溶液中小分子物质的含量，极大提高了血液中如万古霉素等抗生素的检测灵敏度，解决了目前的检测方案灵敏度低、操作复杂、试剂需求量大等问题。
下面结合附图及实施例对本申请提供的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法进行说明。
实施例1
万古霉素检测
(1)免疫磁珠制备，如图1所示。
S1.采用EDC/NHS交联方法将磁珠上的羧基与万古霉素抗体上的氨基偶联。
S11、首先摇匀磁珠，然后使用移液器移取10mg羧基磁珠到2mL EP管；进一步地，磁珠可以采用20μm粒径磁珠。
S12、磁性分离去除上清液，然后每次用500μL活化缓冲液进行磁性分离洗涤2次，再移除上清液。
S13、继续在EP管中迅速加入新鲜配制的500μL活化剂(EDC溶液，10mg/mL，用冷的活化液现用现配)，放于控温摇床保持混匀状态，转速设置15r/min，25℃活化40min。
S14、磁性分离去除上清液，然后在EP管中加入50μg～100μg万古霉素抗体，之后迅速放入控温摇床，保持混匀状态；需要说明的是，万古霉素抗体用量、浓度及缓冲液类型需要可根据具体实验进行优化。
S15、继续在控温摇床上25℃偶联2h，或者25℃偶联1h后放置4℃静置过夜，偶联期间保持磁珠的悬浮状态。
S2.封闭处理。
S21、完成步骤S15之后，磁性分离去除上清液，然后加入500μL封闭液/PBST溶液(pH 7.2，且含1％ BSA)重悬磁珠，25℃反应1h，封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团，该期间保持磁珠悬浮状态。
S22、继续磁性分离去除上清液，然后用保存缓冲液每次500μL的洗涤3次。
S23、接着用保存液定容到500μL，制得用于进行免疫竞争反应的载体IMB，即免疫磁珠，置于2-8℃保存，禁止冻存。
(2)混合物免疫竞争反应和检测，如图2和图3所示。
S3.免疫竞争反应。
S31、将万古霉素样本溶液与其竞争物溶液混合，混合成450μL的混合物溶液，混合物溶液中竞争物浓度为3-10μg/ml；万古霉素的竞争物本身已经绑定了一个荧光探针，被激光激发可以发荧光。
S32、在混合物溶液中加入50μL步骤S23中的免疫磁珠，37℃孵育反应15-20min，混合物溶液中游离的万古霉素及其竞争物会竞争性地与载体IMB上的结合位点结合，得到反应后的溶液。
S4.检测。
S41、将孔径为8μm的镍制的多孔滤膜平铺于夹具台上，用PBS缓冲液冲洗多孔滤膜，并用干燥的滤纸吸收多余的PBS缓冲液。
进一步地，多孔滤膜的孔的形状为正六边形，孔径8um±200nm，该孔径适合生物分子通过，又可以很稳定的卡住磁珠，且镍制的多孔滤膜在激光照射下其自发荧光最低。
S42、用移液器将3μL步骤S32中的反应后的溶液点在多孔滤膜的膜反应区的中心位置，静置10-20秒后，37℃恒温箱烘干2h自动平铺，如图5所示。
S43、使用荧光显微镜(DM6B，Leica，德国)在多孔滤膜上进行荧光观测，根据荧光亮度数值计算万古霉素样本溶液中万古霉素的浓度；可以理解的是，荧光检测可以提供高灵敏度的光信号检测，在不饱和情况下，荧光亮度数值和浓度值是线性关系，根据此线性关系即可获取不同荧光亮度数值下的浓度值。
磁珠在多孔滤膜上的平铺，可以通过分析软件ImageJ的圆形框框选出每个磁珠，然后采集整个圆形框内荧光轻度平均值，就得到磁珠上的信号，整个工作需要把拍到照片内的所有磁珠一个个框选出来采集取均值，然后所有的磁珠荧光均值再取个均值，减去底噪，得出信号。
需要说明的是，荧光亮度数值和浓度值的线性关系可以使用配置的不同浓度的样本预先制作，如图4所示，标准曲线简要形成步骤：分别配置10uL的16ug/ml、8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml万古霉素竞争物浓度梯度，移液器取1uL滴在载玻片上，其荧光强度用徕卡荧光显微镜观察拍照，图像用ImageJ软件采集荧光强度数值，然后绘制成标准曲线(横坐标为万古霉素竞争物浓度，纵坐标为荧光强度数值)，在实际待测溶液得到荧光亮度值后，将该值代入标曲函数中，即求得该亮度对应的浓度值。
本实施例以生化小分子万古霉素为例，万古霉素(vancomycin)为一种三环糖肽类抗生素，分子量1449.25，是能够透过血脑屏障(blood brain barrier，BBB)的抗菌药物，具有极强的杀菌能力，是目前临床治疗颅内感染的首选药物；但因其治疗窗口窄，个体差异显著，临床上需要监测其血药浓度来调整用药；例如白细胞介素-6(Interleukin-6)，分子量130kd，同样适用于上述检测方法，最低可以检测到1ng/ml的IL-6，灵敏度较好。
在检测过程中，分离磁珠和上清液，常规方法采用磁力架分离，存在EP管里操作繁琐，包括后续清洗和荧光观测也需要多次操作；相比于常规方法采用磁力架分离，本申请通过多孔滤膜分离磁珠和溶液的方法操作更加简便高效，并且后续可以直接在多孔滤膜上进行荧光观测，实验步骤较少，仅需微量的反应后的溶液，即样本溶液需求量小，且极大简化了操作流程，在多孔滤膜辅助下极大提高了目标分子，特别是万古霉素等小分子物质的检测灵敏度，且重复性好、稳定性高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，包括：
提供磁珠、目标分子抗体、多孔滤膜；并且所述磁珠的粒径大于所述多孔滤膜的孔径；
将所述磁珠与所述目标分子抗体偶联，得到免疫磁珠；
将待测溶液与所述免疫磁珠混合，在适于免疫反应的条件下进行孵育，得到反应后的溶液；
用所述多孔滤膜过滤所述反应后的溶液，然后对所述多孔滤膜进行荧光检测，根据检测结果计算待测溶液中目标分子的浓度。
2.根据权利要求1所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，用所述多孔滤膜过滤所述反应后的溶液包括：
将所述多孔滤膜平铺于夹具台上；
用PBS缓冲液冲洗所述多孔滤膜，并用干燥的滤纸吸收多余的PBS缓冲液；
用移液器将所述反应后的溶液点在所述多孔滤膜的膜反应区的中心位置，过滤后，恒温干燥所述多孔滤膜。
3.根据权利要求2所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，所述反应后的溶液点在所述膜反应区的中心位置的量为3-5μL。
4.根据权利要求2或3所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，所述反应后的溶液点在所述膜反应区的中心位置后静置10-20s。
5.根据权利要求2所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，所述恒温干燥的温度为37℃，时间为120min-160min。
6.根据权利要求1-3任一所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，所述多孔滤膜的孔径为8μm±300nm。
7.根据权利要求1所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，所述适于免疫反应的条件为：在37℃孵育15-20min。
8.根据权利要求1所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，所述磁珠与所述目标分子抗体偶联采用EDC/NHS法。
9.根据权利要求1所述的多孔滤膜辅助的磁珠法免疫检测方法，其特征在于，所述磁珠与所述目标分子抗体偶联后，首先采用封闭液封闭磁珠表面未反应的活化羧基基团。
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