JPH04504059A - 化学発光検出を用いた核酸の配列決定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学発光検出を用いた核酸の配列決定 発明の背景 全ての生きている有機体の遺伝情報はデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核 酸（ＲＮＡ）中に記憶されている。ＤＮＡは４つの化学的構造用ブロック、即ち ヌクレオチド類、デオキシアデノシン−５゛　−モノホスフェート（Ａ）、デオ キシグアノシン−５°−モノホスフェート（Ｇ）、デオキシシトシン−５゛−モ ノホスフェート（Ｃ）およびデオキシチミジン−５°−モノホスフェート（Ｔ） （これらは直線的に並べられて、個々の異なる特定の配列を生じる）からできて いる。個々の遺伝子または完全なゲノムのＤＮＡ配列の明示は分子生物学におい て鍵となる役割を果している。同様に、ＲＮＡの構造用ブロックも配列して特定 の配列を生じる。

ＤＮＡ配列決定のための下記の２つの基本的方法が開発された：核塩基特異性を 示す修飾用薬剤を用いた化学劣化方法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、およびＧ１１ｂ ｅｒｔ、　１．、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４ ：５６０　（１９７７））と、ＤＮＡポリメラーゼおよび核塩基特異性を示す鎖 末端用デオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いた酵素的方法（Ｓａｎｇｅ ｒ、　Ｆ、他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４：５ ４６３　（１９７７））　、　ＤＮＡ配列決定の重要さ、および全体的ゲノム、 例えばヒトのゲノムのＤＮＡ配列を得るための最終目的のため（例えば、１ｌｏ ｏｄ、　Ｌ、Ｅ、およびＳｍ１ｔｈ、　Ｌ、Ｍ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 　５：９３３（１９８７））　、数多くの新規なりＮＡクローン化、位置決定お よび配列決定技術が開発された（例えば、「酵素学における方法Ｊ　（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　（１９８７）、１５５、？ｕ、、　Ｒ ，編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓｌＮｅｗ　Ｙｏｒｋ；　５ａｌｕｚ、　 Ｈ，Ｐ、およびＪｏｓｔ、　Ｊ、Ｐ、著「ゲノム配列決定に対する実験ガイド」 （Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｓｅｑｕｅ ｎｃｉｎｇ）　、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８７）、Ｂａ５ｅ ｌ、Ｂｏｓｔｏｎ；　ｆａｄａ、　Ａ、、Ｎａｔｕｒｅ　３２５ニア７１　（１ ９８７））。

一般に、ＤＮＡ配列決定操作は下記に示す主要な数段階から成る二１）　配列決 定に関する収集からのＤＮＡクローン体の選択（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、他、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、１６２ニア２９　（１９８２）　；　Ｄ ｅｉｎｉｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｌ、、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１２９：２１ ６　（１９８３）；　Ｈｅ１ｎｉｋｏｆｆ、　Ｓ、、Ｇｅｎｅ　２８：３５１　 （１９８４））。

２）　この選択したＤＮＡクローン体に、塩基特異性を示す反応を受けさせる（ Ｍａｘａｍ、　Ａ、１１．およびＧ１１ｂｅｒｔ、　？、、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４：５６０　（１９７７）；　Ｓａｎｇ ｅｒ、　Ｆ、他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７ ４：５４６３（１９７７））。

３）　変性用ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により、大きさ従つ てＤＮＡ反応生成物を分離する。

４）　このＤＮＡが放射性異性体（例えば＄！ｐ１ｓｓＳ）で標識されているか 、或は非放射性標識分子（例えば蛍光団、比色染色）で標識されているかに応じ て、種々の技術のいずれかにより、変性用ＰＡＧＥ中またはその後分離されたＤ ＮＡ帯のパターンを検出する。Ｃｏｎｎｅｌｌ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ 　５：３４２　（１９８７）；　Ｐｒｏｂｅｒ、　１．Ｍ、他、５ｃｉｅｎｃｅ 　２３８：３３６　（１９８７）；Ｓｍ１ｔｈ、　Ｌ、１１．他、Ｎａｔｕｒｅ 　３２１：６７４　（１９８６）；　Ａｎｓｏｒｇｅ、　Ｗ、他、Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：４５９３　（１９８７）：　Ｋａｍｂａｒａ 、　Ｈ，他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：８１６　（１９８８）；　Ｂｅ ｃｋ、　Ｓ、、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１６４：５１４　（１９８７）） 。

５）　音波式ディジタイザ−およびコンピューターを用いて、Ａ％Ｇ１Ｃおよび Ｔの配列として、その分離したＤＮＡの帯を読み取る（Ｂａｎｋｉｅｒ、　Ａ、 Ｔ、およびＢａｒｒｅｌｌ、　Ｂ、Ｇ、、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ 　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　ｂ５巻、Ｆｌａｖｅｌｌ　Ｒ，Ａ、　（１！ 集）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　Ｉｒｅｌａｎｄ、　１−３４頁（１９８３）：　５ ｔａｄｅｎ、　Ｒ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：４９９　 （１９８４）；　Ｅｌｄｅｒ、　Ｊ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　１４：４１７　（１９８５）；　Ｃｏｎｎｅｌｌ他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ　５：３４２　（１９８７）；　Ｐｒｏｂｅｒ、　Ｊ」、他、５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３８：３３６　（１９８７）：　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｌ、Ｍ、他、Ｎａｔｕ ｒｅ　３２１：６７４　（１９８６）；　Ａｎｓｏｒｇｅ、　Ｗ、他、Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：４５９３　（１９８７）：Ｋａｍｂａｒ ａ、　Ｈ，他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：８１６　（１９８８）；）。

異なる配列決定方法の段階のいくつかを以下に要約する：１）　ポリマー状担体 を用いたＤＮＡ配列決定：この方法では、配列決定すべきＤＮＡを固体状担体（ 例えばＣＣ５−紙、ＤＥＡＥ−紙、アビジン−アガロース）上に固定化する（Ｃ ｈｕｖｐｉｌｏ。

ＳＡ、およびＫｒａｖｃｈｅｎｃｏ、　ｖ、Ｖ、、Ｂｉｏｒｇ、　Ｋｈｉｍ　９ ：１６９４　（１９８３）；　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、Ａ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：１１７３　（１９８５）；　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ 、　Ａ、他、Ｇｅｎｅ　４２：１　（１９８６）；　Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、＾、 他、ヨーｏ、ｙパ特許出願０１７１０７２；　５ｔａｈｌ。

Ｓ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６：３０３８　（１９８８ ）参照）。固相上への固定化の利点は、配列決定反応で用いられる種々の試薬を 容易に適用できそして定量的に除去でき、その結果として、より速（、きれいで ありそしてより高い効率の反応サイクルが得られることである。更に、この全体 の操作はより便利でありそして自動化が容易である。化学劣化および酵素的ＤＮ Ａ配列決定方法の両方共、ポリマー状支持体上で行うことができる。固体状支持 体はまた、種々のサンプルの配列決定反応を同時に行うことを可能にし得る。

２）　多重ＤＮＡ配列決定： 標準ＤＮＡ配列決定操作において、配列決定すべきＤＮＡの各々のサンプルは、 上に概略を示した５つの段階により個々に処理される必要がある。この「生産量 」は制限される、何故ならば、配列決定操作の数多くの段階を何回も繰り返す必 要があるからである。多重ＤＮＡ配列決定はこの問題の解決策を提供するもので あり、これは、現在のところ最も有望な高生産性ＤＮＡ配列決定技術である（Ｃ ｈｕｒｃｈ、　Ｇ、およびＫｉｅｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ｓ、、５ｃｉｅ ｎｃｅ　２４０：１８５　（１９８８８））　。多重ＤＮＡ配列決定は、配列決 定すべき異なるＤＮＡサンプルをプールする（多重化する）ことによって、繰り 返し段階の数を減少させる。ＤＮＡは、初期の組換ＤＮＡ収集から得られるとこ ろの、プラスミドを有するコロニーの形態でプールされる。この多重方法の鍵と なる要素は、１組の配列決定用ベクター（これらの各々は、２種の、２０個のヌ クレオチド長「タグ」配列に関してのみ異なっている）の設計である。このこと によって、標識を付けた「タグ」オリゴデオキシヌクレオチド類（これらは、相 当する標識配列に対して相補的である）を用いることによる、個々の配列決定パ ターンの差別化および検出が可能になる。

ゲノム状のＤＮＡフラグメント（これらは「ショットガン」選択によりて得られ てもよい）を、個々の多重配列決定ベクター中でクローン化した後、プール中で 増幅させる。次に、このプールしたサンプルに、塩基特異性を示す反応を受けさ せた後、得られる反応生成物を、変性用ＰＡＧＥにより大きさに従って分離する 。ＤＮＡサンプルに関する与えられたプールの全ての配列決定帯を、膜上に移し くプロットし）た後、ＵＶ架橋により固定化する。その１組の特異性を示すタグ −オリゴデオキシヌクレオチドを用いた膜の多重再試験（雑種形成）により、個 々の配列決定帯のパターンが可視化され得る（例えば、オートラジオグラフィー による放射能標識の場合）。このように、各々の多重反応および電気泳動分離は 数多くのデータを与え、そしてこれらは、用いられ得る数多くの試験サイクルに よる標準的配列決定実験のそれ以上である。例えば、２０個から成る個々の多重 ベクターを用いる場合、これらの２０個のベクター中に一体化される２個のＤＮ Ａストランドの各々の配列を得るために４０回の試験サイクルが行われ得る。こ の両方の方法において、配列決定用ゲルの各々のレーンが同じ量の配列決定され たＤＮＡを含有していると仮定すると、これには、標準ＤＮＡ配列決定よりも４ ０倍高い検出感度が必要とされる。現在のところ、より多くの材料をＰＡＧＥＩ ：用いた時および／または３２ｐ＠識したタグ−オリゴデオキシヌクレオチドを 用いた時のみ、充分な感度が得られる。

３）　直接プロッティング電気泳動（ＤＢＥ）：ＤＢＥは、電気泳動による分離 と固定膜上へのＤＮＡ配列決定用帯のプロッティングとの組み合わせである（Ｐ ｏｈｌ、　Ｆ」、、米国特許番号４，６３１、１２２および４，６３１．１２０ ；　Ｂｅｃｋ、　Ｓ、およびＰｏｈｌ、　Ｆ、１１．、ＥｉｌＢＯＪ、　３：２ ９０５およびＢｅｃｋ、　Ｓ、著、ｒＤＮＡ配列決定に用いられる直接転移電気 泳動」（Ｄｉｒｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓυ ｓｅｄ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）　Ｗｕ、　Ｒ。

（編集）、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１５５：２５０、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ 、　（１９８７））　ｅ標準的変性用ＰＡＧＥで得られる「はしご状」の配列決 定とは逆に、ＤＢＥを用いた帯の間隔は、分子量の広い範囲（６％のポリアクリ ルアミドゲルに関しては５０〜５５０個のヌクレオチド）に渡りで一定である。

帯の間隔は、電気泳動のゲルに対して垂直に動く膜の速度により変化させること ができ、従って、標準的配列決定用ゲルに比較して分解能が増大し、そしてこの 電気泳動用ゲルの長さが減少する。多重ＤＮＡ配列決定において、ＤＢＥは、優 位に、配列決定された反応生成物の必要な分離、そしてこの配列決定用はしご状 物を膜上に直接移すための方法を提供する。次に、この配列反応生成物を、永久 的に、ＵＶ架橋により膜上に固定化でき、そして多様な試験法によりこの情報が 読み取られる。放射能標識したＤＮＡフラグメントの場合、各々の試験サイクル の配列パターンはオートラジオグラフィーにより観察される。

４）　ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）：ＰＣＲにより、インビボでのベクター／ ／宿主系中よりもむしろインビトロ系中で、標的となるＤＮＡ分子を増幅させる ことができる。プライマーとして２つの短いオリゴデオキシヌクレオチドフラグ メントを用いる。このプライマーを、増幅すべきＤＮＡフラグメントのマイナス −およびプラス−ストランドの末梢部分に雑種形成させ、そして熱安定性を示す ＤＮＡポリメラーゼに相補ＤＮＡストランドの合成を触媒させる（Ｓａｉｋｆ、 　Ｒ，に、他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７　（１９８ｇ）：　Ｅｒ１ｉｃ ｈ、　Ｈ，Ａ、他、ヨーロッパ特許出願０２５８０１７；　Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｋ 、Ｂ、、ヨーロッパ特許出願０２０１１８４）　。ＤＮＡの配列決定を可能にす るに充分なレベルにまでゲノム状のＤＮＡフラグメントを増幅させるためのクロ ーン化段階を削除できる利点に加えて、このＰＣＲ方法の重要な利点は、標的と なるＤＮＡに対するこの２つのプライマーの特異的雑種形成によるものである。

２つのプライマーが特異的に雑種形成され得るところの末梢配列が公知である限 り、ＤＮＡフラグメントは、これが非常に少量で存在している場合でも、ＤＮＡ 分子の混合物から増幅させ得る。更に、この２つのプライマーのどちらか１つを 標識しそして増幅の後期中のＤＮＡポリメラーゼ鎖反応のための特異性を示すタ ーミネータ−としてジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを用いることによ り、標的となるそのＤＮＡの配列を得ることができる（Ｉｎｎｉｓ、　Ｍ、Ａ、 他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　８５：９４３ ６　（１９８８）；５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８ ７　（１９８８）：　Ｅｒ１ｉｃｈ、　Ｈ，Ａ、他、ヨーロッパ特許臼１１０２ ５８０１７；　１ｌｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂｏ、ヨーロッパ特許出願０２０１１８ ４）、ジデオキシ多重ＤＮＡ配列決定を用いれば、このプライマー（ｆｉ）を標 識する必要がなくなる。「タグ」プローブを用いることによって可視化が達成さ れる。

５）　ＤＮＡ配列決定のための非放射性検出：非放射性分子を基とする検出方法 は有利である、何故ならば、放射性異性体は高価であり、特別な排出物の廃棄を 必要とし、そして重大な健康上の危険をもたらすからである。このことは、ＤＮ Ａ配列決定において特に重要である、と言うのは、配列決定のためにかなりの量 の放射能の使用が必要とされるからである。高価なりＮＡ配列決定プロジェクト にとって、特に、考慮すべき安全性および廃棄物処理問題が障害となっている。

ＤＮＡ配列決定における放射能標識の追加的欠点は、ｍ２ｐおよびｓａＳ放射異 性体の比較的短い半減期および放射分解によるＤＮＡ損傷の受け易さである。こ れらの因子により、標識したプライマー／プローブおよびデオキシヌクレオシド トリホスフェートを使用できる時間が減少する。従って、ＤＮＡ配列決定におけ る非放射性検出は、実際上、大規模なりＮＡ配列決定プロジェクトの目的にとつ て予め必須な事項である。

今までのところ、非放射性ＤＮＡ配列決定に対する２つの異なる方法が報告され ている。１つの方法は蛍光を基とするものである。蛍光団、例えばフルオレセイ ンまたはローダミン（Ｓｍｉｔｈ、　Ｌ、１１．、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３：２３９９　（１９８５）；　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｌ、Ｍ、他 、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：　６７４　（１９８６）；Ｈｏｏｄ、　Ｌ、　Ｅ、他 、ドイツ国特許明細ＤＥ　３５０１３０６：　Ｆｕｎｇ、　Ｓ、他、ヨーロッパ 特許出願０２３３０５３；　Ａｎｓｏｒｇｅ、　Ｗ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：４５９３　（１９８７））を用いて、第一級アミノ基 （Ｃｏｕｌｌ、　Ｊ、他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２７：３９９ １　（１９８６）：　Ａｇｒａｗａｌ、　Ｓ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　１４：６２２７　（１９８６））により、合成配列決定用ブライ？ 　−（Ｓｉｎｈａ、　Ｎ、Ｄ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１２：４５３９　（１９８４））の５゛末端を特異的に標識する。二者択一的に 、化学的オリゴデオキシヌクレオチド合成中、塩基で修飾したデオキシウリジン 部分上に該蛍光団を導入する（Ｂｒｕｍｂａｕｇｈ、　Ｊ、Ａ、他、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：５６１０　（１９８８） ：　Ｂｒｕｍｂａｕｇｈ、　Ｊ、Ａ、他、ヨーロッパ特許出願０１５７２８０） ）。後者の方法によって、１個以上の蛍光標識を配列決定用プライマーに特異的 に導入することが可能になり、従って、信号および感度を上昇させる。もう１つ の方法では、プライマーと言うよりはむしろ末端ジデオキシリボヌクレオシドト リホスフェートを蛍光的に標識する（Ｐｒｏｂｅｒ、　Ｊ、Ｍ、、５ｃｉｅｎｃ ｅ　２３８：３３６　（１９８７）：　Ｈｏｂｂｓ、　Ｆ、Ｗ、他、ヨーロッパ 特許出願０２５１７８６））。この方法は魅力的である、何故ならば、特異末端 を有するヌクレオチドのみを標識した時、この配列決定反応中に生じるところの 、全ての非特異的鎖末端が未検出のまま残存するからである。

このことによって、雑音比に対するより低い背景とより良好な信号が得られる。

４つの異なる蛍光標識を用いて４つの塩基Ａ、Ｇ、、ＣおよびＴを区別するとき 、４つの異なる配列決定反応が変性用ＰＥＧＥ中の１つのレーン内で同時に分離 され得る。レーザー励起および４種の染料に特異なフィルターを用いることで、 電気泳動ゲルのレーンは水平にオンラインで走査することができ、そしてこの配 列データは、より一層のデー夕改良のためコンピューターにより処理できる。こ の４種染料ル−ン方法（Ｓｍｉｔｈ、　Ｌ、Ｍ、他、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：　 ６７４　（１９８６）；　Ｐｒｏｂｅｒ、　Ｊ」、他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８ ：３３６　（１９８７））は、配列決定用ゲルの生産量を４倍にまで増大させる 。プライマーもしくはターミネータ−用標識システムのための自動化ＤＮＡ配列 決定装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓおよびＤｕＰｏｎｔ　ｄｅ 　Ｎｅｒｒｒ。

ｕｒｓから商業的に入手可能である。これらの２つの方法の技術的確認はより複 雑で高価であり、そしてこれには、ＤＮＡ配列を読み取るための複雑なデータ処 理が要求され、１種染料４レーン方法（Ａｎｓｏｒｇｅ、　Ｗ、他、Ｎｕｃｌｅ ｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：４５９３　（１９８７））に比較して、相 当の誤差を生じさせる。

プライマー／プローブおよびターミネータ−の標識のために成功裏に用いられて おり、そして半自動装置および適切な蛍光試薬と一緒に商品化されてはいるが、 蛍光標識はいくつかの欠点を有している。第一に、今までに開発されたシステム の全ては、電子操作が全くない配列帯パターンを生じない。正確な配列結果を得 るためには、この主要配列決定用データの電子的フィルターにかけられていない 画像が必要とされている。

数多（の改良にも拘らず、ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの化学的配列決定方 法そしてＳａｎｇｅｒの酵素的配列決定方法は、未だ誤差無しと言う段階ではな く、時には不明瞭な結果を与える。従って、信頼できる結果と不明瞭な結果とを 明確に区別するために、この主要配列決定データの直接画像に対する熟練者によ る評価がしばしば必要となる。この画像（即ちＸ線フィルムまたは写真）が、後 の比較のために利用できるままで保存されるか、或は曖昧な配列領域をより良（ 評価することも重要である。

２番目に、蛍光標識は、放射性標識で得られる程の全体的感度が得られない。従 って、蛍光検出は、現在利用できる最も有望な大規模ＤＮＡ配列決定技術である 多重ＤＮＡ配列決定用として用いることはできない。

更に、現在利用できる全ての膜が自己蛍光を有しているため、蛍光標識したオリ ゴデオキシヌクレオチドを用いた膜固定化ＤＮＡフラグメントの多様再試験はで きそうにない。最後に、蛍光標識した材料は光漂白を受け昌い。

２番目の非放射性検出方法は比色検出およびＤＢＨの使用を伴うものである（Ｂ ｅｃｋ、　Ｓ、、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１６４：５１４　（１９８７） ；　Ｒｉｃｈｔｅｒｉｃｈ、　Ｐ。

他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　７：５２−５９　（１９８９））　ｏこの 配列決定用プライマーの特異的比色標識は、多段階方法で達成される。第１に、 ビオチンを用いて該合成オリゴデオキシヌクレオチドプライマーの５°末端を標 識する（Ｃｏｕｌｌ、　Ｊ、他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　２７： ３９９１　（１９８６）；　Ａｇｒａｗａｌ、　Ｓ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１４：６２２７　（１９８６））　ｏこの反応混合物中の 鎖終結によって得られるオリゴヌクレオチドを、変性用ＰＡＧＥにより大きさに 従って分離する。この分離したオリゴヌクレオチドを、標準技術により膜上に移 すか、或は直接ＤＢＥにより膜上にプロットする。ＵＶ架橋により該膜上にオリ ゴヌクレオチドを共有結合的に結合させた後、ビオチンに対して著しく高い結合 親和性を有するストレプトアビジンによりビオチン化させたＤＮＡフラグメント に対して固定化できるところの、ビオチン化された酵素、例えばアルカリ性ホス ファターゼを用いて、このビオチン化したフラグメントが可視化される。更に、 この目的のため、ホスファターゼアビジン／ストレプトアビジン結合が用いられ 得る。アルカリ性ホスファターゼを用いて全ての配列決定用反応生成物に標識を 付けた後、色を生じる基質（例えばＢＣＩＰ：５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルホスフェート、ＮＢＴ：ニトロブルーテトラゾリウム）上の比色反応は 、着色した帯として配列決定用帯パターンを展開させ得る。

化学的（上述したように）または酵素的（Ｌａｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｒ，他、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　ＵＳＡ　７８：６６３３　（１９８１）；　Ｗａ ｒｄ、　Ｄ、Ｃ，他、米国特許番号４．７１１．９５５；　Ｒ１１ｅｙ、　Ｌ、 に、他、ＤＮＡ　５：３３３　（１９８６））に、核酸はビオチンで標識され得 る。このビオチン／アビジンのシステムは、雑種形成実験のための核酸を含む種 々の生方子を標識するために幅広く用いられてきた（Ｗｉｌｃｈｅｋ、　Ｍ、他 、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７１：１　（１９８８）；　Ｌｅａｒｙ、 　Ｊ、Ｊ、他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０；４０４５　（１９８３）；　Ｃｈｕ、　 Ｂ、Ｃ，Ｆ他、ＤＮＡ　４：３２７　（１９８５）；Ｋｏｃｈ、　Ｊ、他、Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　１４ニア１３３　（１９８６）；　Ｋｏ ｕｒｉｌｓｋｙ、　Ｐ、他、米国特許番号４，５８１，３３３；　Ｗａｒｄ、　 Ｄ、Ｃ０他、米国特許番号４．６８７．７３２）。

比色標識を用いることで、該主要配列決定データの永久的画像を得ることができ る。しかしながら、今のところ、膜に固定化した配列の情報に対して悪影響を与 えないところの、利用できるいかなる有効な定量脱染色方法も存在していない。

従って、比色標識方法を用いた多重ＤＮＡ配列決定は実施できそうにない。更に 、達成され得る感度は多重ＤＮＡ配列決定にとって充分でない。

核酸の配列を測定するための利用できる方法が数多く存在しているにも拘らず、 放射能、蛍光もしくは比色標識を用いるとき遭遇する問題を回避できる検出シス テムの必要性が存在している。

発明の要約 本発明は、核酸分子を検出するための化学発光の使用、並びに化学発光検出を用 いた核酸の配列決定方法に関する。この配列決定方法は、迅速でありそして核酸 （ＤＮＡ／ＲＮＡ）配列測定に対して高い感度を示し、そしてこれにより、放射 能、蛍光および比色可視化方法の使用を回避できる。

本発明に従って、化学発光を生じ得る化合物に対して共有結合的もしくは非共有 結合的に連結させた核酸を提供する。例えば、ＤＮＡ配列決定操作の結果として 核酸を提供する。

化学発光を生じることができる化合物は、光を発する化学発光遺伝的（Ｃｈｅｍ ｉｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）基質を触媒する酵素であり得る。しかしながら、こ の化合物は、それ自身が光の発生を誘発し得るものでもあり得る。

核酸を検出するため、適切な手段により化学発光を発生させる。核酸を酵素に連 結させた後、これを化学発光遺伝的基質と接触させる。次に、この酵素がこの基 質に対して光を生じさせる。二者択一的に、その化学発光を生じる化合物それ自 身が化学発光遺伝的である場合、適当母刺激（例えば、ｐＨ１温度、および酵素 反応を含む化学反応）により光の発生が開始される。１つの具体例において、化 学発光反応を含む段階は、均一相中で行われ得る。この化学発光反応によって生 じる光を検出し、そして核酸の存在または量に対する指示が得られる。

好適な具体例において、核酸を酵素に連結させ、そしてこの酵素のための化学発 光遺伝的基質は、安定であり酵素的に開始可能な置換１，２−ジオキセタンであ る。特に好適な具体例において、発生させる光の強度を増幅するため、この化学 発光遺伝的基質と連結させて増強分子が用いられる。好適には、この増強分子は 、該化学発光反応中に生じる光エネルギーによつてそれ自身が励起されそしてそ の励起状態で光を発する蛍光団である。この増幅された信号を検出する。

化学発光を生じることのできる化合物を、核酸上の１つ以上の部位に共有結合的 もしくは非共有結合的にそれを付着させることによって、この核酸中に組み込む ことができる。例えば、５°および／または３′末端に対して、或は１種以上の 核塩基に対して、或はホスホジエステルのバックボーン上の１種以上の部位に対 して、この化合物を付着させることができる。加つるに、この化合物は、有機リ ンカ−分子、ビオチン／アビジン（ストレプトアビジン）ブリッジ、および二特 異性を示す抗体を通して、核酸に付着させることができる。

化学蛍光による核酸の検出方法は、数多くの核酸配列決定技術、例えばＭａｘａ ｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの化学的劣化方法、Ｓａｎｇｅｔの酵素的／プライマー 拡張方法、およびこの２つの配列決定化学のどちらかを基とした多重ＤＮＡ配列 決定もしくは多重化技術で用いられ得る。この方法はまた、核酸雑種形成反応に おいて用いられ得る。化合物を核酸に対して付着させる方法は、使用する配列決 定方法に従う必要がある。

核酸配列決定操作において、この配列決定方法の種々の段階で化学発光を生じる ことのできる化合物に対して核酸を連結させ得る。プライマーもしくは鎖ターミ ネータ−を用いて核酸の配列決定を行う場合、公知の分離技術を用いて配列決定 反応の生成物を分離した後、化学発光を生じる化合物を核酸に付着させ得る。こ の化学発光を生じる化合物を、上述したように、核酸上の１つ以上の部位で、配 列決定用反応生成物に連結させ得る。雑種形成プローブを用いて核酸の配列を検 出する場合、その化学発光を生じる化合物を該プローブ上の１つ以上の部位で連 結させ得る。

化学発光による核酸の検出方法は、他の検出方法に比べて数多くの利点を有して いる。例えばプライマー、プローブおよびターミネータ−を用いて得られる標識 された核酸は、長い保存安定性を有している。放射性を示す材料の使用に伴う危 険性が回避される。Ｘ線またはインスタントフィルムを用いて、配列決定データ の永久的画像が容易に得られる。

種々の増幅手段、例えば化学発光化合物と増強分子との間の分子間エネルギー移 動により、高い感度が得られる。更に、本発明の検出システムは非常に高感度で あり、フィルムへの暴露時間を減少できる。更に、現在利用できる電荷結合素子 カメラを用いて、配列決定画像が直接得られ、従ってフィルム段階を回避できる 。本発明の方法は、直接プロッティング電気泳動（ＤＢＥ）を用いたオンライン の検出システムの一部に用いることができると共に、帯のパターンを配列決定す るための永久的画像を作り出すことができる。更に、本検出方法は、ポリメラー ゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術、固相配列決定およびＤＢＥと同様、多重ＤＮＡ配列袂 定に適用できる。

図の簡単な記述 図１は、安定で選択的開始可能な１．２−ジオキセタン類の例を示している。５ ｃｈａａｐ、　Ａ、Ｐ、、Ｊ、　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｃ ｈｅ＋ａｉｌｕ＋５ｉｎｅｓｃｅｎｃｅ；ＤｅＬｕｃａｍ、　Ｍ、Ａ、およびＭ ｃＥｌｒｏｙ、　Ｗ、Ｄ、（編集）　１９８１　Ａｃａｄｅ＋ｓｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ％ＮｅｗＹｏｒｋからの修飾。

図２は、酵素触媒反応を用いた固定化ＤＮＡフラグメントの化学発光検出のため の図式図を示している。

図３は、化学発光検出（実施例３参照）後のビオチン化オリゴマーＢｉｏ１５Ｍ １３　（実施例１．２参照）を用いて雑種形成をした後のドツトプロットを示し ている。上から下へ５０．１０．２．０．４．０．０５．０．０フ工ムトモル（ １０−”モル）の単一ストランド化Ｍ１３　ＤＮＡを、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａ ｎＴＭ）の片につけた。この片を雑種形成した後、実施例２で示すように処理し た。［１］は、フジのＸ線フィルムに対して１秒（ａ）　、５秒（ｂ）、１０秒 （ｃ）および４５秒（ｄ）暴露した後の第一試験の結果を示している。（ｅ）は 、このプローブを除去した後（３００秒の暴露時間）の同−膜を示している。［ ２］、［２０コおよび［４０コは、相当する試験サイクル番号［’２］、［２０ ］および［４０］（試験サイクル番号１用と同じ暴露時間）に関する結果を示し ている。

図４は、ナイロン膜（Ｎｙｔｒａｎ”）上にＤＢＥを適用した後のＭ１３ｍｐ８ ＤＮＡ配列帯パターンの化学発光検出を示している。実施例４と同様にこの膜を 処理した後、ポラロイド５７白黒フイルムに対して１秒（ａ）、５秒（ｂＬ１０ 秒（Ｃ）および４５秒（ｄ）暴露することによりルミノメータ−中で、ＤＮＡ配 列帯パターンを検出した（実施例３と同様）。

図５は、以下に示す２種のフルサイズｌ１１３ｍｐ８　ＤＮＡ配列プロットの化 学発光検出（Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ”、Ｌｕｍｉｇｅｎｌｌｎｃ、、Ｄｅｔｒｏｉ ｔ、　ＭＥ使用）を示している＝　（ａ）標準電気泳動／ブロッティング使用、 （ｂ）ＤＢＥ使用。この両方のプロットを、実施例３および４と同様にして処理 した後、フジのＸ線フィルムに１分間暴露した。ＤＮＡ配列の順は、左から右に ＡＳＧ、Ｃ，Ｔである。このＤＮＡ配列の長さはヌクレオチドの数として長軸方 向に示されている。

詳細な記述 本発明は、核酸分子を検出するための化学発光の使用に関する。本方法に従って 、化学発光を生じ得る化合物に対して共有結合的もしくは非共有結合的に連結さ せた核酸を提供する。この化合物それ自身は、適当な刺激（例えば、ｐＨ，温度 、および酵素反応を含む化学反応）によって誘発された後、光を発することがで きる。二者択一的に、この化合物は、化学発光を生じさせるため別の化合物に作 用させてもよい。好適には、この化学発光を生じる化合物は、化学発光剤となり 得る適当な基質を誘導し得るところの、酵素である。いくつかの適切な酵素は、 アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクト シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アリールエステラーゼ、 スルファターゼ、ウレアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、キモトリプシン、 トリプシン、アミノペプチダーゼおよびリパーゼである。

核酸と連結するところの、化学発光を生じる化合物が誘導されて、化学発光を生 じ、それによって核酸の検出を可能にする。この化合物が酵素である場合、これ を適当な化学発光遺伝的基質と接触させる。この化学発光は、この核酸の存在に 対する指示を与え、そして発せられる光の強度が、存在している量に対する指示 を与える。上述したように、好適な具体例において、化学発光を生じることので きる化合物は、化学発光遺伝的基質に対して化学発光を開始させる酵素である。

化学発光遺伝的基質の例は、ルミノール、ルシフェリンまたは置換１．２−ジオ キセタン類である。特に好適な具体例において、この化学発光遺伝的基質は安定 であるが、酵素的に開始可能な置換された１、２−ジオキセタンである。適当な 酵素を用いて置換１．２−ジオキセタンを開始させる場合、この酵素は、そのジ オキセタン上の置換基を開裂させて、不安定な負に電荷したジオキセタンを生じ させる。この負の電荷により、分子内電子移動を通してジオキセタンを分解させ て、ビラジカルおよび光を生じさせる。５ｃｈａａｐ、　Ａ、Ｐ、、ヨーロッパ 特許出願０２５４０５１　（１９８７）参照。図１１：いくつかの置換１．２− ジオキセタン類およびそれらの相当する酵素を示す。好適な酵素は、１．２−ジ オキセタンを含有しているホスフェートと連結させて用いられるアルカリ性ホス ファターゼである。

化学発光を生じることのできる化合物は、核酸上の１つ以上の部位に対してそれ を化学的に付着させることによってこの核酸中に組み入れられ得る。例えば、化 学発光を生じる化合物は、核酸に対して、５°および／または３′末端で、或は １種以上の核塩基で、或はホスホジエステルのバックボーン上の１つ以上の部位 に対して付着させ得る。この化合物は、有機リンカ−分子、ビオチン／アビジン （ストレプトアビジン）ブリッジ、および二特異性を示す抗体を通して核酸に付 着させることができる。この付着を容易にさせるために用いられるところの、こ の化合物と分子を付着させる方法を、より詳細に以下に示す。

検出の感度を改良するため化学発光を増幅することができる。例えば、化学発光 反応によって発せられる光の強度は、核酸上の多数の部位に数多くの化学発光発 生分子を組み入れることによって増幅させ得る。前述したように、この化学発光 発生化合物を、核酸に対して、５°末端、３゛末端で、或は核塩基上の１種以上 の部位で、或はホスホジエステルのバックボーン上の１つ以上の部位に対して付 着させ得る。化学発光を増幅するための特定の手段を詳細に以下に示す。

更に、増強分子を該化学発光発生化合物と一緒に用いて、更に化学発光の強度を 増幅させることができる。増強分子は、該化学発光化合物が発する光によって励 起されそしてその励起状態で光を発する分子である。

好適には、この増強分子は蛍光団、例えばフルオレセイン類、クマリン類および ローダミン類の種類のものであり、これらは担体分子と一緒に用いられる。この 担体分子は、該化学発光発生化合物に対してその蛍光団をより近づけることを可 能にする。最も好適なフルオレセイン類は、親フルオレセイン分子である。化学 発光を増強する２つの市販品は、Ｌｕｍ１−Ｐｈｏｓ”　（Ｌｕｍｉｇｅｎ、　 Ｉｎｃ、、Ｄｅｔｒｏｉｔ、　ＭＩ）およびＪａｄｅ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉｎｔｅｎ ｓｉｆｉｅｒ　（Ｑｕｅｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ、 　ＭＡ）である。

核酸配列決定操作において、その核酸配列決定方法に応じ種々の方法で、化学発 光を生じることのできる化合物に核酸を連結させ得る。化学発光を生じることの できる化合物をそれに付着させるため、核酸のプライマーの５′末端を修飾し得 る。同様に、核酸の饋ターミネータ−１例えばジデオキシヌクレオシドトリホス フェートは、それに化学発光発生化合物を付着させるため修飾させ得る。次に、 該配列決定反応生成物を分離した後、この化合物を該プライマーまたはターミネ ータ−に連結させ得る。雑種形成反応において、例えば核酸がプローブである場 合、この核酸の１種以上の部位で、該化学発光発生化合物をこの核酸中に組み入 れることができる。２個以上の化学発光発生化合物を核酸に付着させると、前述 したように、化学発光反応で生じる光の強度が増強できる。

この化学発光反応を誘発させるに先立ち、公知の転移技術またはＤＢＥを用いて 、化学発光発生化合物に連結させた核酸を固体状支持体に付着させ得る。本発明 の検出方法において、いかなる多孔質もしくは非多孔質固体状支持体も使用でき る。しかしながら、その固体表面に対する核酸の共有結合的もしくは非共有結合 的付着を容易にさせるためには、平らな表面を使用するのが有利である。いくつ かの適切な固体状支持体として、ナイロン膜、ナイロン膜誘導体、ポリフッ化ビ ニリデン（ＰＶＤＦ）膜、並びにそれらの誘導体が挙げられる。

本発明は更に、化学発光検出を用いた核酸の配列決定方法に関する。

１つの具体例において、配列決定すべきＤＮＡの領域に対して相補的な核酸プラ イマーを、化学発光を生じることのできる化合物がそれに付着できるように、修 飾する。もう１つの具体例において、核酸の３゛末端を代表している鎮ターミネ ータ−を、化学発光発生化合物がそれに付着できるように、修飾する。好適には 、この修飾したプライマーおよび修飾したターミネータ−は、式Ａ−Ｘ−８ｐ− Ｙ−Ｌ’　［式中、Ａ、Ｘ。

５ｐＳＹおよびＬ＋は図式１．２および３中に記述されている］を有する。次に 、このプライマーを、配列決定すべきＤＮＡに対して雑種形成した後、鋳型とし て配列決定すべきＤＮＡを用いて、デオキシリボヌクレオチドと一緒に拡張させ る。この拡張反応をジデオキシリポヌクレオシドトリホスフェートで終結させて 、ＤＮＡ分子（この長さは、該プライマーからの終点に依存している）を生じさ せる。この拡張反応の各々によって生じるＤＮＡ分子を、公知の分離技術により 大きさに従って分離する。次に、この分離した分子を固体状支持体に付着させ、 これにより、化学発光を生じる化合物を、修飾したプライマーおよび／または修 飾したターミネータ−で、その分離した分子に付着させる。この得られるＤＮＡ 分子を、適当な刺激、例えば化学発光遺伝的基質に接触させて、この化合物に化 学発光を生じさせる。大きさに従って、この分離したＤＮＡ分子のパターンを得 るためこの化学発光を検出するが、ここで、結果として生じる光の量は、核酸の 存在および量に対する指示を与える。

次に、ヌクレオチド配列が、分離されたＤＮＡ分子のパターンを基にして決定さ れる。

二者択一的に、該配列決定反応から分離された分子をブリッジ用単位（Ｍ）に連 結させる（表１参照）。この化学発光発生化合物を、次に、直接もしくは結合用 単位Ｌ２を用いて、Ｍに連結させる。この化合物は化学発光を生じさせられ、そ して上述したように、この化学発光が検出される。

もう１つの具体例において、化学発光を生じることができる化合物を付着させる ため、配列決定すべきＤＮＡを５°または３°末端で修飾する。好適には、この 修飾したＤＮＡは、式Ａ−Ｘ−８ｐ−Ｙ−Ｌ’　［式中、Ａ、Ｘ、Ｓｐ、Ｙおよ びＩ、ｌは、図式１．２および３に記述されている］を有する。この５゛または ３°末端を修飾する方法を以下に詳しく記述する。ＤＮＡに１組の別々の化学反 応を受けさせ、ここで、このＤＮＡと試薬（これは、いかなるＤＮＡ分子中にお いても数個の塩基のみが修飾される条件下で４個のヌクレオシド塩基の１個もし くは２個を特異的に修飾する）とを反応させる。次に、このＤＮＡを、その修飾 した塩基部分で該ＤＮＡを開裂させる試薬と接触させる。この開裂した分子を分 離し、固体状支持体に付着させた後、化学発光を生じ得る化合物を、この分子に 対して直接、その修飾した５゛　もしくは３°末端に付着させるか、或はブリッ ジ用単位を通してその分子に付着させる。この分子を、化学発光を生じさせる適 当な刺激と接触させることによって、化学発光反応を誘発させる。この化学発光 を検出し、ここで、発せられる光が該核酸の存在および量に対する指示を与える 。それにより、ＤＮＡ分子のパターンを基にしてヌクレオチドの配列が決定され る。

更にもう１つの具体例において、数多（のプールされたＤＮＡ分子のＤＮＡ配列 を同時に測定するための多重技術と関連させて、ＤＮＡ配列決定方法（例えばＳ ａｎｇｅｒの鎖拡張方法およびＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの劣化方法）が 用いられ得る。多重技術を用いることで、鎖拡張によるか、或は配列決定すべき ＤＮＡを化学的に劣化させることによって生じたＤＮＡ分子を、大きさ従って分 離した後、固体状支持体に付着させる。次に、この分離した分子を、配列決定す べき個々のＤＮＡ分子に特異性を示すＤＮＡプローブで試験し、ここで、このプ ローブは、このＤＮＡに相補的な核酸配列を有しており、そしてこれを、化学発 光を生じ得る化合物に対して、その上に局在している１個以上の部位で共有結合 的に結合させる。このプローブをその分離したＤＮＡ分子に対して雑種形成をし た後、適当な刺激と接触させて、この化合物に化学発光を生じさせる。この化学 発光を検出し、ここで、発せられたこの光が特異的ＤＮＡの存在および量の指示 を与える。配列決定すべき各々のＤＮＡに対して独特なプローブを用いてこの試 験段階を繰り返して、個々のＤＮＡ分子各々のためのヌクレオチド配列を生じさ せる。

二者択一的に、化学発光発生化合物を非共有結合的に付着させるため、このプロ ーブは、このプローブ上に局在している１個以上の部位において修飾され得る。

この修飾したプローブを、次に、配列決定反応中に生じる分離された分子に対し て雑種形成する。その後、化学発光を生じることのできる化合物をその修飾した プローブに付着させる。この化学発光発生化合物を付着させる方法は以下に詳し く記述する。

雑種形成反応においても化学発光が使用できる。特に、上述したように、化学発 光発生化合物に核酸プローブを共有結合的もしくは非共有結合的に付着させる。

検出すべきＤＮＡ／ＲＮＡを固相に付着させた後、標準雑種形成技術を用いてこ のプローブと接触させる。この雑種形成されたプローブを、化学発光反応を生じ させるに適切な条件下で適当な刺激と接触させる。この化学発光反応で発せられ る光は、ハイブリッドの存在および量を示している。

ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔの化学劣化方法またはＳａｎｇｅｒの酵素的／ プライマー拡張方法のいずれかを用いて核酸の配列決定を行い得る。この２つの 配列決定用化学を基にして、多重技術が利用できる。化学発光を生じることがで きるか、或は別々の化合物に化学発光を生じさせることのできる化合物に、核酸 を共有結合的もしくは非共有結合的に結合させる。

化学発光を生じることのできる化合物を核酸に付着させるための共有結合的およ び非共有結合的方法を図式１．２および３に示す。

Ａ−Ｘ−８ｐ−Ｙ−Ｅ ［式中、 Ａは、核酸であり、 ＸおよびＹは、核酸をＥに連結させるところの、同一もしくは異なる化学官能基 であり、 Ｓｐは、ＡとＥとの間に適当な連結距離を与えるところの、化学スペーサー基で あり、そして Ｅは、化学発光を生じることができるか或は別の化合物に化学発光を生じさせる ことのできるところの化合物である］。

Ａ−Ｘ−Ｓｐ−Ｙ−Ｌ’＋Ｍ＋Ｌ”−Ｅ　→Ａ−Ｘ−Ｓｐ−Ｙ−Ｌ’−Ｍ−Ｌ” −Ｅ［式中、 ＡＳＸ、ＹＳｓｐおよびＥは、上に定義し、ＬｌおよびＬｌは、同一もしくは異 なり、連結単位であり、〜は、非共有結合付着を表し、そして Ｍは、ブリッジ用単位である］。

Ａ−Ｘ−Ｓｐ−Ｙ−Ｌ’−Ｍ−Ｅ Ａ−Ｘ−８ｐ−Ｙ−Ｌｌ−Ｍ−Ｅ ［式中、 Ａ、Ｘ、ｓｐ、ｙ、Ｌｌ、ＭおよびＥは、上に定義する］。

図式１は、化学発光を生じることのできる化合物に対して共有結合的に付着する 核酸を示している。雑種形成反応に適切なプローブとして使用される核酸は、ス ペーサー（Ｓ　ｐ）および化学官能基（Ｘ）および（Ｙ）を通して、化学発光を 生じ得る化合物（Ｅ）に対して共有結合的に連結させ得る。ＸおよびＹは、同一 もしくは異なっていてもよく、そして化学官能基、例えばアミノ、ヒドロキシ、 カルボキシ、メルカプト、メチレン、カルボニルおよびアミドである。好適には 、Ｅは、基質と接触して化学発光反応を生じることのできる酵素である。

二者択一的に、図式２および３は、核酸への、化学発光を生じることのできる化 合物の非共有結合的付着を示している。記号〜は、ここでは、非共有結合付着を 表すために用いる。記号−は、共有結合付着を表すために用いる。化学官能基（ Ｘ）を通して、核酸をスペーサー（Ｓ　ｐ）に連結させる。このスペーサーを更 に、Ｘと同じか或は異なっていてもよい化学官能基（Ｙ）を通して、連結用単位 （Ｌつに連結させる。連結用単位（Ｌ’）は、ビオチン、イムノビオチン、特定 のレクチン結合糖、レクチン類、ステロイドを含む小さい分子、ペプチド類、２ ．４−ジニトロフェニル化アミノ官能基、ハブテン類、ハブテンまたはビオチン に特異な抗体、を含む種々の分子から選択され得る。［、ｌがハブテンもしくは ビオチンに特異な抗体である場合、公知の技術を用いて配列決定反応生成物を分 離した後、それを核酸に連結させる。好適な具体例において、ＡはＤＮＡであり 、Ｌｌはビオチンであり、Ｍはアビジン／ストレプトアビジンであり、Ｌ２はビ オチンであり、Ｅはアルカリ性ホスファターゼテアリ、＋してＸ　５ｐ−ＹＩｔ Ｃ（０）ＮＨ（ＣＨｚ）＊ＮＨである。

Ｓａｎｇｅｒの鎖拡張方法を用いる場合、核酸プライマーおよび／または核酸タ ーミネータ−１例えばジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを、Ｘ−５ｐ− Ｙを通して連結用単位（しりに共有結合的に連結させる。

公知の分離技術を用いてこの配列決定反応生成物を分離した後、化学発光を生じ 得る化合物（Ｅ）を、Ｉ、Ｉを通してその分離した反応生成物に連結させる。

図式２に示すように、連結用単位Ｌ１およびＬ２は、ブリッジ用単位（Ｍ）を通 してＥに非共有結合的に連結させる。二者択一的に、このブリッジ用単位Ｍは、 Ｌ２無しでＥに間接的に核酸を連結させ得る化合物であり得る（図式３）。いく つかの適切なブリッジ用単位は、ビオチン、アビジン／ストレプトアビジン、ビ オチンに特異な抗体、ハブテン、ハブテンに特異な抗体、レクチン、レクチンに 特異な糖、および二特異的抗体である。

更にこのブリッジ用単位は、化学発光を生じることのできる追加的化合物（Ｅ） にそれ自身を連結させ得るところの、他の分子に連結させ得る。追加的ブリッジ 用単位を添加することによって、化学発光反応から生じる光の強度が増幅され得 る。化学発光発生化合物の各々がこの反応で生じる光の強度に加えられるため、 増幅が生じる。表１は、Ｅの非共有結合的付着のための連結用およびブリッジ用 単位のいくつかの組み合わせを示している。これは包括的であることを意味する ものではない。

核酸は、Ｓａｎｇｅｒの鎖拡張方法を用いるときプライマーとして機能するか、 或は配列決定反応を行うためのＳａｎｇｅｒまたはＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅ ｒｔ方法のいずれかを用いたＣｈｕｒｃｈの多重ＤＮＡ配列決定方法を用いると き、プールした配列決定パターンを検出するためのプローブとして機能し得る。

図式４は、それがプライマー／プローブ（ＡＩ、Ａ２およびＡ３）として機能す るとき、化学発光発生化合物（Ｅ）が核酸に付着し得る３つの方法を示している 。

表１ Ｅの非共有結合 ａ）　ｂ）　ｃ）　ｄ）　ｅ）　ｆ）　ｇ）　ｈ）　ｉ）　ＤＬ２　Ｅ　−−ビ オチン　抵抗体　−−レクチン　−　−図式４：　オリゴヌクレオチドの修飾 Ｘは、Ｏ，Ｓ、ＮＨ，ＣＨｔ、ＮＨＮＨ，Ｃｏ、ＮＨＣＯ＊たはＳＳであり、 Ｒ５は、ＨまたはＯＨであり、 Ｙは、ＯＨ，ＮＨ！、ＳＨ，’　Ｃｏ、Ｃ０２Ｚ、Ｃｏ！Ｈ，Ｂｒ、Ｃ１，Ｆ。

）（ｇｃｌ　７ジ）’、ＣＯ−イミダゾール、ＮＨ−ＮＨ！、Ｃｏ−ＮＨＮＨ２ 、またはＮ−マレイミドであり、 Ｓｐは、（ＣＨｚ）−（ＣＨ２）−（Ｃ６Ｈ４）。、［ＮＨ（ＣＨり、ＣＨＲ’ ］、。

または［Ｃ０（ＣＨ２）、Ｏ］。

（式中、 Ｒ’は、Ｈ，（ＣＨｘ）−ＮＨ２，（ＣＨ２）、Ｃ０Ｃ）Ｈ：ｌＥ）’：Ｉｔ　 （ＣＨ２）−８Ｈであり、 Ｚは、４−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、３．５−ジクロロフェニ ル、メトキシメチル、ヒドロキシベンズトリアゾリルおよびＮ−ヒドロキシスク シニミドイルを含むところの、差別的活性を示すエステル結合を生成するアルキ ル、アリール、アラルキル基であり、ｎは、１〜２０の整数であり、 ｍは、１〜６の整数であり、そして Ｂは、アデニン、グアニン、チミジン、シトシンおよびウラシルから成る群から 選択される核塩基である） ＲＩＳＲ２、Ｒ３およびＢは、上に定義し、Ｂ１は、５−修飾ピリミジン、８− 修飾プリン塩基、７−修飾Ｎ７−ジアザアデニン、７−修飾Ｎ７−ジアザアデニ ン、Ｘ、ＳｐおよびＹは、上に定義する］。

Ｒ２は、Ｈであり、 Ｒ５は、ＨまたはＯＨであり、そして Ｘ、Ｙ、ＳｐおよびＢは、上に定義するコ。

Ｓａｎｇｅｒの配列決定方法において、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ■を含む種 々の酵素、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩの大きなフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ フラグメント）、Ｔ４およびＴ７ポリメラーゼ、セクエナーゼ、Ｔａｑポリメラ ーゼを含む熱に安定なりＮＡポリメラーゼ、および４つのデオキシヌクレオシド トリホスフェートの混合物、によって酵素的に拡張されるプライマーとして、短 い核酸が用いられ、そして４つの異なる鎖拡張反応において、塩基に特異な鎖タ ーミネータ−としてその個々のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの１つ を用いる。核塩基（図式４中のＡ２および図式５中のＡ４）、修飾したホスホジ エステルのバックボーン（図式４中のＡ３）または５°−もしくは３°末端（図 式４中のＡｌ）を通して、共有結合付着方法もしくは非共有結合付着方法により 、化学発光を生じ得る化合物、例えば酵素を、核酸に連成させ得る。図式５は、 化学発光を生じることのできる化合物にデオキシリボトリホスフェートを連結さ せ得る種々の方法を示している。

Ｂは、アデニン、グアニン、チミジン、シトシン、ウラシル、７−ジアザアデニ ンおよび７−ジアザグアニンであり、Ｒ４およびＲ６は、ＨまたはＯＨであり、 ３ｐ、ＸＳＹおよびＬｌは、上に定義する］。

ＸおよびＹは、アミノ、ヒドロキシ、ホスフェート、メルカプト、カルボキシ、 エステル（差別的活性を示すエステル）、塩素、臭素、ヨウ素、ＨｇＣ１、ヒド ラジへアジノ、アシルヒドラジド、アシルイミダゾール、Ｎ−（カルボニルオキ シ）イミド、アミド、メチレン、カルボニル、Ｎ−マレイミドおよびイミジエス テル基、を含む数多くの官能基から成る群から選択され得る。公知の酵素反応ま たは化学的オリゴデオキシヌクレオチド合成により、ホスフェート基を核酸中に 組み入れることができる。化学的オリゴヌクレオチド合成後、化学反応によりカ ルボキシ基をこの核酸に連結させる。

化学官能基（Ｘ）を通してスペーサー（Ｓ　ｐ）を核酸に連結させ得る。

このスペーサー（Ｓ　ｐ）は、立体障害および回転に関する問題を阻止するため 核酸とＥとの間に適当な距離を導入するように機能させるところの、有機分子で ある。Ｓｐは、１〜２０個の炭素原子を有するアルキル、アルケニルおよびアル キニル、アルキル／アルケニル／アルキニル部分中に１〜２０個の炭素原子を有 しそしてアリール単位中に６個以下の炭素原子を有するアラルキル、アラルケニ ルおよびアラルケニルから成る群から選択されてもよい。アルキル／アルケニル ／アルキニル鎖中の自由な回転運動を減少させるために、メチル、エチルまたは イソプロピル基を任意に加えてもよい。該アリール基は、塩素、フッ素、臭素、 シアノ、ニトロおよび低級アルキル基、例えばメチル、エチル、イソプロピル、 によって任意に置換されていてもよい。Ｓｐはまた、アミノ酸またはポリアミノ 酸、アルキルウレタンまたはポリアルキルウレタン、アルキル尿素またはポリア ルキル尿素、或はアルキルカーボネートまたはポリアルキルカーボネート（ここ で、ポリマーは１〜２０単位である）であり得る。公知の反応に従って、核酸と ホモニ官能（Ｘ＝Ｙ）またはへテロニ官能試薬（Ｘ＋Ｙ）とを反応させることに よってＸ−５ｐ−Ｙ部分を導入することも可能である。

核酸の末端が付着点であるとき、Ｓａｎｇｅｒ配列決定プライマーとしてそれを 用いる場合、５°末端のみを修飾させ得る（Ｘ−３ｐ−Ｙ部分にその末端を付着 させることによる）。次に、この配列決定反応生成物を分離した後、その部分に 化学発光発生化合物を連結させる。しかしながら、核酸がプローブとして機能す るところの、多重ＤＮＡ配列決定に関しでは、該化学発光発生化合物を、該５゛ 末端、３′末端、該核塩基の１つ以上、および該ホスホジエステルのバックボー ン上の１つ以上の部位から選択されるところの、１つ以上の部位に、共有結合的 もしくは非共有結合的に連結させ得る。該プローブ上の多様な部位にその化学発 光発生Ｅのための付着点を作るため、修飾したインターヌクレオチド結合（図式 ４中のＡ３）もまた使用できる。このような修飾したインターヌクレオチド結合 は、標準的化学技術を用いて導入される。（Ｓｉｎｈａ、　Ｎ、Ｄ。

他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：４５３９　（１９８４）） 　ｏ標準化学的オリゴデオキシヌクレオチド合成中で、適切に保護されたヌクレ オシドビーホスホネート類（Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、Ｃ，および麗、Ｄ、　Ｍ ａｔｔｅｕｃｃｉ、　Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２７：４６９−４７２　（１９８ ６）；　Ｆｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、Ｃ，他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ｓ、　１４：５３９９−５４０７　（１９８６）；　Ｇａｒｅｇｇ、　Ｐ、Ｊ、 他、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２７：４０５１−４０５４　（１９８６）：　Ｇａ ｒｅｇｇ、　Ｐ、Ｊ。

他、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２７：４０５５−４０５８　（１９８６）または１ ，１−ジメチル−２−シアノエチルヌクレオシドホスホアミシト類（Ｎｉｅｌｓ ｅｎ、　Ｊ、およびＭ、Ｈ，Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、　Ｊ、　Ａｍ、　ＣｈｅＩ６ ．　Ｓａｃ、　１０：６２７５−６２７６　（１９８８））を用いると、Ｐ−Ｃ ＳＰ−０，Ｐ−３およびＰ−ＮＨまたはＰ−Ｎ結合を通して種々の５ｐ−Ｙ部分 を導入することが可能となる。核酸は、そのインターヌクレオチド結合で、部分 的もしくは完全に修飾されてもよい。

１つの具体例において、核酸プライマー／プローブは、複素環式核塩基に付着部 位を有している（図式４中のＡ２、図式５中のＡ４）。しかしながら、この配置 は、相補的な標的となる核酸と対を成しているＶａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基を 通して特異的に雑種形成させるプライマー／プローブの必要な特性を阻害すべき ではない。明確に示す目的のため、アノマー状のＣＩ’炭素原子を通してリボー ス／デオキシリポース部分に該複素環式塩基を連結させ、Ｎ１を通して該糖にピ リミジン複素環を付着させ、モしてＮ９原子を通してプリン複素環を付着させる ことを特記する。ピリミジン部分の場合、Ｘ−５ｐ−Ｙ−Ｌ単位はＣ５炭素原子 のみに連結でき、プリン環の場合、それを０８炭素原子に付着させる必要がある が、これは立体的に最適ではない。該Ｘ−８ｐ−Ｙ−Ｌ＋単位をプリン環系に連 結させるためのもう１つの方法は、Ｎ７−ジアザアデニンおよびＮ７−ジアザグ アニンヌクレオシド類の使用であり、この場合、このＸ−８ｐ−Ｙ−Ｌ＋単位を Ｃ７炭素原子に付着させ得る。記述した塩基修飾プライマー／プローブオリゴヌ クレオチド類の合成に関して、適切に保護されたシントン類を使用する必要があ る（図式６中のＡ６）。選択する化学合成方策に応じて、化学発光を生じること のできる化合物を、オリゴヌクレオチド合成が完了した後の核酸に連結させるべ きである。従って、この合成方策に適合する中間配置Ｘ−３ｐ−Ｙ’　を選択す べきである。公知のアミノおよびヒドロキシ保護基、例えば環外アミノ基を保護 するためのアシルおよびアミジン基、並びに５′ＯＨ基を保護するための種々の トリチル基を用いて、環外アミノ基および５’　ＯＨ基は保護される必要がある 。この言葉保護基は、そのアミノまたは５°ＯＨ基と結合し、従ってそれが結合 する基を反応しづらくさせ得る構造を意味することを意図している。オリゴリボ ヌクレオチド合成の場合、公知の保護基、例えばテトラヒドロフラニル、テトラ ヒドロピラニル、０−ニトロベンジルおよび種々のシリル保護基、を用いてその ２°　ＯＨ基は保護される必要がある。充分な達成機能を提供するため、ホスホ アミシト類（Ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄｉｔｅｓ）またはＨ−ホスホネートのどち らかが使用できる。図式７は、化学発光を生じることのできる化合物の付着のた めの、核酸を修飾し得る種々の方法の例を示している。

Ｂ重、ＸおよびＳｐは、上に定義し、 Ｒ４は、Ｈまたは０ＲＩＯであり、 Ｒ’は、ＣＨｓ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、Ｃ（ＣＨｓ）２ＣＨｚＣＮ　であり、ＤＭ Ｔは、４．４−ジメトキシトリチルであり、Ｒ９は、アミノ保護基であり、 Ｙｌは、オリゴヌクレオチド合成に適切な保護基と連結するところの、上に定義 した如きＹ基であり、そして ＲＩ　Ｏは、オリゴヌクレオチド合成に適切な基で保護されているＨまたはＯＨ である］。

図式７：　化学発光を生じ得る化合物付着のための、核酸の修飾ａ）　５°末端 付着 ｂ）　内部付着 Ｘ１ＹおよびＳｐは、上に定義し、そしてＬ！またはＥは、酵素、ビオチン、抗 体およびハブテンから成る群から選択される（ここで、Ｌ＋またはＥは、前に定 義したようなスペーサー単位を通して該核酸に連結させてもよい）コ。

５′または３′末端、複素環式塩基およびインターヌクレオチド結合におけるＸ −３ｐ−Ｙ−Ｌ＋またはＥ部分の付着に関するいかなる組み合わせも可能であり 、これは本発明に含まれる。ヌクレオチド上の種々の位置での該部分の付着によ り、多数の付着部位が存在することになるため、信号が増幅され得る。結果とし て検出感度が上昇する。特別な情況においては、オリゴデオキシリボヌクレオチ ドよりもむしろオリゴリボヌクレオチドを用いるのが有利である。上述した付着 方法は、保護されているか或は未保護の２’　−ＯＨ官能基の存在に応じて修飾 され得る。

しかしながら、該化学発光発生化合物を付着させるために用いられる付着点およ び分子は、使用する配列決定および分離方法に依存していると理解すべきである 。更に、抗体および酵素を含む蛋白質分子は、該配列決定反応生成物を分離した 後、付着させる必要がある。

化学発光を生じ得る化合物を修飾および付着させるための要点を以下に要約する ： Ｓａｎｇｅｒの鎖拡張方法：　化学発光発生化合物を付着させるため、核酸プラ イマーを、５°末端、１種以上の核塩基、およびホスホジエステルのバックボー ン上の１種以上の部位から選択されるその上に存在している１個以上の部位で、 修飾させ得る。二者択一的に、鎖ターミネータ−を、核塩基、糖、或はそれらの 組み合わせ部分で、修飾させ得る。

Ｍａｘａａ＋およびＧ１１ｂｅｒｔの化学劣化：　配列決定すべき核酸は、核塩 基および糖または核塩基と糖との組み合わせから選択されるところの、５゛末端 もしくは３°末端のどちらかで修飾され得る。

雑種形成プローブ：　核酸が雑種形成プローブであるとき、このプローブは、化 学発光を生じ得る化合物に、５°末端、３°末端、１個以上の核塩基およびホス ホジエステルのバックボーン上の１個以上の部位から選択されるところの、その 上に存在している１個以上の部位で連結させ得る。

化学発光発生化合物をＤＮＡ配列決定過程に組み込むためのもう１つの方法は、 ヌクレオシドトリホスフェートを修飾することによるものである（図式５中のＡ ４およびＡ５）。この場合、塩基で修飾したデオ午ジヌクレオシドトリホスフェ ートまたはりポヌクレオシドジーもしくはトリホスフェート（適用する酵素に応 じて）は、公知の酵素および操作を用いて、各々ＤＮＡもしくはＲＮＡ中に酵素 的に組み入れることができる。複素環式塩基のための付着部位は、上で考察した のと同様の理由で決定される。ＳａｎｇｅｒのＤＮＡ配列決定方法を用い、Ａ４ が鎖ターミネータ−であるとき、Ｒ４はＨであり、そしてＲ５はＨまたはＯＨで ある。

上で考察したように、化学発光発生化合物の次の付着のための鎖ターミネータ− を修飾することで、ＤＮＡ配列決定における背景のレベルを優位に減少させる。

ヌクレオシドトリホスフェートをターミネータ−として用いる場合、Ｘ−Ｓ］） −Ｙ−Ｌｌの付着部位もまた、３°もしくは２′のどちらかで、糖部分内に位置 させることができる（図式５中のＡ５）。

ここで、該スペーサーの選択は、ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼのためのＡ５の基 質特性によって支配される。鎖ターミネータ−の場合、塩基および糖の修飾に関 する全ての組み合わせは、その付着部位を多重化させることによって信号を上昇 させるように選択され得る。上記組み合わせの全ては本発明の範囲内に含まれる 。

化学発光を生じ得る化合物は、酵素、例えばアルカリ性ホスファターゼ、酸性ホ スファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ 、ルシフェラーゼ、アリールエステラーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アセ チルコリンエステラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、アミノペプチダーゼお よびリパーゼであり得る。核酸を酵素に共有結合的もしくは非共有結合的に付着 させる場合、これを適当な化学発光遺伝的基質に接触させて、化学発光反応を生 じさせる。いくつかの適切な基質は、ルミノール、ルシフェリンおよび１．２− ジオキセタン類である。

化学発光反応からの光放出を増幅するため、該核酸に追加的Ｅ基を付着させるこ とによって、化学発光を増強できる。この様式の増強は、ここでは、直接的化学 発光増強として定義する、何故ならば、検出されるこの光はその化学発光反応そ れ自身から得られるからである。これは、１種の独立した分子の代わりに多様な Ｅ基から成る重合させた複合体を用いるか、或はＥＬＩＳＡ（酵素連結免疫ソル ベント定量法）の如き免疫学的および臨床学的操作で用いられる抗体増強様式を 用いて達成され得る。後者の場合、結合用単位Ｌ１または化学発光を生じ得る化 合物（例えば、酵素もしくは酵素の複合体）に対して特異的な抗体１（Ａｂｌ） をＬｌまたはＥに結合させる。公知の免疫学的技術を用いて予めＥに結合させた 多様な２番目の抗体（アルファＡｂ１）をＡｂｌに結合させ得る。直接的化学発 光は、ＤＮＡの標的分子に対して、化学発光を生じ得るより多くの化合物（例え ば、酵素）を特異的に付着させることによって増強される。

直接的化学発光に加えて、分子間エネルギー移動を通してそれ自身が光を放出し 得る増強分子を用いて、化学発光を有意に増幅させ得る。このような増強剤の使 用により、間接的化学発光反応が生じる、何故ならば、検出される光はその増強 分子からのものであるからである。適切な増強分子は上に示しである。増強剤、 即ち適切な抗体およびいくつかの置換１．２−ジオキセタン類は商業的に入手可 能である（Ｌｕｍｉｇｅｎ、　Ｉｎｃ。

Ｄｅｔｒｏｉｔ、　ＭＩ；　Ｑｕｅｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、、Ｂｅｄｆ ｏｒｄ、　ＭＡ、　Ａｍｅｒｓｈａｒａ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＵＫ） 。好適には、直接的化学発光および間接的化学発光増強の両方を用いて化学発光 を増幅させ得る。

好適な具体例において、ＤＮＡの化学発光の検出は、安定であるが酵素的に開始 し得る１、２−ジオキセタン（図２参照）を用いた酵素触媒反応により行われる 。この標的となるＤＮＡを、種々の公知の技術、例えばＵＶ架橋、並びに共有結 合および非共有結合化学付着を用いることによって、ナイロン類の膜上に固定化 する。ナイロン類の膜を実施例中に示しているが、いかなる多孔質もしくは非多 孔質の固体状支持体も本発明で使用できる。好適には、この固体状支持体は、核 酸の付着を容易にさせる平らな表面を有している。図２に示すように、オリゴデ オキシヌクレオチドブライマーＡ（図式１および２）は、その５′末端で、スペ ーサーＳｐとしての１．６−ジアミツヘキサンを通して、ビオチン（Ｌｌ）によ り修飾される。アルカリ性ホスファターゼ（Ｅ）もまた、連結用単位（Ｌりとし てのビオチンに連成させた後、ブリッジ用単位Ｍとしてのストレプトアビジンを 通して、該オリゴヌクレオチドブライマーに付着させる。化学発光を生じ得る化 合物に連結している核酸を適当な化学発光遺伝的基質（例えば、０ＰＯｓＮａｔ で置換されている１゜２−ジオキセタン）に接触させると、その酵素の作用によ り該ホスフェート部分が開裂して、化学発光を生じる。

この系の感度および特異性を試験するため、単一ストランド化したＭ１３＋ｅｐ ８ＤＮＡの１：５連続希釈のドツトプロットを調製した後、オリゴデオキシヌク レオチドＢｉｏ１５１１１３を用いて雑種形成した（実施例２参照）。

化学発光検出後の結果（実施例３参照）を図３に示す。第一検出サイクル後（図 ３．１ａ−ｄ）、このプローブをその膜から取り出しく図３、ａ）、そしてこの 膜を再び雑種形成した（図３．２ａ−ｄ）。これらの条件下、ドツト当たり０． ４ｘｌＯ〜１５モルの少ない量のＤＮＡ　（直径５ｍｍ）が、１分未満の暴露で 検出できた（図３．１ｃ−ｄ）。各々５０および１０ｘｌＯ”モルの標的ＤＮＡ を含有している最初の２つのドツトは、暗室中容易に目で検出できた。図３のｅ 中に示すように、この膜に関して、そのプローブもしくは信号を定量的に取り出 すことができた。５分間の暴露時間でさせも、いかなる残存する信号も示さなか った。腹当たりの試験サイクルの最大可能回数を測定する目的で、同じ膜片に、 全体で４０回の雑種形成／取り出しサイクルを受けさせた。図３（２０および４ ０）は、各々、再試験サイクル２０および４０後の結果を示している。試験番号 １および２後同じ期間、この膜を暴露させた。

この実験は、多重ＤＮＡ配列決定技術を模擬したものである。

もう１つの具体例において、プライマー拡張配列決定反応（実施例４参照）にお いて、Ｂｉｏ１５Ｍ１３オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡ配列プロットを調製 した。反応生成物を分離した後、直接プロッティング電気泳動（ＤＢＥ）を用い てプロットした（実施例４参照）。実施例３と同様にしてこのプロットを処理し た後、画像を捕まえるため、ポラロイド５７フイルムを用いたルミノメータ−中 でＤＮＡ配列パターンを検出した。

図４は、１秒（図４のａ）〜４５秒（図４のｄ）の範囲の種々の暴露時間でＤＮ Ａ配列帯パターンを検出した化学発光の結果を示している。１秒間の暴露時間後 の全体帯パターンは、実際上、いかなる背景の干渉も無く鮮明に見ることができ る。

本発明中で提供する化学発光検出が、感度および検出速度に関して、全ての存在 する方法よりも優れていることを明らかに示す目的で、２種類（１種類は標準的 電気泳動／ブロッティンッグ技術（図５ａ）であり、もう１つはＤＢＥ技術（図 ５ｂ）を使用）の全長ＤＮＡ配列プロットを調製した後、処理した。図５に示す 結果は、５０〜３５０個のヌクレオチドの範囲にあるＭ１３ｍｐ８配列を示して いる。両者共、ＤＮＡをナイロン膜（ＢＩＯＤＹＮＥ”、　Ｐａ１ｌ、ＮＹ）上 にプロットした後、フジのＸ線フィルムに１分間暴露した。この暴露は、そのプ ロットを処理するためのプラスチック製バッグ上に、直接、Ｘ線フィルムを置く ことによって行った。

配列決定化学（Ｋｌｅｎｏｗ酵素）に関する偏差内で、標準ジデオキシ配列決定 反応生成物の全体的分子重量範囲に渡って、その個々の帯の強度は均一である。

多重ＤＮＡ配列決定もしくは標準ジデオキシヌクレオシドＤＮＡ配列決定のどち らかを用いたＤＮＡ雑種形成のための、本発明中に記述した如き化学発光検出化 学は、高感度であり、そしてこれは、存在している放射異性体、蛍光および比色 方法に比べて、下記のい（つかの長所を有している： １）安定性：　ビオチンを連結させたオリゴヌクレオチド類および配列決定反応 物は、崩壊、放射能分解または光漂白を受けない。これらは、適切な条件下で保 存されている場合、無限に安定である。このことによって、この化学発光および ビオチンを基にしたいかなる化学も、多数のサンプルをバッチ処理する経済的方 法、例えば多重ＤＮＡ配列決定に関して、特に適切なものとなっている。

２）検出時間：　ホスファターゼ触媒光反応の高収率により、非常に短い検出時 間を可能にし、これは通常、全体配列プロットに関しては数秒の範囲である。こ れは、放射異性体もしくは比色染色を用いた検出で数時間の範囲が必要であるこ とに比較すると、非常な改良である。加つるに、冷却したＣＣＤカメラを用いて 膜から直接ＤＮＡ配列を読み取ることが可能になり、それにより更に、データを 収集する速さが増加した。本発明とは異なり、配列決定用のオンライン蛍光検出 の使用は、全体配列を生じさせる時間的長さのため欠点を有している。従って、 大規模なりＮＡ配列決定（即ち、多重ＤＮＡ配列決定）用としての蛍光検出は、 実施できそうにない。

３）材料二　本発明の方法は迅速で高感度であり、そしてＤＮＡを配列決定する ための便利な方法を提供する。本方法を実施するために必要な材料および装置の 大部分は、いかなる生化学／分子生物学の実験室中でも入手可能である。

更に、本発明の方法は蛍光配列決定よりも経済的である、と言うのは、数多くの 膜が同時に処理でき、従って蛍光配列決定で用いられているような非常に特別で 高価であり複雑な装置（レーザー、光学、電子工学）の使用が回避できるからで ある。本方法の更に一層の利点は、ＤＮＡ配列決定のための、幅広く使用されて いる放射能検出の方法に適合できることである。両者共、配列データに関する永 久的画像はＸ線フィルムであり、これは、マニュアルに従う（例えば、音波ディ ジタイザ−の助けで）か、或は市販の自動フィルム読み取り装置を用いて読み取 ることができる。

実施例１：　オリゴヌクレオチドのビオチン化β−シアノエチルホスホルアミシ ト（Ｓｉｎｈａ、　Ｎ、Ｄ、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、　１２： ４５３９　（１９８４））およびＭｉｌｌｉＧｅｎ　７５００　ＤＮＡシンセサ イザーを用い、１．０μモルの規模で、５°−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ −Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−３°の合成を行った。ＷａＣｈｔｅｒ他、（Ｖ ａｃｈｔｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４ニア９８５　（ １９８６））が記述しているように、支持体と結合した脱トリチル化オリゴマー と１，１゛　−カルボニルジイミダゾールおよび１．６−ヘキサンジアミンとを 反応させて、ＨＰＬＣ精製後、１０１０８Ａ２単位のＨＥＮ　（ＣＨ２）ｓＮＨ ｃ　（０）　（Ｔ　Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ ）を生じさせた。

このアミノ末端オリゴヌクレオチド（２５Ａ！。単位）とｄ−ビオチンのＮ−ヒ ドロキシスクシニミドエステルとの反応を、Ｃｏｕｌｌ他、（Ｃｏｕｌｌ。

Ｊ、他、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２７：３９９１　（１９８６））と同様に行っ た。このビオチン化したオリゴマーを、逆相クロマトグラフィーにより反応混合 物から単離した。生成物（Ｂｉｏ１５Ｍ１３と呼ぶ）を含有している画分を一緒 にして、精製した１３．　８Ａ４６゜単位のオリゴヌクレオチドを得た。雑種形 成実験のため、このオリゴヌクレオチドもまた、末端デオキシヌクレオチジルト ランスフェラーゼおよびＢｉｏｌｌ−ｄＣＴＣ（Ｋｕｍａｒ、　Ａ、他、Ａｎａ ｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１６９：３７６　（１９８ｇ））を用いて３゛末端を酵素的に標識することがで きる。

実施例２：　ドツトプロット雑種形成 ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリフ、−ＨＣｌ、ｐＨ８，１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ） 中でＭ１３ｍｐ８Ｄ　Ｎ　Ａの希釈（１００μＬ当たり、５０．１０．２．０． ４．０．０８お、Ｊ：び０ｘｌＯ−”モル）　を行っｆニー。ナイロン膜（例え ば　ＮｙｔｒａｎｆＭ）をＨ２ＯおよびＰｖＤＦ膜（ポリニフッ化ビニリデン、 例えばＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｎ）中で予め湿らせた。このＰｖＤＦ膜を、自家製 の真空濾過装置（ウェルの大きさ、直径４ｍｍ）中に入れる前、最初に２５％の エタノール、次にＨ，Ｏ中で予め湿らせた。ＤＮＡ希釈を行う前に、各々のウェ ルを中程度の減圧下で１００μＬのＴＥ緩衝液で洗浄した。１００μＬのＴＥ洗 浄後、ＤＮＡをナイロン膜に対してＵＶ架橋（１ｃｍ２の膜当たり２１００μワ ツトで１分間）させるか、或はＰｖＤＦに対して８０℃で１０分間焼入れした後 、上述した予備湿潤化操作を行った。雑種形成は本質的にＣｃｈｕｒｃｈおよび Ｋｉａｆｆｅｒ−Ｈｉｇｇｉｎｓ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１８５　（１９ ８８））と同様に行い、平行して数枚の膜を処理した。ＩＣｍ２の膜当たり５％ のＳＤＳを含有している１００μＬのＰＢＳ　（７，３ｇ／ＬのＮａＣ１，２， ３６ｇ／ＬのＮａ、ＨＰＯｎ、１．３ｇ／ＬのＮａＨｚＰＯ４・２Ｈ２０）（予 備雑種形成溶液）を用いて、雑種形成を、ヒートシールしたプラスチック製バッ グ中４２℃で３０分間行った。この予備雑種形成溶液を取り出し、２００ｘｌＯ ”モルのプローブ（Ｂｉｏ１５Ｍ１３）を加えた後、４２℃で一晩反応させて雑 種形成した。中程度に振とうしながらプラスチック製の皿の中、過剰容積のＰＢ Ｓ、０．５％ＳＤＳ中で８回（室温で各々１５分）この膜を洗浄することによっ て、雑種形成されていないプローブを除いた。同じ日に化学発光検出（実施例３ 参照）を行わない場合、この膜を、ヒートシールしたバッグ中のＰＢＳ、０．２ ％ＳＤＳ中に保存した。検出が完了した後（実施例３に記述されているように） 、１ｃｍ”の膜当たり１ｍＬのストリップ溶液（０゜１％のＳＤＳ、２ｍＭのＮ ａ、ＥＤＴＡ、）リス塩基でｐＨを８に調整）を加えた後、ヒートシールしたプ ラスチック製バッグ中８０℃で２０分間加熱することによって、このプローブを 除去した。その後、ＰＢＳ。

０．５％ＳＤＳ中で１５分間洗浄した。この膜をこのまま、２回目の雑種形成サ イクルのために用いるか、或はＰＢＳ、０．２％ＳＤＳ中に保存した。

実施例３：　化学発光検出 該予備雑種形成中にこれらの膜が既に遮断されていることでドツトプロットのた めの遮断段階を除く以外は、同様にして、ＤＮＡ配列決定プロットおよびドツト プロットの処理を行った。全ての裏操作は手袋を付けて行い、そして全ての培養 段階は室温で行った。このプロットを、プラスチック製バッグ中３０分間、Ｉｃ ｍ２の膜当たり１００μＬのＰＢＳ、５％ＳＤＳを用いて遮断した。この遮断溶 液を排出させた後、１゜０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンを含有しているＰＢ Ｓ−ＨＴ　（１５゜０００単位／Ｌのヘパリンと０．　５％の７ｗｅｅｎ２０を 有するＰＢＳ）を１ｃｍ２の膜当たり１００！ｉＬ加えた後、１０分間培養した 。過剰容積のＰＢＳ−ＨＴで１５分間３回洗浄した後、０．５μｇ／ｍＬのビオ チン化したアルカリ性ホスファターゼが入っているＰＢＳ−ＨＴ　（１ｃｍ”の 膜当たり１００μＬ）を加えた後、更に１０分間培養した。過剰容積のＰＢＳ− ＨＴ中で１５分間２回、０．１％のウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）、そして１ ００ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ９，５）、１００ｍＭのＮａＣ１，５ＱｍＭ のＭ　ｇ　Ｃｌ　２中で１５分間２回洗浄することによって、結合していないホ スファターゼを除去した。Ｑｕｅｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　ＩｎＣ，からの化学 発光遺伝的基質を使用する場合、膜１ｃｍ”当たり１００μＬのＪａｄｅ　Ｇｒ ｅｅｎ　Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ　（Ｑｕｅｓｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、 、Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）中でこの膜を５分間培養した。Ｊａｄｅ　Ｇｒｅｅ ｎ　Ｉｎｔｅｎｓｉｆｉｅｒ溶液中のＡＭＰＰＤ　（０，３ｍＭ　〜１．６ｍＭ の３−　（２’　スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリ ルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタンの二ナトリウム塩）　（Ｑｕｅｓｔ 　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、）中でこの膜を培養することによって、化学発光 反応を開始させた。Ｌｕｍｉｇｅｎ、　Ｉｎｃ、からの化学発光基質を使用する 場合、膜１ｃｍ”当たり１００μＬのＬｕｍ１−Ｐｈｏｓ”　（Ｌ＋ｎ＋＋ｉｇ ｅｎ、　Ｉｎｃ、、Ｄｅｔｒｏｉｔ、輩Ｉ）（７５０ｍＭの２−アミノ−２−メ チル−１−プロパツール、ｐＨ９，６，０，８ｍＭのＭｇ　（ＯＡｃ）２、臭化 セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）およびフルオレセイン界面活性剤中 １４０ｍｇ／Ｌ）中で５分間、この膜を培養した。５分後、この化学発光基質を 排出させた後、湿っている膜をプラスチック製バッグ中に密封し、そしてポラロ イド５７フイルム（例えば、Ｂｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓｔｒ ｕｍｅｎｔｓ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏからのルミノメータ−を用いて） またはＸ線フィルム（フジまたはコダック）に１〜６０秒間暴露させた。

この化学発光反応は１２時間に渡って検出できた。該化学発光基質溶液を回収し て、４℃で保存した後、３週間に渡って再使用した。

実施例４：　ＤＮＡ配列決定反応 以下のような修飾を行ったＢａｎｋｉｅｒ、　Ａ、Ｔ、他、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５５：５１　（１９８７）の記述に従って、ＤＮＡ 配列決定反応をミクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ、　＃３９１１）中で行 った。各々の配列決定反応（Ｔ。

Ｃ，ＧおよびＡ）に関して、２μＬの単一ストランド化したＭ１３ｍｐ８鋳型Ｄ ＮＡ　（２００ｘｌＯ”モル）と２μＬプライマー−ミックス（１，５μＬのｄ ＮＴＰ、ｄｄＮＴＰ−ミックス、０．２５μＬの１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ８，５ＱｍＭのＭｇＣｌ２．０．２５μＬのＢｉｏ１５Ｍ１３（５００ｘｌＯ ”モル））とを混合した（Ｃｏｎｎｅｌｌ　Ｃ，他、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ ｓ　５：３４２　（１９８７））。このミクロタイタープレートをサランラップ で覆った後、このビオチン化したプライマーを５５℃で３０分間冷冷却光させた 。プライマー拡張反応に関して、２μＬの酵素ミックス（１２，５ｍＭのジチオ トレイトール中の０．５ＵのＫｌｅｎｏｗ）を各々の反応ウェルに加えた。再び 、このミクロタイタープレートをサランラップで覆った後、３７℃で３０分間培 養した。２μＬのホルムアミド染料（脱イオン化ホルムアミド、２０ｍＭのＮａ ｔＥＤＴＡ、０．０３％のブロモフェノールブルー、０．０３％のキシレンシア ツール）を各々のウェルに加えることで、この反応を停止させた。同じ日にこの 反応物を分析する場合、配列決定用ゲル上に載せる以前に８０℃で２０分間それ らを変性させた。

それ以外は、この反応物をサランラップで覆って、−２０℃で保存した。

ゲル電気泳動およびブロッティング： Ａ）　直接プロッティング電気泳動（ＤＢＥ）。固定化用母体上で電気泳動分離 およびエレクトロブロッティングを同時に行うため、ＤＢＥを用いた。配列決定 用ゲルとして、６％のポリアクリルアミドゲル（ＴＢＥ、ｐＨ８，８，７，６Ｍ の尿素、長さ１７．５ｃｍ、幅２３ｃｍ。

厚さ０．３４　Ｃｍ中）を１時間当たり１０ｃｍのプロッティング速度で用いた 。２０ワツトの一定電力でＤＢＥを行った。この分離に続いて、１ｃｍ２当たり ２１００μワツトの紫外線照射を１分間当てること（ＵＶ架橋）で、このＤＮＡ を該湿潤膜に架橋させた。保存中、この膜を、膜１ｃｍ”当たり１ｍＬのＰＢＳ 、０．２％ＳＤＳと一緒にプラスチック製バッグ中に密封した。

Ｂ）　標準電気泳動／ブロッティング。標準電気泳動に関して、上述したのと同 様な緩衝条件の６％のポリアクリルアミドゲル（４０ｃｍｘ２０ｃｍｘ０．０３ ４ｃｍ）を用いた。４０ワツトの一定電力で電気泳動を行った。実験後、このゲ ルを水平エレクトロプロッター（Ｐｏｌｙｔｅｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｓｏ ｍｍｅｒｖｉｌｌｅ、　ＭＡ）中に移した後、このＤＮＡを１２０ボルトで２０ 分間膜上に移した。ＵＶ架架橋／送込後、この膜をヒートシールしたプラスチッ ク製バッグ中のＰＢＳ、０．２％ＳＤＳ中に保存した。

同等物 常規実験以上のものを使用することな（、本分野の技術者は、ここに記述した本 発明の特定の具体例に対する数多くの同等物を理解するか、或は確かめることが できるであろう。これらのおよび全ての他の同等物を以下の請求の範囲に包含す ることを意図するものである。

ノし羨勇云ゲ６蔚イー＃、苓１【 ＦＩＧ、３ａ ＦＩＧ、３ｃ ｏ　ｂ　Ｃｄ ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５ａ　ＦＩＧ、５ｂ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）平成３年９月９日

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ．化学発光を生じ得る化合物に連結する核酸を供給し；ｂ．この化合物に 化学発光を生じさせ；そしてｃ．この化学発光を検出する（ここで、発せられた 光が、該核酸の存在および量に対する指示を与える）；ことから成る段階を含む 、核酸を化学発光で検出する方法。
2. ２．化学発光を生じ得る該化合物が、適当な刺激に応答してそれ自身が光を発す る化合物であるか、或は別の化合物に光を放出させ得る化合物である請求の範囲 １の方法。
3. ３．化学発光を生じ得る該化合物を、該核酸に、５′末端、３′末端、ホスホジ エステルのバックボーン、および１個以上の核塩基から選択されるところの、そ の上に存在している１個以上の部位で連結させる請求の範囲２の方法。
4. ４．化学発光を生じ得る該化合物が、光を発する化学発光遺伝的基質を触媒する 酵素である請求の範囲３の方法。
5. ５．該酵素がアルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダー ゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アリールエ ステラーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、キモ トリプシン、トリプシン、アミノペプチダーゼおよびリパーゼから成る群から選 択される請求の範囲４の方法。
6. ６．該化学発光遺伝的基質がルミノール、ルシフェリンおよび置換１，２−ジオ キセタン類から成る群から選択される請求の範囲４の方法。
7. ７．該化学発光遺伝的基質が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の置換１，２−ジオキセタンである請求の範囲６の方法。
8. ８．段階（ａ）の核酸を固体状支持体に共有結合的もしくは非共有結合的に付着 させる請求の範囲１の方法。
9. ９．均一相で段階（ｂ）を行うことを更に含む請求の範囲１の方法。
10. １０．該化学発光を増幅し得る増強分子の存在下で段階（ｂ）を行うことを更に 含み、ここで、該増強分子が担体分子と一緒に存在している請求の範囲１の方法 。
11. １１．該増強分子がフルオレセイン、クマリンおよびローダミンから成る群から 選択される蛍光団である請求の範囲１０の方法。
12. １２．化学発光を生じ得る化合物に連結する該核酸が、式Ａ−Ｘ−Ｓｐ−Ｙ−Ｅ ［式中、 Ａは、核酸であり、 ＸおよびＹは、同一もしくは異なり、化学発光を生じ得る該化合物を該核酸に連 結させる化学官能基であり、 Ｓｐは、ＡとＥとの間に適当な結合距離を与える化学スペーサー基であり、そし て Ｅは、化学発光を生じ得る化合物である］を有する請求の範囲１の方法。
13. １３．Ａが、核酸配列決定操作から誘導されるデオキシリボ核酸であるか、或は 雑種形成反応に適切な核酸である請求の範囲１２の方法。
14. １４．式中、 Ｓｐが、（ＣＨ２）ｎ，（ＣＨ２）ｍ（Ｃ６Ｈ４）ｍ，［ＮＨ（ＣＨ２）ｎＣＨ Ｒ６］ｍ，▲数式、化学式、表等があります▼，ＮＨ（ＣＨ２）ｍ，［ＮＨ（Ｃ Ｈ２）ｎＯＣ］ｍ，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等 があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，［Ｒ６ＣＨ（ＣＨ２）ｎＮ Ｈ］ｍ，▲数式、化学式、表等があります▼，（ＣＨ２）ｎＮＨ，▲数式、化学 式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、 表等があります▼，または▲数式、化学式、表等があります▼であり、 ｎが、１〜２０の整数でありそしてｍが１〜６の整数であり、Ｒ６が、Ｈ，（Ｃ Ｈ２）ｎＮＨ２，（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨまたは（ＣＨ２）ｎＳＨであり、 ＸおよびＹが、Ｏ，Ｓ，ＮＨ，ＣＨ２，ＮＨＮＨ，ＳＳ，ＯＨ，ＳＨ，ＣＯ２Ｚ ，ＣＯ２Ｈ，Ｂｒ，ＣＯ，ＮＨＣＯ，Ｃｌ，Ｆ，ＨｇＣｌ，ＣＯ−ＮＨＮＨ２， アジド、ＣＯ−イミダゾールおよびＮ−マレイミドから成る群から選択され、 Ｚが、差別的活性を示すエステルを生じるアルキル、アリールまたはアラルキル 基であり、そして Ｅが、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガ ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アリールエステラ ーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、キモトリプ シン、トリプシン、アミノペプチダーゼおよびリパーゼから成る群から選択され る酵素である、請求の範囲１２の方法。
15. １５．化学発光を生じ得る化合物に連結する該核酸が、式Ａ−Ｘ−Ｓｐ−Ｙ−Ｌ １〜Ｍ〜Ｌ２−Ｅ［式中、 Ａは、核酸であり、 ＸおよびＹは、同一もしくは異なり、その化学発光を生じ得る化合物を該核酸に 連結させる化学官能基であり、Ｓｐは、ＡとＥとの間に適当な結合距離を与える 化学スペーサー基であり、 Ｌ１およびＬ２は、同一もしくは異なり、連結用単位であり、Ｍは、ブリッジ用 単位であり、そして Ｅは、化学発光を生じ得る化合物である］を有する請求の範囲１の方法。
16. １６．Ａが、核酸配列決定操作から誘導されるデオキシリボ核酸であるか、或は 雑種形成反応に適切な核酸である請求の範囲１５の方法。
17. １７．式中、 ＳＰが、（ＣＨ２）ｎ，（ＣＨ２）ｍ（Ｃ６Ｈ４）ｍ，▲数式、化学式、表等が あります▼ＮＨ（ＣＨ２）ｎ，［ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＣ］ｍ，▲数式、化学式、 表等があります▼▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等が あります▼，［Ｒ６ＣＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ］ｍ，▲数式、化学式、表等がありま す▼，（ＣＨ２）ｎＮＨ，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式 、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，または▲数式、化学 式、表等があります▼であり、 ｎが、１〜２０の整数でありそしてｍが１〜６の整数であり、ＸおよびＹが、Ｏ ，Ｓ，ＮＨ，ＣＨ２，ＮＨＮＨ，ＳＳ，ＯＨ，ＳＨ，ＣＯ２Ｚ，ＣＯ２Ｈ，Ｂｒ ，ＣＯ，ＮＨＣＯ，Ｃｌ，Ｆ，ＨｇＣｌ，ＣＯ−ＮＨＮＨ２，アジド、ＣＯ−イ ミダゾールおよびＮ−マレイミドから成る群から選択され、 Ｚが、差別的活性を示すエステルを生じるアルキル、アリールまたはアラルキル 基であり、 Ｅが、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガ ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アリールエステラ ーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、キモトリプ シン、トリプシン、アミノペプチダーゼおよびリパーゼから成る群から選択され る酵素であり、Ｌ１およびＬ２が、ビオチン、酵素、レクチンに特異な糖類、レ クチン類、ステロイド類、ペプチド類、ハプテン類、ハプテンに特異な抗体、ビ オチンに特異な抗体、酵素に特異な抗体、および抗抗体から成る群から選択され 、そして Ｍが、二特異的抗体、アビジン／ストレプトアビジン、レクチンに特異な糖類、 レクチン類、ビオチンに特異な抗体、ビオチン、ハプテン、およびハプテンに特 異な抗体から成る群から選択される、請求の範囲１５の方法。
18. １８．式中、ＡがＤＮＡであり、Ｌ１がビオチンであり、Ｍがアビジン／ストレ プトアビジンであり、Ｌ２がビオチンであり、Ｅがアルカリ性ホスファターゼで あり、そしてＸ−Ｓｐ−Ｙが▲数式、化学式、表等があります▼である、請求の 範囲１５の方法。
19. １９．化学発光を生じ得る化合物に連結する該核酸が、式Ａ−Ｘ−Ｓｐ−Ｙ−Ｌ １〜Ｍ〜Ｅ ［式中、 Ａは、核酸であり、 ＸおよびＹは、同一もしくは異なり、化学発光を生じ得る該化合物を該核酸に連 結させる化学官能基であり、 Ｓｐは、ＡとＥとの間に適当な結合距離を与える化学スペーサー基であり、 Ｌ１は、Ｍに共有結合的もしくは非共有結合的に連結する連結用単位であり、 Ｍは、Ｅに共有結合的もしくは非共有結合的に連結するブリッジ用単位であり、 そして Ｅは、化学発光を生じ得る化合物である］を有する請求の範囲１の方法。
20. ２０．Ａが、核酸配列決定操作から誘導されるデオキシリボ核酸であるか、或は 雑種形成反応に適切な核酸である請求の範囲１９の方法。
21. ２１．式中、 Ｓｐが、（ＣＨ２）ｎ，（ＣＨ２）ｎ（Ｃ６Ｈ４）ｍ，▲数式、化学式、表等が あります▼，ＮＨ（ＣＨ２）ｎ，［ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＣ］ｍ，▲数式、化学式 、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表 等があります▼，［Ｒ６ＣＨ（ＣＨ２）ｎＮＨ］ｍ，▲数式、化学式、表等があ ります▼，（ＣＨ２）ｎＮＨ，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化 学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，または▲数式、 化学式、表等があります▼であり、 ｎが、１〜２０の整数でありそしてｍが１〜６の整数であり、ＸおよびＹが、Ｏ ，Ｓ，ＮＨ，ＣＨ２，ＮＨＮＨ，ＳＳ，ＯＨ，ＳＨ，ＣＯ２Ｚ，ＣＯ２Ｈ，Ｂｒ ，ＣＯ，ＮＨＣＯ，Ｃｌ，Ｆ，ＨｇＣｌ，ＣＯ−ＮＨＮＨ２，アジド、ＣＯ−イ ミダゾールおよびＮ−マレイミドから成る群から選択され、 Ｚが、差別的活性を示すエステルを生じるアルキル、アリールまたはアラルキル 基であり、 Ｅが、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガ ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アリールエステラ ーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、キモトリプ シン、トリプシン、アミノペプチダーゼおよびリパーゼから成る群から選択され る酵素であり、Ｌ１が、ビオチン、酵素、レクチンに特異な糖類、レクチン類、 ステロイド類、ペプチド類、ハプテン類、ハプテンに特異な抗体、ビオチンに特 異な抗体、および酵素に特異な抗体から成る群から選択される酵素であり、そし て Ｍが、二特異的抗体、アビジン／ストレプトアビジン、レクチンに特異な糖類、 レクチン類、ビオチンに特異な抗体、ピオチン、ハプテン、およびハプテンに特 異な抗体から成る群から選択される、請求の範囲１９の方法。
22. ２２．ａ．配列決定すべきＤＮＡの領域に相補的な核酸プライマーを供給し、そ れに化学発光を生じ得る化合物を付着させるため、該プライマーを修飾； ｂ．配列決定すべき該ＤＮＡに対して該プライマーを雑種形成し； ｃ．鋳型として配列決定すべきＤＮＡを用いて、デオキシリボヌクレオシドトリ ホスフェートと一緒に該プライマーを拡張し、そしてこの拡張反応をジデオキシ リボヌクレオシドトリホスフェートを用いて終結させて、該プライマーからの終 点に依存している長さを有するＤＮＡ分子を生じさせ； ｄ．大きさに従って、該拡張反応の各々により生じるＤＮＡ分子を分離し； ｅ．この分離したＤＮＡ分子を固体状支持体に取り付け；ｆ．化学発光を生じ得 る化合物を該分離した分子に、該修飾したプライマーで付着させ； ｇ．この化合物に化学発光を生じさせ；ｈ．大きさに従って、該分離したＤＮＡ 分子のパターンを得るために、この化学発光を検出し（ここで、発せられる光が 、核酸の存在および量に対する指示を与える）；そしてｉ．分離したＤＮＡ分子 の該パターンを基にしてヌクレオチド配列を決定する； ことから成る段階を含む、ＤＮＡの配列決定方法。
23. ２３．化学発光を生じ得る化合物を付着させるための連結用単位を、核酸プライ マーに、５′末端、１個以上の核塩基、およびホスホジエステルのバックボーン 上の１個以上の部位から選択されるところの、その上に存在している１個以上の 部位で連結させる請求の範囲２２の方法。
24. ２４．段階（ｅ）の該分離した分子を、二特異的抗体、アビジン／ストレプトア ビジン、レクチンに特異な糖類、レクチン類、ビオチンに特異な抗体、ビオチン 、ハプテン、およびハプテンに特異な抗体から成る群から選択されるブリッジ用 単位に、接触させることを更に含む請求の範囲２３の方法。
25. ２５．化学発光を生じ得る該化合物が、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホスフ ァターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ル シフェラーゼ、アリールエステラーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アセチル コリンエステラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、アミノペプチダーゼおよび リパーゼから成る群から選択される酵素であり、そしてこれを化学発光遺伝的基 質に接触させることによって、該酵素に化学発光の発生を生じさせる請求の範囲 ２２の方法。
26. ２６．該酵素を、化学発光を生じる基質、および発生した化学発光の強度を増幅 する増強分子に、接触させる請求の範囲２５の方法。
27. ２７．該化学発光を増幅し得る増強分子の存在下で段階（ｇ）を行うことを更に 含み、ここで、該増強分子が担体分子と一緒に存在しておりそしてフルオレセイ ン、クマリンおよびローダミンから成る群から選択される蛍光団である請求の範 囲２２の方法。
28. ２８．該酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、該増強剤が蛍光団でありそし て該基質が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の置換１，２−ジオキセタンである請求の範囲２６の方法。
29. ２９．化学発光を増強させるため、化学発光を生じ得る追加的化合物を該修飾し たプライマーに連結させる段階を更に含む請求の範囲２２の方法。
30. ３０．数種のＤＮＡが同時に配列決定されるところの多重操作として該段階を行 う請求の範囲２２の方法。
31. ３１．ａ．配列決定すべきＤＮＡに対して核酸プライマーを雑種形成し； ｂ．鋳型として配列決定すべきＤＮＡを用いて、デオキシリボヌクレオシドトリ ホスフェートと一緒に該プライマーを拡張し；ｃ．化学発光を生じ得る化合物を 付着させるため修飾される鎖ターミネーターを用いて、該拡張反応を終結させて 、該プライマーからの終点に依存している長さを有するＤＮＡ分子を生じさせ； ｄ．大きさに従って、該拡張反応の各々によって生じる該ＤＮＡ分子を分離し； ｅ．この分離したＤＮＡ分子を固体状支持体に取り付け；ｆ．該修飾したターミ ネーターに、化学発光を生じ得る化合物を付着させ； ｇ．この化合物に化学発光を生じさせ；ｈ．大きさに従って、該分離したＤＮＡ 分子のパターンを得るために、この化学発光を検出し（ここで、発せられる光が 核酸の存在および量に対する指示を与える）；そしてｉ．分離したＤＮＡ分子の 該パターンを基にしてヌクレオチド配列を決定する； ことから成る段階を含む、ＤＮＡの配列決定方法。
32. ３２．ａ．配列決定すべきＤＮＡ、即ち化学発光を生じ得る化合物をそれに付着 させるため５′もしくは３′末端で修飾したＤＮＡを、供給し； ｂ．このＤＮＡに１組の別々の化学反応を受けさせ（ここで、いかなるＤＮＡ分 子中においてもいくつかの塩基のみが修飾される条件下で、４個のヌクレオシド 塩基の１個または２個を特異的に修飾する試薬と該ＤＮＡとを反応させた後、こ のＤＮＡを、該修飾した塩基を含有している該ヌクレオチドで該ＤＮＡを開裂さ せる試薬に、接触させる）；ｃ．大きさに従って、この開裂したＤＮＡ分子を分 離し；ｄ．この分離したＤＮＡを固体状支持体に取り付け；ｅ．化学発光を生じ 得る化合物を、該分離した分子に、該修飾した５′もしくは３′末端で付着させ ；ｆ．この化合物に化学発光を生じさせ；ｇ．大きさに従って、該分離したＤＮ Ａ分子のパターンを得るために、この化学発光を検出し（ここで、発せられる光 がＤＮＡの存在に対する指示を与える）；そして ｈ．ＤＮＡ分子の該パターンを基にしてヌクレオチド配列を決定する； ことから成る段階を含む、ＤＮＡの配列決定方法。
33. ３３．化学発光を生じ得る化合物を付着させるための連結用単位を、該ＤＮＡに 、核塩基および糖または核塩基と糖との組み合わせから選択される５′または３ ′末端で連結させる請求の範囲３２の方法。
34. ３４．段階（ｄ）の該分離された分子を、二特異的抗体、アビジン／ストレプト アビジン、レクチンに特異な糖類、レクチン類、ビオチンに特異な抗体、ビオチ ン、ハプテン、およびハプテンに特異な抗体から成る群から選択されるブリッジ 用単位に、接触させることを更に含む請求の範囲３３の方法。
35. ３５．その化学発光を生じ得る化合物が、アルカリ性ホスファターゼ、酸性ホス ファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、 ルシフェラーゼ、アリールエステラーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、アセチ ルコリンエステラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、アミノペプチダーゼおよ びリパーゼから成る群から選択される酵素であり、そしてこれを化学発光遺伝的 基質に接触させることによって、該酵素に化学発光の発生を生じさせる請求の範 囲３２の方法。
36. ３６．該酵素を、化学発光を生じる基質、および発生した化学発光の強度を増幅 する増強分子に、接触させる請求の範囲３５の方法。
37. ３７．該化学発光を増幅し得る増強分子の存在下で段階（ｆ）を行うことを更に 含み、ここで、該増強分子が担体分子と一緒に存在しておりそしてフルオレセイ ン、クマリンおよびローダミンから成る群から選択される蛍光団である請求の範 囲３２の方法。
38. ３８．該酵素がアルカリ性ホスファターゼであり、該増強剤が蛍光団でありそし て該基質が式 ▲数式、化学式、表等があります▼ の置換１，２−ジオキセタンである請求の範囲３２の方法。
39. ３９．化学発光を増強させるため、化学発光を生じ得る追加的化合物を該修飾し た３′末端または５′末端に連結させる段階を更に含む請求の範囲３２の方法。
40. ４０．数種のＤＮＡが同時に配列決定されるところの多重操作として該段階を行 う請求の範囲３２の方法。
41. ４１．ａ．固体状支持体に取り付けられているところの、試験すべき核酸を供給 し； ｂ．この核酸を、雑種形成すべきＤＮＡの領域に相補的なプローブに接触させ、 このプローブが、化学発光を生じ得る化合物に連結し； ｃ．配列決定すべきＤＮＡに対してこのプローブを雑種形成し； ｄ．この化合物に化学発光を生じさせ；そしてｅ．この化学発光を検出する（こ こで、発せられる光が該雑種形成されたＤＮＡの存在および量に対する指示を与 える）；ことから成る段階を含む、ＤＮＡの雑種形成方法。
42. ４２．化学発光を生じ得る化合物を、該核酸プローブに、５′末端、３′末端、 核塩基、およびホスホジエステルのバックボーンから選択されるその上の１個以 上の部位で、共有結合的に連結させる請求の範囲４１の方法。