JPH03502041A - Ｄｎａおよびｒｎａの迅速塩基配列決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡおよびＲＮＡの迅速塩基配列決定方法発明の背景 本発明は一般的には、ＤＮＡおよびＲＮＡの配列決定に関し、そして更に詳細に は個々のヌクレオチドを検出することによるＤＮＡおよびＲＮＡの配列決定に関 するものである。本発明は米国エネルギー省との契約（契約番号ｗ−７４０５− ＥＮＧ−３６）の結果である。

ヒトゲノムにおける塩基配列を分析するために世界的な努力が現在進展している 。ヒトゲノムにおける３×１０９塩基を考えると、この仕事が膨大であることは 明白であり、そして利用可能な塩基配列決定速度は１０〜２４時間当たり約２０ ０〜５００塩基である。非ヒト起源の核酸配列決定にもかなりの関心がある。現 在の方法は労働集約的でありそして１塩基当たり約１ドルの費用がかかる。

たとえば、Ｓａｎｇｅｒ等の「鎖終結阻害剤によるＤＮＡ配列決定Ｊ　、Ｐｒｏ ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ＾ｃａｄｅｉｙ　ｏｆ　５ ｃｉｅｎｃｅ。

ＵＳＡ囚、５４６３〜５４６７　（１９７７）は、ブライマー結合部位から１５ 〜２００のヌクレオチドの配列決定を提供している。放射性リンがマーカーを提 供するためにブライマーエクステンシジンで使用される。鎖終結前駆体とカップ リングした酵素的再合成は、４つのＤＮＡ塩基、即ちアデニン（＾）、シトシン （Ｃ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）の１つて無作為に終結するＤＮＡフ ラグメントを生成させるために使用される。

４組の反応生成物はポリアクリルアミドゲルの隣接レーン中で電気泳動的に分離 される。ＤＮＡフラグメントの移動は写真フィルム上の放射能の作用によって視 覚化される。得られたバンドパターンの注意深い解釈が配列分析には必要である 。この方法は典型的には１〜３日を要する。その上、ゲル中のバンドの重なり合 いの問題があり、更に確認的な配列決定が必要である。

関連技術で、Ａ、Ｍ、ＭａｘａｍおよびＷ、ＧＩ　ＩｂｅｒｔのｒＤＮ＾ＤＮＡ 定の新しい方法Ｊ　、Ｐｒｏｃｅｅｄｉ＋＋ｇｓ　ｏｒｔｈｅ　Ｎａｔ！ｏｎａ ｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｒ　５ｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ　７４．５６０〜５８４（１ ９７７）は、各々特定の終結を有する４組のまちまちの長さのフラグメントにＤ ＮＡを切断する化学的方法を教示している。フラグメントの分析は上記した電気 泳動によって進められる。この方法を使用して得られた結果は「サンガー法（Ｓ ａｎｇｅｒＭｅｔｈｏｄ）　Ｊと本質的に同一である。

もう１つの例で、５ｗ１ｔｈ等の「自動化したＤＮＡ配列分析における螢光検出 Ｊ　、Ｎａｔｕｒｅ　　３２１　、６７４〜６７９　（１９８６年６月）は、Ｄ ＮＡ配列分析の部分的な自動化法を教示している。４つの螢光染料がＤＮＡブラ イマーを個々に標識するために提供される。４つのＤＮＡ塩基の１つで終結し、 各組が４つの染料の１っで特徴（＝ｌけられた４組のＤＮＡフラグメントを産生 させるために、サンが一法が使用される。４組の反応生成物（それぞれ同一のＤ ＮＡフラグメントを多数含有する。）は−緒に混合して、ポリアクリルアミドゲ ルカラム上に置く。次いで、レーザー励起を使用して標識ＤＮＡ、フラグメント の移動バンドをカラム上で同定して特徴を決定する。その際、観察される螢光の スペクトル特性が各フラグメントの末端塩基を同定するために使用される。４０ ０個までの塩基のフラグメントの配列決定が報告されている。

データの信頼性は、螢光ピークのスペクトルの同一性を特異的に識別することが 困難であるので、疑わしいことがある。

本発明は先行技術での上記の問題や他の問題に向けられており、そしてＤＮＡの 塩基配列を迅速に決定する改良方法を提供する。本明細書に記載するように、本 発明は単一の−ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントから切断された個々のヌクレオ チドの連続的検出を提供する。

従って、本発明の１つの目的は、ＤＮＡおよびＲＮＡの自動塩基配列分析を提供 することである。

本発明のもう１つの目的は、ＤＮＡまたはＲＮＡの長いストランド（鎖）、即ち 同士もの塩基を有するストランドを処理することである。

他の１つの目的は迅速に個々の塩基の配列を決定して同定することである。

本発明の更に他の目的、利点および新規な特徴は以下の説明中で記載され、そし て以下の試験によって当該技術分野の熟練者に明白となるかまたは本発明の実施 によって理解されよう。本発明の目的および利点は請求の範囲に特に指摘した手 段および組み合わせによって理解し且つ達成することができる。

発明の概要 上記の目的および他の目的を達成するために、そして本明細書で具体化され且つ 広範に記載されているような本発明の目的に従って、ＤＮＡおよびＲＮＡ塩基の 配列決定方法が提供される。ＤＮＡまたはＲＮＡのストランドからの単一フラグ メントは移動試料流中に懸濁される。エキソヌクレアーゼを使用して、ＤＮＡま たはＲＮＡフラグメント上の末端塩基が該フラグメントから繰り返し切断されて 試料流中に一列の塩基が形成される。その後、これらの塩基は検出器を連続的に 通過する間に検出されてＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列が再現される。

本発明のもう１つの特徴では、ＤＮＡまたはＲＮＡストランドは同定可能な特性 を有する構成塩基から形成される。これらの塩基はストランドの単一フラグメン トの末端から順次切断されて、同定可能な一列の塩基が形成される。その後、− 列の塩基中の切断された単一塩基が順次同定され、ＤＮＡまたはＲＮＡストラン ドの塩基配列が再現される。

本発明の特定の１つの特徴では、ＤＮＡおよびＲＮＡの再合成に有効な各ヌクレ オチドが同定可能な特性を有するように修飾される。ＤＮＡストランドは修飾し たヌクレオチドから合成される。その際、合成したストランドは、測定すべき塩 基配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡストランドに相補的である。相補的ＤＮＡま たはＲＮＡの単一フラグメントを選択し、そして流れている試料流中に懸濁する 。個々の同定可能なヌクレオチドは、懸濁したＤＮＡストランドの遊離末端から 順次切断される。次いで、単一塩基を順次同定する。次いで、ＤＮＡまたはＲＮ Ａの親ストランドの塩基配列を、相補的ＤＮＡストランド塩基配列から決定する ことができる。

図面の簡単な説明 本明細書に導入し、明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明の実施態様を 示すものであり、そして本願の説明と一緒になって、本発明の詳細な説明するの に役立つものである。図面中： 第１図は、本発明によるＤＮＡ塩基配列決定方法の図解的説明である。

第２図は、本発明による出力信号の図示である。

発明の詳細な説明 本発明によれば、移動流中で単一のＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを単離し、 そして次に単一塩基を個々に切断して流れ中に入れ、検出器によってこれらの塩 基の配列を形成させることによって、大きなりＮＡまたはＲＮＡフラグメント中 の塩基配列を決定する方法が提供される。１つの実施態様では、試料流中の単一 塩基をレーザー誘導螢光によって調べて、各塩基の存在および同一性を確認する 。

ＤＮＡおよびＲＮＡストランドは各々、４つの有機塩基、即ちアデニン、シトシ ン、グアニンおよびチミン（ＤＮＡ）またはウラシル（ＲＮＡ）の１つからなる ヌクレオチドから形成されることが理解されよう。ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオ チドは類似しているが、同一ではない。しかしながら、これらのヌクレオチドお よびヌクレオチドのストランドは実質的に同一の方法で機能的に操作することが できる。また、ＲＮＡフラグメントの相補体はウラシルの代わりにチミンを有す るＤＮＡストランドとして通常形成される。下記の説明はＤＮＡ配列を言及する が、ＤＮＡに関する言及は、ＤＮＡおよびＲＮＡの双方に関する言及を含み、Ｄ ＮＡに限定するものではない。

本発明の特定の実施態様では、最初の工程は配列を決定すべきフラグメントに相 補的なりＮＡストランドの酵素的合成であり、その際各塩基はその塩基に特徴的 な螢光性標識を有している。相補的ストランドの配列決定は、元のフラグメント の配列決定に相当する。次いで合成ストランドはエキソヌクレアーゼを含有する 試料流中に懸濁させ、懸濁ＤＮＡまたはＲＮＡの遊離端から塩基を順次切断する 。次いで、切断した螢光的に標識した塩基は焦点を合わせたレーザー光線中に通 過させ、レーザー誘導螢光によって個々に検出しそして同定する。

塩基の配列を決定できる最高速度は、ＤＮＡまたはＲＮＡとのエキソヌクアーゼ 反応の動力学および検出速度によって決まる。計画される１０００塩基／秒の速 度によって、８×１０７塩基／日の配列決定がもたらされよう。これは２００〜 ５００塩基の配列決定に１０〜２４時間かかる標準的方法と対照的である。

第１図を参照すると、１つの有効な配列決定法は次の工程からなる：（１）個々 の塩基が同定可能な特徴を備えている、たとえば４つの塩基の各々を同定可能に する色でコードした螢光性標識で標識されている選択したＤＮＡのストランド１ ０を調製し、（２）同定可能な塩基を有する単一のＤＮＡフラグメントを選択し そして試料流中に懸濁４０させ、（３）懸濁したＤＮＡフラグメントの遊離末端 から同定可能な塩基を順次切断２０シ、そしてり４）個々の塩基を順次同定する 、たとえば螢光標識した単一塩基が焦点を合わせたレーザー系を流れる間にこれ らの塩基を検出３４する。個々の工程の代表的実施態様を以下に説明する。

配列決定すべきＤＮＡフラグメントの選択本発明によれば、標識して分析するた めに単一のＤＮＡフラグメント１．Ｏａを選択しそして調製する。ＤＮＡフラグ メントの異種混合物からの代表的な選択過程においては、アビジンが小球体に結 合し、そして所望のＤＮＡフラグメント１０ａ内の成る配列と相補的なビオチン 結合プローブが小球体上のアビジンに結合している。次いで、アビジン−ビオチ ン結合プローブコンプレックスをＤＮＡフラグメントの異種混合物と混合して所 望のフラグメントｌＯａとハイブリッドを形成させる。ビーズを非結合フラグメ ントから分離して洗浄し、所望の同種ＤＮＡフラグメント１０ａを提供する。

選択したフラグメントは、第１の小球体を除去しそして既知の配列のテイル９を フラグメント１０ａの３′末端に結合したブライマー１２に連結させることによ って更に処理する。小球体４０はフィコエリトリンーアビジンを用いて調製し、 フィコエリトリンーアビジンの単一分子を含むように選別する。既知の配列９に 相補的な単一のプローブ９ａはビオチンを結合させて、選別した小球体４０と結 合させる。次いでこのビーズープローブコンプレソクスは選択したフラグメント ｌＯａとハイブリッドを形成させる。かくして、ＤＮＡの単一のフラグメント１ ０ａは各小球体に結合することになろう。

もう１つの実施態様では、ＤＮＡフラグメントの同種供給源は、例えば遺伝子ラ イブラリーから提供される。この場合には選択工程は必要でなく、同種ＤＮＡフ ラグメントは、上記のように結合した適当な相補的なプローブを有するように、 フィコエリトリンーアビジンの単一分子を含有する小球体４０とハイブリッドを 形成させることができる。

どちらの場合においても、単一の小球体４０には、例えば微小注入ピペットを使 用して操作して、下記で説明するように標識しそして分析するために単一のフラ グメントストランドを運搬することができる。

塩基の螢光標識 単一フラグメントを形成する、分析すべき塩基は、同定可能な特性を有している 。同定可能な特性をＤＮＡストランド１０ａの各ヌクレオチドに直接結合させる ことができる。

或いは、塩基を最初に修飾して個々の同定可能な特徴をもたせてから、選択した ストランドｌｏａに再合成して相補的ＤＮ＾ストランドを形成させることができ る。いずれの場合においても、ＤＮＡフラグメント１０は同定可能な塩基で分析 されるように提供される。

１つの実施態様では、螢光特性が付与される。ＤＮＡ中に存在する塩基は室温で （ｔｏ’の固有の螢光量子収量を有している。しかしながら、螢光技術によって これらの塩基を検出するためには、大きな螢光量子収量および識別可能なスペク トル特性を有する種を形成するよううにこれらの塩基を修飾する、即ちこれらの 塩基を標識することが望ましい。

標識した塩基で酵素的手法を用いてＤＮＡの補助的ス）・ランドを合成する方法 は知られている。例えば、Ｐ、Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ等、［ビオチン−標識化したポ リヌクレオチドの酵素合成：新規な、核酸アフィニティープローブＪ　、Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａ、　Ｓｅｔ、　ＬＩＳ＾７８．６Ｆ１３３（１９８１）　；　Ｍ、Ｌ、Ｓ Ｍａｋｕｓ等、「ビオチン−標識化したヌクレオチド類似体の合成及び特徴付け 」、ＤＮＡ５．２４７（１９８Ｂ）参照。これらは全て参照文献として本明細書 に加える。第１図を参照すると、ブライマー１２はＤＮＡフラグメント１０ａの ３′末端に結合しており、そして酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼクレノウフラ グメント（ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−Ｋｌｅｎｏｖ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）が ブライマー１２の末端から出発するＤＮ＾フラグメントｌｏａの相補体を合成す るために使用される。修飾したデオキシヌクレオチド１４．１６．１８．２２は 合成で使用される（典型的には修飾したｄＡＴＰ　１４ａ、ｄＴＴＰ　（又はｄ ｔｌＴＰ）　ｌｅａ　、　ｄＣＴＰ　１８ａ及びｄＧＴＰ　２２ａ）。

修飾したヌクレオチドの各々は、特徴的な螢光染料１４ｃ　。

ｌｅｅ　、　１．８ｃおよび２２ｃでそれぞれ終結している長い炭素鎖リンカ− アーム１４ｂ　、１６ｂ　、　１８ｂおよび２２ｂで形成される。

次いで、修飾したヌクレオチド１４．１６．１８および２２はＤＮ＾ポリメラー ゼによって合成フラグメントに導入される。長いリンカ−アーム１４ｂ　、　１ ６ｂ　、　１８ｂ　、　２２ｂは、塩基１４ａ　。

ｌｅａ　、　１．８ａ　、　２２ａから螢光染料標識１４ｃ　、　１６ｃ　、　 １８ｃ　。

２２ｃを単離して酵素活性が阻害されないようになる。

数ｋＢ長さのＤＮＡフラグメントは、以下に記載するように、ビオチンで終結す る炭素鎖リンカ−アームを含有する各塩基で合成されている。ＤＮＡの合成、標 識化および切断方法を例示するために、ＤＮＡヌクレオチドの既知のストランド を形成し、ヌクレオチドをビオチンで終結するリンカ−アームで標識し、そして ＤＮＡの相補的ストランドを標識されたヌクレオチドから合成した。ビオチンは 、合成および切断反応を証明するために、螢光染料としてではなくモデル標識と して使用した。

１゜既知ストランド［ｄ（Ａ、Ｇ）］の調製：ホ’）　チオ＋シヌクレオｆ　Ｆ ｄ（Ａ、Ｇ）２１３Ｂを、Ｒ，ｌ、、　Ｒａｔ　Ｉ　ｉ　ｒｒ等の［末端デオキ シリボヌクレオチジルトランスフエラーゼによるヘテロポリヌクレオチド合成Ｊ 　、ＢｉｏｃｈｅｌｌｉｓｔｒｙＢ、　８５１（１，９６７）および「末端デオ キシリボヌクレオチジルトランスフエラーゼで合成したヘテロポリヌクレオチド 。

■１球菌性デオキシリボヌクレアーゼによる消化の隣接塩基頻度および程１ｊＪ 　、Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　　？　、４１２　（１９６８）に略述された方 法によって調製した。下付き文字２１３８はフラグメント中の平均塩基数を指し 、モしてＡとＧの間のコンマは塩基が無作為の順序で導入されることを示す。

２゛−デオキシアデノシン（ｄＡＴＰ）の５−トリフオスフェートｌＯマイクロ モルを、２°−デオキシグアノシン（ｄＧＴＰ）の５゛−トリフォスフェート１ マイクロモルおよびプライマーとして作用する５゛＝チミジル酸の直線状７量体 ［ｄ（ｐＴ）７１５５ナノモルと混合した。ｐＨ７に緩衝化した溶液に末端トラ ンスフェラーゼ１万ユニツトを加え、反応混合物を３７℃で２４時間維持した。

（１ユニツトは１ナノモルのヌクレオチドを１時間で重合する酵素量として定義 される。）次いて、得られたｄ（Ａ、Ｇ）２．３８を反応混合物から分離し、精 製する。

２、ビオチン結合した相補的ストランド［ｄ（Ｃ１Ｕ）２．３８コの調製： 上記したようにして調製したｄ（Ａ、Ｇ）２□３８と相補的なりＮＡストランド を、ビオチンで標識したヌクレオチドｄ　（ＣＴＰ）およびｄ　（ＵＴＰ）から 合成した。２゛−デオキシシチジン（ｄＣＴＰ）のビオチン結合した５゛−トリ フオスフェート１０ナノモルと２゜−デオキシウリジン（ｄＵＴＰ）のビオチン 結合した５゛−トリフォスフェート２０ナノモルの混合物を、ｄ（Ａ、Ｇ）２１ ３８１０ナノモルおよびｄ（ｐＴ）ｙ　２２ピコモルに加えた。次いてＤＮＡポ リメラーゼ（大腸菌）フレノウフラグメント１０ユニツトをｐＨ８に緩衝化した 混合物に加え、そして３７℃で２時間維持した。電気泳動して得られた生成物の 分析によって、反応が完了しそして完全にビオチン結合した相補的ＤＮＡフラグ メントｄ（Ｃ，ＩＪ）２□３８が形成されたことが示された。

３、ビオチン結合したｄ（Ｃ１Ｕ）２１３８のエキソヌクレアーゼ切断： 上記したようにして合成された完全にビオチン結合したｄ（Ｃ，Ｕ）２□３８を 、５ナノモルあｄ（＾、Ｇ）２□３８・ビオチン結合化ｄ（Ｃ，Ｕ）２１３８に １０ユニツトのエキソヌクレアーゼ■を添加することによって順次切断した。反 応混合物をｐＨ８，３７℃で２時間維持した。２時間の終わりに、反応混合物を 分析して、ＤＮＡの３０％が切断されそして切断反応が未だ進行中であるように みえることが示された。通常のｄ（Ｃ，Ｔ）、、□３８を使用する対照反応では ２時間で８５％の切断がもたらされた。このことから、ビオチン結合化はエキソ ヌクレアーゼ■を使用する切断反応を減速させると思われるが、標識したヌクレ オチドはＤＮＡフラグメントから順次切断された。

本発明によると、選択された螢光染料が、各ヌクレオチドタイプをそのヌクレオ チドに特徴的な染料で特異的に標識するために、ビオチンの代わりに使用される 。次いで、得られた相補的ＤＮＡ鎖は特有の強い螢光を発する染料を各塩基に与 える。例として、上掲のＳｍ１ｔｈ等は個々に識別可能な４個の標識からなる１ 組を教示している。

螢光検出の感度は、必要な場合、リンカ−アームに沿って幾つかの染料分子を結 合させることにより上昇させることができる。或いは、フィコエリトリン様分子 または多くの染料分子を含有する小さな小球体でさえリンカ−アームに結合させ ることができる。更にもう１つの変法では、螢光標識をストランドにされた単一 の一次フラグメントに結合することができ、そうすることによって、標識した塩 基を形成したり相補的ストランドを合成する必要がなくなる。

ＤＮＡフラグメントｌＯはＤＮＡの一重鎖かまたは二重鎖かのどちらであっても よいことに注目すべきである。ＤＮＡの一重鎖は、選択されたＤＮＡストランド が塩基同定用に直接標工される場合、または標識され再合成された相補的ＤＮＡ ストランドが選択されたストランドから分離される場合に生じる。二重鎖は、再 合成されたＤＮＡストランドが選択されたストランドと結合したまま維持されて いる場合に生じる。

本明細書で使用するとき、用語「フラグメント」はこのような状態のいずれかま たは全てを言う。

標識したヌクレオチドの酵素的切断 ＤＮＡフラグメント１０が同定可能な塩基で形成されそして小球体４０とハイブ リッドを形成した後、単一のフラグメント１０は小球体４０と共に操作すること ができそして流れ２４中に懸濁することができる。エキソヌクレアーゼ２０は、 流れ２４に懸濁された単一のＤＮＡフラグメント１０から塩基１４ａ　。

ｌｅａ　、　１８ａ　、　２２ａを順次切断するために使用される。リンカ−ア ームおよび螢光染料が存在すると、成る種のエキソヌクレアーゼの酵素的活性を 阻害することがあるが、適当なエキソヌクレアーゼは速度を僅かしか下げないで 切断する。個々の塩基は、上記したように完全にビオチン結合したヌクレオチド から形成されたＤＮＡフラグメントから順次酵素的に切断された。例えば、本明 細書に参照文献として加えた上掲のＭ、ｌ４．５ｈｉｉｋｕｓ等を参照。切断速 度は、エキソヌクレアーゼの濃度、温度を変えるかまたは有害剤を使用して調節 することができる。１つの塩基を取り除く時間は１ミリ秒のオーダーであるよう にすることができる。例えば、Ｖ、Ｅ、Ｒａｚｚｅｌ　１等の「ポリヌクレオチ ドに関する研究」、修飾された個々のヌクレオチド１４．１６．１８および２２ は、単一分子検出系３４で検出し分析するために、流れセル２６中に流れ２４に よって運ばれる。レーザー誘導螢光検出系の１つの実施態様は、本明細書に参照 文献として加えた、Ｄ、Ｃ。

Ｎｇｕｙｅｎ等の「流体力学的に集中した流れ中での超高感度のレーザー誘導螢 光検出Ｊ　、　Ｊ、Ｏｐｔ、Ｓｏｃ、Ａｍ、Ｂ、　、４．１３８〜１４３　、Ｎ ｏ、　２　（１９８７）に記載されている。そこに記載された光電子増倍管に基 づく検出系は、レーザーで誘導した螢光によって、集中した（ｒｏｃｕｓｅｄ） 試料流中でフィコエリトリンの単一分子を検出している。本明細書に参照文献と して加えた、Ｄ、Ｃ，Ｎｇｕｙｅｎ等の「流体力学的に集中した流れ中でのレー ザー誘導螢光によるフィコエリトリン単一分子の検出」Ａｎａｌ　、ＣｈｅＩｌ 、５９．２１５８〜２１８１（１９８７年９月）参照。

フィコエリトリンはローダミン−６Ｇ染料２５分子の相当物を含有する大きなタ ンパク質である。ローダミン−６Ｇの単一分子／発色団および相当する染料分子 の検出には、系の改良が提案される。かくして、背景ノイズを減少させるために 、集光効率の改善、量子効率を改善した検出器、またはパルス励起およびゲート でコントロールした検出の組み合わせをＮｇｕｙｅｎ等の系で使用することがで きる。フィコエリトリンの検出は１８０マイクロ秒で達成され、この時間は分子 が焦点を合わせたレーザー光線中を流れるのに要したものである。

本発明方法の好ましい実施態様では、Ｎｇｕｙｅｎ等の流体力学的に集中した流 れ系は、本明細書に参照文献と１２で加える５ｈｅｒａにより出願された係属中 の米国特許出願「単一分子追跡Ｊ　（Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎａ６５，７３７）に記載 された、改善された螢光検出系を備えている。そこに記載されているように、流 れ２４は流れセル２６に、ＤＮＡストランドＩＯから切断される順番に修飾ヌク レオチド１４．１６．１８および２２を提供する。レーザー系３２は、流れセル 内の薄層状試料２８中て同定するために選択した波長で、螢光染料１４ｃ　、　 １６ｃ　、　１８ｃ　、および２２ｃを励起する。

光学的信号３６に含まれる螢光現象は高感度位置検出系４２上のレンズ３８によ って集められる。検出系４２は、観察された光子現象の空間的座標を取り出すた めに、微少通路板（ｏ＋１ｃｒｏｃｈａｎｎｅｌ　ｐｌａｔｅ：ＭＣＰ）センサ ーから構成できる。内部クロックは一時的な座標を提供し、その際データ処理器 ４４は流れセル２６内の分子の存在を測定する。レーザー３２励起に対する分子 スペクトル応答によって特定の修飾ヌクレオチドの同定が可能になる。上掲の５ ｈｅｒａの文献に記されているように、単−分子検出系３４でのデータ処理によ って、標識された単一のヌクレオチドのみ含有している移動試料容量が集中流２ ８内に効率的にもたらされる。かくして系３４は、集中流２８内に存在する多数 の分子を追跡して高速度の配列決定の持続を可能にすることができる。

ここで、第２図に言及すると、単−分子検出系からの代表的な出力信号が示され ている。個々のヌクレオチド分子１４、Ｉ６．１８および２２は、ＤＮＡストラ ンド１０から個々に切断されて流れ２４に入る。流速度および薄層流条件によっ て分子は流れセル２Ｂを順次通過するように一列に維持され、そしてレーザー励 起した分子的螢光から放出される光子は上記セル内を通過する個々の分子を付与 される。各タイプのヌクレオチドに特徴的な染料は、同定可能な励起または螢光 スペクトルを有するように選択される。この特徴的なスペクトルは、分析中のＤ ＮＡストランドの塩基配列を確定するために使用することができる。

本発明方法は更に、検出される分子を選別してそれらをその後の同定、例えば本 明細書に参照文献として加えるＭ、Ｒ，Ｍｅｌａｍｅｄ等の［流れの血球計算お よび選別Ｊ　、　Ｗｉｌｅｙ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１，９７９）に記載されているような同定のために移動基質 上に沈着させる能力を提供する。流れは、二次的同定装置へ送るために、空間的 に単離された塩基を流れ中に維持する。移動基質上の分子間の位置は調節可能で あり、そして選別された分子を別の技術で解明するのに十分な程大きくすること ができる。

本発明の好ましい実施態様に関する前述の記載は、説明の目的で示したものであ る。開示されたその通りの形態に本発明を限定することは意図しておらず、そし て上記の教示に照らして多くの修正および変更が明らかに可能である。

本発明の範囲は請求の範囲により規定されるものである。

国際調査報告 特表平３−５０２０４１　（７）

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡまたはＲＮＡの単一フラグメントを単離する工程；前記単一フラグメ ントを移動試料流に導入する工程；前記ＤＭＡまたはＲＮＡフラグメントから末 端塩基をエキソヌクレアーゼで順次切断して一列の前記塩基の列を形成させる工 程；および検出器を順次通過する前記塩基列中の塩基を検出する工程からなるこ とを特徴とするＤＮＡおよびＲＮＡ塩基配列決定方法。
2. ２．前記単一フラグメントの各塩基は、該塩基のための同定可能な特性を有する 標識を含有するように修飾される請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記塩基は前記切断に先立って修飾される請求の範囲第２項に記載の方法。
4. ４．特性化すべきＤＮＡまたはＲＮＡストランドに相補的なＤＮＡストランドを 酵素的に合成する工程をさらに含み、前記合成ストランドを形成する各ヌクレオ チドは該ヌクレオチドに特徴的な標識を含有している請求の範囲第２項に記載の 方法。
5. ５．前記標識は前記切断のために有効なリンカーアームによってヌクレオチドか ら分離される請求の範囲第２項に記載の方法。
6. ６．前記切断された塩基は光学的に検出される請求の範囲第１項に記載の方法。
7. ７．前記各標議は前記ヌクレオチドの１つのタイプに特徴的な螢光染料である請 求の範囲第６項に記載の方法。
8. ８．前記各螢光染料を励起して前記染料の螢光スペクトルを検出する工程をさら に含む請求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．ＤＮＡまたはＲＮＡの単一フラグメントを単離する前記工程は、ハイブリッ ド形成に有効な部位を有する基質と前記フラグメントをハイブリッド形成させる 工程を含む請求の範囲第１項に記載の方法。
10. １０．前記ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントをＤＮＡまたはＲＮＡフラグメント の異種コレクションから選択する工程をさらに含み、前記部位は選択されるＤＮ ＡまたはＲＮＡフラグメントとハイブリッド形成させるのに有効なビオチンを結 合したプローブである請求の範囲第９項に記載の方法。
11. １１．前記単一フラグメントの単離は、単一ＤＮＡフラグメントとのハイブリッ ド形成に有効な単一部位を前記基質に付与する工程を含む請求の範囲第９項に記 載の方法。
12. １２．同定可能な特性を有する塩基でＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントを形成す る工程；前記フラグメントの１つから同定可能な単一の塩基を順次切断して１列 の前記同定可能な塩基の列を形成する工程；および前記塩基列中の切断された単 一の塩基を同定する工程からなることを特徴とするＤＭまたはＲＮＡフラグメン トの塩基配列決定方法。
13. １３．特徴的な同定可能な螢光染料を前記各塩基に結合させる工程をさらに含む 請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. １４．フラグメントを形成させる前記工程は、配列決定すべき前記ＤＮＡまたは ＲＮＡの相補的ストランドを同定可能な特性を有する前記塩基から酵素的な合成 によって形成し、次いで前記相補的ストランドの塩基配列を決定する工程を含む 請求の範囲第１２項に記載の方法。
15. １５．特徴的な同定可能な螢光染料を前記各塩基に結合させる工程をさらに含む 請求の範囲第１４項に記載の方法。
16. １６．切断された単一の塩基を同定する前記工程は、前記各螢光染料を励起して 前記染料の螢光スペクトルを検出する工程を含む請求の範囲第１３項に記載の方 法。
17. １７．切断された単一の塩基を同定する前記工程は、前記各螢光染料を励起して 前記染料の螢光スペクトルを検出する工程を含む請求の範囲第１５項に記載の方 法。
18. １８．ＤＮＡまたはＲＮＡ合成に有効な各ヌクレオチドを修飾して、ＤＮＡまた はＲＮＡ合成およびエキソヌクレアーゼ切断を可能にするのに有効なリンカーア ームでそのヌクレオチドに特徴的な螢光染料を結合させる工程；決定すべき塩基 配列を有するＤＮＡまたはＲＮＡストランドに相補的なＤＮＡストランドを前記 修飾ヌクレオチドから合成する工程；前記相補的ＤＮＡストランドを含有する単 一フラグメントから前記各修飾ヌクレオチドを順次切断する工程；および前記各 特徴的染料を蛍光化して前記ヌクレオチドの配列を同定する工程からなることを 特徴とするＤＮＡまたはＲＮＡの塩基配列決定方法。
19. １９．染料を螢光化する前記工程はさらに、前記特徴的染料を螢光化するのに有 効なレーザーで前記各修飾ヌクレオチドを励起する工程；および前記螢光を検出 して前記ヌクレオチドを順次同定し、前記ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を生じさせ る工程からなる整求の範囲第１８項に記載の方法。
20. ２０．合成されたＤＮＡまたはＲＮＡの単一フラグメントを薄層状流中に懸濁さ せる工程をさらに含む請求の範囲第１８項に記載の方法。
21. ２１．各合成されたＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントは、ハイブリッド形成に有 効な部位を有する小球体と前記フラグメントをハイブリッド形成させることによ って操作される請求の範囲第１８項に記載の方法。