JPS5841356A - 抗原の検定方法および試薬 - Google Patents
抗原の検定方法および試薬Info
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- JPS5841356A JPS5841356A JP12429282A JP12429282A JPS5841356A JP S5841356 A JPS5841356 A JP S5841356A JP 12429282 A JP12429282 A JP 12429282A JP 12429282 A JP12429282 A JP 12429282A JP S5841356 A JPS5841356 A JP S5841356A
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- antibody
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
免疫化学型の検定は急速に臨床診断市場の主要な部門に
なりつ＼ある。現在、比濁法および放射−免疫検定（Ｅ
ＩＡ）は免疫診断学において最良に確立された技術を示
している。酸素増殖免疫検定技術（ＥＭＩＴ）、酵素免
疫検定（ＥＩＡ）および不拘−ケイ光免疫検定の如き新
技術が導入され各様の成功を見ている。これらの検定技
術の多くは放射性同位元素の取扱いに多くの問題が包含
されるためＲＩＡの代替を目的としている。
なりつ＼ある。現在、比濁法および放射−免疫検定（Ｅ
ＩＡ）は免疫診断学において最良に確立された技術を示
している。酸素増殖免疫検定技術（ＥＭＩＴ）、酵素免
疫検定（ＥＩＡ）および不拘−ケイ光免疫検定の如き新
技術が導入され各様の成功を見ている。これらの検定技
術の多くは放射性同位元素の取扱いに多くの問題が包含
されるためＲＩＡの代替を目的としている。
例えば、メイエル、ジュニア （ｍａｉｅｒ、Ｊｒ）
ＫＪ：る米国特許第４，１０４，０２９は化学発光標識
抗原と試料抗原との間に競争反応を起す化学発光検定を
教示している。これらの２種は検定中に存在する抗体に
より与えられた有効な限定された結合点に対して競争す
る。得られる発光は試料中の抗原の量に対し逆の関係に
ある。
ＫＪ：る米国特許第４，１０４，０２９は化学発光標識
抗原と試料抗原との間に競争反応を起す化学発光検定を
教示している。これらの２種は検定中に存在する抗体に
より与えられた有効な限定された結合点に対して競争す
る。得られる発光は試料中の抗原の量に対し逆の関係に
ある。
他の方法は発光種が光吸収種に密接に接近して光吸収種
の吸光度スペクトルが発光種の発光スＲクトルと重なる
時に生ずる非放射エネルギー移動の概念を使用している
。他の條件では放射体により光の形で放出される光エネ
ルギーのすべては好條件下では代わりに吸収種に移動さ
れる。この條件はエネルギ移動速度が吸収および放射種
の間の距離の６乗に逆比例すること示すフォルスターの
式により示されている（”エネルギー移動と有機光化学
、ｌピー・エーレールメーカース（Ｐ、Ａ。
の吸光度スペクトルが発光種の発光スＲクトルと重なる
時に生ずる非放射エネルギー移動の概念を使用している
。他の條件では放射体により光の形で放出される光エネ
ルギーのすべては好條件下では代わりに吸収種に移動さ
れる。この條件はエネルギ移動速度が吸収および放射種
の間の距離の６乗に逆比例すること示すフォルスターの
式により示されている（”エネルギー移動と有機光化学
、ｌピー・エーレールメーカース（Ｐ、Ａ。
Ｌｅｅｒｍａｋｅｒｓ）およびニー・ワイスベルガー（
Ａ・Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ）編集、Ｔｔｃｈｎｉｑｕ
ｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４巻
、１７−１３２ＰＣ１９６９年）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ （＝ニーヨーク）参照）。従って放射種および
吸収種はエネルギー移動を与えるよう互に極めて接近す
ることが必要である。
Ａ・Ｗｅｉｓｓｂｅｒｇｅｒ）編集、Ｔｔｃｈｎｉｑｕ
ｅ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １４巻
、１７−１３２ＰＣ１９６９年）、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ （＝ニーヨーク）参照）。従って放射種および
吸収種はエネルギー移動を与えるよう互に極めて接近す
ることが必要である。
例えばウルマン等による米国特許第３，９９６，３４５
号は抗原とケイ光発光体−消光体との１対を使用する免
疫検定を実施する方法を教示している。放射に際して得
られるケイ光は関心のある成分の量に関連する。ウルマ
ン（Ｕｌ １ｍａｎ）またはウルマン等による米国特許
第３ 、９９８ 、９．！１３号、第４．１６０．０１
６号、第４．１７４．３８４号、第４．１６１．５１５
号および第４．１９９，５５９号を包含する問題の件に
密接に関係する多数の特許が発行されている。これらの
特許はすべて伺かの方法においてケイ光消光の概念に関
するものである。ケイ光性消光を包含する類似の方法が
、２論文に記載されている（”ケイ光励起移動免疫検定
、 ” Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ−底叫二二五、２５１巻、１４号、４１７２
−４１７８頁（１９７６年７ 月２５日）；および”エ
ネルギー移動免疫検定における標識としてのフルオレス
カミンお一９２頁（１９８０年）参照）。
号は抗原とケイ光発光体−消光体との１対を使用する免
疫検定を実施する方法を教示している。放射に際して得
られるケイ光は関心のある成分の量に関連する。ウルマ
ン（Ｕｌ １ｍａｎ）またはウルマン等による米国特許
第３ 、９９８ 、９．！１３号、第４．１６０．０１
６号、第４．１７４．３８４号、第４．１６１．５１５
号および第４．１９９，５５９号を包含する問題の件に
密接に関係する多数の特許が発行されている。これらの
特許はすべて伺かの方法においてケイ光消光の概念に関
するものである。ケイ光性消光を包含する類似の方法が
、２論文に記載されている（”ケイ光励起移動免疫検定
、 ” Ｔｈｅ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ−底叫二二五、２５１巻、１４号、４１７２
−４１７８頁（１９７６年７ 月２５日）；および”エ
ネルギー移動免疫検定における標識としてのフルオレス
カミンお一９２頁（１９８０年）参照）。
抗原−抗体反応の特異性はエネルギー移動の要求を満す
ため化学発光種と光吸収様および再放射種とを十分に接
近させるための手段を与えることが現在見出されている
。これは外部励起光源の必要性を除きかつ高感度にする
ことができる。
ため化学発光種と光吸収様および再放射種とを十分に接
近させるための手段を与えることが現在見出されている
。これは外部励起光源の必要性を除きかつ高感度にする
ことができる。
本発明の１観点は（ａ）吸収体／放射体の複合抗体；化
学発光触媒の複合抗体；および前記の化学発光触媒の複
合抗体の存在において発光の光応答を誘起するのに適し
た化学発光試薬；の各有効量とからなる試薬中に抗原含
有試料を導入し、（ｂ）化学発光の光応答により誘起し
た吸収体／放射体複合抗体から光応答を検出する。こと
を特徴とする抗体に対し多重結合点を有する抗原を検定
するための方法にある。本明細書において”吸収体／放
射体”の用語は光エネルギーを吸収し、異なる波長の光
を発光する種を指す。この用語は特にケイ先回およびリ
ン先回を包含する。またＩ＋化学発光性１＋またはｉ化
学発光ｎの用語は生物発光の密接に関連した現象を包含
する。″抗体１１の用語は抗体類似体を包含する。
学発光触媒の複合抗体；および前記の化学発光触媒の複
合抗体の存在において発光の光応答を誘起するのに適し
た化学発光試薬；の各有効量とからなる試薬中に抗原含
有試料を導入し、（ｂ）化学発光の光応答により誘起し
た吸収体／放射体複合抗体から光応答を検出する。こと
を特徴とする抗体に対し多重結合点を有する抗原を検定
するための方法にある。本明細書において”吸収体／放
射体”の用語は光エネルギーを吸収し、異なる波長の光
を発光する種を指す。この用語は特にケイ先回およびリ
ン先回を包含する。またＩ＋化学発光性１＋またはｉ化
学発光ｎの用語は生物発光の密接に関連した現象を包含
する。″抗体１１の用語は抗体類似体を包含する。
化学発光触媒複合抗体および吸収体／放射体複合抗体の
密接な接近のために１個の抗原に結合した時高能率のエ
ネルギ移動が、化学発光触媒から吸収体／放射体まで起
る。吸収体／放射体は吸収された化学発光の光より長波
長の光を発光することによりエネルギーを放散する。故
に、ケイ先回吸収体／放射体の場合にはケイ光はただ抗
原が試料中にある時に実質的に放射される。糸から検出
されたケイ光は光−標識試薬抗体が無制限の量で存在す
る時、試料中の抗原量に関連する。背景の光として試薬
溶液から放射したケイ光の光量は適当な試薬のすべてが
同時に互に極めて密接していることが必要であるため無
視できる。溶液中で化学発光触媒とケイ先回との間の平
均距離は無視できるエネルギー移動が結合位置（表面抗
原）を抗体複合試薬に対し提供する抗原の存在なしに起
こるようなものである。これらの結合点は互に十父に密
接して適当なエネルギーを移動せしめる。
密接な接近のために１個の抗原に結合した時高能率のエ
ネルギ移動が、化学発光触媒から吸収体／放射体まで起
る。吸収体／放射体は吸収された化学発光の光より長波
長の光を発光することによりエネルギーを放散する。故
に、ケイ先回吸収体／放射体の場合にはケイ光はただ抗
原が試料中にある時に実質的に放射される。糸から検出
されたケイ光は光−標識試薬抗体が無制限の量で存在す
る時、試料中の抗原量に関連する。背景の光として試薬
溶液から放射したケイ光の光量は適当な試薬のすべてが
同時に互に極めて密接していることが必要であるため無
視できる。溶液中で化学発光触媒とケイ先回との間の平
均距離は無視できるエネルギー移動が結合位置（表面抗
原）を抗体複合試薬に対し提供する抗原の存在なしに起
こるようなものである。これらの結合点は互に十父に密
接して適当なエネルギーを移動せしめる。
更に特に１本発明の好ましい観点は化学発光補助因子の
生成に触媒反応を及ぼす”化学発光補助因子発生触媒の
複合抗体ガを化学発光試薬中に包含することである。本
明細書においては”補助因子１は発光反応を生成するの
に必要な反応性種であってこ〜に論じた触媒は除外され
る。両触媒は抗原に密接に接近して結合させる抗体に共
役しているため、吸収体／放射体を励起するのに十分な
化学発光の光応答の可能性は光生成反応において必要な
補助因子の局部的発生により増加される。
生成に触媒反応を及ぼす”化学発光補助因子発生触媒の
複合抗体ガを化学発光試薬中に包含することである。本
明細書においては”補助因子１は発光反応を生成するの
に必要な反応性種であってこ〜に論じた触媒は除外され
る。両触媒は抗原に密接に接近して結合させる抗体に共
役しているため、吸収体／放射体を励起するのに十分な
化学発光の光応答の可能性は光生成反応において必要な
補助因子の局部的発生により増加される。
化学発光試薬中に７化学発光補助因子補集”触媒を包含
することもまた好ましい。この触媒は溶液中に遊離して
残留し抗体と共役しない。抗原−結合試薬の付近に存在
する必要な補助因子および他の試薬のみを有することが
望ましいのでこの触媒は試薬溶液中に一般に存在する特
定の補助因子を除去する作用をする。故にか〜る補助因
子補集触媒は光−生成反応における基本の種を除去する
ことにより背景の光の放射を減少するのを助長する。一
方、抗原近くの補助因子の濃度が、補助因子補集触媒に
対しあまりに高いために感知できる効果を持ち得ないた
め、溶液中の補集触媒の存在は一般に検定に影響しない
。故に、望ましい正の反応が依然起こる。
することもまた好ましい。この触媒は溶液中に遊離して
残留し抗体と共役しない。抗原−結合試薬の付近に存在
する必要な補助因子および他の試薬のみを有することが
望ましいのでこの触媒は試薬溶液中に一般に存在する特
定の補助因子を除去する作用をする。故にか〜る補助因
子補集触媒は光−生成反応における基本の種を除去する
ことにより背景の光の放射を減少するのを助長する。一
方、抗原近くの補助因子の濃度が、補助因子補集触媒に
対しあまりに高いために感知できる効果を持ち得ないた
め、溶液中の補集触媒の存在は一般に検定に影響しない
。故に、望ましい正の反応が依然起こる。
本発明の更に一つの観点は（ａ）吸収体／放射体の複合
抗原；化学発光触媒の複合抗体；および前記の化学発光
触媒の複合抗体の存在において化学発光の光応答を誘起
するのに適した化学発光試薬；の各有効量からなる試薬
溶液に試料を導入し、かつ（ｂ）化学発光の光応答によ
り誘起された吸収体／放射体複合抗原から光応答を検出
することを特徴とする唯１つの結合点を有する抗原を検
定する方法にある（吸収体／放射体を抗体に取り付は抗
原を化学発光触媒により標識することも適している）。
抗原；化学発光触媒の複合抗体；および前記の化学発光
触媒の複合抗体の存在において化学発光の光応答を誘起
するのに適した化学発光試薬；の各有効量からなる試薬
溶液に試料を導入し、かつ（ｂ）化学発光の光応答によ
り誘起された吸収体／放射体複合抗原から光応答を検出
することを特徴とする唯１つの結合点を有する抗原を検
定する方法にある（吸収体／放射体を抗体に取り付は抗
原を化学発光触媒により標識することも適している）。
この観点は試薬溶液が光−標識抗原を含有し、光−標識
抗体に対し光−標識抗原と試料中の抗原との間に競合を
起す点において前記の観点と異なっている。故に、試料
抗原の存在のない場合に発光するある量の第２の光と試
料抗原の存在下に発光するより少量の第２の光とがある
。
抗体に対し光−標識抗原と試料中の抗原との間に競合を
起す点において前記の観点と異なっている。故に、試料
抗原の存在のない場合に発光するある量の第２の光と試
料抗原の存在下に発光するより少量の第２の光とがある
。
本発明の更に一つの観点は開示した方法を実施する際に
有用である本明細書中に記載した試薬である。
有用である本明細書中に記載した試薬である。
本発明の方法を実施する際に、ケイ光またはリン光の励
起性光源と励起する化学発光光源とを共に極めて密接に
接近せしめるため、非常に特異な抗原−抗体反応が利用
される。この原理を利用する目的は与えられた試料中の
抗原を検定するための感度および信頼性の高い方法を確
立することである。抗原−抗体親和性により試料抗原が
存在する時、特徴ある光応答を放射するある必要な反応
物を同伴する。独特の方法を与えることによりこの目的
を達成する手段を与えられる。
起性光源と励起する化学発光光源とを共に極めて密接に
接近せしめるため、非常に特異な抗原−抗体反応が利用
される。この原理を利用する目的は与えられた試料中の
抗原を検定するための感度および信頼性の高い方法を確
立することである。抗原−抗体親和性により試料抗原が
存在する時、特徴ある光応答を放射するある必要な反応
物を同伴する。独特の方法を与えることによりこの目的
を達成する手段を与えられる。
第１図に注目すると、特異な代表試料が、試験されて本
発明は更に容易に理解できる。第１図は試薬溶液が検定
される試料と混合の結果として抗原が試薬溶液中に存在
する時に起きる種々の反応を説明している。抗原は種々
の試薬に攻撃する場所を提供している多数の結合点を含
有する。ケイ先回複合抗体（吸収体／放射体複合抗体）
、被ルオキシダーゼ複合抗体（化学発光触媒複合抗体）
およびグルマースオキ７ダーゼ複合抗体（化学発光補助
因子発生触媒複合抗体）が示され、すべてが試薬溶液の
均衡に関して必然的に小空間に結合し濃縮されている。
発明は更に容易に理解できる。第１図は試薬溶液が検定
される試料と混合の結果として抗原が試薬溶液中に存在
する時に起きる種々の反応を説明している。抗原は種々
の試薬に攻撃する場所を提供している多数の結合点を含
有する。ケイ先回複合抗体（吸収体／放射体複合抗体）
、被ルオキシダーゼ複合抗体（化学発光触媒複合抗体）
およびグルマースオキ７ダーゼ複合抗体（化学発光補助
因子発生触媒複合抗体）が示され、すべてが試薬溶液の
均衡に関して必然的に小空間に結合し濃縮されている。
反応種のこの密接な接近はケイ光発光反応のかなり大き
な可能性を起こす。この特殊な試薬系に対する適切な化
学発光反応は次の通りである。
な可能性を起こす。この特殊な試薬系に対する適切な化
学発光反応は次の通りである。
ｆｉｌ グルコース＋Ｑ２１北子テ÷−２Ｈ２０２＋
グルコン酷塩オキ− （２１Ｈ，０２＋ルミノール ＜ｉｖ土−ｙ’−！オキ
ジルミノール十Ｈ２０＋Ｎ２＋ ｈｒ 反応（２）から分るように、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と
ルミノールの両者は発光反応を起すためにペルオキシダ
ーゼ触媒と接触せねばならない。このために試薬溶液中
に十分な量の両補助因子（過酸化水素とルミノール）を
たｙ有することである（かつ本発明の範囲内にある）が
、かかる状態は抗原の存在如伺に拘わらず著しい背景の
化学発光の光を放射させる。この背景の光はろ過できる
が、か〜る状態は好ましくない。過量の背景放射を避け
るため、化学発光共因子発生触媒複合抗原（グルコース
オキシダーゼａｔ抗体）が反応溶液中に包含される。こ
れは必要な補助因子（Ｈ２Ｏ２’ ）の１種だけが抗原
−結合Ｒルオキシダーゼ触媒の近くに生成されるため化
学発光は単に抗原が存在するときだけに最も起ることを
確実にする。更に発生する不要の機会の化学発光の保証
として第１図に説明した試薬溶液は次の式により一般に
過酸化水素を試薬溶液から除去する化学発光補助因子補
集触媒（カタラーゼ）を含有する。
グルコン酷塩オキ− （２１Ｈ，０２＋ルミノール ＜ｉｖ土−ｙ’−！オキ
ジルミノール十Ｈ２０＋Ｎ２＋ ｈｒ 反応（２）から分るように、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）と
ルミノールの両者は発光反応を起すためにペルオキシダ
ーゼ触媒と接触せねばならない。このために試薬溶液中
に十分な量の両補助因子（過酸化水素とルミノール）を
たｙ有することである（かつ本発明の範囲内にある）が
、かかる状態は抗原の存在如伺に拘わらず著しい背景の
化学発光の光を放射させる。この背景の光はろ過できる
が、か〜る状態は好ましくない。過量の背景放射を避け
るため、化学発光共因子発生触媒複合抗原（グルコース
オキシダーゼａｔ抗体）が反応溶液中に包含される。こ
れは必要な補助因子（Ｈ２Ｏ２’ ）の１種だけが抗原
−結合Ｒルオキシダーゼ触媒の近くに生成されるため化
学発光は単に抗原が存在するときだけに最も起ることを
確実にする。更に発生する不要の機会の化学発光の保証
として第１図に説明した試薬溶液は次の式により一般に
過酸化水素を試薬溶液から除去する化学発光補助因子補
集触媒（カタラーゼ）を含有する。
（３） ２Ｈ，Ｏ□Ｌ註＝ム２Ｈ２０＋Ｏ□故に、第
１図はいかにグルコースオキシダーゼ。
１図はいかにグルコースオキシダーゼ。
Ｒルオキシダーゼおよびケイ先回のすべてが複合抗体に
より抗原に結合されることにより相互に接近していかに
保持されるかを示している。・試薬中のグルコースおよ
び酸素はグルコースオキシダーゼに接触して過酸化水素
を生成する。（ルオキシダーゼ触媒に接して発生する過
酸化水素は化学発光の光エネルギー（ｈｖ≦５００ ｎ
ｍ）を放射する試薬中に存在するルミノールと結合する
。しがしながら、抗原にも密接に結合する被ルオキシダ
ーゼおよびケイ先回の密接な接近のためこの放射した光
エネルギーはケイ先回（ｈＹ≦５００ｎｍ）により吸収
されてケイ光の光に変換される。イ６営発光の光はいず
れもろ過され試料中延存在する抗原の量に比例するケイ
光の光を検出器のみが検出できる。
より抗原に結合されることにより相互に接近していかに
保持されるかを示している。・試薬中のグルコースおよ
び酸素はグルコースオキシダーゼに接触して過酸化水素
を生成する。（ルオキシダーゼ触媒に接して発生する過
酸化水素は化学発光の光エネルギー（ｈｖ≦５００ ｎ
ｍ）を放射する試薬中に存在するルミノールと結合する
。しがしながら、抗原にも密接に結合する被ルオキシダ
ーゼおよびケイ先回の密接な接近のためこの放射した光
エネルギーはケイ先回（ｈＹ≦５００ｎｍ）により吸収
されてケイ光の光に変換される。イ６営発光の光はいず
れもろ過され試料中延存在する抗原の量に比例するケイ
光の光を検出器のみが検出できる。
第２図は試料中に存在する抗原がないが第１図と同じ試
薬系を示している。ケイ光の光応答を生成するために必
要な試薬はすべて無差別に溶液中に分散しているので化
学発光の発生の可能性は少なく、特に生成した過酸化水
素を補集するカタラーゼの存在のためそうである。第２
の光放射（ケイ光）発生の機会は励起した化学発光の放
射体がケイ先回に極めて接近して生成されることが必要
なために一眉少ない。それ以外の場合は、エネルギー移
動は検出できるケイ光の応答を完成するには不十分であ
る。
薬系を示している。ケイ光の光応答を生成するために必
要な試薬はすべて無差別に溶液中に分散しているので化
学発光の発生の可能性は少なく、特に生成した過酸化水
素を補集するカタラーゼの存在のためそうである。第２
の光放射（ケイ光）発生の機会は励起した化学発光の放
射体がケイ先回に極めて接近して生成されることが必要
なために一眉少ない。それ以外の場合は、エネルギー移
動は検出できるケイ光の応答を完成するには不十分であ
る。
試薬を調製するのに使用される必要な抗体は既知の方法
例えば問題の抗原と共に予め注入された動物の血液から
の抗体の単離〔ヘルマン・エヌ・アイゼｙ （Ｈｅｒｍ
ａｎ−Ｎ−Ｅｉｓｅｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＊第
１５．１７章、Ｈａｒｐｅｒ Ｒｏｗ、＝ニーヨーク（
１９７４年）参照〕 または単分枝系（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体の安定な
形成体を生成するため抗体形成細胞を骨随腫（ｍｙｅｌ
ｏｍａ）細胞と共に融解する〔アール・エッチ・ケネッ
ト（Ｒ−Ｈ−Ｋｅｎｎｅｔ）およびチー・ジエー。
例えば問題の抗原と共に予め注入された動物の血液から
の抗体の単離〔ヘルマン・エヌ・アイゼｙ （Ｈｅｒｍ
ａｎ−Ｎ−Ｅｉｓｅｎ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＊第
１５．１７章、Ｈａｒｐｅｒ Ｒｏｗ、＝ニーヨーク（
１９７４年）参照〕 または単分枝系（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体の安定な
形成体を生成するため抗体形成細胞を骨随腫（ｍｙｅｌ
ｏｍａ）細胞と共に融解する〔アール・エッチ・ケネッ
ト（Ｒ−Ｈ−Ｋｅｎｎｅｔ）およびチー・ジエー。
７７ フカ７−７ （Ｔ−Ｊ−Ｍｃｋｅａｒｎ （編集
）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐ
ｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、 ニューヨーク（１９８１
年）参照〕 により得られる。両文献とも本明細書に含
める。
）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐ
ｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、 ニューヨーク（１９８１
年）参照〕 により得られる。両文献とも本明細書に含
める。
適当な化学発光触媒には次の分離反応により光を生成す
る投ルオキシダーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、およびル
シフェラーゼが包含される。
る投ルオキシダーゼ、細菌性ルシフェラーゼ、およびル
シフェラーゼが包含される。
＋Ｈ２０＋Ｎ、 ＋ｈｒ
（５） ＦＭＮＨ，＋Ｏ，＋ＲＣＨ貴１註二二ニョ―
ＦＭＮ ＋ ＲＣＯＯＨ＋ Ｈ，、＋ｈｒ（６） ル
シフェリン＋ＡＴＰ ＋０２−はａΣとと２２＝と二五
−オキジルシフェリン＋ＡＭＰ−１−ＣＯ２＋ｐｐ ｉ
＋ｈビ（式中、 ＦＭＮＨ２は還元されたフラビンモノ
ヌクレオタイドであり、Ｒは約８−１２の炭素を有する
直鎖状炭素鎖であり、ＦＭＮはフラビンモノヌクレオタ
イドゝであり、ＡＴＰはアデノシン三リン酸塩であり、
ＦＭＮはフラビンモノヌクレオタイ［・８であり、ＡＴ
Ｐはアデノシン三リン酸塩であり、ＡＭＰはアデノシン
−リン酸塩であり、ｐｐｉは無機リン酸塩である。
ＦＭＮ ＋ ＲＣＯＯＨ＋ Ｈ，、＋ｈｒ（６） ル
シフェリン＋ＡＴＰ ＋０２−はａΣとと２２＝と二五
−オキジルシフェリン＋ＡＭＰ−１−ＣＯ２＋ｐｐ ｉ
＋ｈビ（式中、 ＦＭＮＨ２は還元されたフラビンモノ
ヌクレオタイドであり、Ｒは約８−１２の炭素を有する
直鎖状炭素鎖であり、ＦＭＮはフラビンモノヌクレオタ
イドゝであり、ＡＴＰはアデノシン三リン酸塩であり、
ＦＭＮはフラビンモノヌクレオタイ［・８であり、ＡＴ
Ｐはアデノシン三リン酸塩であり、ＡＭＰはアデノシン
−リン酸塩であり、ｐｐｉは無機リン酸塩である。
与えられた試薬系に対し特定の吸収体／放射体を選択す
るにあたり、化学発光試薬により生成される化学発光の
スにクトル領域に吸光度を有することが必要である。吸
収体／放射体の発光は効果的に試薬系により放射された
化学発光と区別できる十分長波長であることが好ましい
。例えば第１に話題の２種の化学発光反応は過酸化水素
によるルミノール酸化とアルデヒド酸化である（例えば
インブチルアルデヒドゝおよびプロパツール）。これら
の反応はいずれもペルオキシダーゼにより触媒反応され
る。ルミノール化学発光反応用の適切な吸収体／放射体
にはウロポルフィリンおよびテトラカルボキシフェニル
ポルフィリンの如き遊離塩基のポルフィリン類、マグネ
シウムまたは亜鉛の如き金属を含有する金属ポルフィリ
ン類、ルミノール化学発光の領域（４００および４５０
ｎｍの間）に強い吸光度を生成するのに十分な大きさの
共役環系を有するテトラフェニルカルボキシポルフィリ
ン、ペリレン、アントラセン、７−メチルジベンゾ（ａ
、ｈ）ピレンおよび他の多環芳香族が包含される。吸収
体／放射体は抗体との共役のため容易にスルホン化され
、一般の合成法によるスルホン酸クロリドの生成により
活性化される。
るにあたり、化学発光試薬により生成される化学発光の
スにクトル領域に吸光度を有することが必要である。吸
収体／放射体の発光は効果的に試薬系により放射された
化学発光と区別できる十分長波長であることが好ましい
。例えば第１に話題の２種の化学発光反応は過酸化水素
によるルミノール酸化とアルデヒド酸化である（例えば
インブチルアルデヒドゝおよびプロパツール）。これら
の反応はいずれもペルオキシダーゼにより触媒反応され
る。ルミノール化学発光反応用の適切な吸収体／放射体
にはウロポルフィリンおよびテトラカルボキシフェニル
ポルフィリンの如き遊離塩基のポルフィリン類、マグネ
シウムまたは亜鉛の如き金属を含有する金属ポルフィリ
ン類、ルミノール化学発光の領域（４００および４５０
ｎｍの間）に強い吸光度を生成するのに十分な大きさの
共役環系を有するテトラフェニルカルボキシポルフィリ
ン、ペリレン、アントラセン、７−メチルジベンゾ（ａ
、ｈ）ピレンおよび他の多環芳香族が包含される。吸収
体／放射体は抗体との共役のため容易にスルホン化され
、一般の合成法によるスルホン酸クロリドの生成により
活性化される。
カルボキシル化も必要ならば実施でき、これから生成し
た酸塩化物は抗体に結合するため活性化される。
た酸塩化物は抗体に結合するため活性化される。
アルデヒド酸素化から得られる化学発光用の適当な吸収
体／放射体には上記のポリフィリンおよび多核芳香族が
包含される。しかしながら多核芳香族のハロゲン化は化
学発光放射体からエネルギーの有効な移行を与えるため
必要であるがこれは３重励起状態からの放身のためであ
る。有効なハロゲン化多核芳香族の実例は９．１０−ジ
ブロモアントラセン、９−１０−ジブロモ−２，６−ア
ントラセンジスルホン酸、６．１０−ジブロモ−４，９
−ペリレンジカルボン酸塩およびろ、９−または６．１
０−ジブロモにリレンである。もし必要ならば記載した
ようなスルホン化またはカルボキシル化が、一般の合成
法によりこれらの化合物にもまた容易に実施できる。
体／放射体には上記のポリフィリンおよび多核芳香族が
包含される。しかしながら多核芳香族のハロゲン化は化
学発光放射体からエネルギーの有効な移行を与えるため
必要であるがこれは３重励起状態からの放身のためであ
る。有効なハロゲン化多核芳香族の実例は９．１０−ジ
ブロモアントラセン、９−１０−ジブロモ−２，６−ア
ントラセンジスルホン酸、６．１０−ジブロモ−４，９
−ペリレンジカルボン酸塩およびろ、９−または６．１
０−ジブロモにリレンである。もし必要ならば記載した
ようなスルホン化またはカルボキシル化が、一般の合成
法によりこれらの化合物にもまた容易に実施できる。
リン光化合物もまた放射体の６重性能により化学発光ア
ルデヒド系における吸収体／放射体の如く使用できる。
ルデヒド系における吸収体／放射体の如く使用できる。
しかしながら、一般にリン光の吸収体／放射体は酸素の
存在で消光への感受性により好ましくない。この種類の
化合物には２．６−ブタジオン％ １−Ｃカルボキシフ
ェニル〕−１，２被／タンジオンおよび１−フェニル−
１，２−プロパンジオンの如きα−ジケトンが包含され
る。
存在で消光への感受性により好ましくない。この種類の
化合物には２．６−ブタジオン％ １−Ｃカルボキシフ
ェニル〕−１，２被／タンジオンおよび１−フェニル−
１，２−プロパンジオンの如きα−ジケトンが包含され
る。
後者の場合に抗体または抗原への結合はフェニル環のス
ルホン酸クロリド、酸クロリドまたはジアゾ活性中間体
による置換により与えられる。
ルホン酸クロリド、酸クロリドまたはジアゾ活性中間体
による置換により与えられる。
適当な抗体に吸収体／放射体、化学発光触媒および化学
発光補助因子発生触媒を付着させる方法は関連する特異
な種に左右される。例えば９．１゜−ジブロモ−２−ア
ントラセンスルホン酸の如きケイ先回のスルホン酸誘導
体はジクロロエタン中でＰＯＣ，ｌ、による処理によっ
てスルホン酸クロリドゝに変換される。スルホン酸りロ
リ白ま次に水溶液中で抗体のリジン残留物またはＮ−末
端アミノ酸のアミン基に結合する。ジブロモペリレンジ
カルボン酸の如きケイ先回のカルボン酸誘導体は塩化チ
オニルによる処理により酸クロリドに変換できる。酸ク
ロリ白まスルホン酸クロリドと同様の方法で抗体に結合
する。これらおよび他の一般のカップリング方法は文献
で知られている〔例えば本明細書に包含されているエッ
チ・エッチ・ライタＥｎｚｙｍｅｓ、Ａｎｔｉｇｅｎｓ
、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ。
発光補助因子発生触媒を付着させる方法は関連する特異
な種に左右される。例えば９．１゜−ジブロモ−２−ア
ントラセンスルホン酸の如きケイ先回のスルホン酸誘導
体はジクロロエタン中でＰＯＣ，ｌ、による処理によっ
てスルホン酸クロリドゝに変換される。スルホン酸りロ
リ白ま次に水溶液中で抗体のリジン残留物またはＮ−末
端アミノ酸のアミン基に結合する。ジブロモペリレンジ
カルボン酸の如きケイ先回のカルボン酸誘導体は塩化チ
オニルによる処理により酸クロリドに変換できる。酸ク
ロリ白まスルホン酸クロリドと同様の方法で抗体に結合
する。これらおよび他の一般のカップリング方法は文献
で知られている〔例えば本明細書に包含されているエッ
チ・エッチ・ライタＥｎｚｙｍｅｓ、Ａｎｔｉｇｅｎｓ
、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ。
第１章、 Ｍａｒｅｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ＋ニューヨーク
（１９７５年）参照）。抗体の多くのペルオキシダーゼ
複合体は市場で入手可能であり、抗体のアミノ基がシフ
塩基結合を形成して反応する炭水化物残留分のペルオキ
シダーゼの酸化により製造される。これらのシフ塩基は
更にホウ化水素の還元により安定化される。グルコース
と抗体の複合は２官能試薬サクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミド９メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩
（本明細書に包含される古物等によるＥｕｒｏｐｅａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第
１０１巻、３９５−３９９頁）の使用が報告されている
。
（１９７５年）参照）。抗体の多くのペルオキシダーゼ
複合体は市場で入手可能であり、抗体のアミノ基がシフ
塩基結合を形成して反応する炭水化物残留分のペルオキ
シダーゼの酸化により製造される。これらのシフ塩基は
更にホウ化水素の還元により安定化される。グルコース
と抗体の複合は２官能試薬サクシニミジル４−（Ｎ−マ
レイミド９メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩
（本明細書に包含される古物等によるＥｕｒｏｐｅａｎ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第
１０１巻、３９５−３９９頁）の使用が報告されている
。
選択された化学発光触媒複合抗体の存在で光応答を誘起
するために必要な化学発光試薬または補助因子は生物化
学の当業者によりよく証明され。
するために必要な化学発光試薬または補助因子は生物化
学の当業者によりよく証明され。
かつ容易に定量することができる。例えばペルオキシダ
ーゼ化学発光試薬の存在で光−誘起試薬または補助因子
には（１）ルミノールおよび過酸化水素あるいは（２）
アルデヒド９（イソブチルアルデヒドまたはプロピオン
アルデヒドの如き）、溶解酸素。
ーゼ化学発光試薬の存在で光−誘起試薬または補助因子
には（１）ルミノールおよび過酸化水素あるいは（２）
アルデヒド９（イソブチルアルデヒドまたはプロピオン
アルデヒドの如き）、溶解酸素。
エタノールおよび／あるいはピロリン酸ナトリウムおよ
び／あるいはリン酸ナトリウムのいずれかが包含できる
。はたるルシフェラーゼの存在では光誘発試薬にはＦＭ
ＮＨ，、長鎖アルデヒド・、および溶解酸素が包含され
る（前記の反応式（４）、（５）および（６）参照）。
び／あるいはリン酸ナトリウムのいずれかが包含できる
。はたるルシフェラーゼの存在では光誘発試薬にはＦＭ
ＮＨ，、長鎖アルデヒド・、および溶解酸素が包含され
る（前記の反応式（４）、（５）および（６）参照）。
検定は光の放射が検出できる透明な壁を有する適当な容
器中で実施できる。検定は便宜上室温で実施するのが好
ましい。一般に、試薬溶液中の各種の試薬の濃度は抗体
複合体に対しては約１０−８−１Ｑ ’Ｍ、 ルミ／
−／ｌ／使用に対ｔ、テ＆！ １０−３Ｍ、過酸化水素
使用には５Ｘ１ｏ−３Ｍ、アルデヒドが使用された場合
はｉ ｏ−３−ｉ ０−２Ｍ、ピロリン酸塩が使用され
た場合は１０−２−１０−１Ｍ、リン酸塩が適用された
場合は１０”−１０’Ｍである。
器中で実施できる。検定は便宜上室温で実施するのが好
ましい。一般に、試薬溶液中の各種の試薬の濃度は抗体
複合体に対しては約１０−８−１Ｑ ’Ｍ、 ルミ／
−／ｌ／使用に対ｔ、テ＆！ １０−３Ｍ、過酸化水素
使用には５Ｘ１ｏ−３Ｍ、アルデヒドが使用された場合
はｉ ｏ−３−ｉ ０−２Ｍ、ピロリン酸塩が使用され
た場合は１０−２−１０−１Ｍ、リン酸塩が適用された
場合は１０”−１０’Ｍである。
血液または尿の試料の検定用の試薬溶液の１例にはきル
オキダーゼ複合抗体（〜１０’Ｍ）、カルボキシーフェ
ニルポルノイリン複合抗体（〜１０−８Ｍ ）、ルミノ
ール（〜１０−３Ｍ）および過酸化水素（〜５ Ｘ １
０” Ｍ ）が包含される。
オキダーゼ複合抗体（〜１０’Ｍ）、カルボキシーフェ
ニルポルノイリン複合抗体（〜１０−８Ｍ ）、ルミノ
ール（〜１０−３Ｍ）および過酸化水素（〜５ Ｘ １
０” Ｍ ）が包含される。
任意に、試薬溶液はまたグルコースオキシダーゼ複合抗
体（〜１０−８Ｍ）、グルコース（〜１ｏ−３Ｍ）およ
びカタラーゼ（〜１０−６Ｍ ）が包含できる。
体（〜１０−８Ｍ）、グルコース（〜１ｏ−３Ｍ）およ
びカタラーゼ（〜１０−６Ｍ ）が包含できる。
更に１つの特定の試薬溶液にはペルオキシダーゼ複合抗
体（〜１０−６Ｍ ）、６．１０−ジブロモペリレン複
合抗体（〜１０ ’Ｍ）、イソブチルアル７’ ヒ）”
（〜５ｘ１０−２Ｍ）、溶解酸素、エタノール、リン
酸ナトリウム、およびピロリン酸塩が包含される。
体（〜１０−６Ｍ ）、６．１０−ジブロモペリレン複
合抗体（〜１０ ’Ｍ）、イソブチルアル７’ ヒ）”
（〜５ｘ１０−２Ｍ）、溶解酸素、エタノール、リン
酸ナトリウム、およびピロリン酸塩が包含される。
更に特定の試薬溶液にはほたるルシフェラーゼ複合抗体
（〜１０−８Ｍ ）、ウロポルフィリン複合抗体Ｃ〜１
０−７１１／ｍｌ）、ＡＴＰ（〜ｉ ［１−６Ｍ ）、
ルシフェリン（〜５Ｘ１０−５Ｍ）、Ｍｇ＋２イオン（
〜１０−２Ｍ ）および溶解酸素が包含される。
（〜１０−８Ｍ ）、ウロポルフィリン複合抗体Ｃ〜１
０−７１１／ｍｌ）、ＡＴＰ（〜ｉ ［１−６Ｍ ）、
ルシフェリン（〜５Ｘ１０−５Ｍ）、Ｍｇ＋２イオン（
〜１０−２Ｍ ）および溶解酸素が包含される。
当業者は説明のために示された前記試料から多くの変化
を行うことができるが本発明の請求の範囲内である。
を行うことができるが本発明の請求の範囲内である。
第１図は試料抗原の存在下で特定の試薬系を使用した本
発明の１実施例である。 第２図は試料抗原がないことを除いて第１図と同じ系で
ある。 特許出願人 スタンダード・オイル・カンパニー纂ｉ図 名漁中どａ給 抵ｌ゛
発明の１実施例である。 第２図は試料抗原がないことを除いて第１図と同じ系で
ある。 特許出願人 スタンダード・オイル・カンパニー纂ｉ図 名漁中どａ給 抵ｌ゛
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １−（ａ） 吸収体／放射体の複合抗体；化学発光触
媒複合抗体；および化学発光触媒複合抗体の存在におい
て光応答の誘起に適した化学発光試薬：とからなる試薬
溶液に試料を導入し、かつ（ｂ） 吸収体／放射体複
合抗体により放射されたいかなる光も検出する。各工程
からなる多数の結合点を有する抗原を検定する方法。 ２、化学発光試薬が、化学発光補助因子発生触媒の複合
抗原からなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、化学発光試薬が、化学発光補助因子補集触媒からな
る特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、吸収体／放射体が、ケイ先回である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ５、 ケイ先回が、ウロポルフィリン、テトラカルボキ
シフェニルポルフィリン、ペリレン、アントラゼン、７
−メチルジインゾ（ａ、ｈ）ピレン、９．１０−ジブロ
モアントラセン、リボフラビン。 ３．９−ジブロモペリレン、６．１０−：）プロモヘリ
レンおよび６．１０−ジブロモ−４，９−ペリレンジカ
ルボン酸塩からなる群から選択される特許請求の範囲第
４項記載の方法。 ６、吸収体／放射体が、リン光団である特許請求の範囲
第１項記載の方法。 ７、 リン光団が、２．６−ブタンジオン、１−〔カル
ボキシフェニル〕−１，２−−＜ンタンジオンおよび１
−フェニル−１，２−プロペンジオンからなる群から選
択される特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、化学発光触媒が、深ルオキシダーゼ、細菌性ルシフ
ェラーゼおよびほたるルシフェラーゼからなる群から選
択される特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、吸収体／放射体の複合抗体；化学発光触媒の複合抗
原；および化学発光触媒の複合抗体の存在において化学
発光の光応答を誘起するために必要な化学発光試薬：か
らなり、大抗原を検定するための試薬溶液。 １０、化学発光試薬が、化学発光補助因子発生器触媒の
複合抗体からなる特許請求の範囲第９項記載の試薬溶液
。 １１、化学発光試薬が、化学発光補助因子捕集型触媒か
らなる特許請求の範囲第１０項記載の試薬溶液。 １２、ペルオキシダーゼ複合抗体、ウロポルフィリン複
合抗体、ルミノールおよび過酸化水素からなり、大抗原
を検定するための試薬溶液。 １６、Ｒルオキシダーゼ複合抗体、リボフラビン複合抗
体、ルミノール、グルコースオキシダーゼ複合抗体、グ
ルコース、およびカタラーゼからなり、大抗原を検定す
れための試薬溶液。 １４、ペルオキシダーゼ複合抗体、ウロポルフィン複合
抗体、インブチルアルデヒド、溶解酸素およびエタノー
ルからなり、大抗原を検定するための試薬溶液。 １５、はたるルシフェラーゼ複合抗体、ウロポルフィリ
ン複合抗原、アデノシン三すン酸塩、ルシフェリン、マ
グネシウムイオン、および溶解酸素からなり、大抗原を
検定するための試薬溶液。 １６、吸収体／放射体の複合抗原；化学発光触媒複合抗
体；および化学発光触媒複合抗体の存在において化学発
光の光応答を誘起するために必要な化学発光試薬；の各
有効量からなる、小抗原を検定するための試薬溶液。 １７、化学発光触媒複合抗原；吸収−／放射体複合抗体
；および化学発光触媒複合抗原の存在において化学発光
の光応答を誘起するために必要な化学発光試薬；の各有
効量からなる、小抗原を検定するだめの試薬溶液。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US28440081A | 1981-07-17 | 1981-07-17 | |
| US294400 | 2002-11-14 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5841356A true JPS5841356A (ja) | 1983-03-10 |
Family
ID=23090074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12429282A Pending JPS5841356A (ja) | 1981-07-17 | 1982-07-16 | 抗原の検定方法および試薬 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0070686B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5841356A (ja) |
| CA (1) | CA1185177A (ja) |
| DE (1) | DE3266683D1 (ja) |
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| WO2019187467A1 (ja) * | 2018-03-28 | 2019-10-03 | ソニー株式会社 | 標的物質検出方法、標的物質検出用キット及び標的物質検出装置 |
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- 1982-07-16 JP JP12429282A patent/JPS5841356A/ja active Pending
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0070686A3 (en) | 1983-04-13 |
| EP0070686A2 (en) | 1983-01-26 |
| EP0070686B1 (en) | 1985-10-02 |
| DE3266683D1 (en) | 1985-11-07 |
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