JP2536105B2 - 標識された核酸フラグメント - Google Patents
標識された核酸フラグメントInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，遺伝子工学と遺伝子組換え技術に関する。
特に，核酸の塩基配列の分析に用いられる，螢光性，発
光性，または色素性標識体で，生物活性のある核酸セグ
メントを標識あるいはラベルして得られる核酸フラグメ
ントに関する。
特に，核酸の塩基配列の分析に用いられる，螢光性，発
光性，または色素性標識体で，生物活性のある核酸セグ
メントを標識あるいはラベルして得られる核酸フラグメ
ントに関する。
（従来の技術） 遺伝子工学の歴史は,1973年に始まつたと一般的に考
えられている。遺伝子の分析方法の改良は，遺伝子を構
成するデオキシリボ核酸（DNA）の発生，複製，発現に
おける予想もしなかつた複雑性と細かい区別立てを解明
することに役だつた。在来概念の修正は，遺伝子を解剖
し，クローニングし，そして増幅するための分子生物学
的な道具の使用に依存してきた。
えられている。遺伝子の分析方法の改良は，遺伝子を構
成するデオキシリボ核酸（DNA）の発生，複製，発現に
おける予想もしなかつた複雑性と細かい区別立てを解明
することに役だつた。在来概念の修正は，遺伝子を解剖
し，クローニングし，そして増幅するための分子生物学
的な道具の使用に依存してきた。
DNAの塩基配列を決定できるということは，基礎研究
あるいは，現在の臨床医学にとつて，もつとも基本的で
重要な技術の一つである。DNAの塩基配列を決める一般
的な方法は，試験管内（in vitro）で32Pなどの半減期
の短い，生物にとつて危険のあるアイソトープを用い
て,DNA断片の長さと内容を決定するものである。しかし
ながら，決定する過程は労力を要し，時間がかかる。
あるいは，現在の臨床医学にとつて，もつとも基本的で
重要な技術の一つである。DNAの塩基配列を決める一般
的な方法は，試験管内（in vitro）で32Pなどの半減期
の短い，生物にとつて危険のあるアイソトープを用い
て,DNA断片の長さと内容を決定するものである。しかし
ながら，決定する過程は労力を要し，時間がかかる。
配列解析をするための化学的方法は,DNA断片の末端塩
基を標識し，そして塩基に特異的な加水分解を行なう。
一方，酵素的複製法は，解析をする遺伝子のクローニン
グと，一本鎖DNAフアージにその遺伝子を付加する方法
である。プライマーDNAはクローン化された遺伝子に隣
接するDNA部分の配列に相補的な塩基配列をもち，この
クローン化された遺伝子のDNAを複製し始めるために用
いられる。この複製には，前駆体（プレカーサー）とし
ての４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP,d
CTP,dGTP及びdTTP）と，鎖合成終息因子（チエーンター
ミネーター）として４種のジデオキシリボヌクレオシド
三リン酸（ddATP,ddCTP,ddGTP及びddTTP）が必要であ
る。DNAを複写するために,4本の試験管にそれぞれ４種
すべてのプレカーサーと,4種のチエーンターミネーター
の１種だけを含む反応液をつくる。ジデオキシリボヌク
レオシド三リン酸が複写されたDNAに入つた時に，その
後のDNA合成はただちに終了し，チエーンターミネーシ
ヨンが起こる。ddATPがチエーンターミネーターであれ
ば，すべてのDNAは通常には,dATPが入る場所で複製が終
了する。ジデオキシリボヌクレオシドリン酸は複写され
たDNAのどこにでも入るので，ジデオキシリボヌクレオ
シドリン酸を末端にもついろいろな長さのDNAが生成す
る。このようにして生成したDNAは，ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により，そのDNAの長さ，すなわち塩
基の数に従つて分離される。ゲル中のDNAを検出するた
めに，ラジオアイソトープで例えば32Pで標識されたデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸を，複写されたDNAに
取り込ませる。ラジオアイソトープで標識されたDNAは
ゲルで分離されて,X線フイルム上に露光することにより
目に見えるようになる。複製されたDNAの塩基配列は，
ゲルのオートラジオグラフイーから読み取れる。
基を標識し，そして塩基に特異的な加水分解を行なう。
一方，酵素的複製法は，解析をする遺伝子のクローニン
グと，一本鎖DNAフアージにその遺伝子を付加する方法
である。プライマーDNAはクローン化された遺伝子に隣
接するDNA部分の配列に相補的な塩基配列をもち，この
クローン化された遺伝子のDNAを複製し始めるために用
いられる。この複製には，前駆体（プレカーサー）とし
ての４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP,d
CTP,dGTP及びdTTP）と，鎖合成終息因子（チエーンター
ミネーター）として４種のジデオキシリボヌクレオシド
三リン酸（ddATP,ddCTP,ddGTP及びddTTP）が必要であ
る。DNAを複写するために,4本の試験管にそれぞれ４種
すべてのプレカーサーと,4種のチエーンターミネーター
の１種だけを含む反応液をつくる。ジデオキシリボヌク
レオシド三リン酸が複写されたDNAに入つた時に，その
後のDNA合成はただちに終了し，チエーンターミネーシ
ヨンが起こる。ddATPがチエーンターミネーターであれ
ば，すべてのDNAは通常には,dATPが入る場所で複製が終
了する。ジデオキシリボヌクレオシドリン酸は複写され
たDNAのどこにでも入るので，ジデオキシリボヌクレオ
シドリン酸を末端にもついろいろな長さのDNAが生成す
る。このようにして生成したDNAは，ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法により，そのDNAの長さ，すなわち塩
基の数に従つて分離される。ゲル中のDNAを検出するた
めに，ラジオアイソトープで例えば32Pで標識されたデ
オキシリボヌクレオシド三リン酸を，複写されたDNAに
取り込ませる。ラジオアイソトープで標識されたDNAは
ゲルで分離されて,X線フイルム上に露光することにより
目に見えるようになる。複製されたDNAの塩基配列は，
ゲルのオートラジオグラフイーから読み取れる。
他の研究者は，ラジオアイソトープを他の標識，例え
ば螢光あるいは発光に置換することを試みた。F.サンガ
ー法は，ラジオアイソトープ標識の代わりに一色の螢光
色素で標識したプライマーを用いて行なわれている。こ
の塩基配列決定法は，ポリアクリルアミドゲルの４本の
レーンが必要である。４本のレーンの各々は，それぞれ
４種の核酸塩基を決定する。しかしながら４本のレーン
を用いるポリアクリルアミドゲルは，いわゆるスマイル
効果（smile effect）を生じることがある。これは両側
のレーンの核酸フラグメントの易動度が低いことによ
り，レーン間であいまいさが生じることを言う。通常レ
ーンの間隔は１ヌクレオチドの重量の違いによつて少な
くとも１ユニツト以上離されるべきである。このスマイ
ル効果は，各々のレーンにみられる核酸塩基のはしごか
ら読み取つてDNAの塩基配列を決定するのにあいまいさ
を残す。
ば螢光あるいは発光に置換することを試みた。F.サンガ
ー法は，ラジオアイソトープ標識の代わりに一色の螢光
色素で標識したプライマーを用いて行なわれている。こ
の塩基配列決定法は，ポリアクリルアミドゲルの４本の
レーンが必要である。４本のレーンの各々は，それぞれ
４種の核酸塩基を決定する。しかしながら４本のレーン
を用いるポリアクリルアミドゲルは，いわゆるスマイル
効果（smile effect）を生じることがある。これは両側
のレーンの核酸フラグメントの易動度が低いことによ
り，レーン間であいまいさが生じることを言う。通常レ
ーンの間隔は１ヌクレオチドの重量の違いによつて少な
くとも１ユニツト以上離されるべきである。このスマイ
ル効果は，各々のレーンにみられる核酸塩基のはしごか
ら読み取つてDNAの塩基配列を決定するのにあいまいさ
を残す。
理想的な方法は，ひとつのレーンを使用する方法であ
る。この方法はスマイル効果を除外できる。しかしなが
ら,4種類の核酸塩基のうち各々の核酸塩基でターミネー
トされたフラグメント例えばチミン（Ｔ）またはウラシ
ル（Ｕ）とシトシン（Ｃ），アデニン（Ａ），グアニン
（Ｇ）の違いを認識しなければならない。それぞれの核
酸塩基に特異的な螢光を使用することにより，この問題
は解決できる。このような，方法としてスミス，フアン
グらによつて開発された方法がある。この方法は４種類
の異なつた化学物質で螢光標識されたDNAプライマーを
使用している。しかしながら，これらの化学物質の化学
特性はポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるプライ
マーの易動度（モビリテイー）を各々変化させるもので
ある。この易動度の違いは，電気泳動後に分離されたパ
ターンを読む際にはつきりとわかるくらいのものであ
る。つまり,DNA塩基配列の決定の精度は劣ることにな
る。
る。この方法はスマイル効果を除外できる。しかしなが
ら,4種類の核酸塩基のうち各々の核酸塩基でターミネー
トされたフラグメント例えばチミン（Ｔ）またはウラシ
ル（Ｕ）とシトシン（Ｃ），アデニン（Ａ），グアニン
（Ｇ）の違いを認識しなければならない。それぞれの核
酸塩基に特異的な螢光を使用することにより，この問題
は解決できる。このような，方法としてスミス，フアン
グらによつて開発された方法がある。この方法は４種類
の異なつた化学物質で螢光標識されたDNAプライマーを
使用している。しかしながら，これらの化学物質の化学
特性はポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるプライ
マーの易動度（モビリテイー）を各々変化させるもので
ある。この易動度の違いは，電気泳動後に分離されたパ
ターンを読む際にはつきりとわかるくらいのものであ
る。つまり,DNA塩基配列の決定の精度は劣ることにな
る。
したがつて，単純化された自動DNA塩基配列決定を正
確に行なうために標識物質の化学的特性を補償してポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で一列の泳動レーンのみを
使用する方法が望まれていた。
確に行なうために標識物質の化学的特性を補償してポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で一列の泳動レーンのみを
使用する方法が望まれていた。
この方法はまた，化学合成DNAプライマーだけでなく
自然界で得られるDNAプライマーをも標識できるような
ものでなければならない。
自然界で得られるDNAプライマーをも標識できるような
ものでなければならない。
本発明は，これらの課題を解決するものである。
（課題を解決するための手段） 本発明は,5′末端をもつ核酸セグメントと，最初の末
端と最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上の
メチレン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′末
端に結合しているリンカーと，そのリンカーの最後の末
端に結合した螢光物質，発光物質又は着色物質の３者の
組み合わせからなることを特徴とする標識された核酸フ
ラグメントに関する。
端と最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上の
メチレン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′末
端に結合しているリンカーと，そのリンカーの最後の末
端に結合した螢光物質，発光物質又は着色物質の３者の
組み合わせからなることを特徴とする標識された核酸フ
ラグメントに関する。
５′末端をもつ核酸セグメントとは,DNA合成における
DNAプライマーとされるものであり，オリゴヌクレオチ
ド，ヌクレオチド，天然のDNA化学合成されたDNA,天然
のRNA,化学合成されたRNAなどを意味する。
DNAプライマーとされるものであり，オリゴヌクレオチ
ド，ヌクレオチド，天然のDNA化学合成されたDNA,天然
のRNA,化学合成されたRNAなどを意味する。
核酸セグメントの５′末端に結合するリンカーは，両
端にアミノ基を持ち，その間にいくつかのメチレン基
〔（CH2）n,nは自然数を表す〕をもつものである。メチ
レン基の数は，標識物質として使用される螢光，発光又
は色素物質の化学的な性質による差によつておこる，ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動における易動度の違いを
補償するために調整される。メチレン基４残基分が核酸
フラグメントの易動度を１核酸塩基分の泳動距離だけ下
げることが実験的に確認された。したがつて，電気泳動
によるポリアクリルアミドゲルのレーンで標識された核
酸フラグメントの易動度は１メチレン残基あたり1/4核
酸塩基分だけ正確に調節される。リンカーとして使用さ
れるジアミノアルカン（NH2（CH2）nNH2）は、ｎが２か
ら12までの範囲を持つものが市販されている。この範囲
は，螢光物質，発光物質又は色素物質によつて標識され
た核酸フラグメントの易動度を調節するのに十分であ
る。ジアミノアルカンとしては，例えば,1,2−ジアミノ
エタン,1,6−ジアミノヘキサン,1,10−ジアミノデカン
等を挙げることができる。
端にアミノ基を持ち，その間にいくつかのメチレン基
〔（CH2）n,nは自然数を表す〕をもつものである。メチ
レン基の数は，標識物質として使用される螢光，発光又
は色素物質の化学的な性質による差によつておこる，ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動における易動度の違いを
補償するために調整される。メチレン基４残基分が核酸
フラグメントの易動度を１核酸塩基分の泳動距離だけ下
げることが実験的に確認された。したがつて，電気泳動
によるポリアクリルアミドゲルのレーンで標識された核
酸フラグメントの易動度は１メチレン残基あたり1/4核
酸塩基分だけ正確に調節される。リンカーとして使用さ
れるジアミノアルカン（NH2（CH2）nNH2）は、ｎが２か
ら12までの範囲を持つものが市販されている。この範囲
は，螢光物質，発光物質又は色素物質によつて標識され
た核酸フラグメントの易動度を調節するのに十分であ
る。ジアミノアルカンとしては，例えば,1,2−ジアミノ
エタン,1,6−ジアミノヘキサン,1,10−ジアミノデカン
等を挙げることができる。
本発明では，メチレン基単位の数（ｎ）をあらかじめ
決めておいたリンカーを５′末端に結合させた核酸セグ
メント（アミノアルキルフオスフオラミド誘導体）を，
螢光物質，発光物質又は色素物質で標識する。
決めておいたリンカーを５′末端に結合させた核酸セグ
メント（アミノアルキルフオスフオラミド誘導体）を，
螢光物質，発光物質又は色素物質で標識する。
用いる標識物質のイオン化度，分子量，形状などの要
因で易動度は異なるので，それらに応じてメチレン基の
数（ｎ）が決まる。例えば，もし４種類の螢光標識を用
いるのであれば４種類の螢光物質各々の化学特性はそれ
ぞれ異なるので，各々の螢光物質で標識された核酸フラ
グメントの易動度も多様化してしまう。螢光標識された
核酸フラグメントの易動度は，リンカーのメチレン基の
数を変化させることにより調節でき,4つのメチレン基を
リンカーに付加することにより，同じ螢光物質を使用し
た場合，約１塩基分の距離だけ易動度を遅くすることが
できる。従つて,4種類の核酸フラグメントの易動度を同
一にすることができる。このようにしてできた，標識物
質と易動度を調節した核酸フラグメントは，ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により，同一のレーンを使用し
て実際の塩基配列決定する場合に有効に使用できる。な
お，この方法による易動度の調節は，発光物質または色
素物質で標識された核酸フラグメントにも使用できる。
因で易動度は異なるので，それらに応じてメチレン基の
数（ｎ）が決まる。例えば，もし４種類の螢光標識を用
いるのであれば４種類の螢光物質各々の化学特性はそれ
ぞれ異なるので，各々の螢光物質で標識された核酸フラ
グメントの易動度も多様化してしまう。螢光標識された
核酸フラグメントの易動度は，リンカーのメチレン基の
数を変化させることにより調節でき,4つのメチレン基を
リンカーに付加することにより，同じ螢光物質を使用し
た場合，約１塩基分の距離だけ易動度を遅くすることが
できる。従つて,4種類の核酸フラグメントの易動度を同
一にすることができる。このようにしてできた，標識物
質と易動度を調節した核酸フラグメントは，ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法により，同一のレーンを使用し
て実際の塩基配列決定する場合に有効に使用できる。な
お，この方法による易動度の調節は，発光物質または色
素物質で標識された核酸フラグメントにも使用できる。
本発明に使用しうる標識物質の好ましい１例として，
例えば以下に示すような４種の螢光物質が挙げられる。
例えば以下に示すような４種の螢光物質が挙げられる。
フルオレセインイソチオシアネート（FITC,515nmに最
大発光を持つ，緑色），４−フルオロ−７−ニトロベ
ンゾ−フラザン（NBD−F,540nmに最大発光を持つ，黄緑
色），テトラメチルローダミンイソチオシアネート
（TRITC,573nmに最大発光を持つ，オレンジ色），テ
トラメチルイソチオシアネート,601nmに最大発光を持
つ，赤色） これらの標識物質は，リンカーを介して核酸セグメン
トに付加する。
大発光を持つ，緑色），４−フルオロ−７−ニトロベ
ンゾ−フラザン（NBD−F,540nmに最大発光を持つ，黄緑
色），テトラメチルローダミンイソチオシアネート
（TRITC,573nmに最大発光を持つ，オレンジ色），テ
トラメチルイソチオシアネート,601nmに最大発光を持
つ，赤色） これらの標識物質は，リンカーを介して核酸セグメン
トに付加する。
本発明における標識された核酸フラグメントの合成
は，例えば図１に示した工程で行なうことができる。な
お，図１において,B1,B2及びB3は，ヌクレオチドの塩基
を表わす。
は，例えば図１に示した工程で行なうことができる。な
お，図１において,B1,B2及びB3は，ヌクレオチドの塩基
を表わす。
本発明によつて合成される，標識された核酸フラグメ
ントは，標識されたDNAプライマーとして，例えば以下
に示すようなDNAの塩基配列の分析に使用される。
ントは，標識されたDNAプライマーとして，例えば以下
に示すようなDNAの塩基配列の分析に使用される。
DNA合成のために,4種類の反応液を用意する。各反応
液には,4種のデオキシヌクレオチド（dATP,dGTP,dCTP及
びdTTPの他に，それぞれ本発明により得られる１種類の
螢光物質（例えば,XRITC,赤色）で標識されたプライマ
ーと１種類のジデオキシヌクレオチド（例えば,ddATP）
を含むようにする。すると,DNA合成反応後には，ジオキ
シアデノシン（ddA）で反応終了したいろいろな長さのD
NA分子が生成する。同様にしてddCで終了したDNAはオレ
ンジ色のTRITC,ddGで終了したDNAは黄緑色のNBD−F,ddT
で終了したDNAは緑色のFITCでそれぞれ標識されてい
る。得られたいろいらの長さのDNA分子から塩基配列を
分析する場合ラジオアイソトープで標識する方法はポリ
アクリルアミドゲルで４つのレーンを使用しなければな
らないが，この新しい方法は１つのレーンで良い。すな
わち,4種類の反応液すべてを１本のチユーブにまとめて
電気泳動する。螢光で標識されたDNAは，その長さで分
離され，各々のバンドはゲル中で見える。レーザー光あ
るいは可視光は，ゲルをスキヤンするのと，螢光を励起
させ，その物質特有の色を発するために用いられる。第
２図は，上述のような螢光色と核酸塩基との関係で,1つ
のレーンからDNAの塩基配列が直接読み取れる様子を示
している。
液には,4種のデオキシヌクレオチド（dATP,dGTP,dCTP及
びdTTPの他に，それぞれ本発明により得られる１種類の
螢光物質（例えば,XRITC,赤色）で標識されたプライマ
ーと１種類のジデオキシヌクレオチド（例えば,ddATP）
を含むようにする。すると,DNA合成反応後には，ジオキ
シアデノシン（ddA）で反応終了したいろいろな長さのD
NA分子が生成する。同様にしてddCで終了したDNAはオレ
ンジ色のTRITC,ddGで終了したDNAは黄緑色のNBD−F,ddT
で終了したDNAは緑色のFITCでそれぞれ標識されてい
る。得られたいろいらの長さのDNA分子から塩基配列を
分析する場合ラジオアイソトープで標識する方法はポリ
アクリルアミドゲルで４つのレーンを使用しなければな
らないが，この新しい方法は１つのレーンで良い。すな
わち,4種類の反応液すべてを１本のチユーブにまとめて
電気泳動する。螢光で標識されたDNAは，その長さで分
離され，各々のバンドはゲル中で見える。レーザー光あ
るいは可視光は，ゲルをスキヤンするのと，螢光を励起
させ，その物質特有の色を発するために用いられる。第
２図は，上述のような螢光色と核酸塩基との関係で,1つ
のレーンからDNAの塩基配列が直接読み取れる様子を示
している。
各々のバンドからの発光は写真撮影でも検出できる
し，自動塩基配列決定装置中の光感性検出器によつても
認識される。
し，自動塩基配列決定装置中の光感性検出器によつても
認識される。
この方法は天然あるいは合成した核酸フラグメントに
使用できるため，あらかじめ選択した遺伝子の一般的な
標識方法として用いることが可能である。
使用できるため，あらかじめ選択した遺伝子の一般的な
標識方法として用いることが可能である。
さらに，この標識はサザン・ブロツテイング法とノー
ザン・ブロツテイング法を用いて臨床検査にも応用でき
る。この標識法は，ある特定のDNAを検出するためのDNA
プローブにも使える。病原体は，そのリボソームRNAに
対する標識プローブを用いることによつて検出できる。
ザン・ブロツテイング法を用いて臨床検査にも応用でき
る。この標識法は，ある特定のDNAを検出するためのDNA
プローブにも使える。病原体は，そのリボソームRNAに
対する標識プローブを用いることによつて検出できる。
上記は本発明の望ましい一つの具体例である。この技
術にみられる方法は本発明の範囲内でいろいろな汎用性
があろうし，応用もされるであろう。
術にみられる方法は本発明の範囲内でいろいろな汎用性
があろうし，応用もされるであろう。
（実施例） 本発明の実施例を以下に示すが，本発明はこれに限定
されるものではない。
されるものではない。
オリゴヌクレオチドとしては，自動DNA合成装置（Sys
terモデル1540A）による固相CED−フオスフオラミド法
によつて合成した15マー（15−mers）を使用した。
terモデル1540A）による固相CED−フオスフオラミド法
によつて合成した15マー（15−mers）を使用した。
合成した15マーのオリゴヌクレオチドのリン酸化は,5
0mMのトリス−HCl（pH7.6）,10mMのMgCl2,10mMのジチオ
スレイトール,3mMのATP,T4−ヌクレオチドカイネースを
ふくむ100μの反応液中で37℃,1時間行なつた。リン
酸化されたオリゴヌクレオチドは，ゲルロ過用カラム
（東ソー（株）製TSK 2000 SW）を使用して，高速液
体クロマトグラフイー（HPLC）で精製した。オリゴヌク
レオチドのピークを集め凍結乾燥により溶媒の酢酸アン
モニウムを除いた。
0mMのトリス−HCl（pH7.6）,10mMのMgCl2,10mMのジチオ
スレイトール,3mMのATP,T4−ヌクレオチドカイネースを
ふくむ100μの反応液中で37℃,1時間行なつた。リン
酸化されたオリゴヌクレオチドは，ゲルロ過用カラム
（東ソー（株）製TSK 2000 SW）を使用して，高速液
体クロマトグラフイー（HPLC）で精製した。オリゴヌク
レオチドのピークを集め凍結乾燥により溶媒の酢酸アン
モニウムを除いた。
得られたオリゴヌクレオチドを250mMの1,2−ジアミノ
エタン（pH6.0）,200mMのエチル−３（３−ジエチル−
アミノ−プロピル）カルボジイミド（EDAC）,100mMのＮ
−methylimidazole（pH6.0）の反応液100μ中で25℃,
1晩保温して，リンカーを結合させた。
エタン（pH6.0）,200mMのエチル−３（３−ジエチル−
アミノ−プロピル）カルボジイミド（EDAC）,100mMのＮ
−methylimidazole（pH6.0）の反応液100μ中で25℃,
1晩保温して，リンカーを結合させた。
続いて，リンカーに螢光物質を標識するために，フル
オレセインイソチオシアネート（FITC）を第１図に示し
たように,DNAのアミノアルキルフオスフオラミデート誘
導体を2mg/mlのFITCのジメチルホルムアミド（DMF）溶
液15μを含む0.2M NaCO3緩衝液（pH9.3）50μ中で,
25℃,1晩暗室で保温する。FITC標識されたDNAは上記に
記述したHPLCで精製する。
オレセインイソチオシアネート（FITC）を第１図に示し
たように,DNAのアミノアルキルフオスフオラミデート誘
導体を2mg/mlのFITCのジメチルホルムアミド（DMF）溶
液15μを含む0.2M NaCO3緩衝液（pH9.3）50μ中で,
25℃,1晩暗室で保温する。FITC標識されたDNAは上記に
記述したHPLCで精製する。
得られた物質はリンカーによつて結ばれた螢光物質を
持つプライマーである。
持つプライマーである。
（発明の効果） 本発明における標識された核酸フラグメントを使用す
れば,DNAの塩基配例の分析において，ポリアクリルアミ
ドゲルの１レーンで，正確にフラグメントを分離できる
し，各々の核酸塩基ユニツトは，それぞれが持つ特異的
な螢光，発光又は着色によつて確認される。また，本発
明は，天然のDNA及びRNAでも化学合成されたDNA及びRNA
と同じように標識できる能力を供与する発明でもある。
れば,DNAの塩基配例の分析において，ポリアクリルアミ
ドゲルの１レーンで，正確にフラグメントを分離できる
し，各々の核酸塩基ユニツトは，それぞれが持つ特異的
な螢光，発光又は着色によつて確認される。また，本発
明は，天然のDNA及びRNAでも化学合成されたDNA及びRNA
と同じように標識できる能力を供与する発明でもある。
さらに本発明は，人間のDNAやRNA,そして病原性微生
物を検出するプローブのような臨床診断用手法にも非ラ
ジオアイソトープ標識を導入できるものである。
物を検出するプローブのような臨床診断用手法にも非ラ
ジオアイソトープ標識を導入できるものである。
【図面の簡単な説明】 第１図は，螢光性物質FITCを例にして本発明における標
識された核酸フラグメントを得る過程を示す説明図であ
り，第２図は，本発明における核酸フラグメントを用い
て,DNAの塩基配列を１レーンのポリアクリルアミドゲル
電気泳動で分析した結果の１例を表わすデータ図であ
る。
識された核酸フラグメントを得る過程を示す説明図であ
り，第２図は，本発明における核酸フラグメントを用い
て,DNAの塩基配列を１レーンのポリアクリルアミドゲル
電気泳動で分析した結果の１例を表わすデータ図であ
る。
Claims (26)
- 【請求項１】５′末端をもつ核酸セグメントと，最初の
末端と最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上
のメチレン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′
末端に結合しているリンカーと，そのリンカーの最後の
末端に結合した螢光物質，発光物質又は着色物質の３者
の組み合わせからなることを特徴とする標識された核酸
フラグメント。 - 【請求項２】５′末端をもつ核酸セグメントと，最初の
末端と最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以上
のメチレン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′
末端に結合しているリンカーと，そのリンカーの最後の
末端に結合した螢光物質の３者の組み合わせからなるこ
とを特徴とする標識された核酸フラグメント。 - 【請求項３】螢光物質の化学的性状の違いによるポリア
クリルアミドゲル電気泳動の易動度の変化を，リンカー
のメチレン基の数によつて調整してなる請求項２記載の
標識された核酸フラグメント。 - 【請求項４】螢光物質が４種の違つた波長で螢光を発す
るようにあらかじめ選択されている請求項２又は３記載
の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項５】核酸セグメントが天然のDNAである請求項
2,3又は４記載の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項６】核酸セグメントが化学合成されたDNAであ
る請求項2,3又は４記載の標識された核酸フラグメン
ト。 - 【請求項７】核酸セグメントが天然のRNAである請求項
2,3又は４記載の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項８】核酸セグメントが化学合成されたRNAであ
る請求項2,3又は４記載の標識された核酸フラグメン
ト。 - 【請求項９】５′末端をもつ核酸セグメントと，最初の
末端と最後の末端にアミメ基をもちその中間に１つ以上
のメチレン基をもち最初の末端が核酸セグメントの５′
末端に結合しているリンカーと，そのリンカーの最後の
末端に結合した発光物質の３者の組み合わせからなるこ
とを特徴とする標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１０】発光物質の化学的性状の違いによるポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の易動度の変化をリンカー
のメチレン基の数によつて調整してなる請求項９記載の
標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１１】発光物質が４種の違つた波長の発光をす
るようにあらかじめ選択されている請求項９又は10記載
の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１２】核酸セグメントが天然のDNAである請求
項9,10又は11記載の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１３】核酸セグメントが化学合成されたDNAで
ある請求項9,10又は11記載の標識された核酸フラグメン
ト。 - 【請求項１４】核酸セグメントが天然のRNAである請求
項9,10又は11記載の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１５】核酸セグメントが化学合成されたRNAで
ある請求項9,10又は11記載の標識された核酸フラグメン
ト。 - 【請求項１６】５′末端をもつ核酸セグメントと，最初
の末端と最後の末端にアミノ基をもちその中間に１つ以
上のメチレン基をもち最初の末端がDNAセグメントの
５′末端に結合しているリンカーと，そのリンカーの最
後の末端に結合した色素物質の３者の組み合わせからな
ることを特徴とする標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１７】色素物質の化学的性状の違いによるポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の易動度の変化を，リンカ
ーのメチレン基の数によつて調整してなる請求項16記載
の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１８】色素物質が４種の違つた波長の発色をす
るようにあらかじめ選択されている請求項16又は17項記
載の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項１９】核酸セグメントが天然のDNAである請求
項16,17又は18記載の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項２０】核酸セグメントが化学合成されたDNAで
ある請求項16,17又は18記載の標識された核酸フラグメ
ント。 - 【請求項２１】核酸セグメントが天然のRNAである請求
項16,17又は18記載の標識された核酸フラグメント。 - 【請求項２２】核酸セグメントが化学合成されたRNAで
ある請求項16,17又は18記載の標識された核酸フラグメ
ント。 - 【請求項２３】請求項１に記載される標識された核酸フ
ラグメントをDNAプライマーとすることを特徴とするDNA
の塩基配列の分析方法。 - 【請求項２４】請求項２に記載される標識された核酸フ
ラグメントをDNAプライマーとすることを特徴とするDNA
の塩基配列の分析方法。 - 【請求項２５】請求項９に記載される標識された核酸フ
ラグメントをDNAプライマーとすることを特徴とするDNA
の塩基配列の分析方法。 - 【請求項２６】請求項16に記載される標識された核酸フ
ラグメントをDNAプライマーとすることを特徴とするDNA
の塩基配列の分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63297078A JP2536105B2 (ja) | 1988-11-24 | 1988-11-24 | 標識された核酸フラグメント |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63297078A JP2536105B2 (ja) | 1988-11-24 | 1988-11-24 | 標識された核酸フラグメント |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02142500A JPH02142500A (ja) | 1990-05-31 |
| JP2536105B2 true JP2536105B2 (ja) | 1996-09-18 |
Family
ID=17841922
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63297078A Expired - Fee Related JP2536105B2 (ja) | 1988-11-24 | 1988-11-24 | 標識された核酸フラグメント |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2536105B2 (ja) |
-
1988
- 1988-11-24 JP JP63297078A patent/JP2536105B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02142500A (ja) | 1990-05-31 |
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|---|---|---|---|
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