JPH02142500A - 標識された核酸フラグメント - Google Patents
標識された核酸フラグメントInfo
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- JPH02142500A JPH02142500A JP29707888A JP29707888A JPH02142500A JP H02142500 A JPH02142500 A JP H02142500A JP 29707888 A JP29707888 A JP 29707888A JP 29707888 A JP29707888 A JP 29707888A JP H02142500 A JPH02142500 A JP H02142500A
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Landscapes
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、遺伝子工学と遺伝子組換え技術に関する。特
に、核酸の塩基配列の分析に用いられる。
に、核酸の塩基配列の分析に用いられる。
螢光性１発光性、″または色素性標職体で、生物活性の
ある核酸セグメントを標識あるいけラベルして得られる
核酸フラグメントに関する。
ある核酸セグメントを標識あるいけラベルして得られる
核酸フラグメントに関する。
（従来の技術）
遺伝子工学の歴史は、１９７３年に始まったと一般的に
考えられている。遺伝子の分析方法の改良は、遺伝子を
構成するデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）の発生、複製２見
現における予想もしなかった複雑性と細かい区別立てを
解明することに役だった。
考えられている。遺伝子の分析方法の改良は、遺伝子を
構成するデオキシリポ核酸（ＤＮＡ）の発生、複製２見
現における予想もしなかった複雑性と細かい区別立てを
解明することに役だった。
在来概念の修正は、遺伝子を解剖し、クローニングし、
そして増幅するための分子生物学的な道具の使用に依存
してきた。
そして増幅するための分子生物学的な道具の使用に依存
してきた。
ＤＮＡの塩基配列を決定できるということは。
基礎研究あるいは、現在の臨床医学にとって、もつとも
基本的で重要な技術の一つである。ＤＮＡの塩基配列を
決める一般的な方法は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ
）でＨｐなどの半減期の短い、生物にとって危険のある
アイソトープを用いて、ＤＮＡ断片の長さと内容を決定
するものである。しかしながら、決定する過程は労力を
要し９時間がかかる。
基本的で重要な技術の一つである。ＤＮＡの塩基配列を
決める一般的な方法は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ
）でＨｐなどの半減期の短い、生物にとって危険のある
アイソトープを用いて、ＤＮＡ断片の長さと内容を決定
するものである。しかしながら、決定する過程は労力を
要し９時間がかかる。
配列解析をするための化学的方法は、ＤＮＡ断片の末端
塩基を標識し、そして塩基に特異的な加水分解を行なう
。一方、ＩＷ素的複梨法は、解析をする遺伝子のクロー
ニングと、−重鎖ＤＮＡファージにその遺伝子を付加す
る方法である。プライマーＤＮＡはクローン化された遺
伝子に隣接するＤＮＡ部分の配列に相補的な塩基配列を
もち、このクローン化された遺伝子のＤＮＡを複製し始
めるため罠用いられる。この複製には、前駆体（プレカ
ーサー）としての４種のデオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸（ｄＡＴＰ、ｄｃＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）と
、鎖合成終息因子（チェーンターミネータ−）として４
種のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＡＴＰ
、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰ）が必要であ
る。ＤＮＡを複写するために、４本の試験管にそれぞれ
４種すべてのプレカーサーと、４種のチェーンターミネ
ータ−の１８［だけを含む反応液をつくる。ジデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸が複写されたＤＮＡに入った
時に、その後のＤＮＡ合成はただちに終了し、チェーン
ター２ネーシヨンが起こる。ｄｄＡＴＰがチェーンター
ミネータ−であれば、すべてのＤＮＡは通常には、ｄＡ
ＴＰが入る場所で複製が終了する。
塩基を標識し、そして塩基に特異的な加水分解を行なう
。一方、ＩＷ素的複梨法は、解析をする遺伝子のクロー
ニングと、−重鎖ＤＮＡファージにその遺伝子を付加す
る方法である。プライマーＤＮＡはクローン化された遺
伝子に隣接するＤＮＡ部分の配列に相補的な塩基配列を
もち、このクローン化された遺伝子のＤＮＡを複製し始
めるため罠用いられる。この複製には、前駆体（プレカ
ーサー）としての４種のデオキシリボヌクレオシド三リ
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種のジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＡＴＰ
、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ及びｄｄＴＴＰ）が必要であ
る。ＤＮＡを複写するために、４本の試験管にそれぞれ
４種すべてのプレカーサーと、４種のチェーンターミネ
ータ−の１８［だけを含む反応液をつくる。ジデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸が複写されたＤＮＡに入った
時に、その後のＤＮＡ合成はただちに終了し、チェーン
ター２ネーシヨンが起こる。ｄｄＡＴＰがチェーンター
ミネータ−であれば、すべてのＤＮＡは通常には、ｄＡ
ＴＰが入る場所で複製が終了する。
ジデオキシリポヌクレオシドリン酸は複写されたＤＮＡ
のどこにでも入るので、ジデオキシリボヌクレオシドリ
ン酸を末端にもついろいろな長さのＤＮＡが生成する。
のどこにでも入るので、ジデオキシリボヌクレオシドリ
ン酸を末端にもついろいろな長さのＤＮＡが生成する。
このようＫして生成したＤＮＡは、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法により、そのＤＮＡの長さ、すなわち塩
基の数に従って分離される。ゲル中のＤＮＡを検出する
ために、ラジオアイソトープで例えばｓ２Ｐで標識され
たデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、複写されたＤ
ＮＡに取り込ませる。ラジオアイソトープで標識された
ＤＮＡはゲルで分離されて、Ｘ線フィルム上に露光する
ことによシ目に見えるようになる。複製されたＤＮＡの
塩基配列は、ゲルのオートラジオグラフィーから読み取
れる。
ゲル電気泳動法により、そのＤＮＡの長さ、すなわち塩
基の数に従って分離される。ゲル中のＤＮＡを検出する
ために、ラジオアイソトープで例えばｓ２Ｐで標識され
たデオキシリボヌクレオシド三リン酸を、複写されたＤ
ＮＡに取り込ませる。ラジオアイソトープで標識された
ＤＮＡはゲルで分離されて、Ｘ線フィルム上に露光する
ことによシ目に見えるようになる。複製されたＤＮＡの
塩基配列は、ゲルのオートラジオグラフィーから読み取
れる。
他の研究者は、ラジオアイソトープを他の標識。
例えば螢光あるいは発光に置換することを試みた。
Ｆ、サンガー法は、ラジオアイソトープ標識の代ゎシに
一色の螢光色素で標識したプライマーを用いて行なわれ
ている。この塩基配列決定法は、ポリアクリルアミドゲ
ルの４本のレーンが必要である。
一色の螢光色素で標識したプライマーを用いて行なわれ
ている。この塩基配列決定法は、ポリアクリルアミドゲ
ルの４本のレーンが必要である。
４本のレーンの各々は、それぞれ４種の核酸塩基を決定
する。しかしながら４本のレーンを用いるポリアクリル
アミドゲルは、いわゆるスマイル効果（５ｍ１ｌｅ
ｅｆｆｅｃｔ ）を生じることがある。これは両側のレ
ーンの核酸フラグメントの易動度が低いことＫよシ、レ
ーン間であいまいさが生じることを言う。通常レーンの
間隔は１ヌクレオチドの重量の違いによって少なくとも
１ユニット以上離されるべきである。このスマイル効果
は、各々のレーンにみられる核酸塩基のはしごから読み
取ってＤＮＡの塩基配列を決定するのにあいまいさを残
す。
する。しかしながら４本のレーンを用いるポリアクリル
アミドゲルは、いわゆるスマイル効果（５ｍ１ｌｅ
ｅｆｆｅｃｔ ）を生じることがある。これは両側のレ
ーンの核酸フラグメントの易動度が低いことＫよシ、レ
ーン間であいまいさが生じることを言う。通常レーンの
間隔は１ヌクレオチドの重量の違いによって少なくとも
１ユニット以上離されるべきである。このスマイル効果
は、各々のレーンにみられる核酸塩基のはしごから読み
取ってＤＮＡの塩基配列を決定するのにあいまいさを残
す。
理想的な方法は、ひとつのレーンを使用する方法である
。この方法はスマイル効果を除外できる。
。この方法はスマイル効果を除外できる。
しかしながら、４種類の核酸塩基のうち各々の核酸塩基
でターミネートされたフラグメント例えばチミンｆＴ）
またけウラシル回とシトシン（Ｃ）、アデニンｆＡｌ、
グアニン（Ｇｌの違いを認識しなければならない。
でターミネートされたフラグメント例えばチミンｆＴ）
またけウラシル回とシトシン（Ｃ）、アデニンｆＡｌ、
グアニン（Ｇｌの違いを認識しなければならない。
それぞれの核酸塩基に特異的な螢光を使用することによ
υ、この問題は解決できる。このような、方法としてス
ミス、ファングらによって開発された方法がある。この
方法は４種類の異なった化学物質で螢光標識されたＤＮ
Ａプライマーを使用している。しかしながら、これらの
化学物質の化学特性はポリアクリルアミドゲル電気泳動
におけるプライマーの易動度（モビリティ−）を各々変
化させるものである。との易動度の違いは、電気泳動後
に分離されたパターンを読む際にはっきりとわかるくら
いのものである。つ−＄ｆｉ、 ＤＮＡ塩基配列の決定
の精度は劣ることになる。
υ、この問題は解決できる。このような、方法としてス
ミス、ファングらによって開発された方法がある。この
方法は４種類の異なった化学物質で螢光標識されたＤＮ
Ａプライマーを使用している。しかしながら、これらの
化学物質の化学特性はポリアクリルアミドゲル電気泳動
におけるプライマーの易動度（モビリティ−）を各々変
化させるものである。との易動度の違いは、電気泳動後
に分離されたパターンを読む際にはっきりとわかるくら
いのものである。つ−＄ｆｉ、 ＤＮＡ塩基配列の決定
の精度は劣ることになる。
したがって、単純化され九自動ＤＮＡ塩基配列決定を正
確に行なうために標識物質の化学的特性を補償してポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で一列の泳動レーンのみを
使用する方法が望まれていた。
確に行なうために標識物質の化学的特性を補償してポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で一列の泳動レーンのみを
使用する方法が望まれていた。
この方法はまた。化学合成りＮＡプライマーだけでなく
自然界で得られるＤＮＡプライマーをも標識できるよう
なものでなければならない。
自然界で得られるＤＮＡプライマーをも標識できるよう
なものでなければならない。
本発明は、これらの課題を解決するものである。
（課題を解決するための手段）
本発明は、５′末端をもつ核酸セグメントと、最初の末
端と最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上の
メチレン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′末
端に結合しているリンカ−と。
端と最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上の
メチレン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′末
端に結合しているリンカ−と。
そのリンカ−の最後の末端に結合した螢光物質。
発光物質又は着色物質の３者の組み合わせからなること
を特徴とする標識された核酸フラグメントに関する。
を特徴とする標識された核酸フラグメントに関する。
５′末端をもつ核酸セグメントとは、ＤＮＡ合成におけ
るＤＮＡプライマーとされるものであ夛。
るＤＮＡプライマーとされるものであ夛。
オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、天然のＤＮＡ化学
合成されたＤＮＡ、天然のＲＮＡ、化学合成されたＲＮ
Ａなどを意味する。
合成されたＤＮＡ、天然のＲＮＡ、化学合成されたＲＮ
Ａなどを意味する。
核酸セグメントの５′末端に結合するリンカ−は。
両端にアミノ基を持ち、その間にいくつかのメチレン基
［（ＣＨｚ）ｎ、 ”は自然数を表す〕をもつもので
ある。メチレン基の数は、標識物質として使用される螢
光９発光又は色素物質の化学的な性質による差によって
おこる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動における易動
度の違いを補償するために調整される。メチレン基４残
基分が核酸フラグメントの易動度を１核酸塩基分の泳動
距離だけ下げることが実験的に確認された。したがって
、′ｗＬ気泳動によるポリアクリルアミドゲルのレーン
で標識された核酸フラグメントの易動度は１メチレン残
基あたｊ）１／４核酸塩基分だけ正確に調節される。リ
ンカ−として使用されるジアミノアルカ７ （ＮＨｚ
（ＣＨｚ ）ｎ ＮＨｘ ）は、ｎが２から１２までの
範囲を持つものが市販されている。この範囲は。
［（ＣＨｚ）ｎ、 ”は自然数を表す〕をもつもので
ある。メチレン基の数は、標識物質として使用される螢
光９発光又は色素物質の化学的な性質による差によって
おこる。ポリアクリルアミドゲル電気泳動における易動
度の違いを補償するために調整される。メチレン基４残
基分が核酸フラグメントの易動度を１核酸塩基分の泳動
距離だけ下げることが実験的に確認された。したがって
、′ｗＬ気泳動によるポリアクリルアミドゲルのレーン
で標識された核酸フラグメントの易動度は１メチレン残
基あたｊ）１／４核酸塩基分だけ正確に調節される。リ
ンカ−として使用されるジアミノアルカ７ （ＮＨｚ
（ＣＨｚ ）ｎ ＮＨｘ ）は、ｎが２から１２までの
範囲を持つものが市販されている。この範囲は。
螢光物質２発光物質又は色素物質によって標識された核
酸フラグメントの易動度を調節するのに十分である。ジ
アミノアルカンとしては９例えば。
酸フラグメントの易動度を調節するのに十分である。ジ
アミノアルカンとしては９例えば。
１．２−ジアミノエタン、１．６−ジアミツヘキサン。
１．１０−ジアミノデカン等を挙げることができる。
本発明では、メチレン基単位の数（ｎ）をあらかじめ決
めておいたリンカ−を５′末端に結合させた核酸セグメ
ント（アミノアルキルフォスフォラミド誘導体）を、螢
光物質２発光物質又は色素物質で標識する。
めておいたリンカ−を５′末端に結合させた核酸セグメ
ント（アミノアルキルフォスフォラミド誘導体）を、螢
光物質２発光物質又は色素物質で標識する。
用いる標識物質のイオン化度１分子量、形状などの要因
で易動度は異なるので、それらに応じてメチレン基の数
ｉｎ＋が決まる。例えば、もし４種類の螢光標識を用い
るのであれば４種類の螢光物質釜々の化学特性はそれぞ
れ異なるので、各々の螢光物質で標識された核酸フラグ
メントの易動度も多様化してしまう。螢光標識された核
酸フラグメントの易動度は、リンカ−のメチレン基の数
ヲ変５化させることにより調節でき、４つのメチレン基
をリンカ−に付加することＫよシ、同じ螢光物質を使用
した場合、約１塩基分の距離だけ易動度を遅くすること
ができる。従って、４種類の核酸フラグメントの易動度
を同一にすることができる。
で易動度は異なるので、それらに応じてメチレン基の数
ｉｎ＋が決まる。例えば、もし４種類の螢光標識を用い
るのであれば４種類の螢光物質釜々の化学特性はそれぞ
れ異なるので、各々の螢光物質で標識された核酸フラグ
メントの易動度も多様化してしまう。螢光標識された核
酸フラグメントの易動度は、リンカ−のメチレン基の数
ヲ変５化させることにより調節でき、４つのメチレン基
をリンカ−に付加することＫよシ、同じ螢光物質を使用
した場合、約１塩基分の距離だけ易動度を遅くすること
ができる。従って、４種類の核酸フラグメントの易動度
を同一にすることができる。
このようにしてできた、標識物質と易動度を調節した核
酸フラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により、同一のレーンを使用して実際の塩基配列決定す
る場合に有効ＶＣ２用できる。
酸フラグメントは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により、同一のレーンを使用して実際の塩基配列決定す
る場合に有効ＶＣ２用できる。
なお、この方法による易動度の調節は９発光物質または
色素物質で標識された核酸フラグメントにも使用できる
。
色素物質で標識された核酸フラグメントにも使用できる
。
本発明１ｃＩ’ｉｌ！用しうる標識物質の好ましい１例
として２例えば以下に示すような４種の螢光物質が挙げ
られる。
として２例えば以下に示すような４種の螢光物質が挙げ
られる。
■フルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ。
５１５ｎｍＫ最大発光を持つ、緑色）、■４−フルオロ
−７−二トロベンゾーフラザン（ＮＢＤ−Ｆｌ ５４
０ ｎｍに最大発光を持つ、黄緑色）、■テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ，５７３ｎ
ｍに最大発光を持つ、オレンジ色）、■テトラメチルイ
ンチオシアネート。
−７−二トロベンゾーフラザン（ＮＢＤ−Ｆｌ ５４
０ ｎｍに最大発光を持つ、黄緑色）、■テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ，５７３ｎ
ｍに最大発光を持つ、オレンジ色）、■テトラメチルイ
ンチオシアネート。
６０１１ｍに最大発光を持つ、赤色）
これらの標識物質は、リンカ−を介して核酸セグメント
に付加する。
に付加する。
本発明における標識された核酸フラグメントの合成は９
例えば図１に示した工程で行なうことができる。なお１
図１においてｅ Ｂ１ ｅ Ｂ、及びＢｓ１ｄ。
例えば図１に示した工程で行なうことができる。なお１
図１においてｅ Ｂ１ ｅ Ｂ、及びＢｓ１ｄ。
ヌクレオチドの塩基を表わす。
本発明によって合成される。標識された核酸フラグメン
トは、標識されたＤＮＡプライマーとして９例えば以下
に示すようなりＮＡの塩基配列の分析に使用される。
トは、標識されたＤＮＡプライマーとして９例えば以下
に示すようなりＮＡの塩基配列の分析に使用される。
ＤＮＡ合成のために、４種類の反応液を用意する。各反
応液には、４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの他Ｋ。
応液には、４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄ
ＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの他Ｋ。
それぞれ本発明によシ得られる１種類の螢光物質（例え
ば、ＸＲＩＴＣ，赤色）で標識されたプライマーと１種
類のジデオキシヌクレオチド（例工ば。
ば、ＸＲＩＴＣ，赤色）で標識されたプライマーと１種
類のジデオキシヌクレオチド（例工ば。
ｄｄＡＴＰ）を含むようにする。すると、ＤＮＡ合成反
応後には、ジオキシアデノシン（ｄｄＡ）で反応終了し
たいろいろな長さのＤＮＡ分子が生成する。同様にして
ｄｄｅで終了したＤＮＡはオレンジ色のＴＲ，ＩＴＣ，
ｄｄＧで終了したＤＮＡは黄緑色のＮＢＤ−Ｆ、ｄｄＴ
で終了したＤＮＡは緑色のＦＩＴＣでそれぞれ標識され
ている。得られたいろいろな長さのＤＮＡ分子から塩基
配列を分析する場合ラジオアイソトープで標識する方法
はポリアクリルアミドゲルで４つのレーンを使用しなけ
ればならないが、この新しい方法は１つのレーンで良い
。すなわち、４種類の反応液すべてを１本のチューブに
まとめて電気泳動する。螢光で標識されたＤＮＡは、そ
の長さで分離され、各々のバンドはゲル中で見える。レ
ーザー光あるいは可視光は、ゲルをスキャンするのと、
螢光を励起させ。
応後には、ジオキシアデノシン（ｄｄＡ）で反応終了し
たいろいろな長さのＤＮＡ分子が生成する。同様にして
ｄｄｅで終了したＤＮＡはオレンジ色のＴＲ，ＩＴＣ，
ｄｄＧで終了したＤＮＡは黄緑色のＮＢＤ−Ｆ、ｄｄＴ
で終了したＤＮＡは緑色のＦＩＴＣでそれぞれ標識され
ている。得られたいろいろな長さのＤＮＡ分子から塩基
配列を分析する場合ラジオアイソトープで標識する方法
はポリアクリルアミドゲルで４つのレーンを使用しなけ
ればならないが、この新しい方法は１つのレーンで良い
。すなわち、４種類の反応液すべてを１本のチューブに
まとめて電気泳動する。螢光で標識されたＤＮＡは、そ
の長さで分離され、各々のバンドはゲル中で見える。レ
ーザー光あるいは可視光は、ゲルをスキャンするのと、
螢光を励起させ。
その物質特有の色を発するために用いられる。第２図は
、上記のような螢光色と核酸塩基との関係で、１つのレ
ーンからＤＮＡの塩基配列が直接読み取れる様子を示し
ている。
、上記のような螢光色と核酸塩基との関係で、１つのレ
ーンからＤＮＡの塩基配列が直接読み取れる様子を示し
ている。
各々のバンドからの発光は写真撮影でも検出できるし、
自動塩基配列決定装置中の光感性検出器によっても認識
される。
自動塩基配列決定装置中の光感性検出器によっても認識
される。
この方法は天然あるいけ合成した核酸フラグメントに使
用できるため、あらかじめ選択した遺伝子の一般的な標
識方法として用いることが可能である。
用できるため、あらかじめ選択した遺伝子の一般的な標
識方法として用いることが可能である。
さらに、この標識ケサザン・プロッティング法とノーザ
ン・プロッティング法を用いて臨床検査にも応用できる
。この標識法は、ある特定のＤＮＡを検出するためのＤ
ＮＡプローブにも使える。病原体は、そのリポソームＲ
ＮＡに対する標識プローブを用いることによって検出で
きる。
ン・プロッティング法を用いて臨床検査にも応用できる
。この標識法は、ある特定のＤＮＡを検出するためのＤ
ＮＡプローブにも使える。病原体は、そのリポソームＲ
ＮＡに対する標識プローブを用いることによって検出で
きる。
上記は本発明の望ましい一つの具体例である。
この技術にみられる方法は本発明の範囲内でいろいろな
汎用性があろうし、応用もされるであろう。
汎用性があろうし、応用もされるであろう。
（実施例）
本発明の実施例を以下に示すが２本発明はこれに限定さ
れるものではない。
れるものではない。
オリゴヌクレオチドとして、自動ＤＮＡ合成装置（５ｙ
ｓｔｅｒ モデル１５４０Ａ）による固相ＣＥＤ−フォ
スフォラミド法によって合成した１５マー（１５−ｍｅ
ｒｓ ）を使用した。
ｓｔｅｒ モデル１５４０Ａ）による固相ＣＥＤ−フォ
スフォラミド法によって合成した１５マー（１５−ｍｅ
ｒｓ ）を使用した。
合成した１５マーのオリゴヌクレオチドのリン酸化は、
５０ｍＭ（７））リス−ＨＣＩ （ｐＨ７，６） 、
１０ｍＭのＭｇｃｆ２．１０ｍＭのジチオスレイトール
。
５０ｍＭ（７））リス−ＨＣＩ （ｐＨ７，６） 、
１０ｍＭのＭｇｃｆ２．１０ｍＭのジチオスレイトール
。
３ｍＭのＡＴＰ、Ｔ４−ヌクレオチドカイネースをふく
む１００μｌの反応液中で３７℃、１時間行なった。リ
ン酸化されたオリゴヌクレオチドは。
む１００μｌの反応液中で３７℃、１時間行なった。リ
ン酸化されたオリゴヌクレオチドは。
ゲルロ適用カラム（東ソー■製ＴＳＫ ２０００ＳＷ
）を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）で精製した。オリゴヌクレオチドのピークを集め凍結
乾燥により溶媒の酢酸アンモニウムを除いた。
）を使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）で精製した。オリゴヌクレオチドのピークを集め凍結
乾燥により溶媒の酢酸アンモニウムを除いた。
得られたオリゴヌクレオチドを２５０ｍＭの１゜ミ
２−シアえノエタ７（ＰＨ６，０）、２００ｍＭのエチ
ル−３（３−ジエチル−アミノ−プロビル）カルボジイ
ミ）”（ＥＤＡＣ）、１００ｍＭのへ−ｍｅｔｈｙｌｉ
ｍｉｄａｚｏｌｅ （ｐＨ６，０）の反応液１ｏＯμ／
中で２５℃、１晩保温して、リンカ−を結合させた。
ル−３（３−ジエチル−アミノ−プロビル）カルボジイ
ミ）”（ＥＤＡＣ）、１００ｍＭのへ−ｍｅｔｈｙｌｉ
ｍｉｄａｚｏｌｅ （ｐＨ６，０）の反応液１ｏＯμ／
中で２５℃、１晩保温して、リンカ−を結合させた。
続いて、リンカ−に螢光物質を標識するために。
フルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴＣ）を第１
図に示したように、ＤＮＡのアミノアルキルフオスフオ
ラミデート誘導体を２１ｎｇ／ｍｌノＦＩＴＣのジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液１５ μｉを含む０．２
Ｍ ＮａＣＯ３緩衝液（ｐＨ９，３）５０μｌ中で、
２５℃、１晩暗室で保温する。
図に示したように、ＤＮＡのアミノアルキルフオスフオ
ラミデート誘導体を２１ｎｇ／ｍｌノＦＩＴＣのジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液１５ μｉを含む０．２
Ｍ ＮａＣＯ３緩衝液（ｐＨ９，３）５０μｌ中で、
２５℃、１晩暗室で保温する。
Ｆ’ＩＴＣ標識されたＤＮＡは上記に記述したＨＰＬＣ
で精製する。
で精製する。
得られた物質はリンカ−によって結ばれた螢光物質を持
つプライマーである。
つプライマーである。
（発明の効果）
本発明における標識された核酸フラグメントを使用すれ
ば、ＤＮＡの塩基配例の分析において。
ば、ＤＮＡの塩基配例の分析において。
ポリアクリルアミドゲルのル−ンで、正確にフラグメン
トを分離できるし、各々の核酸塩基ユニットは、それぞ
れが持つ特異的な螢光９発光又は着色によって確認され
る。また９本発明は、天然のＤＮＡ及びＲＮＡでも化学
合成されたＤＮＡ及び几ＮＡと同じように標識できる能
力を供与する発明でもある。
トを分離できるし、各々の核酸塩基ユニットは、それぞ
れが持つ特異的な螢光９発光又は着色によって確認され
る。また９本発明は、天然のＤＮＡ及びＲＮＡでも化学
合成されたＤＮＡ及び几ＮＡと同じように標識できる能
力を供与する発明でもある。
さらに本発明は、入間のＤＮＡやＲＮＡ、そして病原性
微生物を検出するプローブのような臨床診断用手法にも
非ラジオアイソトープ標識を導入できるものである。
微生物を検出するプローブのような臨床診断用手法にも
非ラジオアイソトープ標識を導入できるものである。
第１図は、螢光性物質ＦＩＴＣを例にして本発明におけ
る標識された核酸フラグメントを得る過程を示す説明図
であり、第２図は９本発明における核酸フラグメントを
用いて、ＤＮＡの塩基配列をル−ンのポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分析した結果の１例を表わすデータ図
である。 〆＝１５１、 代理人 弁理士 若 林 邦 彦り１−１．。 ＄ １ 図
る標識された核酸フラグメントを得る過程を示す説明図
であり、第２図は９本発明における核酸フラグメントを
用いて、ＤＮＡの塩基配列をル−ンのポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動で分析した結果の１例を表わすデータ図
である。 〆＝１５１、 代理人 弁理士 若 林 邦 彦り１−１．。 ＄ １ 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、５′末端をもつ核酸セグメントと、最初の末端と最
後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上のメチレ
ン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′末端に結
合しているリンカーと、そのリンカーの最後の末端に結
合した螢光物質、発光物質又は着色物質の３者の組み合
わせからなることを特徴とする標識された核酸フラグメ
ント。 ２、５′末端をもつ核酸セグメントと、最初の末端と最
後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上のメチレ
ン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′末端に結
合しているリンカーと、そのリンカーの最後の末端に結
合した螢光物質の３者の組み合わせからなることを特徴
とする標識された核酸フラグメント。 ３、螢光物質の化学的性状の違いによるポリアクリルア
ミドゲル電気泳動の易動度の変化を、リンカーのメチレ
ン基の数によつて調整してなる請求項２記載の標識され
た核酸フラグメント。 ４、螢光物質が４種の違つた波長で螢光を発するように
あらかじめ選択されている請求項２又は３記載の標識さ
れた核酸フラグメント。 ５、核酸セグメントが天然のＤＮＡである請求項２、３
又は４記載の標識された核酸フラグメント。 ６、核酸セグメントが化学合成されたＤＮＡである請求
項２、３又は４記載の標識された核酸フラグメント。 ７、核酸セグメントが天然のＲＮＡである請求項２、３
又は４記載の標識された核酸フラグメント。 ８、核酸セグメントが化学合成されたＲＮＡである請求
項２、３又は４記載の標識された核酸フラグメント。 ９、５′末端をもつ核酸セグメントと、最初の末端と最
後の末端にアミメ基をもちその中間に１つ以上のメチレ
ン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′末端に結
合しているリンカーと、そのリンカーの最後の末端に結
合した発光物質の３者の組み合わせからなることを特徴
とする標識された核酸フラグメント。 １０、発光物質の化学的性状の違いによるポリアクリル
アミドゲル電気泳動の易動度の変化をリンカーのメチレ
ン基の数によつて調整してなる請求項９記載の標識され
た核酸フラグメント。 １１、発光物質が４種の違つた波長の発光をするように
あらかじめ選択されている請求項９又は１０記載の標識
された核酸フラグメント。 １２、核酸セグメントが天然のＤＮＡである請求項９、
１０又は１１記載の標識された核酸フラグメント。 １３、核酸セグメントが化学合成されたＤＮＡである請
求項９、１０又は１１記載の標識された核酸フラグメン
ト。 １４、核酸セグメントが天然のＲＮＡである請求項９、
１０又は１１記載の標識された核酸フラグメント。 １５、核酸セグメントが化学合成されたＲＮＡである請
求項９、１０又は１１記載の標識された核酸フラグメン
ト。 １６、５′末端をもつ核酸セグメントと、最初の末端と
最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上のメチ
レン基をもち最初の末端がＤＮＡセグメントの５′末端
に結合しているリンカーと、そのリンカーの最後の末端
に結合した色素物質の３者の組み合わせからなることを
特徴とする標識された核酸フラグメント。 １７、色素物質の化学的性状の違いによるポリアクリル
アミドゲル電気泳動の易動度の変化を、リンカーのメチ
レン基の数によつて調整してなる請求項１６記載の標識
された核酸フラグメント。 １８、色素物質が４種の違つた波長の発色をするように
あらかじめ選択されている請求項１６又は１７項記載の
標識された核酸フラグメント。 １９、核酸セグメントが天然のＤＮＡである請求項１６
、１７又は１８記載の標識された核酸フラグメント。 ２０、核酸セグメントが化学合成されたＤＮＡである請
求項１６、１７又は１８記載の標識された核酸フラグメ
ント。 ２１、核酸セグメントが天然のＲＮＡである請求項１６
、１７又は１８記載の標識された核酸フラグメント。 ２２、核酸セグメントが化学合成されたＲＮＡである請
求項１６、１７又は１８記載の標識された核酸フラグメ
ント。 ２３、請求項１に記載される標識された核酸フラグメン
トをＤＮＡプライマーとすることを特徴とするＤＮＡの
塩基配列の分析方法。 ２４、請求項２に記載される標識された核酸フラグメン
トをＤＮＡプライマーとすることを特徴とするＤＮＡの
塩基配列の分析方法。 ２５、請求項９に記載される標識された核酸フラグメン
トをＤＮＡプライマーとすることを特徴とするＤＮＡの
塩基配列の分析方法。 ２６、請求項１６に記載される標識された核酸フラグメ
ントをＤＮＡプライマーとすることを特徴とするＤＮＡ
の塩基配列の分析方法。
Priority Applications (1)
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| JP63297078A JP2536105B2 (ja) | 1988-11-24 | 1988-11-24 | 標識された核酸フラグメント |
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| JPH02142500A true JPH02142500A (ja) | 1990-05-31 |
| JP2536105B2 JP2536105B2 (ja) | 1996-09-18 |
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1988
- 1988-11-24 JP JP63297078A patent/JP2536105B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP2536105B2 (ja) | 1996-09-18 |
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