WO2019187467A1 - 標的物質検出方法、標的物質検出用キット及び標的物質検出装置 - Google Patents

標的物質検出方法、標的物質検出用キット及び標的物質検出装置 Download PDF

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WO2019187467A1
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oxygen sensor
oxygen
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浩之 細川
友照 阿部
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ソニー株式会社
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    • G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)

Definitions

  • the present invention relates to a target substance detection method, a target substance detection kit, and a target substance detection apparatus.
  • a method using a detection probe has been widely used to detect a target substance (protein, peptide, nucleic acid, small molecule, complex of these). For example, there is a method of selecting a detection probe that is not a detection probe bound to a target substance by using the binding to the bottom surface of the microwell plate.
  • a sandwich ELISA method may be mentioned.
  • two types of antibodies that specifically bind to the target substance are used.
  • One antibody (capture antibody) is bound to the bottom of the microwell plate to capture the target substance.
  • the other antibody (detection antibody) labeled with the enzyme is bound to the target substance bound to the bottom of the microwell plate via the antibody.
  • the sandwich ELISA method it is important to bind to the bottom of the microwell plate and to remove unbound substances.
  • the unbound target substance and enzyme-labeled antibody in the microwell plate are carried over to the next step, and the enzyme-labeled antibody adsorbed nonspecifically on the bottom of the microwell plate becomes the background signal. It is. This requires a lot of cleaning work and is a time consuming and laborious method.
  • the method using proximity probes is a method using a probe set that is devised to generate a labeled signal only when two types of probes are in the vicinity without using the bottom surface of the microwell. Being able to identify whether or not two types of probes are in the vicinity allows the presence of unbonded probes and reduces the number of washing steps. High specificity can be maintained by using antibodies labeled with probes for antibodies corresponding to the supplementary antibody and detection antibody in the sandwich ELISA method.
  • proximity probes examples include Scintillation proximity assay (Mol Immunol 1979), AlphaLISA (PerkinElmer), Proximity Ligation assay (PLA), ⁇ Proximity Extension assay (PEA), FRET using nucleic acids.
  • Scintillation proximity assay (Mol Immunol 1979)
  • AlphaLISA PerkinElmer
  • Proximity Ligation assay PHA
  • PDA Proximity Extension assay
  • FRET FRET using nucleic acids.
  • nucleic acids are used as proximity probes.
  • PKA Proximity Ligation assay
  • PDA Proximity Ligation assay
  • a single-stranded nucleic acid is used as a probe, one probe is fixed at the 5 ′ end, and the other probe is fixed at the 3 ′ end.
  • the bound nucleic acid can be quantified using PCR or the like (Patent Document 3).
  • PDA Proximity Extension Extension
  • the 3 ′ end and 5 ′ end of the non-fixed side have a complementary sequence so that only a combination of probe nucleic acids in the vicinity can be obtained by DNA polymerase. It is extended (Patent Document 4).
  • fluorescent molecules are used as “proximity” probe. Fluorescence resonance energy transfer that occurs when fluorescent molecules are in the vicinity is used (Patent Document 5).
  • the present technology includes the following steps: (A) contacting the biological sample with an oxygen sensor bound with a first molecule that specifically binds to a target substance; (B) contacting the biological sample with a first solid phase support on which a second molecule that specifically binds to the target substance and an oxygen-consuming enzyme is held; and (C) the step (A) ) And (B) provide a target substance detection method including the step of acquiring information emitted from the oxygen sensor.
  • the oxygen sensor may be held on a second solid support.
  • the biological sample preferably contains living cells.
  • the step (D) may further include contacting the living cell with a cell stimulating substance.
  • the steps (A) to (D) can be performed in a well that can capture a single cell.
  • the target substance can be selected from the group consisting of proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids, vitamins and hormones.
  • the oxygen sensor may be selected from the group consisting of metal porphyrin, metal phthalocyanine, metal chlorin, and ruthenium complex.
  • the information emitted from the oxygen sensor is optical information and can be acquired by irradiating excitation light having a wavelength range corresponding to the oxygen sensor.
  • the information emitted from the oxygen sensor can be phosphorescence intensity or fluorescence intensity.
  • the phosphorescence intensity or fluorescence intensity may be acquired over time.
  • an oxidase can be used as the oxygen consuming enzyme.
  • the second solid support is preferably a plate or a particle, and the first solid support is preferably a particle.
  • the first molecule that specifically binds to the target substance and the second molecule that specifically binds to the target substance may be molecules including an antibody, an aptamer, or a molecule recognition polymer.
  • the present technology also includes a first solid phase support on which a second molecule that specifically binds to a target substance and an oxygen-consuming enzyme are retained;
  • a kit for detecting a target substance can be provided that includes a first molecule that specifically binds to the target substance and a second solid phase support on which an oxygen sensor is held.
  • the present technology further includes a microchip mounting portion for mounting a microchip having a well into which a biological sample is placed, A sample flow control unit for controlling the flow of the biological sample, A first contact part for bringing the biological sample into contact with an oxygen sensor bound with a first molecule that specifically binds to a target substance; A second contact part for bringing the biological sample into contact with a second solid phase support on which a second molecule that specifically binds to the target substance and an oxygen-consuming enzyme is held; It is possible to provide a target substance detection device including a light irradiation unit that irradiates light to the well of the microchip and an information acquisition unit that acquires information generated from the oxygen sensor.
  • an assay in the presence of a living cell or the like can be performed without limiting the size of the target substance.
  • the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in the present disclosure.
  • FIG. 6 is a schematic view when phosphorescence is generated by irradiating excitation light to beads on which an oxygen sensor and a first molecule are immobilized. It is the schematic which shows the bead by which the 2nd molecule
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing a single cell chip used in Reference Example 2. It is a figure which shows the result of the reference example 2.
  • Target substance detection method 1-1 Biological sample 1-2. First molecule and second molecule 1-3. Oxygen sensor 1-4. Oxygen consuming enzyme 1-5. Step of detection method 2.
  • biological samples are not particularly limited. For example, a single cell-containing sample, a nucleic acid-containing sample, a cell secretion-containing sample, a cell extract, and a cell in which cells are united and suspended in a buffer or the like. Examples thereof include body fluids such as culture fluid, urine, blood and plasma, serum, spinal fluid, and lymph fluid.
  • First molecule and second molecule are molecules that specifically react with a target substance contained in a biological sample. Specific examples include antibodies, aptamers, nucleic acids, molecular recognition polymers and the like.
  • an antibody produced using a mouse, rabbit or the like as a target substance as an antigen can be used.
  • examples include antibodies to CD antigens that appear on the cell surface upon differentiation, antibodies to various cancer-specific antigens, antibodies to major histocompatibility antigens, antibodies to sugar chains, antibodies to various cell secretions, antibodies to various proteins and peptides, and the like.
  • Aptamers are nucleic acid molecules and peptides that specifically bind to target substances.
  • a DNA aptamer, an RNA aptamer, a peptide aptamer, a modified aptamer whose specificity has been improved by introducing a modification into a nucleic acid skeleton or a base, and the like can be mentioned.
  • the molecular recognition polymer captures the target cell surface molecule with high selectivity even in the presence of a compound having physicochemical properties similar to the target substance. Also called molecular imprinted polymer, it has a selectively synthesized compound recognition region.
  • the first molecule and the second molecule specifically bind to the same target substance, but the target substance site recognized by the first molecule and the target substance site recognized by the second molecule Are preferably different.
  • the target substance of the first molecule and the second molecule is not particularly limited, and examples thereof include biologically derived molecules such as proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids, vitamins, and hormones.
  • Oxygen sensor The oxygen sensor can be selected from the group consisting of metal porphyrin, metal phthalocyanine, metal chlorin and ruthenium complex.
  • the metal of the metal porphyrin complex examples include platinum, magnesium, zinc, cadmium, palladium, iron, copper, cobalt, manganese, vanadium, nickel, rhodium, iridium and the like.
  • the metal introduced into the porphyrin is not particularly limited, but, for example, platinum can be preferably used.
  • platinum porphyrin complex examples include platinum octaethylporphyrin (PtOEP), platinum octaethylporphyrin ketone (PtOEPK), platinum tetrakis (pentafluorophenyl) porphyrin (PtTFPP), platinum tetra (N-methyl-4-pyridyl) porphyrin (PtTMP), Examples thereof include platinum tetraphenylporphyrin (PtTPP), platinum tertiary butylphenylporphyrin (PtTDBPP), platinum tetradichlorophenylporphyrin (PtTDCPP), and platinum tetradibromophenylporphyrin (PtTBCPP).
  • the platinum porphyrin complex is not particularly limited.
  • platinum octaethylporphyrin (PtOEP) can be preferably used.
  • Platinum octaethylporphyrin emits phosphorescence when excited by UV light or a 405 nm laser. It is known that the phosphorescence lifetime and intensity vary depending on the oxygen concentration. When the oxygen concentration is low, the phosphorescence lifetime is extended and the intensity is increased (FIG. 1).
  • platinum tetraphenylporphyrin (PtTPP) and ruthenium complex are also oxygen-sensitive fluorescent materials.
  • PtTPP platinum tetraphenylporphyrin
  • ruthenium complex is also oxygen-sensitive fluorescent materials.
  • the oxygen-sensitive material is excited by irradiating light of 480 nm and transitions from the excited state to the ground state, for example, Fluorescence is emitted at a wavelength of 610 nm. When oxygen is present, the fluorescence is quenched according to the oxygen concentration.
  • Oxygen consuming enzyme is specifically an enzyme called oxidase, and examples thereof include polyphenol oxidase, glucose oxidase, lactate oxidase, alcohol oxidase, sulfite oxidase, urease, and peroxidase.
  • oxidase an enzyme called oxidase, and examples thereof include polyphenol oxidase, glucose oxidase, lactate oxidase, alcohol oxidase, sulfite oxidase, urease, and peroxidase.
  • the type of oxidase is not particularly limited, but those that do not affect the target substance or biological sample, such as denaturation, are preferred.
  • the present technology includes the following steps: (A) contacting the biological sample with an oxygen sensor bound with a first molecule that specifically binds to a target substance; (B) contacting the biological sample with a first solid phase support on which a second molecule that specifically binds to the target substance and an oxygen-consuming enzyme is held; and (C) the step (A) ) And (B), including the step of acquiring information emitted from the oxygen sensor, preferably the step (D): contacting the living cells with a cell stimulating substance.
  • the step (A) and the step (B) may be performed in any order, or the step (A) and the step (B) may be performed simultaneously, regardless of the order.
  • an oxygen sensor to which the first molecule is bonded is used.
  • a bead or plate on which an oxygen sensor to which a first molecule is bound is immobilized is referred to as a “second solid phase support”.
  • FIG. 2 shows a bead 22 (second solid support) on which the oxygen sensor 21 is coated and the first molecule 1 is immobilized.
  • the target substance in the biological sample is specifically bound to the first molecule by bringing the oxygen sensor to which the first molecule is bound into contact with the biological sample.
  • the incubation may be appropriately performed and may be performed with stirring. Incubation temperature, time, etc. can vary depending on the target cell and the first molecule.
  • the oxygen sensor 21 when the oxygen sensor 21 is coated and the beads 22 on which the first molecules 1 are immobilized are irradiated with excitation light, the oxygen sensor 21 emits phosphorescence. Depending on the oxygen concentration of the oxygen sensor, the phosphorescence intensity increases at low concentrations (FIG. 1).
  • the first solid support on which the second molecule and the oxygen consuming enzyme are held is used.
  • beads or plates on which the second molecule and the oxygen-consuming enzyme are immobilized are referred to as “first solid support”.
  • FIG. 4 shows a bead 11 (first solid support) on which the second molecule 2 and the oxygen consuming enzyme 12 are held.
  • the target substance specifically bound by the oxygen sensor to which the first molecule is bound in the step (A) specifically binds to the second solid support on which the second molecule and the oxygen consuming enzyme are immobilized. . That is, a sandwich of target substances is formed by the first molecule and the second molecule.
  • the incubation may be performed with stirring. Incubation temperature, time, etc. can vary depending on the target cell and the first molecule.
  • FIG. 5 shows the action of the bead 11 on which the second molecule 2 and the oxygen consuming enzyme 12 are immobilized. Since many glucose oxidases, which are an example of the oxygen consuming enzyme 12, are immobilized on the beads 11, a low oxygen state is created around the beads 11.
  • step (C) a step of acquiring information emitted from the oxygen sensor in steps (A) and (B) is performed.
  • the information emitted from the oxygen sensor is optical information, and is acquired by irradiating light having a wavelength corresponding to the oxygen sensor. Specifically, for example, phosphorescence and fluorescence, and their intensities.
  • the information may be acquired with a phosphorescence / fluorescence measuring device or may be acquired with an image, and is not particularly limited.
  • the bead 22 on which the oxygen sensor 21 is coated and the first molecule 1 is immobilized does not react with the target substance 31, the phosphorescence intensity is weak even when irradiated with excitation light. .
  • the bead 22 on which the oxygen sensor 21 is coated and the first molecule 1 is immobilized reacts with the target substance 31, and the second molecule 2 and the oxygen consuming enzyme 12
  • the oxygen sensor 21 is located in the vicinity of the bead 11 holding the second molecule 2 and the oxygen consuming enzyme 12. Is present, and beads 22 having the first molecule 1 immobilized thereon are present. Since the oxygen concentration around the bead 11 is lowered by the oxygen consuming enzyme 12, it emits stronger phosphorescence than the bead on the right side of FIG.
  • the biological sample when the biological sample is a living cell, you may further include making the living cell of a process (D) contact a cell stimulating substance.
  • the cell stimulating substance include sugars, amino acids, fats, acids / alkalis (pH adjusting agents), and differ depending on the type of cells, the type of secretions, and the like.
  • the contact of the cell stimulating substance may be either step (A) or step (B), or between steps.
  • Steps (A) to (D) can be performed in the same container, and the assay can be performed without performing a washing operation.
  • the living body-derived sample is a living cell and is a single cell
  • the amount of secretion from the single cell and the like can be measured by performing in a well that can capture the single cell.
  • the secretory product production ability etc. of a single cell can be measured by measuring with time.
  • the oxygen concentration of the entire solution is in equilibrium with the oxygen concentration in the atmosphere, and the low oxygen state exists only in a very limited region around the fine particles. Since oxygen necessary for cell growth is always present, it is considered that there is little effect on the cells.
  • Target substance detection kit In the target substance detection kit, the second molecule that specifically binds to the target substance and the first solid phase support on which the oxygen-consuming enzyme is held, and the first molecule that specifically binds to the target substance And a second solid support on which an oxygen sensor is held.
  • a cell stimulating substance-containing reagent a biological sample preparation buffer, a disposable container for storing a biological sample, and the like may be included.
  • the first solid phase support holds a second molecule that specifically binds to a target substance and an oxygen-consuming enzyme.
  • the first solid support is not particularly limited, but is preferably a bead or a microbead.
  • the second molecule is an antibody and the oxygen consuming enzyme is glucose oxidase
  • a first solid phase support (bead, plate, etc.) on which the antibody and glucose oxidase are immobilized is prepared in advance.
  • the antibody and glucose oxidase may be directly immobilized on beads or plates, or the beads or plates may be coated with glucose oxidase in advance, and the antibodies may be immobilized thereon. Or vice versa.
  • the bead portion on which the antibody and glucose oxidase are not immobilized is coated with a protein, peptide, or the like using conventional techniques so that a nonspecific reaction with a biological sample or a target substance does not occur.
  • Second solid phase support holds an oxygen sensor to which a first molecule that specifically binds to a target substance is bound.
  • the second solid support is not particularly limited, but is preferably a plate, a bead, or a microbead.
  • a second solid support such as a bead or plate may be first coated with an oxygen sensor to immobilize the first molecule.
  • the plate portion or bead portion on which the antibody and PtOEP are not immobilized is coated with a protein, peptide, or the like using conventional techniques so that a nonspecific reaction with a biological sample or a target substance does not occur.
  • Target substance detection device As shown in FIG. A microchip mounting portion 41 for mounting a microchip having a well into which a biological sample is placed; A sample flow controller 45 for controlling the flow of the biological sample, A first contact portion 43 for contacting the biological sample with an oxygen sensor to which a first molecule that specifically binds to a target substance is bound; A second contact part 44 for bringing the biological sample into contact with a second solid phase support on which a second molecule that specifically binds to the target substance and an oxygen-consuming enzyme is held; A light irradiation unit 46 for irradiating light to the well of the microchip, and an information acquisition unit 48 for acquiring information generated from the oxygen sensor including.
  • the microchip 42 having a well into which a biological sample is placed may be disposable or used for repeated measurement. If a single cell is measured over time with a single device, it is possible to follow changes in the amount of cell product secreted. Therefore, the production capacity of the cells can be analyzed based on the data of the change over time in the secretion amount from the cells.
  • the cell may be a single cell or a cell mass in which a plurality of cells are collected. In the case of a single cell, production capacity can be analyzed for individual cells, so that the results of the analysis, for example, select cells with high production capacity, and further identification, analysis, proliferation, efficient production of cell products and The extraction or the like can be performed.
  • the sample flow control unit 41 that controls the flow of the biological sample can flow a buffer, a biological sample, or the like from an external channel, for example, and can generate a force to be drawn in or a force to be drawn in by a valve, a liquid feeding device, or the like.
  • the single cell which is a biological sample may be put into the well of the single cell chip, or the cell flow control unit 41 can be made common and the cell stimulant reagent or the like can be put into the well.
  • the sample flow control unit 41 may be controlled by a program installed in a computer.
  • the first contact portion 43 for bringing the biological sample into contact with the oxygen sensor to which the first molecule that specifically binds to the target substance is bonded is, for example, a bead that holds the first molecule and the oxygen sensor, and the contact itself. Is performed in the well of the microchip. Alternatively, the first molecule and the oxygen sensor may be immobilized on the well of the microchip.
  • the second contact portion 44 that contacts the second solid phase support on which the second molecule that specifically binds to the target substance and the oxygen consuming enzyme is held for example, holds the second molecule and the oxygen consuming enzyme. The contact itself is performed in the well of the microchip 42.
  • the light irradiation unit 47 that irradiates light to the well of the microchip 42 can change the wavelength of the excitation light to be irradiated depending on the oxygen sensor used.
  • the light irradiation unit 47 may irradiate the entire microchip, or may irradiate only a well containing cells, for example. Moreover, it is possible to irradiate not only once but continuously with time.
  • the irradiation pattern may be controlled by providing a light irradiation control unit 47.
  • a commercially available plate reader, phosphorescence / fluorescence measurement device, image acquisition device, or the like can be used as the information acquisition unit that acquires information generated from the oxygen sensor.
  • the information acquisition unit can also contact the analysis unit and analyze the information obtained by the information acquisition unit.
  • the analysis unit can calculate the secretory production ability of a single cell based on the obtained data, for example.
  • the data and analysis results obtained here may be further accumulated in a storage unit installed.
  • Embodiment 1 [Amount of interleukin-2 secreted by Jurkat cells using SBS standard microplate] (1) Jurkat cells are seeded in a 96-well microplate in an amount of 4 ⁇ 10 5 cells / mL ⁇ 50 ⁇ L / 1 well. (2) Add 8 ⁇ g / mL Phytohemagglutinin (PHA) or 50 ⁇ L / well of a medium (negative control). (3) Culture at 37 ° C. under 5% CO 2 for one day.
  • PHA Phytohemagglutinin
  • a culture solution in which the concentration of purified interleukin-2 (IL-2) is changed and dissolved is prepared, and a calibration curve is prepared.
  • IL-2 purified interleukin-2
  • a calibration curve is prepared.
  • (4) Add microparticles containing an oxygen sensor holding an anti-IL-2 antibody to the cell culture medium.
  • (5) Incubate for 30 minutes with good mixing.
  • Microparticles containing an oxygen-consuming enzyme holding an anti-IL-2 antibody that recognizes a site different from the above (4) are added to the cell culture medium.
  • Embodiment 2 [Quantification of IL-2 secreted by Jurkat cells using SBS standard microplate (short version)] (1) Jurkat cells are seeded in a 96-well microplate in an amount of 4 ⁇ 10 5 cells / mL ⁇ 50 ⁇ L / 1 well. (2) Add 8 ⁇ g / mL Phytohemagglutinin (PHA) or 50 ⁇ L / well of a medium (negative control). (3) Culture at 37 ° C. under 5% CO 2 for one day. As a standard sample, prepared is a culture solution in which the concentration of purified IL-2 is changed and dissolved, and a calibration curve is prepared.
  • PHA Phytohemagglutinin
  • Fine particles containing an oxygen sensor holding an anti-IL-2 antibody and fine particles containing an oxygen consuming enzyme holding an anti-IL-2 antibody that recognizes another site are added to the cell culture solution. (5) Incubate for 30 minutes with good mixing. (6) Measure phosphorescence intensity with a plate reader.
  • Embodiment 3 [Quantification of IL-2 secreted by Jurkat cells using a PDMS chip with a single cell well]
  • Jurkat cells are seeded on a PDMS chip having a single cell well.
  • (2) Incubate for 10 minutes.
  • PHA Phytohemagglutinin
  • Add microparticles containing retained oxygen consuming enzyme With this solution, excess cells are washed away and Jurkat cells are stimulated.
  • (4) Incubate under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the phosphorescence intensity for each well is measured every hour.
  • prepared is a culture solution in which the concentration of purified IL-2 is changed and dissolved, and a calibration curve is prepared.
  • FIG. 8 shows a schematic diagram of an example in which a protein secreted from a single cell is measured by the present technology using a single cell chip.
  • a single cell enters each well of a single-cell chip.
  • a second molecule that specifically binds to a specific site of the bead and a bead holding an oxygen consuming enzyme are introduced into the well.
  • the beads exist separately. Further, even if there is a single cell in the well, the beads exist separately even when the secreted protein is not secreted.
  • the bead and secreted protein form a sandwich and the oxygen surrounding the bead that holds the oxygen-consuming enzyme is hypoxic. Is produced.
  • a sandwich is formed, and when the oxygen sensor is irradiated with excitation light, strong phosphorescence is generated according to the large amount of protein. This can be acquired as image data.
  • Reference example 1 In Reference Example 1, an anti-IL-2 antibody is immobilized on the bottom of the well, a single cell is introduced into the well, and IL-2 secreted from the single cell is sandwiched with a streptavidin-labeled anti-IL-2 antibody. The detection system was performed (FIG. 9).
  • FIG. 11 shows a single cell chip having a well that is greatly opened downwardly sandwiched between a lower layer inlet and an upper layer outlet, and the single cell is attracted to the lower layer by a suction force through a through hole from the upper layer outlet.
  • tip caught from the flow of an inlet is shown.
  • the biotin-streptavidin sandwich detection system which is a conventional detection method, can detect IL-2 secreted by Jurkat cells using the single cell chip of this reference example.
  • the possibility was suggested. Therefore, the possibility of a detection system using the oxygen sensor and oxygen consuming enzyme of the present technology was also shown in the single cell chip of this reference example.
  • this technique can also take the following structures; [1] The following steps: (A) contacting the biological sample with an oxygen sensor bound with a first molecule that specifically binds to a target substance; (B) contacting the biological sample with a first solid phase support on which a second molecule that specifically binds to the target substance and an oxygen-consuming enzyme is held; and (C) the step (A) ) And (B), the target substance detection method including the process of acquiring the information emitted from the said oxygen sensor. [2] The target substance detection method according to [1], wherein in the step (A), the oxygen sensor is held on a second solid phase support. [3] The target substance detection method according to [1] or [2], wherein the biological sample includes live cells.
  • the target substance is selected from the group consisting of proteins, peptides, nucleic acids, carbohydrates, lipids, vitamins, and hormones.
  • the oxygen sensor is selected from the group consisting of metal porphyrin, metal phthalocyanine, metal chlorin, and ruthenium complex.
  • the information emitted from the oxygen sensor is optical information, and is obtained by irradiating excitation light having a wavelength range corresponding to the oxygen sensor, according to any one of [1] to [7] Target substance detection method.
  • the target substance detection method according to any one of [1] to [8], wherein the information emitted from the oxygen sensor is phosphorescence intensity or fluorescence intensity.
  • the target substance detection method according to [9], wherein the phosphorescence intensity or fluorescence intensity is acquired over time.
  • a target substance detection kit comprising: a first molecule that specifically binds to the target substance; and a second solid phase support on which an oxygen sensor is held.
  • a microchip mounting portion for mounting a microchip having a well into which a biological sample is placed, A sample flow control unit for controlling the flow of the biological sample, A first contact part for bringing the biological sample into contact with an oxygen sensor bound with a first molecule that specifically binds to a target substance; A second contact part for bringing the biological sample into contact with a second solid phase support on which a second molecule that specifically binds to the target substance and an oxygen-consuming enzyme is held;
  • a target substance detection device comprising: a light irradiation unit that irradiates light to a well of the microchip; and an information acquisition unit that acquires information generated from the oxygen sensor.

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Abstract

反応性が低い分子種を介した相互作用を用い、２種の微小粒子をproximity probes とし標的物質を検出する方法を提供すること。 （Ａ）生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる工程、 （Ｂ）前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体に接触させる工程、及び （Ｃ）前記工程（Ａ）及び（Ｂ）により、前記酸素センサから発せられる情報を取得する工程 を含む、標的物質検出方法である。

Description

標的物質検出方法、標的物質検出用キット及び標的物質検出装置
　本発明は、標的物質検出方法、標的物質検出用キット及び標的物質検出装置に関する。
　従来から、標的物質（タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、これらの複合体当）を検出するために検出プローブを利用する方法が広く使用されている。例えば、標的物質に結合している検出プローブとしていない検出プローブを、マイクロウェルプレート底面への結合を利用して選別する方法が挙げられる。
　一般的に用いられている方法としては、例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が挙げられる。サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、いずれも標的物質に特異的に結合する２種の抗体を用いる。片方の抗体（捕捉用抗体）をマイクロウェルプレート底面に結合させ、標的物質を捕捉する。その後、酵素によって標識したもう片方の抗体（検出用抗体）を、マイクロウェルプレート底面に抗体を介して結合している標的物質に結合させる。マイクロウェルプレート底面に結合している酵素量を活性測定することで、生体由来サンプル溶液中に含まれる標的物質の量を測定できる。また、２種類の抗体を用いて検出することで、特異性が高い検出方法となっている。
　前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、マイクロウェルプレート底面へ結合させること、及び結合していない物質の除去が重要である。各実験ステップにおいて、マイクロウェルプレート内の結合していない標的物質及び酵素標識抗体の次ステップへの持越しや、非特異的にマイクロウェルプレート底面に吸着した酵素標識抗体が、バックグラウンドシグナルとなるためである。非常に多くの洗浄作業を必要とすることから、時間と手間がかかる方法となっている。
　この問題を解決するために、いくつかのproximity probes（近接プローブ）を用いた、洗浄工程の不要な検出方法が開発されている。前記サンドイッチＥＬＩＳＡ法では、底面に結合した酵素標識抗体を測定することで、底面に結合させた抗体と酵素標識抗体の２種の抗体が近傍にあることを検出しているとも言える。
　proximity probesを使用した方法とは、マイクロウウェル底面を利用せずに、２種のプローブが近傍にある時にのみ、標識シグナルが発生する工夫をしたプローブセットを用いる方法である。２種のプローブが近傍にあるか否かを識別できることで、結合していないプローブが存在していることを許容し、洗浄工程を減らすことが可能となっている。サンドイッチＥＬＩＳＡ法における補足用抗体、検出用抗体に相当する抗体にそれぞれプローブ標識した抗体を利用することで特異性の高さを維持することができる。
　前記proximity probesを用いた検出方法としては、例えば、Scintillation proximity assay（Mol Immunol 1979）、AlphaLISA（PerkinElmer社）、核酸を用いたProximity Ligation assay (PLA), Proximity Extension assay (PEA) 、FRETを利用したアッセイ（Cytometry 1998）が挙げられる。
　Scintillation proximity assayでは、 proximity probes として、放射性原子と、放射性原子の放出電子によって蛍光を発するシンチレーターを含むビーズを利用する。放出電子が水中を進む距離が限られているため、放射性原子と蛍光を発するシンチレーターを含むビーズが近傍にある場合に高い蛍光を発する（特許文献１）。
　AlphaScreen/AlphaLISA（PerkinElmer社）では、proximity probes として、光反応によって一重項酸素を生じるビーズと、一重項酸素によって蛍光を発するビーズを利用する。一重項酸素の半減期が４マイクロ秒程度であり、２種のビーズが近傍にある場合のみ、一重項酸素を介したエネルギー移動が起こり蛍光を発する（特許文献２）。
　Proximity Ligation assay (PLA), Proximity Extension assay (PEA)では、proximity probes として、核酸を利用する。 
　Proximity Ligation assay (PLA)　では、一本鎖核酸をプローブとして、一方のプローブは５’末端側、もう一方のプローブは３’末端側を固定する。固定していない側の、３’末端側と５’末端側を連結する形でハイブリダイゼーションする核酸を加えることで、近傍に存在するプローブ核酸の組み合わせのみ結合させる。ライゲーション反応後、ＰＣＲなどを利用して、結合した核酸を定量することができる（特許文献３）。
 　Proximity Extension assay (PEA)では、固定していない側の、３’末端側と５’末端側の一部を相補的な配列を持たせることで、近傍に存在するプローブ核酸の組み合わせのみＤＮＡポリメラーゼによって伸長される（特許文献４）。
　FRETを利用したアッセイでは、 proximity probes として、蛍光分子を使用する。蛍光分子が近傍にある場合に起こる蛍光共鳴エネルギー移動を利用する（特許文献５）。
米国特許第４，５６８，６４９号 米国特許第９，３９３，３０６号 米国公開公報２００８／０２９３０５１号 米国特許第７，３０６，９０４号 米国特許第７，６１５，６２０号
　これらの方法により、高い特異性を保ったまま、洗浄工程の煩雑さを減らすことができているが、いずれの方法も生体由来サンプル溶液中に含まれる標的物質の検出だけを目的にしており、生体由来サンプル、特に、生細胞がある場合の影響などには着目していない。
　前記Scintillation proximity assayでは、放射性同位体を利用するため、細胞や遺伝子を変化させることがある。同様の理由で実験環境も限られてしまう。
　前記AlphaScreen/AlphaLISA（PerkinElmer社）では、一重項酸素を介したエネルギー移動を利用するが、一重項酸素は非常に反応性が高い。生細胞存在下で利用した場合に生細胞への影響が出る場合があると考えられる。
　前記Proximity Ligation assay (PLA)、Proximity Extension assay (PEA)では、検出方法としてPCRを使用するため、生細胞への影響が出るであろう高温を使用する。FRETを利用したアッセイでは、生細胞への影響は小さいと考えられるが、シグナルが弱く、proximity probesとして使用できる距離が１０ｎｍ以下と非常に短いことが、検出物質サイズを制限してしまう。
　そこで、本技術では、反応性が低い分子種を介した相互作用を用い、２種の粒子をproximity probes とし標的物質を検出する方法を開発した。
すなわち、本技術は、以下の工程：
（Ａ）生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる工程、
（Ｂ）前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体に接触させる工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）及び（Ｂ）により、前記酸素センサから発せられる情報を取得する工程
を含む、標的物質検出方法を提供する。
　前記工程（Ａ）において、前記酸素センサは第二の固相支持体に保持してもよい。
　また、前記生体由来試料は生細胞を含むことが好ましい。
　また、工程（Ｄ）：前記生細胞を細胞刺激物質に接触させることを更に含むことができる。
　前記工程（Ａ）から（Ｄ）は、単一細胞を捕捉可能であるウェル内で行うことができる。
　前記標的物質は、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ビタミン及びホルモンからなる群から選択され得る。
　前記酸素センサは、金属ポリフィリン、金属フタロシアニン、金属クロリン及びルテニウム錯体からなる群から選択され得る。
　また、前記酸素センサから発せられる情報は、光情報であり、前記酸素センサに応じた波長範囲を有する励起光を照射することにより取得できる。
　前記酸素センサから発せられる情報は燐光強度又は蛍光強度であり得る。前記燐光強度又は蛍光強度は経時的に取得してもよい。
　また、前記酸素消費酵素はオキシダーゼを用いることができる。
　また、前記第二の固相支持体はプレート又は粒子であり、前記第一の固相支持体は粒子であることが好ましい。
　更に、前記標的物質と特異的に結合する第一の分子及び前記標的物質と特異的に結合する第二の分子は、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子であり得る。
　本技術はまた、標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体と、
　前記標的物質と特異的に結合する第一の分子及び酸素センサが保持された第二の固相支持体と
を含む標的物質検出用キットを提供することができる。
　本技術は更に、生体由来試料を入れるウェルを有するマイクロチップを装着するマイクロチップ装着部、
　前記生体由来試料の流れを制御する試料流制御部、
　前記生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる第一接触部、
　前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第二の固相支持体に接触させる第二接触部、
　前記マイクロチップのウェルに光を照射する光照射部、及び
　前記酸素センサから発生する情報を取得する情報取得部
を含む、標的物質検出装置を提供することができる。
　反応性が低い分子種を介した相互作用を用いることで、標的物質のサイズの制限無く、生細胞などの存在下でのアッセイを可能にする。
　なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
酸素濃度と酸素センサの燐光強度の関係を示したグラフである。 酸素センサが被覆され第一の分子が固定化されたビーズを示す概略図である。 酸素センサと第一の分子が固定化されたビーズに励起光を照射して燐光が生じたときの概略図である。 第二の分子と酸素消費酵素とが固定化されたビーズを示す概略図である。 第二の分子と酸素消費酵素とが固定化されたビーズの作用を示す概略図である。 本技術の標的物質の検出を示す概略図である。 標的物質検出装置の概略を示す模式図である。 単一細胞用チップを用いて単一細胞から分泌されたタンパク質を本技術により測定する例の模式図である。 参考例１の検出系を示す模式図である。 参考例１の結果を示す図面代用写真である。 参考例２で用いた単一細胞用チップを示すの模式図である。 参考例２の結果を示す図である。
　以下、本技術を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．標的物質検出方法
　１－１．生体由来試料
　１－２．第一の分子及び第二の分子
　１－３．酸素センサ
　１－４．酸素消費酵素
　１－５．検出方法の工程
２．標的物質検出用キット
　２－１．第一の固相支持体
　２－２．第二の固相支持体
３．標的物質検出装置
４．実施態様
　４－１．実施態様１
　４－２．実施態様２
　４－３．実施態様３
　４－４．実施態様４
　４－５．実施態様５
５．参考例
　５－１．参考例１
　５－２．参考例２
＜１．標的物質検出方法＞
１－１．生体由来試料
　本技術において生体由来試料は特に限定されないが、例えば、細胞を単一にしてバッファー等に懸濁した単一細胞含有試料、核酸含有試料、細胞分泌物含有試料、細胞抽出液、細胞培養液、尿、血液や血漿、血清、髄液、リンパ液等の体液が挙げられる。
１－２．第一の分子及び第二の分子
　第一の分子及び第二の分子は、生体由来試料中に含まれる標的物質と特異的に反応する分子である。
　具体的には、抗体、アプタマー、核酸、分子認識ポリマー等が挙げられる。
　抗体は、標的物質を抗原としてマウスやウサギ等を用いて作製したものが使用できる。例えば、分化すると細胞表面に現れるCD抗原に対する抗体、各種ガン特異的抗原に対する抗体、主要組織適合抗原に対する抗体、糖鎖に対する抗体、各種細胞分泌物に対する抗体、各種タンパク質やペプチドに対する抗体等が挙げられる。
　アプタマーは、標的物質と特異的に結合する核酸分子やペプチドである。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、ペプチドアプタマー、核酸骨格や塩基に修飾を導入して特異性を向上させた修飾アプタマー等が挙げられる。
　分子認識ポリマーは、標的物質に似た物理化学特性を持つ化合物の存在下でも、高い選択性で目的の細胞表面分子を捕捉する。モレキュラーインプリントポリマーとも呼ばれ、選択的に合成された化合物認識領域を有する。
　なお、第一の分子と第二の分子とは、同じ標的物質に特異的に結合するが、第一の分子が認識する標的物質の部位と、第二の分子が認識する標的物質の部位とは、異なることが好ましい。
　なお、第一の分子と第二の分子の標的物質は特に限定されないが、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ビタミン、ホルモン等の生体由来の分子が挙げられる。
１－３．酸素センサ
　酸素センサとしては、金属ポリフィリン、金属フタロシアニン、金属クロリン及びルテニウム錯体からなる群から選択できる。
　金属ポルフィリン錯体の金属としては、例えば、白金、マグネシウム，亜鉛、カドミウム，パラジウム、鉄、銅、コバルト、マンガン、バナジウム、ニッケル、ロジウム、イリジウム等が挙げられる。本技術において、ポルフィリンに導入される金属は特に限定されないが、例えば白金を好ましく用いることができる。
　白金ポルフィリン錯体としては、白金オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）、白金オクタエチルポルフィリンケトン（ＰｔＯＥＰＫ）、白金テトラキス（ペンタフルオロフェニル）ポルフィリン（ＰｔＴＦＰＰ）、白金テトラ（Ｎメチル―４―ピリジル）ポルフィリン（ＰｔＴＭＰ）、白金テトラフェニルポルフィリン（ＰｔＴＰＰ）、白金ターシャルブチルフェニルポルフィリン（ＰｔＴＤＢＰＰ）、白金テトラジクロロフェニルポルフィリン（ＰｔＴＤＣＰＰ）、白金テトラジブロモフェニルポルフィリン（ＰｔＴＢＣＰＰ）等が挙げられる。本技術において、白金ポルフィリン錯体は特に限定されないが、例えば白金オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）を好ましく用いることができる。
　白金オクタエチルポルフィリン（ＰｔＯＥＰ）は、ＵＶ光や４０５ｎｍレーザーによって励起することで、燐光を発する。燐光寿命や強度は酸素濃度依存的に変化することが知られており、酸素濃度が低い場合に燐光寿命が延びるとともに強度も増加する（図１）。
　また、例えば、白金テトラフェニルポルフィリン（ＰｔＴＰＰ）やルテニウム錯体も酸素感受性蛍光物質であるので、例えば４８０ｎｍの光を照射して酸素感受性物質を励起させ、励起状態から基底状態に遷移する際に、例えば波長６１０ｎｍの蛍光を発するが、蛍光は酸素が存在するとその酸素の濃度に応じて消光される。
１－４．酸素消費酵素
　酸素消費酵素は、具体的にはオキシダーゼと呼ばれる酵素で、ポリフェノールオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラクタートオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、スルフィットオキシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ等が挙げられる。本技術において、オキシダーゼの種類は特に限定されないが、標的物質や生体由来試料に変性等の影響を与えないものが好ましい。
１－５．検出方法の工程
　本技術は、以下の工程：
（Ａ）生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる工程、
（Ｂ）前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体に接触させる工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）及び（Ｂ）により、前記酸素センサから発せられる情報を取得する工程
を含み、好ましくは工程（Ｄ）：前記生細胞を細胞刺激物質に接触させることを含めることができる。
　なお、工程（Ａ）と工程（Ｂ）は、その順番を問わず、工程（Ｂ）が先であってもよいし、工程（Ａ）と工程（Ｂ）を同時に行ってもよい。
　工程（Ａ）では、第一の分子が結合した酸素センサを用いる。本技術では、第一の分子が結合した酸素センサが固定化されるビーズやプレートを「第二の固相支持体」とよぶ。
　図２に、酸素センサ２１が被覆され第一の分子１が固定化されたビーズ２２（第二の固相支持体）を示す。
　第一の分子が結合した酸素センサと生体由来試料を接触させることにより、生体由来試料中の標的物質が第一の分子に特異的に結合する。このとき、インキュベーションを適宜行い、撹拌しながら行ってもよい。インキュベーション温度、時間等は、標的細胞と第一の分子に応じて変えることができる。
　なお、図３に示すように、酸素センサ２１が被覆され第一の分子１が固定化されたビーズ２２に励起光を照射すると、酸素センサ２１により燐光が発せられる。酸素センサは酸素濃度に依存して、低濃度になると燐光強度が上昇する（図１）。
　工程（Ｂ）では、第二の分子と酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体を用いる。　本技術では、第二の分子と酸素消費酵素が固定化されるビーズやプレートを「第一の固相支持体」とよぶ。
　図４に、第二の分子２と酸素消費酵素１２とが保持されたビーズ１１（第一の固相支持体）を示す。
　工程（Ａ）において第一の分子が結合した酸素センサが特異的に結合した標的物質が、第二の分子と酸素消費酵素が固定化された第二の固相支持体と特異的に結合する。すなわち、第一の分子と第二の分子とで、標的物質のサンドイッチが形成される。このとき、インキュベーションを撹拌しながら行ってもよい。インキュベーション温度、時間等は、標的細胞と第一の分子に応じて変えることができる。
　また、図５に、第二の分子２と酸素消費酵素１２とが固定化されたビーズ１１の作用を示す。ビーズ１１には酸素消費酵素１２の一例であるグルコースオキシダーゼが多く固定化されているため、ビーズ１１の周辺に低酸素状態が作り出される。
　工程（Ｃ）では、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）により前記酸素センサから発せられる情報を取得する工程を行う。酸素センサから発せられる情報は光情報であり、前記酸素センサに応じた波長の光を照射することにより取得される。具体的には、例えば燐光、蛍光であり、それらの強度である。情報は、燐光／蛍光測定装置で取得してもよいし、画像で取得してもよく、特に限定されない。
　図６の右側に示すように、酸素センサ２１が被覆され第一の分子１が固定化されたビーズ２２が標的物質３１と反応していないときは、励起光を照射しても燐光強度は弱い。
　しかし、図６の左側に示すように、酸素センサ２１が被覆され第一の分子１が固定化されたビーズ２２と標的物質３１とが反応し、かつ第二の分子２と酸素消費酵素１２とが保持されたビーズ１１と標的物質３１とが反応し、標的物質３１のサンドイッチが形成されたときは、第二の分子２と酸素消費酵素１２とが保持されたビーズ１１の近傍、酸素センサ２１が被覆され第一の分子１が固定化されたビーズ２２が存在することになる。ビーズ１１の周囲は、酸素濃度が酸素消費酵素１２により低くなっているので励起光を照射すると図６の右側のビーズよりも強い燐光を発する。
　また、本技術においては、生体由来試料が生細胞のときは工程（Ｄ）の生細胞を細胞刺激物質に接触させることを更に含めてもよい。
　細胞刺激物質は、例えば、糖、アミノ酸、脂肪、酸・アルカリ（ｐＨ調整剤）が挙げられ、細胞の種類や分泌物の種類等によって異なる。
　細胞刺激物質の接触は、工程（Ａ）、工程（Ｂ）のいずれでもよいし、工程と工程の間でもよい。
　工程（Ａ）から（Ｄ）は、同一の容器で行うことができ、洗浄操作を行わずにアッセイを行うことができる。また、生体由来試料が生細胞で単一細胞のときは単一細胞を捕捉可能であるウェル内で行うと、単一細胞からの分泌物の量等を測定することができる。また、経時的に測定することにより単一細胞の分泌物生産能等を測定することができる。
　なお、容器が解放状態のとき、溶液全体の酸素濃度は大気中の酸素濃度と平衡状態にあり、低酸素状態は微粒子周辺のごく限られた領域のみに存在する。細胞の生育などに必要な酸素は常に存在しているため、細胞への影響は少ないと考えられる。
＜２．標的物質検出用キット＞
　標的物質検出用キットには、標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体と、前記標的物質と特異的に結合する第一の分子及び酸素センサが保持された第二の固相支持体とを含む。この他に、細胞刺激物質含有試薬、生体由来試料調製用バッファー、生体由来試料を入れるディスポーザブル容器等を含めてもよい。
２－１．第一の固相支持体
　第一の固相支持体には、標的物質と特異的に結合する第二の分子と酸素消費酵素とが保持されている。第一の固相支持体は特に限定されないが、好ましくはビーズ、微小ビーズである。
　例えば、第二の分子を抗体とし、酸素消費酵素をグルコースオキシダーゼとすると、抗体とグルコースオキシダーゼとを固定化した第一の固相支持体（ビーズやプレート等）をあらかじめ作製しておく。抗体とグルコースオキシダーゼは、ビーズやプレートに直接固定化してもよいし、ビーズやプレートをあらかじめグルコースオキシダーゼで被覆しておき、その上に抗体を固定化してもよい。あるいはその逆でもよい。
　抗体とグルコースオキシダーゼが固定化されなかったビーズ部分は、生体由来試料や標的物質等と非特異的反応が起こらないように、従来技術を用いてタンパク質やペプチド等で被覆しておく。
２－２．第二の固相支持体
　第二の固相支持体には、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサとが保持されている。第二の固相支持体は特に限定されないが、好ましくはプレート、ビーズ、微小ビーズである。ビーズやプレートの第二の固相支持体にまず酸素センサを被覆し、それに第一の分子を固定化してもよい。
　抗体とＰｔＯＥＰが固定化されなかったプレート部分やビーズ部分は、生体由来試料や標的物質等と非特異的反応が起こらないように、従来技術を用いてタンパク質やペプチド等で被覆しておく。
＜３．標的物質検出装置＞
　本技術の標的物質検出装置は、図７に示すように、
　生体由来試料を入れるウェルを有するマイクロチップを装着するマイクロチップ装着部４１、
　前記生体由来試料の流れを制御する試料流制御部４５、
　前記生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる第一接触部４３、
　前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第二の固相支持体に接触させる第二接触部４４、
　前記マイクロチップのウェルに光を照射する光照射部４６、及び
　前記酸素センサから発生する情報を取得する情報取得部４８
を含む。
　生体由来試料を入れるウェルを有するマイクロチップ４２はディスポーザブルでもよいし、繰り返し測定に使用するものでもよい。１個のデバイスで、単一細胞を経時的に測定すれば、細胞生産物の分泌量等の変化を追うことができる。よって、細胞からの分泌量の経時的変化のデータに基づいて、細胞の生産能力等を分析することができる。細胞は、単一細胞でもよいし、複数の細胞が集まった細胞塊でもよい。単一細胞の場合、個々の細胞について生産能力を分析できるので、分析の結果、例えば生産能力の高い細胞を選択し、該細胞について更なる同定、分析、増殖、細胞生産物の効率的生産及びその抽出等を行うことができる。
　生体由来試料の流れを制御する試料流制御部４１は、例えば外部流路からバッファーや生体由来試料等を流して、バルブ、送液装置等により引き込む力、入れ込む力を生じさせることができる。これにより、生体由来試料である単一細胞を単一細胞用チップのウェルに入れてもよいし、試料流制御部４１を共通させて、細胞刺激物試薬等をウェルに入れることができる。試料流制御部４１は、コンピュータに搭載されたプログラムにより制御してもよい。
　生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる第一接触部４３は、例えば第一の分子と酸素センサとを保持するビーズであり、接触自体はマイクロチップのウェル内で行う。あるいは、第一の分子と酸素センサとがマイクロチップのウェルに固相化されていてもよい。
　また、標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第二の固相支持体に接触させる第二接触部４４は、例えば第二の分子と酸素消費酵素を保持するビーズであり、接触自体はマイクロチップ４２のウェル内で行う。
　マイクロチップ４２のウェルに光を照射する光照射部４７は、用いている酸素センサに依存して照射する励起光の波長を変えることができる。光照射部４７は、マイクロチップ全体に照射するようにしてもよいし、例えば細胞が入っているウェルだけに照射してもよい。また、一回照射するだけでなく、経時的に連続的に照射することもできる。照射パターンは光照射制御部４７を設けてコントロールしてもよい。
　酸素センサから発生する情報を取得する情報取得部は、市販のプレートリーダーや、燐光／蛍光測定装置、画像取得装置等を用いることができる。情報取得部は、解析部と連絡して情報取得部で得られた情報を解析することもできる。解析部は、例えば得られたデータに基づいて単一細胞の分泌物生産能を算出することができる。ここで得られたデータや解析結果は、更に設置された記憶部に蓄積されるようにしてもよい。
＜４．実施態様＞
　以下に、生体由来試料として単一細胞を用いた実施態様を示す。
４－１．実施態様１
［ＳＢＳスタンダードマイクロプレートを用いてのＪｕｒｋａｔ細胞が分泌したインターロイキン－２量］
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ　×　５０μＬ／１　ｗｅｌｌの量で９６穴マイクロプレートに播種する。
（２）８μｇ／ｍＬPhytohemagglutinin　（ＰＨＡ）、もしくは、培地（negative control）を５０μＬ／ｗｅｌｌ加える。
（３）３７℃、５％ＣＯ２条件下で一日培養する。
　標準試料として、精製インターロイキン－２（ＩＬ－２）の濃度を変えて溶解してある培養液を準備しておき、検量線を作製する。
（４）抗ＩＬ－２抗体を保持している酸素センサを含む微粒子を細胞培養液に加える。
（５）良く混ぜながら３０分間インキュベーションする。
（６）前記（４）とは別の部位を認識する抗ＩＬ－２抗体を保持している酸素消費酵素を含む微粒子を細胞培養液に加える。
（７）良く混ぜながら３０分間インキュベーションする。
（８）プレートリーダーにて燐光強度を測定する。
４－２．実施態様２
［ＳＢＳスタンダードマイクロプレートを用いてのＪｕｒｋａｔ細胞が分泌したＩＬ－２量の定量（短縮版）］
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞を４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ　×　５０μＬ／１　ｗｅｌｌの量で９６穴マイクロプレートに播種する。
（２）８μｇ／ｍＬPhytohemagglutinin　（ＰＨＡ）、もしくは、培地（negative control）を５０μＬ／ｗｅｌｌ加える。
（３）３７℃、５％ＣＯ２条件下で一日培養する。
　標準試料として、精製ＩＬ－２の濃度を変えて溶解してある培養液を準備しておき、検量線を作製する。
（４）抗ＩＬ－２抗体を保持している酸素センサを含む微粒子、別の部位を認識する抗ＩＬ－２抗体を保持している酸素消費酵素を含む微粒子を細胞培養液に加える。
（５）良く混ぜながら３０分間インキュベーションする。
（６）プレートリーダーにて燐光強度を測定する。
４－３．実施態様３
［単一細胞用ウェルを持つＰＤＭＳチップを用いてのＪｕｒｋａｔ細胞が分泌したＩＬ－２量の定量］
（１）単一細胞用ウェルを持つＰＤＭＳチップにＪｕｒｋａｔ細胞を播種する。
（２）１０分間インキュベーションする。
（３）８μｇ／ｍＬ　Phytohemagglutinin （ＰＨＡ）、もしくは、培地（negative control）に対し、同時に抗ＩＬ－２抗体を保持している酸素センサを含む微粒子、別の部位を認識する抗ＩＬ－２抗体を保持している酸素消費酵素を含む微粒子を加える。本溶液で、余剰細胞を洗い流し、Ｊｕｒｋａｔ細胞を刺激する。
（４）３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養する。
（５）１時間ごとにウェル毎の燐光強度を測定する。
　標準試料として、精製ＩＬ－２の濃度を変えて溶解してある培養液を準備しておき、検量線を作製する。
４－４．実施態様４
　図８に、単一細胞用チップを用いて単一細胞から分泌されたタンパク質を本技術により測定する例の模式図を示す。
　単一細胞用チップの各ウェルに単一細胞が入り、標的物質の分泌タンパク質の特定の箇所に特異的に結合する第一の分子と酸素センサを保持するビーズと、標的分子の分泌タンパク質の別の特定の箇所に特異的に結合する第二の分子と酸素消費酵素を保持するビーズとがウェルに導入される。ウェルに単一細胞がないときは分泌タンパク質もなく、ビーズ同士は別々に存在する。また、ウェルに単一細胞があっても分泌タンパク質が分泌されていないときもビーズ同士は別々に存在する。
　分泌タンパク質が少量存在すると、ビーズと分泌タンパク質とでサンドイッチを形成し、酸素消費酵素を保持するビーズ周囲は低酸素であるので、酸素センサに励起光を照射すると少量の分泌タンパク質に応じて弱い燐光を生ずる。
　分泌タンパク質が大量に存在するとサンドイッチを形成し、酸素センサに励起光を照射すると大量のタンパク質に応じて強い燐光を生ずる。
　これを画像データとして取得することができる。
＜５．参考例＞
　参考例では、従来技術であるビオチン－ストレプトアビジン検出系を用い、細胞からの分泌物を培養プレート底面に固定化した抗体で捕捉、検出する方法を行った。
５－１．参考例１
　参考例１では、ウェル底面に抗ＩＬ－２抗体を固相化し、単一細胞を該ウェルに導入し、単一細胞から分泌されるＩＬ－２をストレプトアビジン標識抗ＩＬ－２抗体でサンドイッチして検出する系を行った（図９）。
（１）単一細胞が入るサイズのウェルを持つ抗ＩＬ－２抗体を固相化済のチップにＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液を載せる。
（２）１０分程度インキュベーションする。
（３）ＰＨＡ／ＰＭＡ入り培地を流し込み、余剰細胞の洗い流し＋Ｊｕｒｋａｔ細胞を活性化（ＩＬ－２分泌を誘導）４時間を行う。
（４）３時間程度インキュベーションする。
（５）検出用のビオチン化抗ＩＬ－２抗体を流し込む。
（６）余剰抗体を洗い流す。
（７）蛍光標識したストレプトアビジンを流し込む。
（８）余剰ストレプトアビジンを洗い流す。
（９）蛍光顕微鏡にて観察する。
　図１０に結果を示す。
　黒い矢印は細胞のあるウェルを示し、白い矢印は蛍光スポットが検出されたウェルを示し、Ｊｕｒｋａｔ細胞からのＩＬ－２の分泌を検出していた。ただし、細胞が存在していないウェルにおいてもＩＬ－２が検出出来ている場合がある。その理由は、検出のために底面に結合していない抗体等を洗浄する必要があり、その洗浄工程で細胞までもが洗い流されているためと考えられる。洗浄工程の必要ないproximity probesを用いた検出方法では細胞が洗い流されるおそれがない優位性が示唆された。
５－２．参考例２
　図１１に、単一細胞用チップであって、下層インレットと上層アウトレットとに挟まれた下方に大きく開口したウェルを有し、単一細胞は上層アウトレットからの貫通孔を介した吸引力により下層インレットの流れから捕捉されるチップを用いた参考例を示す。当該単一細胞用チップの詳細は特願２０１７－１７１９２１を参照されたい。
（１）貫通孔、ウェル部分に抗ＩＬ－２抗体を結合した直径３μｍのメゾポーラスビーズを捕捉する。
（２）余剰ビーズを洗い流す。
（３）Ｊｕｒｋａｔ細胞を捕捉する。
（４）余剰細胞を洗い流す。
（５）ＰＨＡ／ＰＭＡ入り培地を流し込み、Ｊｕｒｋａｔ細胞を活性化してＩＬ－２分泌を誘導する。
（６）３時間程度インキュベーションする。
（７）検出用のビオチン化抗ＩＬ－２抗体を流し込む。
（８）余剰抗体を洗い流す。
（９）蛍光標識したストレプトアビジンを流し込む。
（１０）余剰ストレプトアビジンを洗い流す。
（１１）蛍光顕微鏡にて観察する。
　図１２に結果を示す。
　図１２の右上に示すように、本参考例の単一細胞用チップを用いて、従来の検出法であるビオチン－ストレプトアビジンのサンドイッチ検出系では、Ｊｕｒｋａｔ細胞の分泌したＩＬ－２を検出できている可能性が示唆された。
　よって、本参考例の単一細胞用チップでも本技術の酸素センサ及び酸素消費酵素を用いた検出系の可能性が示された。
　なお、本技術は、以下の構成をとることもできる；
［１］　以下の工程：
（Ａ）生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる工程、
（Ｂ）前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体に接触させる工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）及び（Ｂ）により、前記酸素センサから発せられる情報を取得する工程
を含む、標的物質検出方法。
［２］　前記工程（Ａ）において、前記酸素センサは第二の固相支持体に保持される、［１］に記載の標的物質検出方法。
［３］　前記生体由来試料は生細胞を含む、［１］又は［２］に記載の標的物質検出方法。
［４］　（Ｄ）前記生細胞を細胞刺激物質に接触させる工程を更に含む、［１］～［３］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［５］　前記工程（Ａ）から（Ｄ）は、単一細胞を捕捉可能であるウェル内で行われる、［４］に記載の標的物質検出方法。
［６］　前記標的物質は、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ビタミン及びホルモンからなる群から選択される、［１］～［５］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［７］　前記酸素センサは、金属ポリフィリン、金属フタロシアニン、金属クロリン及びルテニウム錯体からなる群から選択される、［１］～［６］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［８］　前記酸素センサから発せられる情報は、光情報であり、前記酸素センサに応じた波長範囲を有する励起光を照射することにより取得される、［１］～［７］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［９］　前記酸素センサから発せられる情報は燐光強度又は蛍光強度である、［１］～［８］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［１０］　前記燐光強度又は蛍光強度は経時的に取得される、［９］に記載の標的物質検出方法。
［１１］　前記酸素消費酵素はオキシダーゼである、［１］～［１０］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［１２］　前記第二の固相支持体はプレート又は粒子である、［２］～［１１］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［１３］　前記第一の固相支持体は粒子である、［１］～［１２］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［１４］　前記標的物質と特異的に結合する第一の分子及び前記標的物質と特異的に結合する第二の分子は、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子である、［１］～［１３］のいずれかに記載の標的物質検出方法。
［１５］　標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体と、
　前記標的物質と特異的に結合する第一の分子及び酸素センサが保持された第二の固相支持体と
を含む標的物質検出用キット。
［１６］　生体由来試料を入れるウェルを有するマイクロチップを装着するマイクロチップ装着部、
　前記生体由来試料の流れを制御する試料流制御部、
　前記生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる第一接触部、
　前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第二の固相支持体に接触させる第二接触部、
　前記マイクロチップのウェルに光を照射する光照射部、及び
　前記酸素センサから発生する情報を取得する情報取得部
を含む、標的物質検出装置。
１　　　第一の分子
２　　　第二の分子
１１　　ビーズ
１２　　酸素消費酵素
２１　　酸素センサ
２２　　ビーズ
３１　　標的物質
４１　　マイクロチップ装着部
４２　　マイクロチップ
４３　　第一接触部
４４　　第二接触部
４５　　試料流制御部
４６　　光照射部
４７　　光照射制御部
４８　　情報取得部

Claims (16)

  1. 　以下の工程：
    （Ａ）生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる工程、
    （Ｂ）前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体に接触させる工程、及び
    （Ｃ）前記工程（Ａ）及び（Ｂ）により前記酸素センサから発せられる情報を取得する工程
    を含む、標的物質検出方法。
  2. 　前記工程（Ａ）において、前記酸素センサは第二の固相支持体に保持される、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  3. 　前記生体由来試料は生細胞を含む、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  4. 　（Ｄ）前記生細胞を細胞刺激物質に接触させる工程を更に含む、請求項３に記載の標的物質検出方法。
  5. 　前記工程（Ａ）から（Ｄ）は、単一細胞を捕捉可能であるウェル内で行われる、請求項４に記載の標的物質検出方法。
  6. 　前記標的物質は、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、ビタミン及びホルモンからなる群から選択される、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  7. 　前記酸素センサは、金属ポリフィリン、金属フタロシアニン、金属クロリン及びルテニウム錯体からなる群から選択される、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  8. 　前記酸素センサから発せられる情報は、光情報であり、前記酸素センサに応じた波長範囲を有する励起光を照射することにより取得される、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  9. 　前記酸素センサから発せられる情報は燐光強度又は蛍光強度である、請求項８に記載の標的物質検出方法。
  10. 　前記燐光強度又は蛍光強度は経時的に取得される、請求項９に記載の標的物質検出方法。
  11. 　前記酸素消費酵素はオキシダーゼである、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  12. 　前記第二の固相支持体はプレート又は粒子である、請求項２に記載の標的物質検出方法。
  13. 　前記第一の固相支持体は粒子である、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  14. 　前記標的物質と特異的に結合する第一の分子及び前記標的物質と特異的に結合する第二の分子は、抗体、アプタマー又は分子認識ポリマーを含む分子である、請求項１に記載の標的物質検出方法。
  15. 　標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第一の固相支持体と、
    　前記標的物質と特異的に結合する第一の分子及び酸素センサが保持された第二の固相支持体と
    を含む標的物質検出用キット。
  16. 　生体由来試料を入れるウェルを有するマイクロチップを装着するマイクロチップ装着部、
    　前記生体由来試料の流れを制御する試料流制御部、
    　前記生体由来試料を、標的物質と特異的に結合する第一の分子が結合した酸素センサに接触させる第一接触部、
    　前記生体由来試料を、前記標的物質と特異的に結合する第二の分子及び酸素消費酵素が保持された第二の固相支持体に接触させる第二接触部、
    　前記マイクロチップのウェルに光を照射する光照射部、及び
    　前記酸素センサから発生する情報を取得する情報取得部
    を含む、標的物質検出装置。
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