JP2553519B2 - 光学発光法 - Google Patents

光学発光法

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JP2553519B2 JP61162929A JP16292986A JP2553519B2 JP 2553519 B2 JP2553519 B2 JP 2553519B2 JP 61162929 A JP61162929 A JP 61162929A JP 16292986 A JP16292986 A JP 16292986A JP 2553519 B2 JP2553519 B2 JP 2553519B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、化学発光法に関する。本発明は、さらに詳
しくは、化学発光を使用する核酸雑種、抗体、抗原およ
び酵素の検出に関する。なおさらに、本発明は化学発光
装置に関する。
本発明は、また、延長増強された化学発光に関する。
さらに詳しくは、本発明は窒素含有化合物の使用により
増強された化学発光反応における酵素の安定化に関す
る。
本発明は、さらに、化学発光反応による核酸雑種の検
出に関する。
発光（ルミネツセンス）は熱によらない発光として定
義される。発光に際して、エネルギーは一定の分子に特
異的に流れるので、その分子の温度を大きく上昇させな
いで、特定の発光状態が形成される。色は随伴する発光
の状態の特性により決定され、そしてエネルギーまたは
その生成法が変化する場合でも、変化しない。
化学発光は、化学反応が同一温度および同一スペクト
ルの範囲内で黒体（black body）の発光（熱放射）を越
える光（紫外、可視または赤外）の放出の原因となるエ
ネルギーを供給する発光として定義される。こうして、
化学発光は化学エネルギーの光エネルギーへの直接の変
換を含む。500℃以下では、化学反応の間の光の放出は
化学発光を伴う。ブンゼンバーナーの青色の内側の円錐
またはコールマン（Coleman）ガスランプはその例であ
る。
多くの化学反応はエネルギーを発生する。通常、この
発熱性は熱として、すなわち、生成物の分子の並進、回
転および振動のエネルギーとして現われる。これに対し
て可視の化学発光が起こるためには、反応生成物の１つ
が励起した電子状態（下に星印で示す）で発生しなくて
はならず、これは光子の放射により失活されうる。それ
ゆえ、下の反応（ａ）および（ｂ）に示すように、化学
発光反応は光化学反応の逆と見なすことができる。
Ａ＋Ｂ→Ｃ＊＋Ｄ （ａ） Ｃ＊→Ｃ＋ｈν （ｂ） 光子ｈν（ここでｈはプランクの定数であり、そして
νが光の振動数である）のエネルギーはＣの基底状態と
最初の励起した電子状態との間の距離に依存し、そして
化学発光のスペクトルは放射体の蛍光のスペクトルと通
常一致する。場合によって、この反応は追加の段階、Ｃ
＊から他の分子への電子エネルギーの移動（必ずしもこ
の反応に伴わない）を伴う。時には、明確な励起状態は
特定されず、この場合において、化学発光のスペクトル
は、いわゆる空気の残光におけるように、分子の形成に
関連する構造をもたない連続体である:NO＋Ｏ→NO2＋ｈ
ν（緑の光）。
化学発光の効率は、その量子収量φ、すなわち、反応
した分子につき放射される光子の数として表わされる。
多くの反応は、１分子当り約70〜40Kcal（１分子当り30
0〜170キロジユール）に相当する波長400〜700nmの可視
光の最大アインシユタイン単位（１アインシユタイン＝
Nhν、ここでＮはアボガドロ数である）より遥かに小さ
い量子収率（10-8hν／分子）を有する。こうして、非
常に発熱性、または「発エルゴンの」化学過程のみが化
学発光であるものとを期待できる。部分的にこの理由の
ため、化学発光の最もよく知られた例は酸素および酸化
の過程（またはプロセス）を伴い、これらの最も効率よ
い例は酵素が仲介する生物発光である。空気中のリンの
発光（glow）は歴史的に重要な例であるが、この複雑な
反応の機構はまだ完全には理解されていない。アルデヒ
ド類またはアルコール類のような各種の有機基質の酸
素、過酸化水素またはオゾンなどによる酸化も化学ルミ
ネツセンスである。加熱されたエーテル蒸気と空気との
反応は、例えば、青味がかった「冷たい」炎を生ずる。
溶液中のある化学発光、例えば、ルミノール（Ｉ）（下
の式を参照）の酸化および、ことに、あるシユウ酸エス
テル（II）（下の式を参照）と過酸化水素との反応の効
率は非常に高い（φ＝30％）。
振動によるエネルギーの散逸を最小にする化学発光の
ための要件は充分な発熱性であり、そして適当な発光体
が存在することに限られずさらにその化学的プロセスが
非常に速く、かつわずかな幾何学的変化をも伴わないこ
とであると信じられている。例えば、強力な酸化剤から
還元剤への１個の電子の移動（しばしば反対電荷の２つ
のラジカルイオンが電気化学的に発生する）は、ある場
合において、電子の励起の非常に有効な発生を生じうる
型のプロセスである。例えば、9,10−ジフエニルアント
ラセン（DPA）を使用する例を反応（ｃ）に示す。
DPA-＋DPA+→ DPA＊＋DPA （ｃ） 同一のことが４構成員の環状過酸化物（III）のカル
ボニル生成物への分解について当てはまり、この分解は
反応（ｄ）に示されており、これは多くの化学発光の原
型である。
化学発光の特定の型は生物発光である。
生物発光は、エネルギー生成化学反応に起因して、生
きている有機体による光の放出として定義され、ここで
ルシフエリンと呼ばれる特定の生化学的物質が、ルシフ
エラーゼと呼ばれる特定の酵素により触媒されて酸化を
受ける。
化学的に異なる多くの特定のルシフエリン類およびル
シフエラーゼ類が存在し、各種の生きている発光性有機
体中に含まれている。ホタルの発光、大洋の鮮明な「リ
ン光」または「輝き」、あるいは夜における森林の奥ま
ったところのキノコ類の不気味な発光は、これら各種の
生物発光性有機体のほんのわずかの例である。
生物発光は化学発光の１つの型であるので、光の放出
を得るために生きている有機体を準備することは不必要
である。含まれる化学物質の保存は、簡単にできる。こ
れはある場合において有機体を穏和な条件下で迅速に乾
燥することによって実施することができる。
乾燥したホタルの尾［ランタン（lantern）］は、水
ですりつぶすとき、光を放出する。この光の放出は数分
以内に削滅するが、細胞のエネルギー機構における主要
な補酵素であるアデノシン三リン酸（ATP）の添加によ
って回復させることができる。この場合において、ATP
はホタルのルシフエニリンと反応して、ルシフエニルア
デニレート中間体とピロリン酸塩（PP）を生ずる。
数十万匹のホタルからのランタン抽出物を使用して、
ジヨンズ・ポプキンス大学（Johns Hopkins Universi
ty）の化学者らはホタルのルシフエリンの化学構造がC
13H12N2O3S2であることを決定した。それは現在合成す
ることができる。ルシフエニリンアデニレートと酸素と
の反応は、４員環のアルフア−ペルオキシラクトン中間
体を与え、そしてアデノシン−燐酸（AMP）を放出する
と推定されている。これはエネルギー生成段階で分解し
て二酸化炭素と発光する励起した分子とを与える。これ
は光子（ｈν）としてそのエネルギーを失い、この場合
のスペクトルは黄色領域にある。
保存した光器官からのホタルのルシフエリンとルシフ
エラーゼは、ATPを検出するための非常に高感度の生化
学試験において使用されている。
ホタルのルシフエリンに関して推定されている経路は
次の通りである： ホタルの発光は短時間の閃光として起こり、神経系の
制御のもとに、ランタン中の発光性細胞の内部から来
る。日本の海岸から沖の海水中に存在する小さい海産甲
殻網のウミホタル（Cypridina）において、非常に異な
る状況が起こる。それは各種の腺においてそのルシフエ
リンとルシフエラーゼを合成する。発光するために、そ
れはルシフエリンとルシフエラーゼを海水中に単に吹き
出すだけであり、動物から離れた場所で反応が起こる。
この光は捕食動物の注意をそらし、かうそれをだます機
能を有するかも知られない。
ウミホタル（Cypridina）のルシフエリンの化学は、
日本における化学者のグループのより決定された。C22H
27ON7は矢印で示されるように酸素と直接反応して、ホ
タルの分子と同様に１つの型のアルフア−ペルオキシラ
クトンを生成すると推定されている。最後の段階におい
て、二酸化炭素が、また、励起された分子と一緒に放出
され、励起された分子はこの場合青色を放出する。
ウミホタル（Cypridina）のルシフエリンについて推
定されている経路は、次の通りである： ホタルと同様に、乾燥したウミホタル（Cypridina）
は冷水ですりつぶすとき発光する。ウミホタル（Cyprid
ina）をすりつぶすとき、保存されたルシフエリンおよ
びルシフエラーゼは腺から開放される。光はルシフエリ
ンが酸化されるにつれて徐々に弱くなるが、さらにルシ
フエリンを添加すると消耗された抽出液中で光を回復す
る。ルシフエリンは合成的に得ることができ、あるいは
乾燥したウミホタル（Cypridina）を熱水中ですりつぶ
すことによって天然の形態で得ることができる。熱は蛋
白質であるルシフエラーゼを破壊するが、ルシフエリン
は活性のままに残る。冷却しそして消耗した抽出液と混
合すると、発光が観察される。これは古典的ルシフエリ
ン−ルシフエラーゼ試験の基礎である。
発光を生じるバクテリアは、連続の青緑の光を放射す
る。このようなバクテリアは海水または死んだ魚の表面
から直線単離することができ、そして３％の塩（海水に
等しい）およびある魚類または肉の抽出物を含有する培
地で急速に成長するであろう。
バクテリアのルシフエリンについて推定されている経
路は、次の通りである： 化学発光の検出は、被検体を検出する最も感度の高い
方法の１つである。この方法は高感度であるが、いくつ
かの欠点に悩まされる。大抵の場合において、光の放出
を仲介する化学発光反応は寿命が非常に短く、発光は非
常に迅速であるので、発光の程度を監視しかつまた被検
体の存在の程度を測定するためには、複雑な装置を開発
しなければならない。また、相互作用する相手の性質を
破壊または変化させないで、相互作用する系を被検体に
結合することは困難である。
最近、ある物質、例えば、ヨードフエノールまたはベ
ンゾチアゾール誘導体が、西洋ワサビのペルオキシダー
ゼにより仲介される化学発光の放出の間に存在する場
合、反応速度は遅延すると同時に発光の量子収量は増大
することが明らかにされている［欧州特許出願公開第0
116454号；欧州特許出願公開第0 103 784号；英国特許
第82062 63号；ガリイ（Gary）H.G.トーペ（Thorpe）、
ロバート・ハツガート（Robert Haggart）、ラリー（L
arry）J.クリクカ（Kricka）およびトウマス（Thomas）
P.ホワイトヘツド（Whitehead）、「風疹の抗体、免疫
グロブリンおよびジゴキシンについての増強された発光
性酵素の免疫アツセイ（Enhanced Luminescent Enzym
e Immunoassays For Rubbella Antibody,Immunoglo
bulin And Digoxin）」、バイオケミカル・アンド・
バイオフイジカル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ
（Biochemical and Biophysical Research Ccmmuni
cations）、Vol.119、No.2、481−487ページ、1984年３
月15日；トウマス（Thomas）P.ホワイトヘツド（Whiteh
ead）、ガリイ（Gary）H.G.トーペ（Thorpe）、チモシ
ー（Thimoty）J.N.ガーター（Garter），カロル・グロ
ウカツツ（Carol Groucutt）およびラリー（Larry）J.
クリクカ（Kricka）、「免疫アツセイにおけるペルオキ
シターゼ標識複合体の高感度測定のための増強された発
光法（Enhanced Luminescence Procedure For Sens
itive Determination Of Peroxidase−labelled Co
njugates In Immunoassay）」、ネイチヤー（Natur
e）、Vol.305、158−159ページ、1983年９月８日；ガリ
イ（Gary）H.G.トーペ（Thorpe）、ラリー（Larry）J.
クリクカ（Kricka）、エイリーン・ギレスピー（Eileen
Gillespie）、スーザン・モウスリー（Susan Mosel
y）、ロバート・アメス（Robert Amess）、ネイル・バ
ツゲツト（Neil Baggett）およびウマス（Thomas）P.
ホウイトヘツド（Whitehead）、「６−ヒドロキシベン
ゾチアゾール類による環状ジアシルヒドラジド類の西洋
ワサビのペルオキシダーゼで触媒された化学発光の酸化
の増強（Enhancement Of The Horseradish Peroxid
ase Catalysed Chemiluminescent Oxidation Of C
yclic Diacyl Hydrazides By ６−Hydroxybenzothi
azoles）」、アナリテイカル・バイオケミストリー（An
al.Biochem.）］。この方法は慣用の免疫アツセイ法に
よる被検体の検出に有用であることが示されたが、この
方法を核酸雑種の検出に利用できるかどうかはまったく
立証されていない。
アーウイン・フリドビツチ（Irwin Fridovich），
「窒素性の配位子による西洋ワサビノペルオキシダーゼ
の刺激（The Stimulation Of Horseradish Peroxid
ase By Nitrogenous Ligands」、ザ・ジヤーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（The Journal
of Biological Chemistry）、Vol.238、No.12、1963
年12月、3921−3927ページは、溶液中のペルオキシダー
ゼの窒素性の配位子による安定化を記載している。
従来、発光がブレオマイシン（bleomycin）の鉄開始
活性化による場合、化学ルミネツセンス反応が起こるこ
とが立証された。自己不活化反応はDNAにより影響され
る。
フオトケミストリー・フオトバイオロジー（Photoche
mistry Photobiology）、Vol.40、823−830ページ（19
84）に、発光が標的分子、例えば、DNAにより消光され
ること、およびDNAの存在は、化学発光に関連するいわ
ゆる自己不活化反応により、ブレオマイシンの鉄開始活
性化を妨害しないことが記載されている。この文献がさ
らに述べているところによると、これらの発見はブレオ
マイシンの電子的に励起された中間体は生物分子を変性
できることを示唆しているが、その場合において、励起
した状態の性質は正確ではなかった。
スウエーデン特許出願8200479号は、核酸雑種の化学
発光の検出を記載している。
欧州特許出願公開第0 070 687号は、発光性ポリヌク
レオチドの交雑の診断法に関する。
従来、化学発光反応は急速に進行し過ぎ、こうして光
をほんの短い期間放出させるだけである。増強剤の使用
は化学発光反応からの光を多少延長しかつ増幅するが、
放出された光の期間および強さはなお多くの場合におい
て不適当である。
免疫アツセイは臨床実験室において最も広く使用され
ている分析技術である。現在、免疫アツセイの大部分は
放射性アイソトープ、ことにヨウ素−125を標識として
使用する。しかしながら、放射性アイソトープはある数
の主要な欠点を有する。第１に、標識化法は高度に放射
性物質の使用が必要であり、それゆえ潜在的に危険な試
薬の使用を伴う。第２に、放射能で標識した物質の貯蔵
寿命は比較的短い。なぜなら、まさにその性質により、
放射性アイソトープは連続的に崩壊するばかりでなく、
かつまた放射能で標識した蛋白質はしばしば不安定であ
るからである。第３に、蛋白質を十分に標識して高感度
でかつ急速に検出可能な試薬をつくることはしばしば困
難である。第４に、放射能で標識した物質の廃棄は不都
合である。
これらの欠点は、放射能標識に代わる入手可能な代替
物についての研究を刺激した。標識として適当であるた
めには、ある物質は少なくとも次の３つの要件を満足し
なくてはならない： a.それは配位子、例えば、抗原または抗体に結合したと
き、迅速にかつ非常に少量で検出可能であるべきであ
り、 b.それは、その測定に影響を及ぼさないで、配位子、例
えば、抗原または抗体に結合することが可能であるべき
であり、そして、 c.いったん結合すると、それは配位子の性質を有意に変
更してはならない。
最も有望な代替の標識のあるものは、反応にそれら自
体が関与して発光を生じることのできる物質であるが、
あるいは適当に処理すると、発光反応に関与できる化合
物を生成する物質である。従来、免疫アツセイにおける
発光の使用は困難であった。なぜなら、発光の測定は急
速なプロセスであり、そして、放射能の測定に一般に要
する数分よりはむしろ、数秒で完結しうるからである。
発光は、３つの主要な発光または発光測定系において
使用されてきた。
a.有機発光または有機発光測定の免疫アツセイ、ここで
は発光反応に直接関与する（すなわち、励起状態に転化
され、次いで光子を放射して非励起状態にもどる）化学
発光または生物発光を生ずる化合物が、配位子、例え
ば、蛋白質、ホルモン、ハプテン、ステロイド、核酸、
代謝物、抗原および／または抗体を標識するために使用
されてきた。適当な化合物の例は、ルミノールおよびイ
ソルミノールを包含する； b.発光性触媒またはコフアクターの免疫アツセイ、ここ
では発光反応の触媒またはコフアクターが標識として使
用されてきた。適当な触媒の１例は、酵素のペルオキシ
ダーゼである；そして c.酵素結合免疫アツセイ、ここでは発光反応は適当な基
質への酵素標識の作用により形成された生成物を定量す
るために使用されてきた。この型の免疫アツセイの１例
は、酵素／抗体試薬をグルコースと反応させて過酸化水
素を形成し、次いで生成した過酸化水素の量を制御され
た条件下にルミノールを添加して発光反応を開始するこ
とによって測定することによって、グルコースオキシダ
ーゼを結合した抗体を定量することである。
上のアツセイの感度は、一部分、標識または標識の生
成物の検出の下限により決定される。発光または発光測
定アツセイの場合において、この系の感度は部分的に標
識された物質の単位当りの発光反応において放出される
光に依存するであろう。
化学発光の検出は分析物を検出する最も感度のある方
法の１つである。この方法は、感度があるが、いくつか
の欠点に悩まされる。大抵の場合において、化学発光反
応が仲介する光の放射は寿命が非常に短く発光は非常に
迅速であるので、発光の程度を監視しかつまた被検体の
存在の程度を測定するために、複雑な装置を開発しなく
てはならない。また、相互作用する相手の性質を破壊ま
たは変更させないで、相互作用する系を被検体に結合さ
せることは困難である。
本発明の１つの目的は、長い期間にわたりかつ大きい
強度で光を放射する化学発光反応を提供することであ
る。
また、本発明の他の目的は、発光の期間を延長できる
化学発光装置を提供することである。
本発明の他の目的は、核酸雑種を検出することであ
る。
本発明のなお他の目的は、化学発光を使用して抗体お
よび抗原を検出することである。
本発明の他の目的は、試料中の酵素の検出である。
また、本発明の目的は、化学発光反応に関与すること
のできる核酸を提供することである。
本発明の他の目的は、未知の試料中の核酸を検出する
方法を提供することである。
本発明の他の目的は、核酸雑種を検出することであ
る。
これらの目的および他の目的は、本発明により実現さ
れる。
本発明は、化学発光前駆体、例えば、2,3−ジヒドロ
−1,4−フタラジンジオン、酸化剤（例えば、過酸化水
素）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ酵素）、および
アンモニアおよび水溶性有機アミンから成る群より選択
される窒素化合物を接触させることからなる化学発光法
に関する。
本発明は、また、容器と、化学発光前駆体、酸化剤、
酵素、ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミンから
成る群より選択される窒素化合物を接触させる手段とか
らなる化学発光装置に関する。
本発明は、また、化学発光前駆体、例えば、2,3−ジ
ヒドロ−1,4−フタラジンジオン、酸化剤（例えば、過
酸化水素）、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ酵素）、
ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミンから成る群
より選択される窒素化合物、ならびに化学発光増強剤、
例えば、４−ヨードフエノールまたは６−ヒドロキシベ
ンゾチアゾールを接触させることからなる化学発光法に
関する。
本発明は、さらに、 a.特定の核酸配列、および b.前記核酸配列に光化学的に結合した化学発光前躯体、 からなり、化学発光反応に参加できる核酸プローブに関
する。
本発明に従う他の核酸プローブは、 a.特定の核酸配列、および b.前記核酸配列に、例えば、共有結合した、化学発光増
強剤、 からなる。このようなプローブは、増強された化学発光
反応における関与体として、およびまたルシフエラーゼ
型酵素のための基質として使用することができる。プロ
ーブ（すなわち基質）は、光化学的リンカーにより酵素
に結合することができる。
本発明は、また、増強された化学発光反応に関与する
ことができ、特定の核酸配列からなる他の核酸プローブ
に関し、ここで前記配列は、 a.化学発光前駆体、 b.化学発光増強剤、および c.酵素、 のいずれか１つに結合されており、（ａ）、（ｂ）およ
び（ｃ）の残りの２つは前記配列に結合されておらず、
前記結合された配列との混合状態にある。核酸プローブ
は、均質混合物、例えば、溶液、不均質相として、ある
いは交雑した形態で存在することができる。交雑した形
態は、均質混合物、例えば、溶液とした、あるいは不均
質相として存在することができる。
本発明は、また、試験媒質中の特定の一本鎖ポリヌク
レオチド配列を、例えば、交雑により、決定する方法に
関し、この方法は、 （ａ） 試験媒質を、測定すべき配列に対して実質的に
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドのプローブ
と、前記プローブと測定すべき配列との間の交雑に好適
な条件下に、結合し、 （ｂ） 生ずる雑種または測定すべき配列と交雑しなか
ったプローブを、増強された化学発光反応における化学
発光前駆体、酵素、酸化体および化学発光増強剤を包含
する参加体の１つで標識付けし、 （ｃ） 標識付けられた剤またはプローブを使用してこ
のような化学発光反応を開始し、および （ｄ） 生ずる光の放出を検出する、 工程からなる。
本発明は、試験媒質中の特定の一本鎖ポリヌクレオチ
ド配列を測定する他の方法に関し、この方法は、 （ａ） 試験媒質中の一本鎖核酸を固定化し、 （ｂ） 固定化された核酸を、決定すべき配列に対して
実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの
プローブと、前記プローブと測定すべき配列との間の交
雑に好適な条件下に、接触させ、 ここで、プローブは、 （１） 2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン化学発
光前駆体、ペルオキシダーゼ酵素および化学発光増強剤
を包含する増強された化学発光反応における関与体から
選択された発光標識で標識されているか、あるいは （２） 特異的結合相手のための結合部位を含み、 （ｃ） 生ずる固定化された雑種を、測定すべき配列と
交雑しなかったプローブから分離し、そしてここでプロ
ーブは結合部位を含み、化学発光標識で標識された結合
相手を添加し、 （ｄ） 化学発光反応を分離された標識固定化雑種を使
用して開始し、 そして （ｅ） 生ずる光の放出を検出する、 工程からなる。
本発明は、また、試験媒質中の特定の一本鎖ポリヌク
レオチド配列を測定する他の方法に関し、この方法は、 （ａ） 試験媒質を、決定すべき配列に対して実質的に
相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドのプローブ
と結合して、一本鎖核酸とそれら自体を区別する抗原決
定基を有する雑種を形成し、 ここでプローブは固定化された形態であるか、あるい
は結合部位を含み、これによりプローブはこのような結
合部位のための固定化された形態の結合相手との接触に
より固定化されることができ、 （ｂ） プローブが固定化された形態であるとき、生ず
る雑種を固定化された結合相手と接触させ、 （ｃ） 生ずる固定化された雑種を、区別的な抗原決定
基に結合できる抗体試薬と接触させ、ここで抗体試薬は
2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン化学発光前駆
体、ペルオキシダーゼ酵素および化学発光増強剤を包含
する増強された化学発光反応における関与体から選択さ
れた発光標識で標識されており、 （ｄ） 固定化された雑種に結合するようになる標識さ
れた抗体を結合しなかったものから分画に分離し、 （ｅ） 分離された分画の１つにおいて化学発光反応を
開始し、そして （ｆ） 生ずる光の放出を検出する、 工程からなる。
本発明は、免疫学的反応により、あるいは核酸交雑法
により監視することのできるある種の病気の状態の臨床
的診断にとくに有用な、増強されかつ延長された化学発
光アツセイに関する。本発明は、また、アツセイのため
の反応成分の１つが試験試料中に未知の量ですでに存在
する試料の分析において直接利用することができる。免
疫アツセイを使用することによるそして／または核酸交
雑アツセイによる病気の状態の診断は、高感度の系を必
要とする。存在する被検体の量は通常非常にわずかであ
るので、アツセイの条件は十分に増幅された検出を提供
すべきである。例えば、血液試料中の感染因子、例え
ば、微生物を検出するとき、微生物によりすでに感染さ
れた血液試料中からDNAを抽出し、そしてその微生物に
ついて特異的な核酸プローブを使用することが可能であ
る。この検出は、試験血液試料から抽出されたDNAおよ
び、血液試料を感染したと思われる微生物について特異
的な核酸プローブを使用する交雑によって実施すること
ができる。
核酸の交雑技術は、また、感染因子と明瞭に異なる遺
伝病の検出に使用することもでき、例えば、ベーターヘ
モグロビンへの点突然変異は鎌状赤血球貧血として知ら
れている欠陥を生ずる。ある突然変異で影響を受けてい
る人およびまたこのような欠陥をもつ人は、交雑技術に
より検出することのできるそれらのゲノム中に核酸の特
異的配列を有する。単一の遺伝子の点突然変異の検出の
ためには、検出する遺伝子が低い濃度で存在するので、
高感度の技術を利用することが必須である。通常、放射
能標識アイソトープがこの検出に使用されている。本発
明は高感度の化学発光を提供する。このアツセイはペル
オキシダーゼ様酵素および発光の光基質のためのジアシ
ルヒドラジド様基質によって過酸化物の存在下に仲介さ
れる。本発明が有用である他のアツセイの例は、エラス
チンのアツセイまたはグルコースオキシダーゼペルオキ
シダーゼ系を使用するグルコースのアツセイである。こ
れらのアツセイの原理および用途は、この分野において
知られており、そして上に関連して説明されており、こ
こで化学発光型アツセイをエラスチンまたはグルコース
の検出に使用できること、および化学発光型アツセイを
免疫アツセイの目的で使用できることが立証された。本
発明は、ある種の窒素を含む物質が単独であるいは増強
剤と一緒に化学発光反応において光の放射速度を遅延し
かつ酵素の活性を長時間延長するという驚くべき観察に
基づく。これらの２つの作用の組み合わせから、窒素を
含む物質はペルオキシダーゼおよび過酸化水素が仲介す
るジアシルヒドラジン類からの化学発光を増強しかつ遅
延すると結論することができる。
核酸雑種を検出する本発明による１つの方法では、未
知のDNA含有試料を、混合物、例えば、溶液の中で、化
学発光前駆体に結合された、例えば、フルオロクマリン
の使用により、光化学的に結合された特定の核酸配列か
らなるプローブと接触させ、ここで前記混合物は酸化
剤、酵素、ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミン
から成る群より選択される窒素化合物を含有するもので
あり、次いで発光の程度を測定する。
核酸雑種を検出する本発明による他の方法では、未知
のDNA含有試料を、混合物、例えば、溶液の中で、特定
の核酸配列および前記核酸配列に結合された酵素からな
るプローブと接触させ、ここで前記混合物は化学発光前
駆体、酸化剤、ならびにアンモニアおよび水溶性有機ア
ミンから成る群より選択される窒素化合物を含有するも
のであり、次いで発光の程度を測定する。
核酸雑種を検出する本発明による１つの方法では、未
知のDNA含有試料を、混合物、例えば、溶液の中で、化
学発光前駆体に結合された、例えば、フルオロクマリン
の使用により、光化学的に結合された特定の核酸配列か
らなるプローブと接触させ、ここで前記混合物は酸化
剤、酵素、増強剤、ならびにアンモニアおよび水溶性有
機アミンから成る群より選択される窒素化合物を含有す
るものであり、次いで発光の程度を測定する。
核酸雑種を検出する本発明による他の方法では、未知
のDNA含有試料を、混合物、例えば、溶液の中で、特定
の核酸配列および前記核酸配列に結合された酵素からな
るプローブと接触させ、ここで前記混合物は化学発光増
強剤、ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミンから
成る群より選択される窒素化合物を含有するものであ
り、次いで発光の程度を測定する。
核酸雑種を検出する本発明による１つの方法では、未
知のDNA含有試料を、混合物、例えば、溶液の中で、特
定の核酸配列および前記核酸配列に結合された化学発光
前駆体からなるプローブと接触させ、その後化学発光増
強剤および酸化剤を添加し、次いで発光の程度を測定す
る。
核酸雑種を検出する本発明による他の方法では、未知
のDNA含有試料を、混合物、例えば、溶液の中で、特定
の核酸配列および前記核酸配列に結合された化学発光増
強剤からなるプローブと接触させ、その後化学発光前駆
体および酸化剤を添加し、次いで発光の程度を測定す
る。
本発明による核酸雑種を検出する他の方法では、混合
物、例えば、溶液の中で、未知の核酸含有試料をプロー
ブと接触させ、ここでこのようなプローブは a.特定の核酸配列、 b.前記核酸配列に結合された光化学的リンカー（linke
r）、 c.前記リンカーに結合された配位子、 d.配位子へ結合された結合性蛋白質、および e.前記結合性蛋白質へ結合された酵素、 からなり、その後化学発光物質、化学発光増強剤および
酸化剤を添加し、次いで発光の程度を測定することを含
む。
本発明は、また、化学発光アツセイに関する。
本発明に従う未知の試料中の抗原を検出する化学発光
免疫アツセイは、前記試料を化学発光前駆体または酵素
に結合された抗原と接触させ、前記試料および前記抗原
を酸化剤、ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミン
から成る群より選択される窒素化合物ならびに前記抗原
が化学発光前駆体に結合されている場合には酵素と、あ
るいは前記抗原が酵素に結合されている場合には化学発
光前駆体と、接触させ、そして発光の程度を測定するこ
とからなる。
本発明に従う未知の試料中の抗体を検出する化学発光
免疫アツセイは、前記試料を前記抗原に対する抗体と接
触させ、ここで前記抗体は化学発光前駆体または酵素に
結合されているものであり、前記試料および前記抗体を
酸化剤、ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミンか
ら成る群より選択される窒素化合物ならびに前記抗原が
化学発光前駆体に結合されている場合には酵素と、ある
いは前記抗原が酵素に結合されている場合には化学発光
前駆体と、接触させ、そして発光の程度を測定すること
からなる。
本発明に従う未知の試料中の抗体を検出する他の化学
発光免疫アツセイは、前記試料を前記抗原に対する抗体
と接触させ、ここで前記抗体は化学発光前駆体または酵
素に結合されているものであり、前記試料および前記抗
体を酸化剤、化学発光増強剤、ならびにアンモニアおよ
び水溶液有機アミンから成る群より選択される窒素化合
物、ならびに前記抗原が化学発光前駆体に結合されてい
る場合には酵素と、あるいは前記抗原が酵素に結合され
ている場合には化学発光前駆体と、接触させ、そして発
光の程度を測定することからなる。
本発明に従う未知の試料中の抗体を検出する他の化学
発光免疫アツセイは、前記試料を前記抗原に対する抗体
と接触させ、ここで前記抗体は化学発光前駆体または酵
素に結合されているものであり、前記試料および前記抗
体を酸化剤、化学発光増強剤、ならびにアンモニアおよ
び水溶液有機アミンから成る群より選択される窒素化合
物、ならびに前記抗原が化学発光前駆体に結合されてい
る場合には酵素と、あるいは前記抗原が酵素に結合され
ている場合には化学発光前駆体と、接触させ、そして発
光の程度を測定することからなる。
本発明は、さらに、未知の試料を化学発光前駆体、酸
化剤、ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミンから
成る群より選択される窒素化合物と接触させ、そして発
光の程度を測定することからなる、ペルオキシダーゼ酵
素を検出するための化学発光アツセイに関する。
本発明は、さらに、未知の試料を化学発光前駆体、酸
化剤、化学発光増強剤、ならびにアンモニアおよび水溶
性有機アミンから成る群より選択される窒素化合物と接
触させ、そして発光の程度を測定することからなる、ペ
ルオキシダーゼ酵素を検出するための化学発光アツセイ
に関する。
さらにまた、化学発光前駆体、酵素、酸化剤、ならび
にアンモニアおよび水溶性有機アミンから成る群より選
択される窒素化合物からなる、化学発光アツセイを実施
するための試験キツトに関する。
さらにまた、化学発光前駆体、酵素、酸化剤、化学発
光増強剤、ならびにアンモニアおよび水溶性有機アミン
から成る群より選択される窒素化合物からなる、化学発
光アツセイを実施するための試験キツトに関する。
本発明は、また、アンモニアおよび水溶性有機アミン
から成る群より選択される窒素化合物および化学発光反
応成分、すなわち、化学発光前駆体、酸化剤および酵素
を含有する容器から構成された化学発光装置に関する。
このような装置の１つの実施態様において、容器は少な
くとも２つの隔室、これらの隔室の各々は少なくとも１
種であるが、すべてではない化学発光反応成分を含有
し、そして窒素化合物および反応成分を一方の隔室から
他方の隔室へ流すための手段を含有する。
本発明は、また、アンモニアおよび水溶性有機アミン
から成る群より選択される窒素化合物および化学発光反
応成分、すなわち、化学発光前駆体、酸化剤、化学発光
増強剤および酵素を含有する容器から構成された他の化
学発光装置に関する。このような装置の１つの実施態様
において、容器は少なくとも２つの隔室、これらの隔室
の各々は少なくとも１種であるが、すべてではない化学
発光反応成分を含有し、そして窒素化合物および反応成
分を一方の隔室から他方の隔室へ流すための手段を含有
する。
本発明は、ある種の窒素化合物および増強剤、例え
ば、ヒドロキシベンゾチアゾールまたはルシフエリンの
相乗的な組み合わせてによって、増強された化学発光法
の寿命および強さを増加させるという驚くべき観察を記
載する。それらを一緒に使用すると、それらが別々に存
在するときよりも強い光および延長された光を放出す
る。光の放出の合計量は、本発明により、個々の光の放
出の合計、例えば、アンモニア含有緩衝剤およびルシフ
エリン含有緩衝剤からの合計よりも大きい。
ピコグラム以下の量の核酸雑種を本発明により検出す
ることができ、これに対して化学発光技術を用いる免疫
アツセイでは、数ナノグラムの量の被検体、例えば、抗
体または抗原を容易に検出することができるに過ぎな
い。
本発明は、ある条件下では、核酸は前記方法に認めら
れ得る作用をもたないため、酵素、例えば西洋ワスビペ
ルオキシダーゼ仲介の化学発光反応を利用して非常に少
量のDNA、RNAまたは他の核酸を、核酸が対応する未知の
試験試料にまたは相補的な核酸配列に対して交雑された
後、検出することができるという、驚くべき観察に基づ
く。
本発明において使用するための窒素化合物の非制限的
例は、アンモニアおよびその塩類、複素環式芳香族およ
び水溶性アミン、例えば、有機アミンを包含する。本発
明において使用するためのアンモニアの塩類の例は、例
えば、酢酸塩、塩化物、硝酸塩、硫酸塩、リン酸塩およ
びホウ酸塩、第一、第二、第二および第四級アンモニウ
ム塩（ここでプロトンはアルキルまたはアリール残基で
交換されている）である。本発明において使用するため
の複素環式窒素化合物の非制限的例は、イミダゾール類
およびそれらのアルキル誘導体およびピリジンおよびそ
のアルキル誘導体を包含する。本発明において使用する
ためのアミンは、アルキルアミン、ポリアミン、アリー
ルアミンおよびベンジルアミンを包含する。本発明にお
いて使用するためのポリアミンの非制限的例は、プトレ
シン（ブチレン−ジアミン）、スペルミル、スペルミジ
ン、およびそれらのアルキル塩類を包含する。チアジン
類も本発明において窒素化合物として使用できる。チア
ジン類の例は、チオニン（thionine:3−イミノ−3H−フ
エノチアジン−７−アミン）およびメチレンブルーであ
る。
本発明において使用するアルキルアミンは、式 式中、X1、X2、X3は同一もしくは相異り、そして脂肪
族飽和炭化水素基である、 により例示される。本発明において使用するための脂肪
族飽和炭化水素基の非制限的例は、１〜８個の炭素原
子、好ましくは１〜８個の炭素原子を有する非置換およ
び置換のアルカンである。このような置換アルカンのた
めの置換基の非制限的例は、ヒドロキシ、ニトロ、ハロ
（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード）、カル
ボキシ、アミドなどを包含する。
本発明において使用するための化学発光前駆体は、2,
3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン（「DPD」）を包
含する。好ましくは、2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジン
ジオンは、式 式中、R1はアミノであり、そしてR2、R3およびR4の各
々は置換されていてもよいC1−C6−アルキルもしくはア
ルケニル、ヒドロキシル、C1−C6−アルコキシ、カルボ
キシル、またはアミノであり、あるいはR2はアミノであ
り、そしてR1、R3およびR4の各々はＨ、非置換もしくは
置換のC1−C6−アルキルもしくはアルケニル、ヒドロキ
シル、C1−C6−アルコキシ、カルボキシルまたはアミノ
であり、あるいはR1およびR2は、一緒に、ベンゾ基のア
ミノまたは置換アミノの誘導体であり、そしてR3および
R4の各々はＨ、非置換もしくは置換のC1−C6−アルキル
もしくはアルケニル、ヒドロキシル、C1−C6−アルコキ
シ、カルボキシル、またはアミノである、 で示される。とくに好ましい化学発光前駆体は、５−ア
ミノ−2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン（ルミノ
ール）および６−アミノ−2,3−ジヒドロ−1,4−フタラ
ジンジオン（イソルミノール）である。
本発明において使用するための置換されたアルキル、
アルケニルおよびアミンは、この分野においてよく知ら
れている。このような置換された基の置換基の非制限的
例は、ハロゲン、例えば、クロロ、フルオロ、ブロモお
よびヨード、ヒドロキシ、カルボキシ、ニトロ、シアノ
およびチオールである。さらに、本発明において使用す
るためのアミン基は、アルキル、好ましくは１〜10個の
炭素原子を有するアルキル、およびアルケニル、好まし
くは２〜10個の炭素原子を有するアルケニルで置換され
ることができる。本発明において使用するためのヒドロ
キシル基は、ハロゲン、アルキル、好ましくは１〜10個
の炭素原子を有するアルキル、またはアルケニル、好ま
しくは２〜10個の炭素原子を有するアルケニルで置換さ
れることができる。
一般に、どのようなペルオキシダーゼ酵素も本発明に
おいて使用できる。本発明において使用するための酵素
の非制限的例は、西洋ワサビのペルオキシダーゼ（HR
P）、ミクロペルオキシダーゼおよびラクトペルオキシ
ダーゼを包含する。
化学発光前駆体と反応して化学反応前駆体を励起さ
せ、こうしてそれが発光反応において光を放出するよう
にさせる、いかなる酸化剤も本発明において使用するこ
とができる。とくに好ましい酸化剤は、過酸化水素、過
ホウ酸のイオンおよびナトリウムパーオキデート（sodi
umperoxidate）である。
本発明において使用するための緩衝化アミンの例は、
アンモニアである。
化学発光増強剤の非制限的例は、４−クロロフエノー
ル、４−ブロモフエノール、４−ヨードフエノール、４
−ブロモ−２−クロロフエノール、2,4−ジクロロフエ
ノール、3,4−ジクロロフエノール、４−メチルフエノ
ール、４−tert−ブチルフエノール、３−（４−ヒドロ
キシフエニル）プロピオン酸エチル、４−ベンジルフエ
ノール、４−（３′−メチルクロチル）フエノール、４
−スチリルフエノール、４−（２′,4′−ジニトロスチ
リル）フエノール、４−ヒドロキシ桂皮酸、アルフア−
シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、４−フエニルフエノー
ル、４−（４′−ヒドロキシフエニル）フエノール、２
−クロロ−４−フエニルフエノール、４−（４′−ヒド
ロキシフエニル）ベンゾフエノン、４−（フエニルア
ゾ）フエノール、４−（２′−カルボキシフエニルア
ゾ）フエノール、４−フエノキシフエノール、４−
（４′−ヒドロキシフエノキシ）フエノール、４−ヒド
ロキシフエニルサルフアイド、４−ヒドロキシフエニル
ジサルフアイド、ナフト−２−オール、１−ブロモナフ
ト−２−オール、６−ブロモナフト−２−オールおよび
1,6−ジブロモナフト−１−オールである。
本発明において使用するための他の化学発光増強剤の
非制限的例は、６−ヒドロキシベンゾチアゾール類、例
えば、式 式中、ＲはＨ、CNまたは非置換もしくは置換のチアゾ
ールであり、そしてX1、X2およびX3の各々はＨ、置換さ
れていてもよいC1−C6−アルキルもしくはアルケニル、
ヒドロキシル、置換ヒドロキシル、C1−C6−アルコキ
シ、カルボキシル、アミノまたは置換アミノである、 で示される６−ヒドロキシベンゾチアゾール類を包含す
る。とくに好ましい化学発光増強剤は、ホタルのルシフ
エリン（4,5−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−
ベンゾチアゾリル）−チアゾール−４−カルボン酸）お
よびデヒドロルシフエリンである。
本発明の化学発光反応からの発光は、酵素、酸化剤、
化学発光前駆体および緩衝化アミンまたは増強剤に依存
するが、また、二次因子、例えば、温度、pH、試薬濃
度、混合速度および光の測定法によって決定されるであ
ろう。本発明の系の感度を最大にするためには、これら
の二次因子を調節して、最大の発光を、再現性よく容易
に測定可能な方法で、信号対バツクグラウンドの比をで
きるだけ大きくして、得るべきである。
選択する条件は、一般に、酵素または酸化剤の触媒活
性、反応の動力学、使用する装置、信号対バツクグラウ
ンドの比および要求する感度に伴う調整を包含する。
最適な結果を得るためには、本発明の化学発光反応は
10℃〜50℃の範囲の温度および６〜10、好ましくは７〜
９のpHの適度な条件下で実施すべきである。本発明はこ
れらの温度に限定されず、そして温度はそれ自体臨界的
ではない。本発明において使用できる適当な緩衝性物質
は、リン酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン、２−アミノ−２−メチル−1,3−プロパンジオール
である。
次の試薬の濃度（溶液に添加するとき）が、本発明に
おける使用にとくに適する： 酵素 0.01ng〜5000mg/l 酸化剤 10μモル〜300ミリモル/l 化学発光物質 0.5μモル〜200ミリモル/l 窒素化合物 ５μモル〜500ミリモル/l 化学発光増強剤 ５μモル〜100ミルモル/l 本発明の一態様は、核酸雑種の検出に関する。
本発明の方法において使用する１つの核酸プローブ
は、配位子に結合した核酸配列、例えば、結合性蛋白質
に結合した配位子であり、そしてこのような結合性蛋白
質は酵素に結合されている。核酸は配位子へ、挿入剤
（インターカレーシヨンを起こす試薬）、例えば、フロ
クマリンまたはフエナントリジン化合物により、あるい
は非挿入剤、例えば、ネトロプシン、ジスタマイシンお
よびビス−ベンズイミダゾールにより結合することがで
きる。とくに好ましい挿入剤は、フクロマリン類、例え
ば、アンゲリシン（イソプソラレン）、プソラレンおよ
びそれらの誘導体、例えば、４−アミノメチル−4,5′
−ジメチルアンゲリシン、４′−アミノメチルトリオキ
ソラン、３−カルボキシ−５−または−８−アミノ−ま
たは−ヒドロキシ−プロラレン、ならびにモノ−または
ビス−アジドアミノアルキルメチジウムまたはエチジウ
ム化合物である。
本発明において使用するための挿入剤の非制限的例
は、下表に例示する通りである： とくに有用な挿入剤は、アジド挿入剤である。それら
の反応性ナイトレン類は長い波長の紫外線または可視光
線で容易に発生し、そしてアリールアジド類のナイトレ
ン類はそれらの転位生成物よりも挿入反応を好む［ホワ
イト（White）ら、メソツド・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymol.）、47、644（1977）］代表的な
アジド挿入剤は、３−アジドアクリジン、９−アジドア
クリジン、エチジウムモノアジド、エチジウムジアジ
ド、エチジウム二量体アジド［ミツチエル（Mitchell）
ら、JACS、104、4265（1982）］、４−アジド−７−ク
ロロキノリンおよび２−アジドフルオレンである。他の
有用な挿入剤はフロクマリン類であり、これらはピリジ
ン残基をもつ［２＋２］シクロアダクトを形成する。ア
ルキル化剤、例えば、ビスジクロロエチルアミン類およ
びエポキシド類またはアジリジン類、例えば、アフラト
キシ類、多環式炭化水素エポキシド類、マイトマイシン
およびノルフイリンＡを使用することもできる。
本発明において使用するための適当なアンゲリシン誘
導体は、次の式を有する： 式中、R1、R2、R3およびR4は、次の通りである： 異なるＲ基をもつ他の化合物を発表された手順に従い
合成できる。
本発明における使用に適当なプソラレン誘導体は、次
の式をもつ： 式中、 Ｒ、R1およびR3は、各々独立に、水素または低級アル
キルであり、 R4は水素、低級アルキルまたはヒドロキシ置換低級ア
ルキル、低級アルコキシ、アミノ、ハロおよび／または であり、そして R2およびR5は、各々独立に、水素、ヒドロキシ、カル
ボキシ、カルボ−低級アルコキシまたは低級アルコキシ
である。
アンゲリシン誘導体はモノ付加物の形成についてプソ
ラレン化合物よりも優れる。一本鎖プローブがある余分
の二本鎖DNAへ共有結合する場合、フエナントリジウム
およびプソラレン化合物は暗所中で二本鎖DNAに優先的
に相互作用するので望ましい。
本発明における使用のための核酸配列の非制限的な例
は、例えば、制御酵素により生産されるような、一本鎖
または二本鎖のDNAまたはRNAまたはそれらの断片である
ことができ、あるいは比較的短いオリゴマーであること
さえできる。
本発明の実施態様において、プローブは固体の支持
体、例えば、ニトロセルロース紙上に固定化される。
本発明における使用のための配位子の非制限的な例
は、ハプテン類およびビオチン、例えば、ビオチン−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドおよびビオチン−Ｐ−ニト
ロフエニルエステルを包含する。
本発明における使用のための結合性蛋白質の非制限的
な例、抗体、アビジンおよびストレプトアビジンを包含
する。
本発明を実施するための１つの実施態様において、ニ
トロセルロース紙上の交雑により固定化された、すなわ
ち、透明容器内に閉じ込められた、標識プローブは、高
感度写真フィルム、例えば、「ポラロイド（POLAROI
D）」フイルムのカートリツジ上に配置する。固定化さ
れたプローブおよびフイルムのカートリツジ、および溶
液の状態の適当な試薬（使用する試薬は利用するプロー
ブに依存し、例えば、プローブが化学発光物質を含有す
るとき、試薬の溶液は増強剤、酸化剤および酵素を含有
するであろう）を、容器に注入して固定化されたプロー
ブと接触させる。次いで、試薬とプローブとの間の反応
により放出した光はフイルム上で検出されるであろう。
放出された光の波長は使用する試薬に依存することに注
意すべきである。交雑が起こるとき、光は放出されるで
あろう。交雑が起こらない場合、光は放出されないであ
ろう。
プローブおよび交雑のフオーマツト 本発明の方法に従うことにより、交雑アツセイおよび
検出に使用できる多くの種類のプローブおよびフオーマ
ツトが存在する。
本発明の目的に対して本質的にいかなる核酸交雑のフ
オーマツトに従うこともでき、ここでプローブと決定す
べき配列との間で形成された雑種あるいは問題の配列と
交雑しなかったプローブのいずれかを選択した化学発光
標識で標識付けする。この分野において知られているよ
うに、このような雑種または交雑しなかったプローブの
標識化は実際の交雑反応の前または後に実現することが
できる。通常、プローブは特異的架橋反応により標識さ
れるかあるいは標識することができ、あるいは形成した
雑種は、通常特異的架橋反応により、引き続いて標識さ
れる。本発明の中心の新規な面は、増強された化学発光
の現象を核酸の交雑の検出に有利に応用できることであ
る。
プローブは、検出すべき配列に対して相補的であるか
あるいはそれと相同の少なくとも１種の一本鎖塩基配列
からなるであろう。しかしながら、このような塩基配列
は単一の連続のポリヌクレオチドセグメントである必要
はなく、非相同の配列により中断された２以上の個々の
セグメントから構成されることができる。これらの非相
同の配列は線状であることができ、あるいはそれらは自
己相補的であり、そしてヘヤピンループを形成すること
ができる。さらに、プローブの相同領域は３′−、５′
−末端で非相同配列、例えば、増殖のため相同配列が挿
入されたベクターのDNAまたはRNAからなるものによって
フランキング（flanking）されることができる。いずれ
の場合においても、分析用試薬として提供されるプロー
ブは１または２以上の点において問題の試料の核酸との
交雑を示すであろう。線状または円形の一本鎖ポリヌク
レオチドをプローブの要素として使用することができ、
主要部分または小部分は相補的なポリヌクレオチドの１
またはそれ以上の鎖と二重らせんを形成しており、ただ
し重要な１またはそれ以上の相同セグメントは一本鎖の
形態でありかつ試料のDNAまたはRNAと交雑に利用されな
くてはならない。相同プローブ配列が本質的に一本鎖の
形態である線状または円形のプローブはとくに好ましい
［とくにフー（Hu）およびメツシング（Messing）、ジ
ーン（Gene）、17、271−277（1982）参照］。
単一のポリヌクレオチド配列のプローブとして使用す
るフオーマツトは、この分野において貫通である。プロ
ーブは化学発光反応に関与できるような方法で標識する
ことができる。これはプローブをある蛋白質に特異的に
結合する配位子、例えば、ピオチンで標識することによ
って達成することができ、そしてその蛋白質は、例え
ば、ルミノールまたは西洋ワサビのペルオキシダーゼに
共有結合した化学発光反応の成分のための担体であるこ
とができる。
プローブは、また、化学発光反応の相手に直接結合さ
せることができる。プローブはルミノールまたは西洋ワ
サビのペルオキシダーゼに光化学的に結合させることが
できる。交雑後、雑種が反応成分の残部と免疫学的に区
別して挙動するような方式で、プローブを生成すること
もでき、例えば、DNAプローブをRNAの検出に使用する
か、あるいはRNAプローブをDNAの検出に使用する場合、
DNA/RNA雑種はそれらの雑種を認識する免疫学的に特異
的な抗体を生成し、そしてそれらの特異的認識を雑種の
検出に利用することができる。RNAプローブを固定化す
る場合、雑種は同様に固定化され、そしてRNA/DNA雑種
に対して特異的な抗体を雑種と反応させる。抗体が化学
発光反応に関与できる標識を有する場合、雑種は抗体お
よび化学発光法を経て検出することができる。例えば、
RNA/DNA雑種特異的抗体を西洋ワサビのペルオキシダー
ゼに共有結合する場合、ペルオキシダーゼ結合抗体との
交雑および相互作用後、前駆体および酸化剤を添加する
ことにより、化学発光反応を開始することが可能であろ
う。
核酸を免疫原性としかつ他の核酸と免疫学的に区別で
きるようにさせる、いくつかの他の方法が存在する。RN
A/DNAまたはDNA/DNA雑種に対して選択的である抗体も知
られており、そして同様に使用することができる。さら
に、核酸が挿入剤と相互作用する場合、核酸の複合体は
未反応の核酸から免疫学的に区別されるようになる。雑
種のフオーマツトにおいて、プローブが交雑後このよう
な相互作用部位を提供するようにプローブを調製する場
合、抗体のアツセイは雑種の検出のために実施すること
ができる。２つの慣用のアツセイのフオーマツトを下に
詳述する。
本発明の分析法の実施は、いかなる特定の交雑フオー
マツトにも限定されない。慣用の交雑技術を使用するこ
とができる。改良がなされかつ概念的に新規なフオーマ
ツトが開発されるので、このようなものは本発明の方法
を実施するとき容易に適用することができる。とくに有
用な慣用の交雑フオーマツトは、試料のヌクレオチド酸
またはポリヌクレオチドプローブを固体の支持体上に固
定化するもの（固相の交雑）およびポリヌクレオチド種
がすべて溶液中に存在するもの（溶液の交雑）を包含す
る。
固相の交雑フオーマツト 固相の交雑フオーマツトにおいて、交雑に参加するポ
リヌクレオチド種の１つを適当な方法でその一本鎖の形
態で固体の支持体へ固定する。有用な固体の支持体はこ
の分野においてよく知られており、そして核酸を共有的
にまたは非共有的に結合するものを包含する。疎水的結
合を包含すると一般に理解されている非共有的支持体
は、天然に産出するポリマー材料および合成のポリマー
材料、例えば、ニトロセルロース、誘導化ナイロン、お
よびフツ素化ポリハイドロカーボンを種々な形態、例え
ば、フイルターまたは固体のシートの形態で包含する。
共有結合の支持体は、また、有用であり、そして化学的
に反応性の１または２以上の基を有する材料、例えば、
ジクロロトリアジン、ジアゾベンジルオキシメチルなど
を包含し、ポリヌクレオチドへの結合のために活性化す
ることができる。
典型的な固相交雑技術は、支持体へ試料の核酸を一本
鎖の形態で固定化することで開始される。この初期の工
程は試料からの相補的鎖の再アニーリングを本質的に防
止し、そして検出を増大するために支持体上に試料材料
を集中させる手段として使用することができる。次い
で、このポリヌクレオチドのプローブを支持体と接触さ
せ、そして交雑をここに記載する方法により検出する。
本発明の目的に対して本質的にいかなる核酸交雑のフ
オーマツトに従うこともでき、ここでプローブと測定す
べき配列との間で形成された雑種あるいは問題の配列と
交雑しなかったプローブのいずれかを選択した化学発光
標識で標識する。この分野において知られているよう
に、このような雑種または交雑しなかったプローブの標
識化は実際の交雑反応の前または後に実現することがで
きる。通常、プローブは特異的結合反応により標識され
るかあるいは標識することができ、あるいは形成した雑
種は、通常特異的結合反応により、引き続いて標識され
る。本発明の中心の新規な面は、増強された化学発光の
現象を核酸の交雑の検出に有利に応用できることであ
る。
プローブは、検出すべき配列に対して相補的であるか
あるいはそれと相同の少なくとも１種の一本鎖塩基配列
からなるであろう。しかしながら、このような塩基配列
は単一の連続のポリヌクレオチドセグメントである必要
はなく、非相同の配列により中断された２以上の個々の
セグメントから構成されることができる。これらの非相
同の配列は線状であることができ、あるいはそれらは自
己相補的であり、そしてヘヤピンループを形成すること
ができる。さらに、プローブの相同領域は３′−、５′
−末端で非相同配列、例えば、増殖のため相同配列が挿
入されたベクターのDNAまたはRNAからなるものによって
フランキングされることができる。いずれの場合におい
ても、分析用試薬として提供されるプローブは１または
２以上の点において問題の試料の核酸との交雑を示すで
あろう。線状または円形の一本鎖ポリヌクレオチドをプ
ローブの要素として使用することができ、主要部分また
は小部分は相補的なポリヌクレオチドの１またはそれ以
上の鎖と二重らせんを形成しており、ただし重要な１ま
たはそれ以上の相同セググメントは一本鎖の形態であり
かつ試料のDNAまたはRNAと交雑に利用されなくてはなら
ない。相同プロープ配列が本質的に一本鎖の形態である
線状または円形のプローブはとくに好ましい［とくにフ
ー（Hu）およびメツシング（Messing）、ジーン（Gen
e）、17、271−277（1982）参照］。
通常、プローブは選択した化学発光標識で直接にある
いは１または２以上の特異的結合対を介して間接に標識
される。ここで使用するとき、１または２以上の特異的
結合対を介する開度の標識化、固定化または他の修飾
は、１対の相互に結合する物質の一方を標識すべき物質
など、例えば、プローブへの結合、および前記対の他方
の構成員の標識化、固定化などを意図する。有用な結合
する対は、ビオチン／アビジン（卵白のアピジンおよび
ストレトアビジンを包含する）、ハプテンおよび抗原／
抗体、炭水化物／レクチン、酵素／阻害剤などのこの分
野において知られているものを包含する。また、対、例
えば、結合するビオチンまたはパプテンを標識すべき物
質などに、および／または、標識の固相などに架橋する
ことができ、そしてそれぞれアビジンまたは抗ハプテン
を使用して２つを架橋することができる。
標識したプローブおよび固定化した試料の核酸を使用
するとき、生ずる雑種を交雑しないプローブから分離
し、そして化学発光反応を分離した分画の一方または他
方において開始する。雑種を交雑しない一本鎖のプロー
ブと区別する抗雑種抗体によって雑種を検出する場合、
雑種および交雑しないプローブを分離する必要はない。
このような抗体は混合されたDNA/RNA雑種のために選択
的であるか、あるいはRNA/RNAまたはDNA/DNA雑種につい
て選択的であるか、あるいは挿入剤が雑種に導入されて
いる場合挿入剤の二重らせんのために選択的であること
ができる。このような抗体試薬について、下に詳述す
る。
試料の核酸の固定化を含む方法の代替法は、固定化さ
れたプローブを用い、そして前述の化学発光標識で直接
または特異的結合対を介して標識された抗雑種抗体を使
用して得られた固定化雑種の検出を用いる。固定化され
た形態で交雑反応に提供されるとき、プローブはそのプ
ローブ、および交雑によりおよび／または抗雑種試薬の
結合によりそのプローブと関連するようになる反応混合
物の成分を、引き続いて残りの混合物から、例えば、遠
心分離、濾過、クロマトグラフイーまたはデカンテーシ
ヨンにより単離または分離することを可能とする任意の
適当な形態であることができる。従って、種々の組成お
よび形状の固定化されたプローブは、明らかでありそし
てこの分野の研究者らには入手可能であろう。反応混合
物中に不溶性の本質的に任意の形態のプローブを使用す
ることもできる。例えば、プローブは凝集しあるいは他
の方法で沈殿しており、不溶性物質、ポリマー、支持体
へ結合されており、あるいはゲル、例えば、アガロース
またはポリアクリルアミド中に捕捉されていることがで
きる［メソツズ・イン・エンジモロジー（Methods in E
nzymology）、12B:635（1968）およびPNAS、67、807（1
970）参照］。共有結合または非共有結合によりプロー
ブを取り付けあるいは固定する固体の支持体を使用する
ことがとくに好ましく、後者は適当に安定なかつ強い取
り付けを提供する吸着法を包含する。固体の支持体は種
々の形状および組成を取ることができ、例えば、微小粒
子、ビーズ、多孔質および不透過性のストリツプおよび
膜、反応容器、例えば、試験管およびマイクロタイター
プレート（microtiter plate）の内表面を包含する。所
望の反応相手を選択した固体の支持体に取り付ける手段
は、この分野の研究者にとって自明であろう。
プローブをニトロセルロースの膜上に吸着させる１つ
の方法は、プローブの溶液をヨウ化ナトリウムで飽和さ
せ、そしてアリコートを膜上にスポツテイングまたは濾
過することを包含する［ブレツサー（Bresser）ら、DN
A、２、2438（1983）］。ヨウ化ナトリウムはプローブ
の変性を促進かつ膜上への吸着を増進する。あるいは、
プローブをグリオキサールで、通常約１モル濃度（Ｍ）
で、処理し、次いで膜上に吸着させることができる。プ
ローブは約80℃に真空下に２〜４時間ベーキングするこ
とにより固定する。［P.S.トウマス（Thomas）、メソツ
ズ・イン・エンジモロジー（Meth.in Enzym.）、100、2
55（1983）］。
RNAまたはDNAの共有結合の固定化を、また、実施する
ことができる。広範な種類の支持物質および結合技術を
用いることができる。例えば、プローブはホスホセルロ
ースへカルボジイミドまたはカルボニルジイミダゾール
により活性化されたホスフエート基を介して結合するこ
とができる［E.K.F.バウツ（Bautz）およびB.D.ホール
（Hall）、プロシーデイングス・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、US
A、48、400−408（1974）;T.Y.シー（Shih）およびM.A.
マーチン（Martin）、バイオケミストリー（Bioche
m.）、13、3411−3418（1974）］。また、ｍ−ジアゾベ
ンゾイルオキシメチルセルロース上のジアゾ基は、ポリ
ヌクレオチドのグアニンおよびチミジンの残基と反応す
ることができる［B.E.ノイエス（Noyes）およびG.R.ス
ターク（Stark）、セル、（Cell）、５、301−310（197
5）;J.レイザー（Reiser）ら、バイオケミカル・アンド
・バイオフイジカル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ
（Biochem.Biophys Res.Comm.）、85、1104−1112（197
8）］。多糖類の支持体は、また、水溶性カルボジイミ
ドの活性化により［D.リツチウツド（Richwood）、バイ
オヒミカ・エト・バイオフイジカ・アクタ（Biochim.Bi
ophys Acta）、269、47−50（1972）;P.T.ギルハム（Gi
lham.）、バイオケミストリー（Biochem．）７、2809−
2813（1968）］、あるいはポリヌクレオチド上の親格部
位と臭化シアン活性化支持体との結合により、［D.J.ア
ーントージヨビン（Arndt−Jovin）ら、ユーロピアン・
ジヤーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Bioche
m.）、54、411−418（1975）;U.リンバーグ（Linberg）
およびS.エリクソン（Ericksson）、ユーロピアン・ジ
ヤーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Bioche
m.）、18、474−479（1971）］ポリヌクレオチドの末端
ホスフエートと支持体のヒドロキシルとの間に形成され
たホスホジエステル結合を介する結合で使用することが
できる。さらに、プローブの３′−ヒドロキシ末端を過
ヨウ素酸塩により酸化し、そしてシツフ塩基によりアミ
ンまたはヒドラジド基を有する支持体と結合させること
ができる［P.F.ギルハム（Gilham）、］メソツズ・イン
・エンジモロジー（Meth.in Enzym.）、21、191−197
（1971）;H.D.ハンスケ（Hansske）ら、メソツズ・イン
・エンジモロジー（Meth.in Enzym.）、59、172−181
（1979）］。親核部位を有する支持体を塩化シアヌル酸
と反応させ、次いでポリヌクレオチドと反応させること
ができる［H.D.ハンガー（Hunger）、バイオヒミカ・エ
ト・バイオフイジカ・アクタ（Biochim.Biophys.Act
a）、653、344−349（1981）］。
一般に、任意の方法をプローブの固定化に使用するこ
とができるが、ただし相補的な一本鎖の配列が試料の核
酸への交雑に利用されなくてはならない。具体的な方法
または材料は本発明において臨界的ではない。
興味ある別の方法はサンドイツチ交雑技術であり、こ
こでプローブの相同配列の２つの相互に排他的な断片の
一方を固定化し、そして他方を標識する。問題のオリゴ
ヌクレオチドの存在は固定化されかつ標識されたプロー
ブのセグメントに対する二重の交雑を生じさせ、再び同
一の究極の測定は固定化されかつ標識されたプローブの
セグメントに対する二重の交雑を生じさせ、再び支持体
に関連して標識された雑種の同一の究極の測定を用い
る。それ以上の詳細については、メソツズ・イン・エン
ジモロジー（Methods in Enzymology）、65、468（198
0）およびジーン（Gene）、21、77−85（1983）を参
照。
さらに良好に例示するため、挿入剤が使用された二重
らせんに対する抗体を使用する検出を伴う次の固相交雑
は本発明においてとくに有用である。
第１の方法において、液状試験媒質からの一本鎖核酸
をまず固体の支持体上に固定化する。次いで、固定化さ
れた試料の核酸をプローブ（この場合、相補的一本鎖部
分に加えて、挿入剤と挿入剤複合体の形態で化学的に結
合した物少なくとも１種の二本鎖部分を含む）と接触さ
せることによって、交雑反応混合物を形成する。プロー
ブの特定の有用な形態は、上のフー（Hu）およびメツシ
ング（Messing）の文献に記載されている円形の形態で
ある。生ずる交雑凝集物はプローブと交雑した固定化さ
れた目的のオリゴヌクレオチドからなり、共有結合し、
挿入剤が挿入された二本鎖区域を有する。次いで、固定
化された二重らせんを有する固体の支持体は反応混合物
の残部から優先的に分離される。抗体を添加し、好まし
くは選択した化学発光標識で標識された抗体を添加し、
そして得られる凝集体中の挿入剤複合体に結合した固定
化抗体を反応混合物の残部から分離する。次いで、支持
体へ結合した抗体を定量してアツセイを完了する。ある
いは、分離した溶液中の抗体を測定することができる
が、こは大過剰の抗体を通常必要とするので、一般に好
ましさに劣る。
この方法の変法は上のようなプローブを使用すること
であるが、このプローブは二本鎖区域へ結合した共有結
合した挿入剤をもたない。むしろ、挿入剤を固定化され
た凝集体に添加して、プローブの二本鎖区域および交雑
により形成された二重らせん化区域の両者と挿入剤の複
合体を形成する。
第２の方法はサンドイツチのフオーマツトに基づき、
ここで反応混合物を目的に配列および第１および第２の
プローブを含有する試験媒質から形成し、各々はそれぞ
れ目的の配列の相互に排他的な部分に対して相補的な少
なくとも１つからなる。第１プローブは固体の支持体上
に固定化されており、そして第２プローブは前の方法に
おけるように共有結合した挿入剤複合体で修飾されてい
る。得られる交雑凝集体は、固定化されたプローブおよ
び挿入剤複合体修飾プローブの両者に対して交雑した目
的の配列からなる。抗体、好ましくは標識された形態の
抗体を添加し、得られる凝集体中の挿入剤複合体に結合
した固定化された抗体を反応混合物の残部から分離す
る。次いで、結合した抗体を定量する。
この第２の方法のいくつかの有用な変法が存在する。
第１、第１の方法の変法の例におけるように、共有結合
挿入剤を含まないプローブを使用することができるが、
むしろ遊離の挿入剤を固定化された複合体に添加して、
すべて有効な二本鎖区域をもつ挿入剤複合体を形成する
ことができる。また、二本鎖部分をもつ第２プローブを
使用する別法として、挿入剤を化学的に結合して有する
完全に一本鎖核酸のプローブを使用し、こうして交雑の
とき、挿入剤複合体が形成するか、あるいは挿入剤を添
加し、こうして２つのプローブと検出すべき配列との間
に形成した二重らせんの間にインターカレーシヨンが起
こるようにする。
この第３の方法において、試料の核酸を固定化された
プローブと接触させ、そして好ましくは生ずる固定化さ
れた二重らせん体を反応混合物の残部から分離する。こ
のフオーマツトにおいて、プローブは一本鎖の形態であ
る。生ずる交雑生成物は、目的の配列と交雑した固定化
されたプローブからなる。また、このフオーマツトは試
料の核酸の相補的区域の間の有意の再アニーリングを可
能とし、これは固定化された配列上に起こることができ
る。このような再アニーリングは、引き続くインターカ
レーシヨンのために追加の二本鎖核酸を提供するので、
アツセイにとって有利にはたらく。このアツセイにおけ
る次の工程は、挿入剤および、再び好ましくは標識され
た形態の、プローブは添加することである。このアツセ
イは、前のフオーマツトにおけるように分離および抗体
の定量工程によって完了する。
最後に、第４の方法が存在し、ここで一本鎖の試料の
核酸を固定化されたプローブと接触させ、ここで、この
場合において、このようなプローブは挿入剤に化学的
に、例えば共有的に結合し、こうして結合した挿入剤の
区域における二重らせんの形成は挿入剤複合体を形成さ
せる。これは高度に有利なフオーマツトであり、ここで
プローブは固定化されかつ修飾されており、固定化工程
または修飾工程をアツセイの時実施することを必要とし
ない。得られる凝集体は、試料とプローブの核酸との間
の交雑区域および再アニーリングされた試料の区域にお
いて、共有結合された挿入剤複合体を含む。次いで、抗
体を添加し、そしてアツセイを前のフオーマツトにおけ
るようにして完了する。このフオーマツトは、ある場合
においては潜在的に危険であることがある、遊離の挿入
剤の溶液の取扱いの必要性を排除するという利点を提供
する。この技術の簡単な変更は、標識されたプローブよ
りはむしろ試料の核酸を固定化し、そして通常の方式で
進行させることである。これは多少好ましさに劣るが、
実際的なアツセイのアプローチである。
溶液相の交雑フオーマツト 前述の固相のフオーマツトに加えて、種々の溶液相の
交雑のフオーマツトを、また、本発明に適用することが
できる。このようなフオーマツトは、交雑工程が試料の
核酸およびプローブの両者とも溶液の形態であることが
必要なことによって特徴づけられる。これは有意に速い
交雑を生じうる。なぜなら、一方が固定化するときに比
較して両方の鎖が溶液中に存在するとき、速度は非常に
速いからである。通常、交雑工程に引き続いて、生ずる
雑種を検出の目的で不動化する。このような固定化は種
々の方法で実現することができる。従来、吸着剤、例え
ば、ヒドロキシアパタイトおよびニトロセルロース膜へ
さらすことによって複合体を選択的に固定化することは
知られている。
溶液相の交雑から形成した雑種を固定化するとくに有
用なアプローチは、反応相手と安定な共有結合または非
共有結合を形成しかつ固定化された形態のこのような反
応相手へさらすことによって固定化を得ることのできる
反応部位を含むプローブの使用の伴う。好ましくは、プ
ローブ中のこのような反応性部位は、ビオチンまたはハ
プテン部分のような結合部位であり、これらの部位は結
合性物質、例えば、相手の役目をするアビジンまたは抗
体と特異的に非共有結合することができる。次いで、交
雑工程後、固定化された形態の反応相手、例えば、結合
性物質を添加することができ、この物質はプローブ上の
反応性部位を介して雑種と選択的に結合しかつそれを固
定化するであろう。
本質的にいかなる対の物質も、反応性部位／反応性相
手の対からなることができ、これらは相互作用のために
適切な親和性を示して安定な結合を形成し、この結合は
２つの間の結合であり、引き続くアツセイの工程、とく
に分離および検出の工程に間を通じて実質的に無傷で残
る。形成された結合は共有結合または非共有結合の相互
作用であることができ、後者はことに選択性または特異
性の程度により特徴づけられるときが好ましい。このよ
うな好ましい結合の形成の場合において、プローブ上の
反応性部位を結合部位と呼び、そして反応相手はそれと
非共有結合の通常特異的な結合を形成する結合物質と呼
ぶ。このような結合部位はプローブの一本鎖の交雑可能
な部分中に存在することができ、あるいはプローブの化
学的修飾の結果として存在することができる。ヌクレオ
チド配列中に存在する結合部位の例は、プローブがプロ
モーター蛋白質（例えば、バクテリオフアージのプロー
モーター、RNAポリメラーゼ）により結合可能なプロモ
ーター配列（例えば、lac−プロモーターまたはtrp−プ
ロモーター）からなるか、あるいはリプレツサー蛋白質
（例えば、lac−リプレツサー）により結合可能なオペ
レーター配列（例えば、lac−オペレーター）からなる
か、あるいは特異的抗体に結合可能な稀な抗原ヌクレオ
チドまたは配列（例えば、５−ブロモまたは５−ヨード
デオキシウリジン、Ｚ−DNA）からなる場合である（英
国特許第2,125,964号明細書参照）。プローブの化学的
修飾により導入された結合部位は、とくに有用であり、
そして特異的結合対の一方の構成員はプローブの核酸へ
結合することを通常含む。選択に有用な結合対は、ビオ
チン／アビジン、ハプテンおよび抗原／抗体、炭水化物
／レクチン、酵素／阻害剤などを包含する。結合対が蛋
白質の構成員および非蛋白質の構成員からなるとき、非
蛋白質の構成員をプローブへ結合することが好ましいで
あろう。なぜなら、蛋白質の構成員はプローブの交雑の
変性条件下に不安定であることがあるからである。好ま
しい系はプローブをビオチンまたはハプテンと結合さ
せ、そしてそれぞれ固定化されたアビジンまたは抗ハプ
テン抗体を使用することを伴う。有用な配位子標識プロ
ーブの調製は文献から知られている［ランガー（Lange
r）ら、プロシーデイングス・オブ・ナシヨナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、78、6633（1981）；ブローカー（Broker）、ヌク
レイツク・アンド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、
５、363（1978）；ソジヤ（Sodja）ら、ヌクレイツク・
アンド・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、５、385（1
978）；チエン（Tchen）ら、プロシーデイングス・オブ
・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.）、81、3466（1984）］。結合物質の
固定化は従来の技術に従うことができる。
固体の支持体上への蛋白質の固定化は種々の方法が知
られており、そしてこれらの方法は結合物質の固定化に
適用することができる［メソツズ・イン・エンジモロジ
ー（Methods in Enzymology）、Vo.44（1976）参照］。
例えば、抗体は共有結合によりあるいは非共有的吸着に
より固定化される。頻繁に使用される非共有的方法は、
ポリスチレンのビーズまたは微小粒子へ、あるいはポリ
塩化ビニルの表面へ吸着される。多くの共有結合の方法
は蛋白質の固定化に使用され、そしてわずかのものは臭
化シアン活性化アガロースおよびデキストラン；グルタ
ルアルデヒド活性化ナイロンおよびポリアクリルアミ
ド；およびアクリリルおよび他の支持体上のエポキシド
を包含する。
プローブを固定化された形態で目的の配列との交雑に
供するとき、その後のプローブの性質により形成された
二重ラセンの固定化工程および抗雑種試薬の添加工程を
所望の順序で進行させることができる固定化および抗雑
種試薬の添加は、含まれる試薬および物質を同時に添加
することによって達成することができ、あるいは介在す
る洗浄または分離の工程を用いてあるいは用いないで、
いずれの順序で、一方を他方に対して先行させることが
できる。順序付けた添加に従うとき、添加する試薬の濃
度は形成する雑種を過度に変性しないようにし、かつそ
れと第２の添加物質との相互作用を禁止するように考慮
しなければならないことはもちろんである。
前述の特異的結合法により固体の支持体に結合するよ
うになる固定化されたプローブまたは固定化可能なプロ
ーブが好ましいが、固定化可能なプローブは比較的低い
特異性をもつプロセスによって支持体へ結合することが
できる。この場合において、支持体は交雑したプローブ
と結合するが、交雑しない形態と結合しない。次いで、
雑種の量を抗体試薬で測定する。この型の支持体の１例
はヒドロキアパタイトであり、これはDNA/RNAおよびRNA
/RNA二重らせんと結合するが、一本鎖の種と結合しない
［ブレンナー（Brenner）およびフオーコウ（Falko
w）、Adv.in Genet.、16、（1973）］。
また、化学的に活性なまたは活性可能な基をプローブ
中に導入し、そして交雑後固体の支持体と反応させるこ
とができる。この系は共有結合で固定化されたプローブ
を与え、そして支持体に結合する雑種の量を抗体を使用
して決定することができる。
上の方法に加えて、溶液相の交雑のフオーマツトを実
施することができ、ここで雑種は固定化されたまたは固
定化可能な抗雑種抗体試薬の結合によって固定化する。
このような抗体試薬はインターカレーシヨン処理された
二重らせん体に対して、あるいはDNA/RNA、RNA/RNAまた
はDNA/DNA雑種に対して前述のように特異的であること
ができる。探索する固定化された二重らせんは、直接ま
たは間接の標識プローブ、生成物結合第２抗雑種抗体、
または標識第２プローブを使用することによって検出さ
れる。
抗雑種抗体試薬および検出法 本発明の好ましい実施態様において使用する抗体試薬
は、プローブと相補的な試料の核酸との間で形成された
雑種結合でき、一本鎖オリゴヌクレオチドを有意に排除
できる能力によって主として特徴づけられる。抗体試薬
は全抗体、抗体断片または多価抗体凝集体から成ること
ができ、あるいは抗雑種抗体からの１種または２種以上
の特異的結合部位からなる任意の物質から成ることがで
きる。全抗体の形態であるとき、それは既知の免疫グロ
ブリン、例えば、IgG、IgMなどのクラスおよびサブクラ
スのいずれに属することもできる。交雑したプローブに
対する特異的結合の親和性を保持するこのような結合の
いずれの断片をも使用することができ、例えば、Fab、
Ｆ（ab′）およびＦ（ab′）２として普通に知られてい
るIgGの断片を使用することもできる。さらに、免疫グ
ロブリン類またはそれらの断片の凝集体、ポリマー、誘
導体および複合体を適当ならば使用することができる。
抗体試薬のための免疫グロブリン源は、任意の有効な
方法、例えば、抗血清およびモノクローナル技術により
得ることができる。抗血清はよく確立された技術、例え
ば、動物、例えば、マウス、ウサギ、モルモツト、ブタ
またはヤギの適当な免疫原の免疫化によって得ることが
できる。免疫グロブリンは、また、体細胞の交雑技術に
よって得ることができ、このような技術は、例えば、モ
ノクローナル抗体と普通に呼ばれるものを与え、また、
適当な免疫原の使用を伴う。
有用な抗雑種抗体は、インターカレーシヨン処理され
た核酸二重らせんについて選択的であるもの、ならびに
DNA/RNA、RNA/RNAまたはDNA/RNA雑種を特異的に結合す
るものを包含する。
インターカレーシヨン処理された二重らせんに対する
抗体は、アニオン性蛋白質または蛋白質誘導体（例え
ば、メチル化ウシ血清アルブミン）とアニオン性のイン
ターカレーシヨン処理された二重らせんとの間のイオン
性複合体から通常なる免疫原に対して誘発される。好ま
しくは、インターカレーシヨンは二重らせんに共有結合
される。あるいは、インターカレーシヨン剤（挿入剤）
の二重らせん複合体は担体の蛋白質に共有結合させるこ
とができる。
DNA/DNAに対する抗体の調製は、欧州特許出願公開第1
35,139号に記載されている。
DNA/RNA雑種に対して特異的な抗体を刺激する免疫原
は、ホモポリマーまたはヘテロポリマーのポリヌクレオ
チド二重らせんからなることができる。可能なホモポリ
マーの二重らせんのうちで、ポリ（rA）およびポリ（d
T）がとくに好ましい［キタガワ（Kitagawa）およびス
トラー（Stollar）、Mol.Immunol.、19、413（198
2）］。しかしながら、一般に、ヘテロポリマーの二重
らせんを使用することが好ましいであろう。そしてこれ
らは種々の方法で、例えば、φX174ビリオン（virion）
DNAのRNAポリメラーゼによる転写により調製することが
できる［ナカザト（Nakazato）、バイオケミストリー
（Bilchem.）、19、2835（1980）。選択されたRNA・DNA
二重らせんをメチル化蛋白質に吸着させるか、あるいは
他の方法で普通の担体物質、例えば、ウシ血清アルブミ
ンに結合し、そして所望の宿主動物に注射することがで
きる［ストラー（Stollar）、メソツズ・イン・エンジ
モロジー（Methods in Enzymol.）、70、70（198
0）］。
RNA・DNA二重らせんに対する抗体は、ウイルス、なか
でも、レオウイルス（reovirus）またはサトウキビに感
染するフイジー（Fiji）病のウイルス由来の二本鎖RNA
に対して誘導することができる。また、ホモポリマーの
二重らせん、なかでも、例えば、ポリ（rI）・ポリ（r
C）またはポリ（rA）・ポリ（rU）を上のように免疫化
のために使用できる。
抗体試薬を使用して雑種を検出するとき、それは通常
化学発光標識で適当な合成手段により標識されるであろ
う。
あるいは、抗体試薬を自然の性質、例えば、それ自身
の抗原性に基づいて検出することができる。化学発光標
識抗（抗体）抗体またはプロテインＡは第１抗体試薬に
結合し、ここで第２抗体またはプロテインＡのための標
識は上のように普通の標識である。さらに、抗体は相補
的固定または標識されたプロテインＡの使用により、な
らびに抗体の検出のためにこの分野で知られた他の技術
により検出することができる。
抗体試薬を標識するとき、好ましいように、標識する
部分および抗体試薬を会合させるか、あるいは互いに対
して結合させることができ、これは直接の化学的結合、
例えば、共有結合を伴うような結合によって、あるいは
標識をマイクロカプセルまたはリポソームに組み込み、
次いでこれらを抗体に結合させることによるような間接
的結合によって実施することができる。標識化技術はこ
の分野においてよく知られており、そして任意に慣用の
方法を本発明において使用することができる。
放出される光は普通の手段により、例えば、光増幅管
により検出することができ、それからの信号を記録装
置、オツシレーターまたはスカラーに供し、かつ表示ま
たは記録することができる。光は、また、ルミノメータ
ーで定量することができる。
使用する標識の種類に依存して、アツセイは不均質ま
たは均質であることができる。前者の場合において、複
雑な流体、例えば、血清を分析することができるが、後
者の場合において、予備的な抽出または精製の工程を必
要とするであろう。
典型的な不均質または均質の発光または発光定量測定
の免疫アツセイは、次に概説する通りである。
1.不均質発光または発光定量測定の免疫アツセイ この型の免疫アツセイにおいて、アツセイすべき物質
をそれに対する抗体と反応させる。次いで、遊離の抗体
を結合した抗体から分離する。この反応は抗体、アツセ
イすべき物質または遊離のもしくは結合した部分と分離
後反応することのできる他の物質を標識することによっ
て定量される。
2.競合不均質発光免疫アツセイ この場合において、未知の量のアツセイすべき物質
を、既知量の標識結合前記物質および既知であるが、限
定された量のそれに対する抗体と混合する。標識物質お
よび非標識物質との競合反応が起こる。抗体と非標識物
質との間の複合体および抗体と標識物質との間の複合体
を、遊離の標識物質および非標識物質から分離する。
抗体に結合する標識物質の量を、アツセイする溶液中
で非標識物質に関係づける。これらの量は、抗体に結合
した標識の量を測定することにより、あるいは残る遊離
の標識物質の量を測定することによって決定することが
できる。ペルオキシダーゼが標識であり、そして抗体が
固相に、例えば、ガラス管の壁を介して、結合するこの
型のアツセイの例は、英国特許第2,044,927号に記載さ
れている。
3.2部位の不均質発光測定免疫アツセイ この型の免疫アツセイにおいて、アツセイすべき物質
をまずそれに対する非標識抗体に結合し、ここでこの抗
体を固相の支持体、例えば、プラスチツクに結合する。
次いで、複合体（抗体と物質との間の）を標識抗体で処
理する。
次いで、得られる固体の複合体中の標識抗体について
の分析は、固体の複合体を溶液から分離し、次いで分離
した固体の複合体中に存在する標識の量、あるいは溶液
中に溶解した残留する標識抗体中に存在する標識の量を
測定することによって実施することができる。
この型の免疫アツセイの別の実施態様において、アツ
セイすべき物質を連続的に標識抗体および非標識固体支
持抗体に結合するか、あるいは１つの結合工程において
標識抗体および非標識抗体の両者に結合することができ
る。
4.均質発光または発光測定免疫アツセイ これは標識が2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオン
のアミノまたは置換アミノの誘導体である免疫アツセイ
に適用することができる。それは目的の遊離の標識され
た物質（またはそれに対する抗体）から放出される光に
依存し、この光は目的の結合された標識された物質（ま
たはそれに対する抗体）から放出される光と強度または
波長が異なる。
１つの実施例において、（プロゲステロン−イソルミ
ノール（誘導体）複合体を添加し、次いでヘムおよび過
酸化水素を添加した反応から、ある強度の光を放出する
ことが発見された。放出された光を測定し、そして未知
の試料中に存在するプロゲステロンの量を標準曲線から
決定した。（未知の試料中に存在するプロゲステロンの
量が多いほど、発光反応の光の収率は低い）。
上の免疫アツセイのすべてにおいて、定量、検出また
は探索の工程は本発明の発光反応であることができる。
上記免疫アツセイにおいて使用する抗体は商業的に入
手可能であるか、あるいは既知の免疫学的技術により調
製することができる。抗体は抗体の複合混合物の形態で
あることができ、あるいは１種または２種以上のモノク
ローナル抗体であることができる。ほんのわずかの容量
の抗体を一般に必要とするだけであり、そしてそれはそ
の活性に適当なpH、イオン強度および温度の条件に維持
される。
下記に列挙する非網羅的な物質に対する抗体は、本発
明の発光反応を利用する免疫アツセイにおいて通常使用
することができる：蛋白質、例えば、インスリン、アル
フアフエトプロテイン（alphafetoprotein）およびフエ
リチン、ホルモン、例えば、成長ホルモン、上皮小体ホ
ルモン、小胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、チロイ
ド刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、グルカゴン
（glucagon）、プロラクチンおよびカルシトニン、ハプ
テン／ステロイド、例えば、エストリオール、プロゲス
テロンおよびコルチゾール、薬物、例えば、シゴキシ
ン、抗原、例えば、細胞表面抗体およびがん胎児性抗原
および抗体、例えば、おたふくかぜのウイルス抗体、ヒ
ト免疫グロブリンＧ（IgG）、ウサギIgG、ヒツジIgG、
モルモツトIgG、さるIgGおよびヒト免疫グロブリンＥお
よびＭ。
第11図は、本発明に従う化学発光装置を示す。装置10
は２つの隔室12および14を有し、これらは弁手段または
膜16により分離されている。隔室12および14の各々は、
化学発光反応成分、すなわち、化学発光前駆体、酸化剤
および酵素の１つであるが、すべてではない成分を含有
する。緩衝化アミンは隔室12および14の一方または双方
中に含有される。典型的な容器は、例えば、隔室12中に
化学発光前駆体を含有し、そして隔室14中に酸化剤、酵
素および緩衝化アミンを含有する。弁手段16は、隔室12
から隔室14への化学発光前駆体の重力流れを制御するで
あろう。光は流れが開始したとき放出される。光の放出
を停止させるためには、弁手段16を閉じて、化学発光前
駆体の流れを停止させる。
次の実施例を参照しながら、本発明を説明する。
実施例 参考例1:配位子結合プローブDNAの調製 下の方法は特定の核酸を使用して例示するが、任意の
DNAプローブを使用することができる。
文献において知られている核酸プローブを標識する他
の種々の方法（例えば、ニツクトランスレーシヨン）が
存在する。核酸、すなわち試験試料を標識する一般的方
法を次に記載する： 上において、以下のものを用いた： ａ）アデノウイルスDNAまたはpB322プローブ［ENZOバイ
オケム（Biochem）、ニユーヨークおよびBRL−ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリー（Bethesda Reseach Laborat
ory）から商業的に入手可能なDNAプローブ］。
ｂ） 光反応性挿入剤はアミノメチルアンゲリシンであ
った。
ｃ） 反応性配位子はＮ−ヒドロキシスクシンイミドビ
オチンであった。
プローブをまず光化学的に挿入剤と反応させた。次い
で、挿入剤をビオチンの反応性残基と反応させた。この
順序を変えて、ビオチン残基をまず光反応性挿入剤と反
応させ、次いでこの生成物を光化学的にプローブと反応
させることができる。
50μｇのDNAを0.500mlのホウ酸塩緩衝液（10mM,pH8.
2）中に溶解し、そしてこの溶液に５μｌ（５μｇ）の
アミノメチルアンゲリシン（1mg/ml/H2O中）を添加し
た。この溶液を346nmで30分間照射した。反応した核酸
をエタノールアで沈殿させて精製した。結合したアンゲ
リシンの−NH2残基は反応性であり、ビオチンのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド誘導体（NHSビオチン）で修飾
することができた。これは次のようにして実施した。ア
ミノメチル−アンゲリシン結合核酸（1mg/ml）をホウ酸
塩緩衝液（10mM,pH8.2）中に溶解し、そして10倍モル過
剰のNHSビオチン（DMF 10mg/ml中に溶解した）を添加
した。この混合物を室温で８時間振盪した。生ずるビオ
チニル化DNAをリン酸塩緩衝液（10mM,NaH2PO4;10mM,Na2
NPO4;1mM EDTA pH7.5）に対して透析した。生ずるビ
オチニル化プローブは交雑に使用できる状態であった。
実施例2:DNAについてのドツト−ブロツト（dot−blot）
アツセイ 100ng〜1pgの光化学的にビオチニル化したDNAをバイ
オラド（BioRad）［リツチモン（Richmond）、米国カル
フオルニア州］ニトロセルロース紙上にスポツテイング
し、加熱器内で80℃において２時間ベーキングし；この
紙を３％のBSA（ウシ血清アルブミン）中に42℃で20分
間浸漬することによりBSAで飽和させた。紙を容器から
外に出しそしてそれを２枚の濾紙間でブロツテイングす
ることによって過剰のBSAを除去した。次いで、この紙
をストレプトアビジン（0.25mg/ml、3.0mlの合計容積）
を含有する溶液中で20分間室温にてインキユベーション
した。次いで、それをトリス（Tris）0.1M、pH7.5、0.1
M NaCl、2mM MgCl2および0.05％のトリトンＸを含有
する緩衝液で３回洗浄した。それをビオチニル化西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（0.1mg/ml）とともに室温で15分
間インキユベーシヨンした。これをトリス（Tris）（0.
1M、pH7.5）、0.1M NaCl、2mM MgCl2および0.05％の
トリトンで３回洗浄した。スポツトを打抜き、そしてDN
Aを含有するデイスクを両側を黒く塗装したマイクロタ
イター平板のウエル中に入れた。打抜いた紙の円形体を
マイクロタイター平板中に配置した後、40mMのトリスお
よび40mMの酢酸をアンモニウムを含有する0.8mlの緩衝
液（pH8.1）を各ウエルに添加した。次いで、DMF中の39
mMのルミノールおよび水中の30mMのH2O2の1:1（v/v）混
合物10μｌを添加し、放出光の写真をとった。光が減衰
した後、H2O2＋ルミノール混合物を添加した。この反応
を３日間続け、酵素活性はほぼ50％だけ損失した。
実施例3:ビオチニル化プローブの交雑および化学発光反
応による検出 溶液： A.トリス−HCL緩衝液（1M;pH7.5） B.0.5M NaOH溶液 C.トリス−HCL（0.5M;pH7.5） D.3モルのNaCl E.SSC×20: 175gのNaCl 88gのNa−クエン酸塩 水を添加して１リツトルにする。
HClでpHを7.0に調節した。
これを水で希釈して異なるSSC濃度を生成した。
F.予備交雑溶液： 45％のホルムアミド 50mmのNa−リン酸塩緩衝液pH6.5 ５×SSC ５×デンハルト（Denhardts）溶液 200μg/mlの水中の一本鎖DNA G.交雑溶液： 45％のホルムアミド 20mmのNa−リン酸塩緩衝液pH6.5 ５×SSC ５×デンハルト溶液 100μg/mlの水中の一本鎖DNA。
方法： １μｇ〜1pgの試験試料のDNAおよび対照のDNA（プロ
ーブと交雑すべきではない）をニトロセルロース紙上に
スポツテイングした。この紙を3MM ワツトマン（Whatm
an）セルロース紙（0.5MのNaOH中でソーキングしかつそ
れで飽和した）と７分間接触させることにより、DNA試
料を変性した。次いで、ニトロセルロース紙を他の湿潤
3MM紙（これは中和用の溶液Ａ中でソーキングした）と
接触させた。紙を２分後に乾燥させた。中和および真空
下の乾燥を３回反復した。
次いで、固定化した変性DNAを含有するニトロセルロ
ース紙を、溶液ＣおよびＤ中でソーキングしかつそれで
飽和した3MM紙と５分間接触させた。次いで、この紙を8
0℃で２時間真空下にベーキングした。次いで、濾紙を1
0mlの溶液Ｆを含有するプラスチツク袋に入れた。この
袋を水浴中で42℃で２時間インキユベーシヨンした。予
備交雑後、この紙を取り出し、そして10mlの溶液Ｇおよ
び１μｇの標識変性プローブ（参考例１の生成物）を含
有する他の袋に入れた。交雑を42℃で16時間実施した。
次いで、ニトロセルロース紙を次の順序で洗浄した： a.250mlの１×SSC＋0.1％のSDS:2回の洗浄、室温で３分
間。
b.250mlの0.2×SSC＋0.1％のSDS:2回の洗浄、室温で３
分間。
c.250mlの0.16×SSC＋0.1％のSDS:2回の洗浄、50℃で15
分間。
d.50mlの２×SSC＋0.1％のSDS:2回の洗浄、室温で３分
間。
次いで、雑種を次のようにして化学発光反応により検
出した：雑種を有する濾紙を３％のBSA（ウシ血清アル
ブミン）中に42℃で20分間浸漬することにより、濾紙を
BSAで飽和させた。紙を容器から外に出しそしてそれを
２枚の濾紙間でブロツテイングすることによって過剰の
BSAを除去した。この紙をストレプトアビジン（0.25mg/
ml、3.0mlの合計容積）を含有する溶液中で20分間室温
にてインキユベーシヨンした。次いで、それをトリス
（Tris）0.1M pH7.5、0.1M NaCl、2mM MgCl2および
0.05％のトリトンＸを含有する緩衝液で３回洗浄した。
次に、その濾紙をビオチニル化西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（0.10mg/ml）とともに室温で15分間インキユベー
シヨンした。これをトリス（Tris）（0.1M、pH7.5）、
0.1M NaCl、2mM MgCl2および0.05％のトリトンで３回
洗浄し、そして10mMのトリス（pH8.0）緩衝液で１回洗
浄した。スポツトを打抜き、そしてDNAを含有するデイ
スクを両側を黒く塗装したマイクロタイター平板のウエ
ル中に入れた。打抜いた紙の円形体をマイクロタイター
平板中に配置した後、40mMのトリスおよび40mMの酢酸ア
ンモニウムを含有する0.8mlの緩衝液（pH8.1）を各ウエ
ルに添加した。次いで、10μｌのDMF中の39mMのルミノ
ールおよび水中の30mMのH2O2の1:1（v/v）混合物を添加
した。それをフイルムホルダー内で直接露光することに
より、光の放出を「ポラロイド」インスタントフイルム
上に記録した。
暗室内で、光を放出する紙を互いに接触させた。この
湿潤した紙を透明なプラスチツク紙、例えば、「サラン
ラツプ」で包み、開いたフイルム上に直接置いた（フイ
ルムホルダーを使用してカバーを引く）。それらを露光
した後、カバーを再配置し、そしてフイルムを引き出す
ことによって現像および処理した。
実施例4:酵素標識プローブの調製および核酸雑種の化学
発光検出 レンズ（Renz）ら、ヌクレイツク・アンド・リサーチ
（Nucleic Acids Res.）、12、3435（1984）に記載され
ているように、核酸プローブを西洋ワサビペルオキシタ
ーゼに化学的に結合し、そして固定化試験試料（実施例
３）に対して交雑させた。交雑の方法および条件はNA
R、12、3435（1984）に記載されいる手順と同一であ
る。交雑後、紙を実施例３に記載するようにトリス緩衝
液（10mM、pH8）で洗浄し、そして打抜きそして検出す
る。酵素標識プローブを使用するとき、交雑後のBSAの
ブロツキングは不必要である。
100mgの４′−アミノメチル−4,5′−ジメチルアンゲ
リシン（１）および0.4gのコハク酸無水物を、無水ピリ
ジン（5ml）中で24時間一緒に振盪する。ピリジンを蒸
発させ、残留物をメタノールで処理し、そして生成物を
蒸発させるとゴム状塊が得られる。この固体を10mlのジ
メチルホルムアミド（DMF）中に入れ、0.2gのカルボジ
イミドおよび0.4gのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添
加する。この反応を24時間実施する。この反応混合物を
−20℃に冷却してジシクロヘキシル尿素を沈殿させ、こ
れを遠心により除去する。得られる生成物をDMF中で３
倍モル過剰のAHEI（６）と反応させる。この反応はこの
混合物を12時間室温でインキユベーシヨンすることによ
って実施する。次いで、DMFを減圧蒸発させる。得られ
る固体は精製しないで使用できる。この固体を10mlのDM
A中に溶解し、この溶液の1.0μｌを標識すべき1mlのプ
ローブ（50μｇ）に添加し、そして参考例１におけるよ
うに光照射を実施し、次いで実施例３におけるように交
雑させる。
交雑後、スポツトを別々にマイクロタイター平板のウ
エル中に入れる。１μｌ（0.1mg/ml）の西洋ワサビペル
オキシダーゼ、1mlのトリス−アンモニウム緩衝液（40m
M トリス＋40mM アンモニウム）および0.5mlの5mMのH
2O2を添加する。光の放出を「ポラロイド」フイルムを
露光することによって記録する。
実施例6:交雑後のオリゴヌクレオチドの検出 この実施例は４つの部分に分割されている。
6a.オリゴヌクレオチドを含有するアミンの合成。
6b.6aの生成物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドビオチ
ンとの反応。
6c.6bの生成物の精製。
6d.交雑およびオリゴヌクレオチドの化学発光法による
検出。
１の合成は上の反応式で概略的に示される。
５−クロロ水銀−２′−デオキシウリジン（５）［D.
E.バーストロム（Berstrom）およいJ.L.ルス（Ruth）、
ジヤーナル・カーボヒドレーテス・ヌクレオサイズ・ア
ンド・ヌクレオチドス（J.Carbohydrates,Nucleosides,
and Nucleotides、４、257（1977）に記載される方法に
従い調製した］を、３−トリフルオロアセトアミド−１
−プロペン（７）［M.パイリーンド（Paileand）、W.J.
フブシユ（Hubsch）、モナトシエフテ・フール・ヘミー
（Monatoshefte fur Chemie）、97、99（1966）］およ
びK2PdCl4でメタノール中で処理して、２回のクロマト
グラフイーおよびメタノールからの結晶化の後に、22％
の収率で５−トリフルオロアセトアミドアリル−２−′
デオキシウリジン（８）が得られた。ピリジン中で８を
塩化4,4′−ジメトキシトリチルと反応させると、フラ
ツシユクロマトグラフイーの後９が85％の収率で得られ
［W.C.スチル（Still）、M.カーン（Kahn）、A.ミトラ
（Mitra）、ジヤーナル・オブ・オーガニツク・ケミス
トリー（J.Org.Chem.）、43、2923（1978）］、これを
引き続いてN,N−ジイソプロピルアミノメトキシクロロ
ホスフイン［L.J.マクブライド（McBride）およびM.H.
カルサーズ（Caruthers）、Tet.Letters、24、245（198
3）］（10）で処理すると、ペンタンから沈殿後に白色
固体として１が得られた。19−単位のオリゴヌクレオチ
ドHB19A′： ３′−GA−GGA−CXC−CTC−TTC−AGA−CG−５′を、D
NA合成装置で調製した。各オリゴヌクレオチドのこれら
の別々の１μモルのバツチをつくり、そして各々を固体
の支持体に結合しそしてジメトキシトリチル基により完
全に保護した。ジメトキシトリチル保護基を５′−末端
から除去し、そして１をDNA合成装置を使用しないが、
この機械（合成装置）が典型的には用いるのと同一の試
薬および条件を使用して、19−単位の鎖に結合した。
この方法の生成物は、支持体から除去した後、Ｃ−
５′末端に５′−（−アミノアリル−５′−（4,4′−
ジメトキシトリチル）−２′−デオキシ−ウリジン単
位、すなわち、 をもつオリゴヌクレオチドである。この生成物のポリヌ
クレオチドを最後に３％のトリクロロ酢酸に短時間暴露
して脱トリチル化し、次いでポリアクリルアミドゲルの
電気泳動により精製した。
このポリヌクレオチドHB19A′は、ポリペプチドのベ
ータヘモグロビンの遺伝情報をコードするヒトDNAの部
分に相当するポリヌクレオチド単位であり、ことにDNA
のその区域には鎌型赤血球ヘモグロビンの形成および鎌
型赤血球貧血として知られている遺伝疾患においてそれ
自体明瞭な突然変異が存在する。
赤外（IR）スペクトルは、特記しないかぎり、CHCl3
中の溶液として得た。ポリスチレンフイルムの1602cm-1
帯を外部較正標準として使用した。
プロトンの磁気共鳴（1H NMR）スペクトルは、特記し
ないかぎり、CDCl3溶液中でえた。ケミカルシフトは、
特記しないかぎり、内部標準のテトラメチルシランから
低磁場へのppmで報告する。
炭素−13の磁気共鳴（13C NMR）スペクトルは、特記
しないかぎり、CDCl3溶液中にえた。カーボンシフト
は、特記しないかぎり、内部標準のテトラメチルシラン
から低磁場へのppmで報告する。
リン−13の磁気共鳴（31P NMR）スペクトルは、特記
しないかぎり、CDCl3溶液中でえた。リンシフトは、特
記しないかぎり、外部標準の水性15％のH3PO4から低磁
場へのpppmで報告する。
薄層クロマトグラフイー（TLC）は、E.メルク（Merc
k）からのシリカゲル60F−254板を使用して実施した。
カラムクロマトグラフイーは、E.メルク（Merck）のシ
リカゲル60（70〜230メツシユ）を使用して実施した。
５−トリフルオロアセトアミドアリル−２′デオキシウ
リジン（８） HPLC（高性能液体クロマトグラフイー）級のメタノー
ル（120ml）中の５−クロロ吸い敏−２′−デオキシウ
リジン（５）［バーグストロム（Bergstrom）およびル
ス（Ruth）、上記］（5.56g;12ナノモル）を、周囲温度
において不活性ガス雰囲気下で維持し、そして３−トリ
フルオロアセトアミド−１−プロペン（７）［パイラー
（Pailer）およびフブシユ（Hubsch）、上記］（7.33g;
48ミリモル;4当量）およびK2PdCl4（4.28g;1.1当量）で
処理した。この反応混合物は徐々に黒色になり、そして
22時間攪拌した。この混合物をH2Sガスで数分間処理
し、次いでセライト（Celite）で濾過し、メタノールで
洗浄し、そして80℃の浴から減圧蒸発乾固すると、粗半
固体の残留物（7.0g）が得られた。この残留物をシリカ
ゲルのクロマトグラフイーにかけ、CH2Cl2:MeOH（5:1）
で展開した。変性ｐ−アニスアルデヒド試薬［エゴン・
スタール（Egon Stahl）、シン・レイヤー・クロマトグ
ラフ（Thin Layer Chromatograph）、第２版、スプリン
ガー−バーロング（Springer−Verlong）、ニユーヨー
ク857（1969）］で青色に着色しかつRf＝0.51（CH3CN:M
eOH 3:1）を有する帯を集め、そして真空蒸発乾固する
と、無色の泡状物が得られた。この生成物を最少量のメ
タノールから結晶化し、濾過し、そして冷CHCl3:MeOH
（3:1）で洗浄し、そして真空乾燥した。母液を第２収
穫物のために処理した−合計の収量1.01g（22％）。MeO
Hから再結晶化すると、表題化合物が元素分析的に純粋
で、融点＝183−４℃を有する小さい白色針状結晶が、6
4℃で一夜真空（＜0.1トル）乾燥後に得られた。IR（KB
r）cm-13420、3260、1718、1683（br）、1560、1478、1
283、1190、1102、1061、980、788、763、737;1H NMR
（DMSO−d6）（標準、DMSO−d6）2.13、（ｄのｄ、Ｊ＝
6Hz、2H）、3.59（br ｓ、2H）、3.70−3.97（ｍ、3
H）、4.25（br ｓ、1H）、5.06（br ｍ、1H）、5.20
（br ｍ、1H）、6.04−6.65（ｍ、4H）、8.01（ｓ、1
H）、9.60（br ｓ、1H）;13C NMR（DMSO−d6）（標
準、DMSd−Ｄ）ppm 162.05、155.29、149.50、138.0
5、124.33、124.14、109.96、87.47、70.23、61.12、3
9.93;（α）Ｄ＝;8.01゜（ｃ＝0.87、MeOH）。
元素分析:C14H16N3O6F3 Ｃ、44.33;H、4.25;N、11.08 Ｃ、44.19;H、4.10;N、10.93 ５−トリフルオロアセトアミドアリル−５′−Ｏ−（4,
4′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシウリジン
（９） 無水ピリジン（8ml）中の８（0.60g;1.58ミリモル）
の溶液を不活性ガス雰囲気下に維持し、そして周囲温度
で塩化4,4′−ジメトキシトリチル（0.67g;1.25ミリモ
ル）で処理した。18時間攪拌後、この反応混合物を氷水
（70ml）中に激しく攪拌しながら注入した。０℃に20分
間放置すると、ゴム状固体が分離し、ほぼ透明な溶液が
残り、これをデカンテーシヨンした。固体をH2O（5ml）
で１回洗浄し、次い2CH2Cl2（10ml）中に取り、ブライ
ン（5ml）で１回洗浄し、次いでCH2Cl2溶液をK2CO3で乾
燥し、濾過し、そして真空蒸発乾固すると、褐色の泡状
物が得られた。この粗生成物をシリカゲル（メルク、等
級60、230−400メツシユ、60A）（75g）のフラツシユク
ロマトグラフイー［スチル（Still）ら、上記］にか
け、CHCl3中の4.0％のMeOH溶媒（1.0リツトル）で展開
した。ピリジン（10μｌ）を含有する管中に各約20mlの
分画を集めて５′ヒドロキシルの脱保護を防止した。主
要生成物の帯を含有する分画（Rf＝0.29;MeOH;CHCl3
7.93）を合わせ、濾過し、真空乾燥すると、９（0.91g;
85％）がわずかに黄色の泡状物として得られた。溶離帯
の中心からの分画から溶媒を除去し、酢酸エチル（EtOA
c）中に取り、「NORIT 211」［ゼオラル・ノリト・カ
ンパニー（General Norit Co.）から販売されている］
で処理し、「セライト（CELITE）］［ケム・アラート
（Chem Alert）から販売されている分析用濾過助剤］で
濾過し、そして真空（1.0トル）蒸発乾固すると、分析
用試料が無色の泡状物とし得られた、融点＝105−110℃
（分解）。IR（CHCl3）cm-13370、2920、1715、1695、1
618、1515、1470、1260、1182、1045、842;1H NMR（CDC
l3）2.38（br ｍ、2H）、3.25−3.75（ｍ、5H）、3.75
（ｓ、6H）、4.10（br ｍ、1H）、4.60（br ｓ、1
H）、5.39（d.J＝16Hz、1H）、6.10−6.55（ｍ、2H）、
6.70−6.95（ｍ、5H）、7.15−7.45（ｍ、10H）、7.84
（ｓ、1H）;13C NMR（CDCl3）（標準、CDCl3）ppm 16
2.31、158.74、157.70、156.01、149.70、144.04、137.
88、135.65、135.52、130.12、128.12、127.26、125.0
5、113.48、111.33、86.94、96.68、85.25、72.18、63.
60、55.34、42.66、41.42。
元素分析:C35H34N3O8F3 Ｃ、61.67;H、5.03;N、5.03 Ｃ、61.47;H、5.19;N、5.95 トリフルオロアセトアミドアリル−５′０−（4,4′−
ジメトキシトリチル）−２′デオキシウリジン−３′−
０−（N,N−ジイソプロピルアミノメトキシホスフイン
（１） 周囲温度においてアルゴン雰囲気下に維持された無水
CH2Cl2（1.5ml）中の９（0.34g;0.5ミリモル）の溶液
を、まず、無水ジイソプロピルエチルアミン（0.35ml;
0.259g;2ミリモル;4当量）で処理し、次いで、N,N−ジ
イソプロピルアミノメトキシ−クロロホスフイン［マク
ブライド（McBride）ら、上記参照］（10）（0.19ml;約
0.2g;2.2当量）で１分にわたり滴下した。生ずる無色の
溶液を20分間攪拌し、次いでEtOAc（20ml）で移した。
（EtOAc）相は前もって飽和水性NaHCO3で洗浄し、次い
でブライン分液漏斗に入れ、ブラインで４回洗浄し（各
35ml）、Na2SO4で乾燥し、濾過し、そして真空蒸発乾固
すると、無色のガラス状物（0.51g）が得られた。この
粗生成物を無水ベンゼン（2ml）中に取り、そして急速
に攪拌した無水ペンタン（60ml）中で−78℃においてア
ルゴン雰囲気下に沈殿させた。得られる懸濁液を濾過
し、−78℃のペンタンで洗浄し、そして１トル未満にお
いてKOH上で一夜真空乾燥すると、表題化合物（１）が
白色非晶質粉末として得られた（0.38g;93％）。IR（CH
Cl3）cm-1 2965、1722、1698、1618、1518、1470、126
2、1185、1045、988、842:1H NMR（CD2Cl2）γ0.95−1.
30（ｍ、12H）、2.20−2.60（ｍ、2H）、3,24および3.3
7（ｄのｄ、Ｊ＝13Hz、3H）（Ｐ−Ｏ−CH3）、3.20−3.
80（ｍ、6H）、3.75（ｓ、6H）、4.17（br ｍ、1H）、
4.68（ｖ br ｍ、1H）、5.42（ｄ、Ｊ＝16Hz、1H）、
6.15−6.55（ｍ、3H）、6.75−6.95（ｍ、4H）、7.20−
7.50（ｍ、10H）、7.79（ｓ、1H）;13C NMR（CD2Cl2）
（標準、CD2Cl2）ppm 162.40、159.21、157.78、149.7
8、144.71、138.34、136.00、130.53、128.71、128.4
5、127.54、125.66、125.27、113.82、111.48、87.23、
86.31、85.31、85.60、55.75、43.78、43.20、42.94、2
4.99、24.60;31P NMR（CD2Cl2）ppm 149.30、148.87、
14.11（ほぼ12％の不純物）、8.18（ほぼ４％の不純
物）。
オリゴヌクレオチドへの１の取り付け 19−単位のオリゴヌクレオチドを、アプライド・バイ
オーシステムス（Applied Bio−Systems）380A型DNA合
成装置を使用してコントロール・ポア・グラス（contro
l pore glass）の固体の支持体上で合成した。１をオリ
ゴマーの５′末端へ取り付ける直前に、５′−０−（4,
4′−ジメトキシトリチル）保護基を機械上でCH2Cl2中
の３％のCCl3CO2Hを用いて切離した。支持体結合５′脱
保護オリゴマーをCH3CNで洗浄し、そしてアルゴン気流
中で乾燥した。引き続く工程を機械（合成装置）を使用
しないで実施したが、同一の化学を用いた； 1.支持体結合オリゴマーを自動化合成に使用した容器
（カラム）から取り出し、そしてアルゴン雰囲気下に乾
燥した隔壁−キヤツプ付きバイアルに移した。
2.結合したオリゴマーを無水CH3CN中の0.5Mの1H−テト
ラゾールの20〜30倍の過剰量で処理した。それをおだや
かに攪拌しながら30分間インキユベーシヨンした。
3.試薬をピペツトで取り、そして結合したオリゴマーを
３回CH3CNで洗浄した。
4.結合したオリゴマーを含有する固体の支持体を過剰の
I2H2O−ルチジン−THF（0.1M:1:10:40）で処理し、そし
て15分間攪拌した。
5.試薬をピペツドで取り、そして結合したオリゴマーを
４回CH3CNで洗浄した。
6.結合したオリゴマーを含有する固体の支持体を、過剰
のチオフエノール−トリエチルアミン−ジオキサンで60
分間洗浄した。
7.試薬をピペツトで取り、そして結合したオリゴマーを
４回MeOHで洗浄した。
8.結合したオリゴマーを含有する固体の支持体を、濃NH
4OH水溶液で２時間周囲温度で処理した（これは保護さ
れたオリゴヌクレオチドを支持体から除去した）。
9.すべての保護基を除去するために、オリゴヌクレオチ
ドを濃NH4OH水溶液で処理し、そして50℃で一夜加熱し
た（これは、ジメトキシトリチルを除く、すべての保護
基を除去する）。
10.支持体を濾過し、そして濾液を蒸発乾固すると、粗
オリゴヌクレオチドが得られた。
上の10工程を支持体結合オリゴヌクレオチドのすべて
のバツチについて反復した。各々をシリカゲルのTLC板
上でCH2Cl2中の３％のCCl3CO2Hで処理すると、ジメトキ
シトリチルカチオンのオレンジ−赤色を発生し、これに
より１がオリゴヌクレオチド中に首尾よく組み込まれた
ことが示された。
修飾されたHB19A′オリゴヌクレオチドの１つの浴
を、CH2Cl2中の３％のCCl3CO2HDで脱トリチル化し、そ
してポリアクリルアミドゲルの電気泳動により精製し
た。
実施例6b:特定のオリゴヌクレオチドとＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドビオチン（NHS−ビオチン）との反応 実施例6aからの２μｇの19A′アミンまたは19S′−ア
ミンを20μｌの10mMのホウ酸塩緩衝液pH8.16中に溶解し
た。これに、ピアース（Pierce）から購入したＮ−ヒド
ロキシスクシンイミドビオチン（10mg/ml）の新しく調
製したDMF溶液の５μｌを添加した。この反応を室温で1
6時間進行させた。反応後、溶媒を減圧蒸発させた。
実施例6c:反応混合物からNHSビオチン19A′の分離 シンクロパツク（Synchropack）RPP4.1×10cm［シン
クロム（Synchrom）；インジアナ州リンデン］カラムに
連結したブラウンリー（Broewnlee）RP300ガード（guar
d）カラムを使用して、周囲温度で、0.1Mの酢酸トリエ
チルアンモニウムpH7から0.01Mの酢酸トリエチルアンモ
ニウムpH7の勾配で、HPLC分離を実施し、50％のアセト
ニトリルを試料に依存して10〜120分の期間にわたって
流す。検出器を254nmにセツトし、そして全目盛は0.15
吸光度単位である。誘導体オリゴヌクレオチド生成物の
位置を決定するために、ブランクの実験をオリゴヌクレ
オチドを含まない反応混合物を使用して実施する。新し
いピークはオリゴヌクレオチドの添加後に現われ、これ
が反応生成物に相当する。生成物を分離しそして分画コ
レクター中に集めた後、生成物をゲル電気泳動により集
め、そして次の実験から、適切なピークの分析の決定は
不必要であることがわかった。次いで、オリゴヌクレオ
チドを減圧蒸発乾固する。
実施例6d:交雑および交雑オリゴヌクレオチドの検出 例示の目的で、精製した血液DNAをニトロセルロース
紙上に固定化し、実施例３におけるように予備交雑し、
実施例6cのビオチニル化オリゴヌクレオチド生成物と、
コンナー（Conner）ら、プロシーデイングス・オブ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Proc.Nna
tl.Acad、Sci.）USA、80、278（1983）に記載される条
件下に交雑し、そして実施例２に記載するように化学発
光法で検出する。
実施例7: トリス＋アンモニウムの代わりに他の緩衝剤を使用し
て、実施例２、３、５および６を反復した。このような
緩衝剤は次の通りであった： （ｉ） 40mMのトリス＋40mMのイミダゾール pH8.1 （ii） 40mMのトリス＋10mMのピリジン pH8.1 （iii） 40mMのトリス＋10mMのスペルミン pH8.1 アンモニウムを使用してより優れた結果が得られた。
しかしながら、緩衝剤（ｉ）、（ii）および（iii）に
おけるこれらのすべての窒素性化合物は、化学発光法に
おける光の放出の遅延において有効であり、そして酵素
を長期間活性に保持し、こうして放出を増強した。
実施例8:抗風疹IgGのアツセイ トーペ（Thorpe）ら、バイオケミカル・アンド・バイ
オフイジカル・リサーチ・コミユニケーシヨンズ（Bioc
hem.Biophys.Res.Comm.）、119、481（1984）に記載さ
れているように、ルバジム・キツト（Rubazyme Kit）
［アボツト・ダイアオスチツク（Abbot Diagnostic）］
をこのアツセイに使用する。ポリスチレンビーズを風疹
（Rubella）ウイルスで被覆する。次いで、この試験試
料をウイルス被覆ビーズと緩衝液中（10mM トリス pH
7.5）でインキユベーシヨンする。未反応の試験成分を
ビーズで分離し、そしてそれらを洗浄することにより除
去する。
次いで、ビーズを抗ヒトIgG（ヤギ）／西洋ワサビの
ペルオキシダーゼ（IgG−HRP）複合体と反応させる。未
反応のIgG−HRPを除去した後、ビーズをマイクロタイタ
ー平板のウエル中に入れる。十分な緩衝液（ほぼ1ml）4
0mMのトリス＋40mMの酢酸アンモニウム（pH＝8.1）を加
え、ビーズを沈める。3mMのルミノール（DMF中）と30mM
のH2O2（H2O中）との40μｌの1:1（v/v）混合物を添加
した。実施例３におけるように「ポラロイド」インスタ
ントフイルムを露光することによって、光の放出を監視
した。
実施例9:西洋ワサビペルオキシダーゼ仲介化学発光反応
におけるアンモニウムおよびルシフエリンの相乗効果 光の放出をSLM4800分光蛍光計で監視した。強度を時
間に対してプロツトした。典型的な測定を第10図に示
す。
A:緩衝液は40mMのトリス＋40mM（pH8.1）酢酸アンモニ
ウムであり、増強剤を含まない。
L:緩衝液はトリス（pH8.5）である。
増強剤はルシフエリン（40um）である。
Ａ＋L:緩衝液はＡと同一である。
増強剤はルシフエリン（40um）である。
−−−−：トリスのみ−アンモニアおよび増強剤を含ま
ない。
１μｌ（１μg/H2Oml）の西洋ワサビペルオキシダー
ゼを添加し、次いで2mlの（Ａ）、（Ｌ）または（Ａ＋
Ｌ）を添加し、次いで39mMのルミノール（DMF中）と30m
MのH2O2（H2O中）との1:1（v/v）混合物の40μｌを添加
することによって、反応を開始した。第１図は相乗効果
を明瞭に示している。換言すると、別々のＡおよびＬか
らの放出の強さの合計はＡ＋Ｌより小さい。
実施例9a:ペルオキシダーゼ仲介化学発光反応へのアン
モニウムおよび増強剤の相乗効果 次の成分： 2mlの緩衝液、 100μｌの1ng/ml（トリス中）のビオチニル化西洋ワ
サビペルオキシダーゼ［シグマ・ケミカル・カンパニー
（Sigma Chem.Co.）、米国ミゾリー州セントルイス］；
および １〜４μｌの増強剤を含有する混合物を60μＭの最終
濃度を生成するようにして調製し、蛍光計のキユベツト
に入れた。このキユベツトを分光蛍光計SLM4800の測定
室に入れた。光源を除き、すべての装置にスイツトを入
れた。40μｌのH2O2−ルシフエリン混合物（実施例）を
添加した。放出を12分まで測定した。典型的な放出を第
１図に示す。
光の放出を積分した値を下表に記載する。
緩衝液は常にトリス（pH8.5）である。
上の表から明らかなように、アンモニウムおよび増強
剤の同時の存在は、蛍光計で測定されるように、放出に
おいて相乗効果を生成する。
実施例10:DNAプローブへの増強剤の結合 ホタルＤ−ルシフエリン、または を実施例５におけるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ドで活性化し、次いで４′アミノメチル−4,5′−ジメ
チルアンゲリシンを実施例１におけるようにプローブへ
反応させる。交雑を実施例３と同一方法で実施する。検
出は追加の１μｌ（0.1mg/ml）の西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、0.1mlの0.5mMのルシフエリン（DMF中）および5
mMのH2O2の1:1混合物の添加を必要とした。この方法は
バツクグラウンドの放出を減少する。なぜなら、遅延さ
れた増強剤の化学発光は交雑したプローブのみから生成
されるからである。
実施例11、12および13: 実施例11、12および13は実施例２と同一方法で実施し
たが、ルシフエリンを使用しなかった。ルシフエリンの
代わりに、同一濃度の次の成分を使用した： ４−ヨードフエノール（実施例11）、 ６−ヒドロキシベンゾチアゾール（実施例12）、およ
び ４−フエニルフエノール（実施例13）。
これらの増強剤の原溶液をエタノール中で10倍の濃度
（2mM）で調製し、そして10μｌのみを100μｌ（ルシフ
エリンについて使用した）の代わりに使用する。
比較の結果は、ヨードフエノールが最大の増強を示す
が、光の放出の減衰はルシフエリンまたは６−ヒドロキ
シベンゾチアゾールよりも速いことを示す。６−ヒドロ
キシベンゾチアゾールは光の放出の遅延および増強にお
いてルシフエリンよりも優れる。フエニルフエノールは
ヨードフエノールに類似する挙動を示す。これらの結論
は露光したフイルムの肉眼的分析から誘導された。
実施例14:ルシフエリンにより遅延された化学発光反応
へのDNAおよびDNA修飾剤の作用 第１図は、SLM4800分光蛍光計中で測定された光の放
出へのDNAの作用を示す。実験は200μｌの0.2mMのルシ
フエリン＋5mMの過酸化水素を1:1混合物で、100μｌの
核酸を含有する溶液に添加することによって実施した。
混合物中に存在した核酸の合計量は、それぞれ１μｇ、
５μｇおよび10μｇであった。西洋ワサビペルオキシダ
ーゼの濃度は100ng/mlであった。比活性はシグマ・ケミ
カル・カンパニー（Sigma Chem.Co.）、米国ミゾリー州
セントルイスから購入した1mg当り250単位であった。核
酸の交雑を研究するときには、前記酵素を使用したの
で、西洋ワサビペルオキシターゼをビオチニル化した。
反応混合物の合計の容積を、10mMのトリス緩衝液および
10mMの酢酸アンモニウムの混合液（pH8.1）の添加によ
り2.4mlに調節した。第１図が明瞭に示すように、核酸
はこの方法に事実上影響を及ぼさない。第２図および第
３図が示すように、同一の条件下に、ビオチニル化DNA
は放出に多少の照明作用を示すことがある。DNAをビオ
チンアンゲリシン付加物と反応させてビオチニル化し、
かつ346nmで照明した光化学的にビオチニル化した核酸
は、ニツクトランスレーシヨンした商業的に入手可能な
生成物が示す種類の作用を示さなかった。ニツクトラン
スレーシヨンした核酸の作用は、明瞭に理解されない
が、この時点において、光化学的なビオチニル化法を実
施する場合、化学発光反応への核酸の作用はアビジンの
使用によりさらに減少させることができる。第４図、第
５図および第６図は、それぞれ、アンゲリシン、ビオチ
ンおよびルシフエリンの作用の結果を示す。核酸雑種の
検出のための西洋ワサビペルオキシダーゼ仲介法を利用
するために、４つの異なるフオーマツトが使用できたの
で、これにより究極的に同様な酵素アツセイの西洋ワサ
ビペルオキシダーゼを使用して最終の反応の結果を監視
できる、 上の実施例の化学発光は、「ポラロイド」フイルムの
ホルダー上でフオトラジオグラフイー（photoradiograp
hy）手段により決定した。
光の放出プローブおよびフイルムが固体物質の薄い透
明片、例えば、「サランラツプ」、透明繊維またはマイ
クロタイター平板の平坦な側によってのみ分離されたカ
セツト中に存在するときに、フイルムを露光した。
実施例15〜28: 実施例15〜28についての実験の原型は実施例9Aと同一
であった。相対的強度は、記録した曲線を裁断し、そし
て分析用秤で秤量することによって測定した。重量は、
増強剤および窒素化合物の両者を加えない場合を１とす
る任意の単位の相対強度として表に記載した。実施例15
〜37の結果を下に示す。
本明細書および特許請求の範囲は例示を目的とし、そ
して限定するものではなく、そして種々の変更および変
化を本発明の精神および範囲を逸脱しないでなすことが
できる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、子牛胸腺DNAの発光速度への影響を示す。 第２図は、ビオチニル下DNAの発光速度への影響を示
す。 第３図は、ニツクトランスレーシヨンビオチニル化DNA
の発光速度への影響を示す。 第４図は、アンゲリシンの発光速度への影響を示す。 第５図は、ビオチンの発光速度への影響を示す。 第6A図は、ルシフエリンおよびビオチニル化DNAの発光
速度への影響を示す。 第6B図は、ルシフエリンおよび非ビオチニル化DNAの発
光速度への影響を示す。 第７図は、非ビオチニル化アデノウイルスDNA対ビオチ
ニル化アデノウイルスDNAの検出限界を示す図に代わる
粒子構造の写真である。 第８図は、交雑ビオチニル化アデノウイルスDNAの検出
を示す図に代わる粒子構造の写真である。 第９図は、交雑ビオチニル化PBR322DNAの検出を示す図
に代わる粒子構造の写真である。 第10図は、緩衝化アミンについて、ルシフエリンについ
て、アミンまたはルシフエリンの不存在について、およ
び緩衝化アミン＋ルシフエリン（本発明による）につい
ての光の強さ対時間のプロツトである。 第11図は、本発明に従う化学ルミネツセンス装置の側面
図である。 10……化学ルミネツセンス 12……隔室 14……隔室 16……弁手段
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ (56)参考文献 特表 昭59−500252（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】化学発光前駆体、酸化剤および酵素を接触
    させる工程を含んでなる化学発光法において、 前記化学発光前駆体が、次式 式中、R1はアミノであり、そしてR2、R3およびR4のすべ
    てが水素原子であるか、あるいはR1はアミノであり、そ
    してR2、R3およびR4の各々は非置換もしくは置換C1−C6
    −アルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換も
    しくは置換ヒドロキシル、カルボキシルまたはアミノで
    あるか、あるいはR2はアミノであり、そしてR1、R3およ
    びR4の各々は水素原子、非置換もしくは置換C1−C6−ア
    ルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしく
    は置換ヒドロキシ、カルボキシルまたはアミノである
    か、あるいはR1およびR2は、それらが結合する環の炭素
    原子と一緒になって、アミノまたは置換アミノによって
    置換された縮合ベンゾ環を形成し、そしてR3およびR4の
    各々は水素原子、非置換もしくは置換C1−C6−アルキ
    ル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしくは置
    換ヒドロキシル、カルボキシル、またはアミノであり、
    前記置換アルキルおよび置換アルケニルの置換基は、塩
    素、フツ素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシル、カルボキシ
    ル、ニトロおよびチオールからなる群より選ばれるもの
    であり、前記置換アミノは、C1−C10−アルキルおよびC
    2−C10−アルケニルからなる群より選ばれる置換基によ
    って置換されているものであり、そして前記置換ヒドロ
    キシルはC1−C10−アルキルおよびC2−C10−アルケニル
    からなる群より選ばれる置換基によって置換されている
    ものである、 で示される2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオンであ
    り、 前記酵素が、ペルオキシダーゼ酵素であり、そして 前記接触が、（ａ）アンモニアまたはその塩、（ｂ）イ
    ミダゾールまたはそれらのアルキル誘導体、ピリジンま
    たはそれらのアルキル誘導体、およびチオニンおよびメ
    チレンブルーから選ばれるチアジンからなる群より選ば
    れる複素環式芳香族化合物、ならびに（ｃ）式 式中、X1、X2およびX3は同一もしくは相異なり、そして
    炭素原子１〜８個の非置換アルキルまたはヒドロキシ
    ル、ニトロ、フツ素、塩素、臭素、ヨウ素およびカルボ
    キシルからなる群より選ばれる置換基によって置換され
    た炭素原子１〜８個のアルキル基である、 で示されるアルキルアミン、ならびにスペルミン、スペ
    ルミジンおよびプトレシンからなる群より選ばれるポリ
    アミン、ならびにベンジルアミンからなる群より選ばれ
    る水溶性有機アミン、からなる群より選ばれる窒素化合
    物の存在下で行われることを特徴とする化学発光法。
  2. 【請求項２】前記窒素化合物が、アンモニアまたはその
    塩である特許請求の範囲第１項記載の化学発光法。
  3. 【請求項３】前記酸化剤が過酸化水素である特許請求の
    範囲１項記載の化学発光法。
  4. 【請求項４】前記ペルオキシダーゼ酵素が西洋ワサビペ
    ルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼおよびラクト
    ペルオキシダーゼからなる群より選ばれる特許請求の範
    囲第１項記載の化学発光法。
  5. 【請求項５】増強剤をさらに含み、前記増強剤が４−ク
    ロロフエノール、４−ブロモフエノール、４−ヨードフ
    エノール、４−ブロモ−２−クロロフエノール、2,4−
    ジクロロフエノール、3,4−ジクロロフエノール、４−
    メチルフエノール、４−tert−ブチルフエノール、３−
    （４−ヒドロキシフエニル）プロピオン酸エチル、４−
    ベンジルフエノール、４−（３′−メチルクロチル）フ
    エノール、４−スチリルフエノール、４−（２′,4′−
    ジニトロスチリル）フエノール、４−ヒドロキシ桂皮
    酸、α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、４−フエニル
    フエノール、４−（４′−ヒドロキシフエニル）フエノ
    ール、２−クロロ−４−フエニルフエノール、４−
    （４′−ヒドロキシフエニル）ベンゾフエノン、４−
    （フエニルアゾ）フエノール、４−（２′−カルボキシ
    フエニルアゾ）フエノール、４−フエノキシフエノー
    ル、４−（４′−ヒドロキシフエノキシ）フエノール、
    ４−ヒドロキシフエニルサルフアイド、４−ヒドロキシ
    フエニルジサルフアイド、ナフト−２−オール、１−ブ
    ロモナフト−２−オール、６−ブロモナフト−２−オー
    ル、1,6−ジブロモナフト−１−オールおよび式 式中、Ｒは水素原子、CNまたは非置換もしくは置換のチ
    アゾールであり、そしてX1、X2およびX3の各々は水素原
    子、非置換もしくは置換のC1−C6−アルキルもしくはア
    ルケニル、ヒドロキシル、置換ヒドロキシル、C1−C6−
    アルコキシ、カルボキシル、アミノまたは置換アミノで
    ある、 で示される６−ヒドロキシベンゾチアゾール類から成る
    群より選択される特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  6. 【請求項６】化学発光前駆体、酸化剤および酵素を接触
    させる工程を含んでなる化学発光法であって、 前記化学発光前駆体が、次式 式中、R1はアミノであり、そしてR2、R3およびR4のすべ
    てが水素原子であるか、あるいはR1はアミノであり、そ
    してR2、R3およびR4の各々は非置換もしくは置換C1−C6
    −アルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換も
    しくは置換ヒドロキシル、カルボキシルまたはアミノで
    あるか、あるいはR2はアミノであり、そしてR1、R3およ
    びR4の各々は水素原子、非置換もしくは置換C1−C6−ア
    ルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしく
    は置換ヒドロキシル、カルボキシルまたはアミノである
    か、あるいはR1およびR2は、それらが結合する環の炭素
    原子と一緒になって、アミノまたは置換アミノによって
    置換された縮合ベンゾ環を形成し、そしてR3およびR4の
    各々は水素原子、非置換もしくは置換C1−C6−アルキ
    ル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしくは置
    換ヒドロキシル、カルボキシル、またはアミノであり、
    前記置換アルキルおよび置換アルケニルの置換基は、塩
    素、フツ素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシル、カルボキシ
    ル、ニトロおよびチオールからなる群より選ばれるもの
    であり、前記置換アミノは、C1−C10−アルキルおよびC
    2−C10−アルケニルからなる群より選ばれる置換基によ
    って置換されているものであり、そして前記置換ヒドロ
    キシルはC1−C10−アルキルおよびC2−C10−アルケニル
    からなる群より選ばれる置換基によって置換されている
    ものである、 で示される2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオンであ
    り、 前記酵素が、ペルオキシダーゼ酵素であり、そして 前記接触が、（ａ）アンモニアまたはその塩、（ｂ）イ
    ミダゾールまたはそれらのアルキル誘導体、ピリジンま
    たはそれらのアルキル誘導体、およびチオニンおよびメ
    チレンブルーから選ばれるチアジンからなる群より選ば
    れる複素環式芳香族化合物、ならびに（ｃ）式 式中、X1、X2およびX3は同一もしくは相異なり、そして
    炭素原子１〜８個の非置換アルキルまたはヒドロキシ
    ル、ニトロ、フツ素、塩素、臭素、ヨウ素およびカルボ
    キシルからなる群より選ばれる置換基によって置換され
    た炭素原子１〜８個のアルキル基である、 で示されるアルキルアミン、ならびにスペルミン、スペ
    ルミジンおよびプトレシンからなる群より選ばれるポリ
    アミン、ならびにベンジルアミンからなる群より選ばれ
    る水溶性有機アミン、からなる群より選ばれる窒素化合
    物の存在下で行う化学発光法によって、抗体、抗原、核
    酸、オリゴヌクレオチドおよび酵素から成る群より選択
    される被検体を検出することを特徴とする被検体の化学
    発光アツセイ。
  7. 【請求項７】被検体または被検体の結合相手を化学発光
    前駆体、増強剤または酵素で標識する特許請求の範囲第
    ６項記載の化学発光アツセイ。
  8. 【請求項８】被検体が核酸である特許請求の範囲第７項
    記載の化学発光アツセイ。
  9. 【請求項９】核酸がリボ核酸、デオキシリボ核酸および
    オリゴヌクレオチドの群から選択される特許請求の範囲
    第８項記載の化学発光アツセイ。
  10. 【請求項１０】化学発光前駆体、酸化剤、酵素、ならび
    にアンモニアまたはその塩、複素環式芳香族化合物およ
    び水溶性有機アミンからなる群より選ばれる窒素化合物
    をそれぞれ別個に含んでなる化学発光を発生するための
    試験キツトにおいて、 前記化学発光前駆体が、次式 式中、R1はアミノであり、そしてR2、R3およびR4のすべ
    てが水素原子であるか、あるいはR1はアミノであり、そ
    してR2、R3およびR4の各々は非置換もしくは置換C1−C6
    −アルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換も
    しくは置換ヒドロキシル、カルボキシルまたはアミノで
    あるか、あるいはR2はアミノであり、そしてR1、R3およ
    びR4の各々は水素原子、非置換もしくは置換C1−C6−ア
    ルキル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしく
    は置換ヒドロキシル、カルボキシルまたはアミノである
    か、あるいはR1およびR2は、それらが結合する環の炭素
    原子と一緒になって、アミノまたは置換アミノによって
    置換された縮合ベンゾ環を形成し、そしてR3およびR4の
    各々は水素原子、非置換もしくは置換C1−C6−アルキ
    ル、非置換もしくは置換アルケニル、非置換もしくは置
    換ヒドロキシル、カルボキシル、またはアミノであり、
    前記置換アルキルおよび置換アルケニルの置換基は、塩
    素、フツ素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシル、カルボキシ
    ル、ニトロおよびチオールからなる群より選ばれるもの
    であり、前記置換アミノは、C1−C10−アルキルおよびC
    2−C10−アルケニルからなる群より選ばれる置換基によ
    って置換されているものであり、そして前記置換ヒドロ
    キシルはC1−C10−アルキルおよびC2−C10−アルケニル
    からなる群より選ばれる置換基によって置換されている
    ものである、 で示される2,3−ジヒドロ−1,4−フタラジンジオンであ
    り、 前記酵素が、ペルオキシダーゼ酵素であり、 前記水溶性有機アミンが、アルキルアミン、ならびにス
    ペルミン、スペルミジンおよびプトレシンから選ばれる
    ポリアミン、ならびにベンジルアミンからなる群より選
    ばれ、かつ前記アルキルアミンは、式 式中、X1、X2およびX3は同一もしくは相異なり、そして
    炭素原子１〜８個の非置換アルキルまたはヒドロキシ
    ル、ニトロ、フツ素、塩素、臭素、ヨウ素およびカルボ
    キシルからなる群より選ばれる置換基によって置換され
    た炭素原子１〜８個のアルキル基である、 で示されるものであり、前記複素環式芳香族化合物がイ
    ミダゾールまたはそれらのアルキル誘導体、ピリジンま
    たはそのアルキル誘導体、ならびにチオニンおよびメチ
    レンブルーから選ばれるチアジンからなる群より選ばれ
    るものである、試験キツト。
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