JP2001514859A

JP2001514859A - クエンチ可能な蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドプローブおよびその使用方法

Info

Publication number: JP2001514859A
Application number: JP2000508820A
Authority: JP
Inventors: トーマスホーン，; ハートマットアール．スクローダー，; ブライアンディー．ワーナー，; エレンフィス，; トッドセルズ，; セイ−ジョンロー，
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1997-09-04
Filing date: 1998-09-03
Publication date: 2001-09-18
Also published as: WO1999011813A3; AU9220498A; US20010009760A1; US6465175B2; EP1009852A2; WO1999011813A2

Abstract

(57)【要約】核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて遭遇するバックグラウンドシグナルを減少するための方法、および標識されたオリゴマーとその相補物とのハイブリダイゼーションを含む他のアッセイを提供する。この方法は、クエンチ可能な色素標識されたオリゴマーがハイブリッド複合体を形成する場合に生じるシグナル生成の有意な減少に対して仮定される。さらに、オリゴマープローブにハイブリダイズした増幅マルチマーから発光される検出可能なシグナルを増強するための方法が提供される。このオリゴヌクレオチドには、クエンチ可能な色素からの発光が、ハイブリッド複合体形成の際にクエンチされないように、クエンチ可能な色素がリンカーを介して結合体化されている。オリゴマーを含む、新規なオリゴヌクレオチドプローブもまた、提供される。このオリゴヌクレオチドプローブに対して、クエンチ可能な色素は、直接的または間接的にリンカーを介している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般的に核酸化学およびハイブリダイゼーションアッセイに関する
。より詳細には、本発明は、検出可能な標識を有するオリゴヌクレオチドブロー
ブを使用して、試料中の標的核酸を検出する方法に関する。

【０００２】（背景）核酸は、ヒトの診断的アッセイのための鍵となる分子標的として抗原および抗
体に結合する。特に、種々の最近の技術的性能の発展に起因して、微生物が現在
では臨床的標本中でかつてない低レベルで検出され、かつ定量され得る。

【０００３】種々の概念は、多数の異なるプローブ−標的ハイブリダイゼーション検出系の
基礎を提供してきた。

【０００４】Ｇｌａｚｅｒら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５９：９５９は、高感度のＤＮ
Ａ検出のための、ポリカチオン性リガンドと二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）との蛍
光を挿入した複合体を記載する。蛍光性ホモダイマーがｄｓＤＮＡへ挿入されて
、電気泳動に安定な複合体が形成されるため、最小限のバックグラウンドの干渉
での分離後のＤＮＡの検出および定量を可能にする。

【０００５】Ｔｙａｇｉら（１９９６）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３
０８は、溶液中で光学的にサイレントであるが相補的標的とのハイブリダイゼー
ションの際には蛍光を発するプローブを記載する。プローブはステムループ（ｓ
ｔｅｍ−ａｎｄ−ｌｏｏｐ）構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。こ
のループは、標的に相補的な配列である。ステムの一方のアームは結合された蛍
光部分を有し、そして他方のアームは結合した非蛍光クエンチング部分を有する
。非ハイブリダイズ状態においては、そのステムは、蛍光部分が非蛍光部分によ
ってクエンチされるように、２つの部分が十分密に接近することを保っている。
ハイブリダイゼーションの際には、プローブにおける調和した立体構造の変化は
、アーム配列を離れさせ、そして蛍光部分が検出されるようにする。

【０００６】Ｍｅｒｇｎｙら（１９９４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２．９
２０−９２８は、一本鎖ＤＮＡの一次または二次構造の特徴について、プローブ
への蛍光エネルギーの移動の使用を記載する。標的ＤＮＡの隣接配列にハイブリ
ダイズする２つのプローブは、それぞれドナーおよびアクセプター色素を有する
。２つのプローブの標的へのハイブリダイゼーションは、ドナーとアクセプター
色素との間の蛍光励起エネルギー移動を導く。

【０００７】Ｄａｖｉｓら（１９９６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２４：７０
２−７０６は、フローサイトメトリーにおける１つまたは２つのフルオレセイン
分子を含むＤＮＡ構築物の使用を記載する。フルオレセイン分子は、１８原子の
スペーサーアームを介してＤＮＡプローブの３’末端に結合され、このアームは
フルオレセインがプローブの３’末端に直接結合されたＤＮＡプローブと比較し
て、１０倍の蛍光強度の増加を生じる。

【０００８】さらに、ポリメラーゼ連鎖反応がまず開発されたので、標的増幅の多数の形態
が、検出感度を増強するために導入されてきた。これらの方法は、標的核酸のよ
り多くの量を産生するために使用され得、そしてこれらの方法を使用するアッセ
イは、一般的に従来的な検出スキームを使用する。

【０００９】対照的に、より良好な感度を有する標的核酸の直接分析は、シグナル増幅を使
用して達成された。この方法は、多くの生物およびｍＲＮＡの定量に適用された
。５０ピコモルほどの少ないヒト免疫不全ウイルスゲノムが、ヒト血漿試料にお
いて定量された。この増幅方法において鍵となる分子は、多数の標識されたプロ
ーブの特異的な挿入を可能にする分枝ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）である。

【００１０】２つの型のｂＤＮＡ分子が使用される。第１の型は、ホモ二官能性アミン反応
性架橋剤を介して互いにカップリングした、３つの等価に分布したＮ⁴−[Ｎ−（
６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）]−５−メチル−２’−デオキシシチジン残基を含むオリゴヌクレオチドから、溶液中でアセンブルされるＤＮＡオ
リゴマーからなる大きなネットワークである。このような「増幅マルチマー」（
ＡＭ）ネットワークは、ハイブリダイゼーションプローブ−標的核酸複合体ごと
に、多数のアルカリホスファターゼ標識ＤＮＡプローブの特異的なハイブリダイ
ゼーションを可能にする。これらのＡＭは、顕著なシグナル増幅を与える。マル
チマーのサイズが大きくなるにつれて、シグナル増幅の限界に達し、これはおそ
らく、大きなアルカリホスファターゼ標識プローブへ接近不可能であり得る球状
の架橋構造に埋もれた相補的オリゴヌクレオチド配列の位置に起因した。

【００１１】第２の型のｂＤＮＡは、標識ＤＮＡプローブに相補的な部位を有する複数の第
２の側鎖配列を有する直鎖状の主要なオリゴヌクレオチドを含む「櫛型」分子で
ある。ＡＭを有する場合と同様に、アルカリホスファターゼ標識ＤＮＡプローブ
は、理論的なシグナル増幅と一致しない増幅されたシグナルを提供し、これはお
そらく、立体構造的な考慮に起因する。

【００１２】蛍光標識されたＤＮＡプローブからのシグナルはまた、多重標識したオリゴマ
ーを使用して増幅され得る。しかし、おそらくクエンチング効果に起因して、さ
らなる標識の標識プローブへの組み込みは、直線的な蛍光シグナルの増加を生じ
ない。例えば、プローブあたり２倍の標識数の増加は、シグナルの出力において
は１．２倍の増加を生じるのみである。標識ＤＮＡプローブの骨格としてｂＤＮ
Ａ分子を使用して、蛍光シグナルの増幅を得ることは可能である。しかし、これ
も、蛍光の近接がクエンチングに限定されるシグナル出力を生じ得る。高感度の
蛍光ｂＤＮＡシグナル増幅に基づくアッセイは、クエンチング現象が最小化され
た場合に生じる。

【００１３】（発明の要旨）本発明は、試料中の核酸分析物を検出するための方法およびプローブを提供す
る。一般的に、この方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションアッセイ
、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、リガーゼ連鎖反応アッセイ、競合ハイブリダ
イゼーションアッセイ、鎖置換アッセイなどのような、核酸ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイを表す。特に、本方法は、固体支持体へ分析物を結合させる工程、
分析物と標識する工程、および支持体上での標識の存在を検出する工程を含む、
液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイを表す。好ましい方法は、分
析物−プローブ複合体中で有意により多くの標識の結合を可能にし、アッセイの
感度および特異性を増強する、増幅マルチマーの使用を含む。このプローブは、
直接的に、またはリンカーを介して間接的に結合体化されたオリゴヌクレオチド
配列、溶液中にある場合、検出可能な放射光を放出する色素を含む。相補的なオ
リゴヌクレオチド配列への直接的なオリゴヌクレオチド−色素結合体のハイブリ
ダイゼーションの際には、検出可能な放射光は、実質的にクエンチされる。オリ
ゴヌクレオチド−リンカー−色素結合体からの検出可能なシグナルは、相補的な
オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの際には認め得るほどにはクエ
ンチされない。

【００１４】本発明の第１の局面において、試料中の目的のオリゴヌクレオチドを検出する
ための方法が提供される。本方法は、（ａ）（ｉ）目的のオリゴヌクレオチド中
の核酸配列に相補的な核酸配列、および（ｉｉ）プローブが一本鎖のハイブリダ
イズされていない形態にある場合、検出可能な蛍光シグナルを提供するが、プロ
ーブが相補的核酸鎖にハイブリダイズする場合、蛍光を提供しない標識を含む、
オリゴヌクレオチドプローブを提供する工程、（ｂ）プローブから発光する蛍光
をモニターしながら、プローブと、ハイブリダイズする条件下で目的のオリゴヌ
クレオチドを含むことが疑われる試料を合わせる工程、および（ｃ）目的のオリ
ゴヌクレオチドの存在または量とを、工程（ｂ）を通して起こる、任意の蛍光の
減少と相関させる工程、を包含する。

【００１５】本発明の関連する局面において、試料中の核酸分析物を検出するための改善さ
れた溶液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイは、以下の工程を含む
：（ａ）固体支持体に間接的に分析物を結合させる工程；（ｂ）分析物を標識す
る工程；ならびに（ｃ）固体支持体上の標識の存在を検出する工程、ここでこの
改善は、（ｉ）分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第１のセグメントＬ
−１および第２のセグメントＬ−２を有する標識拡張分子、（ｉｉ）核酸配列Ｌ
−２にハイブリダイズし得る核酸配列Ｍ−１を含む増幅マルチマー、および標識
プローブにハイブリダイズし得る核酸配列Ｍ−２を含む、複数の同一のオリゴヌ
クレオチドサブユニット、ならびに（ｉｉｉ）Ｍ−２にハイブリダイズし得る核
酸配列Ｌ−３を含むオリゴヌクレオチドプローブおよび分析物、標識拡張分子、
または増幅マルチマー中の核酸配列と特異的にハイブリダイズし得ないリンカー
を介してプローブにカップリングされた標識、を含む標識プローブ系を組み込む
工程を包含する。

【００１６】本発明はさらに、（ｉ）目的のオリゴヌクレオチド中の核酸配列に相補的な核
酸配列、および（ｉｉ）プローブが、一本鎖の非ハイブリダイズ形態にある場合
に、検出可能な蛍光シグナルを提供するが、プローブが相補的核酸鎖にハイブリ
ダイズする場合に、蛍光を提供しない標識、を含むオリゴヌクレオチドプローブ
を含む。

【００１７】さらに、本発明は、（ｉ）第１および第２の相補的ヌクレオチド配列が互いに
ハイブリダイズする場合に、ループ構造を形成する第３のヌクレオチド配列に隣
接する第１および第２の相補的ヌクレオチド配列を含む一本鎖核酸分子（ここで
ループ構造中の第３のヌクレオチド配列は、標的オリゴヌクレオチド中のヌクレ
オチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む）、および（ｉｉ）第１および第
２のヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする場合に、実質的にクエンチさ
れ、そして第３のヌクレオチド配列が目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイ
ズされ、第１および第２のヌクレオチド配列が非ハイブリダイズ形態である場合
に、検出可能な蛍光シグナルを提供する標識を含む、単一の標識されたオリゴヌ
クレオチドプローブを含む。

【００１８】本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮して当業者には
容易になされる。

【００１９】（発明の詳細な説明）（定義および命名法）本発明が開示され、そして詳細に記載される前に、本発明が特定のアッセイ様
式、材料または試薬に限定されず、それ自体、当然ながら変化することは理解さ
れるべきことである。また、本明細書中で使用される専門用語は、特定の実施態
様を記載する目的のみのためであり、限定を意図しない。

【００２０】本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」「ａｎ」お
よび「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限りは、複数の
対象を含む。従って、例えば、「標識プローブ（ａｌａｂｅｌｐｒｏｂｅ）
」への言及は、１つ以上の標識プローブを含み、「色素化合物（ａｄｙｅｃ
ｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、１つ以上の色素化合物を含み、「核酸分析物（
ａｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｎａｌｙｔｅ）」への言及は、１つ以上の分
析物を含み、「ヌクレオシド（ａｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」への言及は、１つ
以上のヌクレオシドを含む、などである。

【００２１】以下に続く本明細書および請求の範囲において、以下の意味を有すると定義さ
れる多数の用語について言及される：用語「クエンチ」または「クエンチング」は、それがなければ発光の放射を発
光させる供給源からの、検出可能な発光の放射、例えば、蛍光または発光放射の
減少を示すために使用される。クエンチングは、少なくとも５０％の減少であり
、好ましくは８０％、より好ましくは９０％の供給源からの検出可能な放射の減
少である。

【００２２】本明細書中で使用される用語「クエンチ可能な色素」は、溶液中でまたは一本
鎖オリゴマーに結合した場合に、直接的にまたは結合する部分を介するかのいず
れかで、検出可能な放射を発光させる単一の分子種である。一本鎖のオリゴマー
に直接的に結合したクエンチ可能な色素の検出可能な放射は、そのオリゴマーの
ハイブリッド二重鎖または三重鎖を形成する相補的オリゴヌクレオチドへのハイ
ブリダイゼーションに際して可逆的にクエンチされる。さらなる分子種、例えば
クエンチング色素は、クエンチングを起こすために必要とされない。しかし、ク
エンチ可能な色素がリンカー部分を介してオリゴマーに結合する場合、そのオリ
ゴマーの、その相補物へのハイブリダイゼーションは、色素によって発光される
検出可能な放射のクエンチングを生じない。

【００２３】本明細書中で使用される用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチ
ド」は、ポリマーが、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるように、塩基対合
および塩基スタッキングを可能にする立体配置において核酸塩基を含む場合、ポ
リデオキシヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）に、ポリリボヌ
クレオチド（Ｄ−リボースを含む）に、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−また
はＣ−グリコシドであるポリヌクレオチドの任意の他の型に、および非ヌクレオ
チド性の骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸
（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏ
ｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎより、Ｎｅｕｇｅｎｅ^TMポリマーとして市販され
ている）、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマー）に包括的なものである。
用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間には、意図する長さ
の区別は存在せず、そしてこれらの用語は交換可能に用いられる。これらの用語
は分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は、例えば、３’−デオキ
シ２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’−Ｐ５’ホス
ホラミデート、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、な
らびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド、およびＰＮＡ
とＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含み、そしてまた公知の型の改変
、例えば、当該分野で公知の標識、メチル化、「キャップ」、１つ以上の天然に
存在するヌクレオチドのアナログでの置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、荷
電していない結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホ
ラミド、カルバメートなど）、負に荷電した結合（例えば、ホスホロチオエート
、ホスホロジチオエートなど）、および正に荷電した結合（例えば、アミノアル
キルホスホラミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）を有する改変、ペ
ンダント部分（例えば、タンパク質（ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプ
チド、ポリ−Ｌ−リジンなど））を含む改変、挿入物（例えば、アクリジン、ソ
ラレンなど）を有する改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、
酸化的金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変された結合（例え
ば、α−アノマーの核酸など）での改変、およびポリヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチドの改変されていない形態を含む。

【００２４】本明細書中で使用される用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、公
知のプリンおよびピリミジン塩基のみを含むのではなく、他の改変された複素環
式塩基もまた含む、これらの部分を含む。このような改変は、メチル化されたプ
リンまたはピリミジン、アシル化されたプリンまたはピリミジン、あるいは他の
複素環を含む。改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分に改
変を含み、例えば、ここで１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置
換されるか、またはエーテル、アミンなどとして機能化される。用語「ヌクレオ
チド単位」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを含むことが意図される。

【００２５】さらに、ヌクレオチドユニットへの改変は、再配置、付加、それぞれの相補的
ピリミジンもしくはプリンと水素結合を形成するプリンもしくはピリミジン塩基
上の官能基を置換するかまたはさもなくば変更することを含む。結果として生じ
る改変ヌクレオチドユニットは、他のそのような改変ヌクレオチドユニットと塩
基対を形成し得るが、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵとは形成し得ない。標準的なＡ
−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対は、それぞれチミジンのＮ³−ＨおよびＣ⁴−オキシと、
アデノシンのＮ¹およびＣ⁶−ＮＨ₂との間の水素結合、ならびにそれぞれシチジンのＣ²−オキシ、Ｎ³およびＣ⁴−ＮＨ₂と、グアノシンのＣ²−ＮＨ₂、Ｎ¹−ＨおよびＣ⁶−オキシとの間の水素結合の形成を可能にする条件下で形成する。従って、例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノ
シル−プリン）が改変されて、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−
β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成し得る。このような改変は、シトシン
と標準的な塩基対をもはや効果的に形成しないヌクレオシド塩基を生じる。しか
し、シトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミ
ジン）の、イソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキ
シ−ピリミジン）を形成する改変は、グアノシンと効果的に塩基対を形成しない
がイソグアノシンとは効果的に塩基対を形成する改変ヌクレオシドを生じる。イ
ソシトシンは、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍ
Ｏ）から市販されている；イソシトシンは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３２：１０４８９−１０４９６およびそこに引用される
参考文献によって記載される方法によって調製され得る；２’−デオキシ−５−
メチル−イソシチジンは、Ｔｏｒら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．
１１５：４４６１−４４６７およびそこに引用される参考文献の方法によって調
製され得る；そしてイソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３
）、前出およびＭａｎｔｓｃｈら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３
−５６０１に記載される方法を使用して、またはＣｏｌｌｉｎｓらに与えられた
米国特許第５，７８０，６１０号により記載される方法によって調製され得る。
κおよびπと呼ばれる天然でない塩基対は、Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０
）Ｎａｔｕｒｅ３４３：３３−３７において、２，６−ジアミノピリミジンお
よびその相補物（１−メチル−ピラゾロ[４，３]ピリミジン−５，７−（４Ｈ，
６Ｈ）ジオン）の合成について記載される方法によって合成され得る。独特な塩
基対を形成する他のこのような改変ヌクレオチドユニットは、Ｌｅａｃｈら（１
９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３およびＳｗ
ｉｔｚｅｒら、前出において記載されるか、または当業者に明らかである。

【００２６】用語「ポリヌクレオチド分析物」および「核酸分析物」は、交換可能に使用さ
れ、そして標的ヌクレオチド配列を含む一本鎖または二本鎖の核酸分子をいう。
分析物である核酸は、種々の供給源（例えば、生物学的液体または固体、食品、
環境物質など）由来であり得、そして種々の手段（例えば、プロテイナーゼＫ／
ＳＤＳ、カオトロピック塩など）によるハイブリダイゼーション分析のために調
製され得る。用語「ポリヌクレオチド分析物」は、本明細書中において、用語「
分析物」、「分析物核酸」、および「標的」と交換可能に使用される。

【００２７】本明細書中で使用される用語「標的領域」または「標的ヌクレオチド配列」は
、標的分子内に含まれるプローブハイブリダイズ領域をいう。用語「標的配列」
は、所望の条件下で安定なハイブリッドをプローブと形成する配列をいう。

【００２８】本明細書中で使用される用語「プローブ」は、先に規定されるような、標的分
析物において存在する核酸配列に相補的な核酸配列を含むポリヌクレオチドから
構成される構造をいう。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡ、および／
またはＲＮＡ、および／または合成ヌクレオチドアナログから構成され得る。

【００２９】ハイブリダイズする配列は、安定なハイブリッドを提供するための完全な相補
性を有する必要はないことが理解される。多くの状況において、４以上のヌクレ
オチドのループを無視すると、塩基のうちの約１０％未満がミスマッチである、
安定なハイブリッドが形成される。従って、本明細書中で使用される用語「相補
性」は、アッセイ条件下で「相補性」を有する安定な二重鎖を形成するオリゴヌ
クレオチドをいい、ここで一般に約９０％以上の相同性が存在する。

【００３０】本明細書中において使用される用語「核酸マルチマー」または「増幅マルチマ
ー」は、同じ反復一本鎖オリゴヌクレオチドセグメントまたは異なる一本鎖ポリ
ヌクレオチドセグメントの線状ポリマーまたは分枝ポリマーをいい、それらの各
々は、標識化プローブがハイブリダイズし得る領域を含む、すなわち標識プロー
ブ内に含まれる核酸配列に対して相補的な核酸配列を含み；オリゴヌクレオチド
セグメントは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、改変ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせ
から構成され得る。少なくとも１つのセグメントは、それが標識化プローブに特
異的にハイブリダイズするのを可能にする配列、長さ、および組成を有し；さら
に、少なくとも１つのセグメントは、それが標識伸長剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）系
またはプレ増幅剤（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒ）系に特異的にハイブリダイズす
るのを可能にする配列、長さ、および組成を有する。代表的には、そのようなセ
グメントは、約１５〜５０、好ましくは１５〜３０のヌクレオチドを含み、そし
て約２０％〜約８０％の範囲内のＧＣ含量を有する。マルチマーにおけるオリゴ
ヌクレオチドセグメントの総数は、通常約３〜１０００の範囲内、より代表的に
は約１０〜１００の範囲内、そして最も代表的には約５０である。マルチマーの
オリゴヌクレオチドセグメントは、ホスホジエステル結合、または核酸、アミノ
酸、炭水化物、もしくはポリオール架橋剤のような挿入される連結剤を介して、
または核酸もしくは改変核酸鎖を架橋し得る他の架橋剤を介して直接的に互いに
共有結合され得る。あるいは、マルチマーは、一部には共有結合されるが、いく
つかの他の様式で（例えば、ハイブリダイズを介して）もまた結合されるオリゴ
ヌクレオチドセグメントから構成され得る。そのようなマルチマーは、例えば、
Ｎｉｌｓｅｎらの米国特許第５，１７５，２７０号に記載される。連結の部位は
、セグメントの末端（通常では、３’から５’方向またはランダムな方向のいず
れか）、および／または鎖における１つ以上の内部ヌクレオチドにあり得る。線
状マルチマーにおいて、個々のセグメントは、末端から末端に連結され、線状ポ
リマーを形成する。分枝マルチマーの１つの型において、３つ以上のオリゴヌク
レオチドセグメントは、分枝構造を形成するために起点から生じる。起点は、少
なくとも３つのセグメントが共有結合され得る別のヌクレオチドセグメントまた
は多機能性分子であり得る。別の型において、１つ以上の付属オリゴヌクレオチ
ドセグメントを有するオリゴヌクレオチドセグメントバックボーンが存在する。
これらの後者の型のマルチマーは、構造において「フォーク様」、「コーム様」
、または組み合わせの「フォーク」および「コーム様」であり、ここで本明細書
中で好ましいマルチマーである「コーム様」マルチマーは、バックボーンから伸
長する多くの側鎖を有する線状バックボーンを有するポリヌクレオチドである。
付属セグメントは、通常、オリゴヌクレオチドが結合または他の様式で付着され
得る適切な官能基を有する改変ヌクレオチドまたは他の有機部分から伸びている
。マルチマーは、全体的に線状であるか、全体的に分枝しているか、または線状
および分枝部分の組み合わせであり得る。代表的には、マルチマーにおいて少な
くとも２つの分枝点、より好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは約５〜３
０の範囲内の分枝部分が存在するが、いくつかの実施態様においては、それより
多くであり得る。マルチマーは、二本鎖配列の１つ以上のセグメントを含み得る
。マルチマー合成および特定のマルチマー構造に関するさらなる情報は、Ｕｒｄ
ｅａらの共有に係る米国特許第５，１２４，２４６号に見出され得る。

【００３１】共有に係る米国特許出願番号第０７／８１３，５８８号および欧州特許公開公
報第５４１，６９３号は、線状バックボーンおよび付属側鎖から構成されるコー
ム型分枝マルチマーを記載し；バックボーンは、分析物核酸または分析物に結合
する核酸に特異的なハイブリダイズ部位を提供するセグメントを含むが、付属側
鎖は、標識化プローブに特異的なハイブリダイゼーション部位を提供するセグメ
ントの反復を含む。コーム型マルチマーを合成する方法は、以下の実施例の節に
おいて記載される。

【００３２】上述のように、「プレ増幅剤系（ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｒｓｙｓｔｅｍ）
」もまた使用され得、これは、標識伸長剤分子と増幅マルチマーとの間の架橋系
として作用する。この方法において、より多くの増幅剤、従ってより多くの標識
は、任意の所定の標的−プローブ複合体において結合され得る。プレ増幅剤系は
、「プレプレ増幅剤分子」および／または「プレ増幅剤分子」を含む。プレプレ
増幅剤分子は、標識伸長剤分子とプレ増幅剤分子との間の架橋として作用するよ
うに設計されるが、プレ増幅剤分子は、標識伸長剤分子またはプレプレ増幅剤分
子のいずれかと増幅マルチマーとの間の架橋として作用するように設計される。
プレプレ増幅剤分子は、代表的には約３０〜約３０００ヌクレオチドを含む線状
または分枝であり得、そしてそれが標識伸長剤に特異的にハイブリダイズするの
を可能にする配列、長さ、および組成を有する少なくとも１つのセグメント、お
よびそれがプレ増幅剤分子にハイブリダイズするのを可能にする少なくとも１つ
のセグメントを含む。プレ増幅剤分子は、順に、線状または分枝のいずれかであ
り得、そして代表的には約３０〜約３０００ヌクレオチドの範囲内を含む。本明
細書中における１つの好ましい実施態様において、アッセイの全体の正確さが増
加されるように（すなわち、なぜなら、複数のハイブリダイゼーション事象には
、プローブ−標的複合体を形成することが必要とされるからである）、プレプレ
増幅剤分子またはプレ増幅剤分子は、少なくとも２つの異なる標識伸長剤分子に
ハイブリダイズする。

【００３３】本明細書中で使用される「生物学的サンプル」は、例えば以下を含むがこれら
に限定されない個体から単離される組織または体液のサンプルをいう：血漿、血
清、髄液、精液、リンパ液、皮膚の外部切片、気道、腸管、および尿生殖器管、
涙、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官、およびまたはインビトロ細胞培養構成
物質のサンプル（細胞培養培地における細胞、推定的にウイルス感染した細胞、
組換え細胞、および細胞成分の増殖から生じる馴化培地を含むが、これらに限定
されない）。本方法の好ましい使用は、以下のような核酸を検出および／または
定量する際における使用である：（ａ）ウイルス性核酸、例えば、Ｂ型肝炎ウイ
ルス（「ＨＢＶ」）、Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ」）、Ｄ型肝炎ウイルス（「
ＨＤＶ」）、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）、およびヘルペス族のウイル
ス（帯状疱疹ウイルス（水痘ウイルス）、単純ヘルペスウイルスＩ型およびＩＩ
型、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、および最近単離された
ヘルペスＶＩ型ウイルスを含む）由来の核酸；（ｂ）細菌の核酸（例えば、Ｃｈ
ｌａｍｙｄｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなど
）；ならびに（ｃ）目的の多くのヒト配列。

【００３４】本明細書中において「標識伸長剤」ともよばれる「標識伸長剤分子（ｌａｂｅ
ｌｅｘｔｅｎｄｅｒｍｏｌｅｃｕｌｅ）（ＬＥ）」は、分析物ポリヌクレオ
チドおよび増幅マルチマーに対する相補性の領域を含む。プレプレ増幅剤または
プレ増幅剤が使用される場合、標識伸長剤分子は、増幅マルチマーに直接ではな
く、この中間種にハイブリダイズする。プレ増幅剤系も増幅剤も使用されない場
合、標識伸長剤分子は、標識化プローブ（「ＬＰ」）における配列に直接的にハ
イブリダイズする。従って、標識伸長剤分子は、分析物ポリヌクレオチドの配列
に相補的な第１の核酸配列Ｌ−１、および標識プローブ、増幅マルチマー、プレ
プレ増幅剤またはプレ増幅剤のセグメントＭ−１に相補的なマルチマー認識配列
Ｌ−２を有する第２のユニバーサル領域を有する一本鎖ポリヌクレオチド鎖であ
る。

【００３５】「標識化プローブ（ＬＰ）」は、標識伸長剤に、または増幅マルチマーがアッ
セイにおいて使用される場合はマルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメント
のいずれかにハイブリダイズするように設計される。ＬＰは、標識を含むか、ま
たは標識にハイブリダイズするように構築されるかのいずれかである。従って、
ＬＰは、マルチマーの反復オリゴヌクレオチド単位内の存在する核酸配列Ｍ−２
に相補的な核酸配列Ｌ−３を含み、そして検出可能なシグナルを直接的または間
接的に提供する標識に結合するか、またはそれにハイブリダイズするように構築
される。

【００３６】本明細書中において「捕獲伸長剤」ともいわれる「捕獲伸長剤分子（ＣＥ）」
は、順に固体支持体に共有結合される、分析物ポリヌクレオチドおよび捕獲プロ
ーブにハイブリダイズする。従って、捕獲伸長剤分子は、分析物の配列に相補的
である核酸配列Ｃ−１を含む第１のポリヌクレオチド配列領域、および捕獲プロ
ーブ認識配列Ｃ−２を有する第２の非相補的領域を有する一本鎖ポリヌクレオチ
ド鎖である。配列Ｃ−１およびＬ−１は、分析物の物理学的に異なる配列にそれ
ぞれ相補的である非同一非相補的配列である。

【００３７】「捕獲プローブ（ＣＰ）」は、捕獲伸長剤にハイブリダイズし、そして固体支
持体に結合する。捕獲プローブは、Ｃ−２に相補的な核酸配列Ｃ−３を有し、そ
して固体支持体に共有結合する（またはそれに共有結合し得る）。

【００３８】一般に、液相ハイブリダイゼーション捕獲アッセイは、Ｕｒｄｅａらの米国特
許第５，６３５，３５２号に開示され、その開示は本明細書中に参考として援用
され、そして以下のように続く。一本鎖分析物核酸は、捕獲伸長剤および標識伸
長剤とともにハイブリダイゼーション条件下でインキュベートされる。得られる
産物は、捕獲伸長剤および標識伸長剤に結合した分析物ポリヌクレオチドの核酸
複合体である。この複合体は、引き続いて、その表面に結合される捕獲プローブ
を有する固相支持体に、ハイブリダイズ条件下で添加され得る；しかし、好まし
い実施態様において、最初のインキュベーションは、支持体結合捕獲プローブの
存在下で実施される。得られる産物は、捕獲伸長剤および捕獲プローブを介して
固相に結合される複合体を含む。次いで、結合した複合体を有する固相は、非結
合物質から分離される。次いで、増幅マルチマー、好ましくは上記のコーム型マ
ルチマーは、マルチマーがＬＥにハイブリダイズするのを可能にするハイブリダ
イゼーション条件下で固相−分析物−プローブ複合体に必要に応じて添加され；
プレ増幅剤系が使用される場合、固相−分析物−プローブ複合体は、増幅マルチ
マーとともに、または好ましくは増幅マルチマーとのインキュベーション前にプ
レ増幅剤系プローブとともにインキュベートされる。次いで、得られる固相複合
体は、洗浄によって、任意の非結合プレ増幅剤および／またはマルチマーから分
離される。次いで、標識化プローブは、ＬＥ、または増幅マルチマーが使用され
る場合はマルチマーの反復オリゴヌクレオチドセグメントへのハイブリダイゼー
ションを可能にする条件下で添加される。次いで、得られる固相標識化核酸複合
体は洗浄されて、非結合標識化オリゴヌクレオチドを除去する。クエンチ可能な
色素が結合した標識プローブは、以下により十分に記載されるように、ＬＥまた
は増幅マルチマーにハイブリダイズする間、検出可能なシグナルを放出しない。
従って、次いで、標識プローブは、当該分野において周知の任意の方法によって
（例えば、加熱によって、界面活性剤または高塩の添加によって、など）、ＬＥ
または増幅マルチマーとのハイブリッド複合体から解離される。次いで、解離さ
れた標識プローブからのシグナルが読み取られ得る。

【００３９】本発明の１つの主要な焦点は、所望の条件下で検出可能なシグナルのみを放出
するプローブを使用することによって、バックグラウンドノイズを最小化するこ
とにある。本発明の別の主要な焦点は、以前の系に関して可能であるよりも多い
収量の検出可能なシグナルを生成するシグナル増幅系を提供することである。

【００４０】本発明者らは、本明細書中において、クエンチ可能な蛍光色素で直接標識され
たオリゴマーが相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズする場合、溶液中に
遊離する同じ量のプローブについて観察される蛍光と比較して実質的なクエンチ
ングが起こることを観察した（実施例１を参照のこと）。以下に例示されるよう
に、例えば、直接的に標識されたプローブのその相補体からの解離の際にのみ検
出可能なシグナルを生じることによって減少したバックグラウンドノイズを有す
る核酸ハイブリダイゼーションは、従来のアッセイ方法を越える有意な改良であ
る。

【００４１】さらに、現在、クエンチングが、リンカーを介してクエンチ可能な色素をオリ
ゴマーに結合することにより、実質的に低減され得ることが観察されている（実
施例３を参照のこと）。これは、分枝したＤＮＡ増幅マルチマーの使用を介する
、シグナル増幅を増強するための手段を提供する。プローブあたり複数の標識を
有する従来の蛍光オリゴマー標識プローブは、「自己クエンチング」する傾向が
あり、それによって蛍光シグナル発光を限定する。さらに、複数の蛍光標識プロ
ーブが、標識プローブに相補的は複数の配列を含む増幅マルチマーにハイブリダ
イズする場合、分子内クエンチングが生じ得る。対照的に、本明細書中に開示さ
れ、そして権利請求されるようなオリゴマーに間接的に結合されたクエンチ可能
な色素化合物を含む標識プローブのハイブリダイゼーションは、自己クエンチン
グを生じないようであり、そして増加したシグナル出力を生じる。

【００４２】好ましいクエンチ可能な色素は、以下の化学構造を有する蛍光ジピロメテンボ
ロンジフルオリド色素であり；

【００４３】

【化１９】

【００４４】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、以下からなる群から独立して選択される：水素；ハロゲン
；アルキル；カルボキシアルキル；アシル；アリール；アリールアルキル；スル
ホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル、ここでＸ、Ｙ
、およびＺは、独立して、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリール、またはヘテロアリールであり；お
よび−Ｌ−Ｇ、ここでＬは、連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカル
ボン酸部分への色素の結合を可能にする反応性基であり；または、ここで（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、ならび
に／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかは、ともに、水
素、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシ
レート、アルキル、ペルフルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ
、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール
、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、
ヘテロアリールアミノ、もしくはアリールアミドからなる群より選択される０〜
４の置換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで２つのオルト置
換基は連結され、さらなるこのような芳香族環を形成し、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内の少なくとも１つの置換基はヘテロアリールであり、
そしてＲ¹〜Ｒ⁷の群内の少なくとも第２の置換基は−Ｌ−Ｇである。

【００４５】これらの化合物は、Ｈａｕｇｌａｎｄらの米国特許第４，７７４，３３９号、
Ｋａｎｇらの同第５，１８７，２８８号、Ｈａｕｇｌａｎｄらの同第５，２４８
，７８２号、Ｋａｎｇらの同第５，２７４，１１３号、Ｋａｎｇらの同第５，４
５１，６６３号、およびＫａｎｇらの同第５，４３３，８９６号に記載され、そ
れらの開示は、本明細書中で参考として援用される。特に、米国特許第５，５４
１，６６３号は、色素結合体を形成するための生物学的に由来するかまたは化学
的に合成された巨大分子と化学的に反応性であるジピロメテンボロンジフルオリ
ド色素の蛍光誘導体を記載する。これらの蛍光色素が合成され得る方法、および
色素が、生物学的に由来するかまたは合成化学物質に結合され得る方法もまた、
Ｈａｕｇｌａｎｄら、およびＫａｎｇらの本明細書中に引用される特許において
記載される。本発明において有用な多くのジピロメテンボロンジフルオリド色素
は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から
市販される。

【００４６】特に好ましいジピロメテンボロンジフルオリド色素は以下である：

【００４７】

【化２０】

【００４８】色素は、オリゴマーに直接的に結合され得るか、またはリンカー部分を介して間
接的に結合され得る。オリゴマー色素結合体は、当該分野において周知の従来の
方法を使用して形成され得る。

【００４９】リンカーは、オリゴヌクレオチドプローブを標識に結合するように作用する部
分であり、プローブおよび標識の両方に共有結合し、そして所望の程度の間隔が
プローブ「バックボーン」と標識との間に提供されるような分子構造を有する。
一般に、リンカー部分は、標識の放出シグナルに対するオリゴマー−標識結合体
のハイブリダイゼーションのクエンチング効果に打ち勝つために十分な長さであ
る。リンカーは、核酸配列、アミノ酸配列、炭化水素鎖などであり得る。好まし
くは、リンカー部分は、少なくとも３以上のヌクレオチド長、より好ましくは３
〜９の間のヌクレオチド長の核酸配列である。さらに、リンカー部分は、（ａ）
標識プローブに相補的な核酸配列、または（ｂ）標的ヌクレオチド配列のいずれ
かへの標準的なハイブリダイズ条件下でハイブリダイズしないことが好ましい。
さらなる好ましいリンカー部分は、３以上、好ましくは３〜９のエチレングリコ
ールのユニットまたはトリエチレングリコールのユニットのエチレングリコール
またはトリエチレングリコールリンカーである。リンカー部分は、オリゴマーの
５’もしくは３’末端、または適切な反応性の側鎖基を有する内部ヌクレオシド
に結合され得る。

【００５０】さらに、色素化合物は、誘導可能なヌクレオチドへの共有結合によって、オリ
ゴマーに組み込まれ得る。標識が付着され得る誘導可能な部位を有する改変され
たヌクレオチド、およびこのような改変されたヌクレオチドを含むオリゴマーは
、Ｕｒｄｅａらの米国特許第４，９１０，３００号、同第５，０９３，２３２号
、および同第５，５９４，１１８号、ならびにＣｈａｎｇらの同第５，５８０，
７３１号および同第５，５９１，５８４号に開示される。例えば、Ｃｈａｎｇら
の’７３１特許のＮ−４改変ピリミジンは、Ｎ−４位または３’位で標識され得
る。

【００５１】以下に例示されるように、クエンチ可能な色素−オリゴマー結合体は、以下を
含むがそれらに限定されない多くの核酸ハイブリダイゼーション方法において有
用である：液相および固相核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、インサイチュ
ハイブリダイゼーションマッピング、点変異検出など。

【００５２】（実験）本発明の実施は、他に示さなければ、合成有機化学、生化学、分子生物学など
の従来技術を使用し、これは、当業者の技術範囲内である。このような技術は、
文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃ
ｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉ
ｇｇｉｎｓ編、１９８４）；およびシリーズ、ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。

【００５３】本発明がその好ましい特定の実施態様と共に記載されているが、上記記述なら
びに以下の実施例は、本発明の範囲を例示することを意図し、限定するものでは
ないことが理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、発明が
関連する当業者に対して明白である。

【００５４】以下の例において、使用された数（例えば、量、温度など）に関して精度を保
証するための努力がなされたが、いくつかの実験誤差および偏差は、説明される
べきである。温度は、常に、摂氏℃で与えられ、そして他に示されなければ、圧
力は、大気圧または大気圧付近である。

【００５５】（一般的方法）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析：ネイティブな１０％ポリ
アクリルアミドスラブゲルを１０ｍｌの４０％ストック溶液（Ａｍｒｅｓｃｏ，
ｃａｔ，ｎｏ．０４９６）、３０ｍｌの１×Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（「ＴＢＥ
」）（１００ｍＭＴｒｉｓ−ホウ酸，１ｍＭＥＤＴＡ，７Ｍ尿素，ｐＨ８
．３）、０．４ｍｌの１０％過硫酸アンモニウムおよび２０μｌのＮ，Ｎ，Ｎ’
，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを含む溶液を使用して調製した。０．５
ｍｍのスラブを２０ｃｍ×２０ｃｍプレート間に注入し、そして１０個の１ｃｍ
のティースを有するコウムをプレート間に挿入し、ローディングウエルを形成し
た。ゲルを２５ｍＡで２０分間、４℃でプレランし、そしてローディングウェル
を予備洗浄した後、サンプル混合物をウェルにロードした。サンプル混合物は、
水中、５μｌのサンプル、５μｌの１５％（Ｗ／Ｖ）フィコールおよび０．０５
％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）からなる。ゲルを２５ｍＡ、４℃で電気泳
動した。バンドをプラスチックラップで覆ったガラス上に蛍光インジケーターを
有するシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（Ｍｅｒｃｋシリカゲル６
０Ｆ₂₅₄）へこのゲルを移すことによって可視化した。ＤＮＡバンドをＵＶ付影によって（すなわち、２６０ｎｍの紫外光にプレート上のゲルを曝露すること
によって）可視化した。蛍光バンドを３６０ｎｍの光にプレート上のゲルを曝露
することによって可視化した。

【００５６】オリゴヌクレオチド合成：オリゴデオキシヌクレオチドを、２−シアノエチル
ホスホルアミダイトモノマーを使用して、標準の固相化学によって合成した。
リン酸化試薬、２−（（２−（（４，４’−ジメトキシトリチル）オキシ）エチ
ル）スルフォニルエチル−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホル
アミダイト（ホステル）を使用して、３’−および５’−リン酸化オリゴマーの
両方を合成した。

【００５７】標識プローブを形成するためのオリゴヌクレオチドプローブへの色素化合物の
結合：ｂｌａ３オリゴヌクレオチド５’−（ＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＡＣ
ＣＡＣＡＴＣＬ−３’）の３’−長鎖アミン（「ＬＣＡ」）部分（Ｌ）（こ
こでＬは、Ｎ⁴−（６−アミノカプロイル−２−アミノエチル）−５−メチル− ２’−デオキシシチジンである）を、ＢＬＡ３：色素の１：１００の割合でカル
ボキシル化した色素分子と反応した。従って、色素、Ｎ−ハイドロキシスクシン
イミドエステルおよびＢＬＡ３を１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．８に加え
、そして室温で３時間インキュベートした。

【００５８】反応混合物を前もって水で平衡化したＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）にアプライし、そして水で溶出した。所望の産物をＰＡＧＥで単離する。この
産物のバンドをゲルから切断し、つぶし、そして０．５ＭＮａＣｌ、１００ｍ
ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３、１０ｍＭＭｇＣｌ₂を使用して抽出し、脱塩およびエタノール沈殿を行う。ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬＬＣＡ−ヌクレオシ
ドは、以下の構造を有する：

【００５９】

【化２１】

【００６０】所望の場合、オリゴマー−色素結合物は、例えば、イオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシ
ングまたはアフィニティクロマトグラフィーを使用してさらに精製され得る。Ｄ
ＮＡに対する標識の割合を分析的ゲル電気泳動を使用して、決定する。

【００６１】

【実施例】

（実施例１直線状オリゴヌクレオチドに対する標識化プローブのハイブリ
ダイゼーションの際の蛍光クエンチング）分枝ＤＮＡ増幅マルチマーの機能特性を以下の２つの蛍光技術で試験した：溶
液相ハイブリダイゼーション依存クエンチング試験およびゲルシフトポリアクリ
ルアミド分析試験。

【００６２】１×ＳＳＣにおいて５μｌの最終容量をそれぞれ有する一連の反応混合物を調
製した。この混合物は、以下の成分のそれぞれの０〜１００ｐｍｏｌを含む：（
１）実施例１において記載されたように調製した増幅マルチマー；（２）５’−
ＢＬＡ３−３’−色素または色素−５’−ＢＬＡ３；および（３）５’−ＢＬＡ
３ｃ−ＰＳＣＰｃ−３’。ＢＬＡ３は、オリゴマー、５’−ＡＡＧＴＡＣＧＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＴ−３’であり、そしてＢＬＡ３ｃ
−ＰＳＣＰｃは、オリゴマー５’−ＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＴ
Ｇ−３’であり、ここで相補的オリゴマーセグメントに下線を付す。反応混合
物を６０℃で１５分間、湯浴中で加温し、次いで室温に冷却した。サンプルを水
中、５μｌの１５％（Ｗ／Ｖ）フィコール／０．０５％ＢＰＢで希釈し、次いで
、１０％ネイティブＰＡＧＥゲル（尿素を有さない注入された２０×２０ｃｍ）
のウェル中にロードした。このゲルをトレーサー色素（ＢＰＢ）がゲルの下、約
２／３に移動するまで電気泳動した。バンドをＵＶ影付けによって可視化した。
このゲルをプラスチックのラップで覆った２０×２０ｃｍシリカゲル薄層クロマ
トグラフィープレート（ガラス上に蛍光インジケーターを有するＥ．Ｍｅｒｃｋ
シリカゲル６０Ｆ₂₅₄）に移した。このゲル／プレートを２６０ｎｍでＵＶ光に曝露して、ＤＮＡバンドを可視化し、そして３６０ｎｍのＵＶ光で蛍光バンド
を可視化した。１５×３増幅マルチマーおよび１５×３増幅マルチマー／５’−
ＢＬＡ３−Ｔ₅−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬハイブリッドは、ゲル中へ移動しなかった。ところが、５’−ＢＬＡ３−Ｔ₅−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬは、ＢＰＢ染料のわずかに前に移動した。

【００６３】１８個の核酸繰り返し配列と相補性の配列を有する１連のプローブを６０マー
で合成した。各プローブは、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＰｒｏｂｅ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、フルオレセインまたはテキサスレッ
ドで標識化した。個々のプローブは、直線状相補的配列とハイブリダイズし、そ
してｎａｔｉｖｅＰＡＧＥによって分析し、標識化されたオリゴマーの蛍光特
性を決定した。すべての場合、定量的ハイブリッド形成は、遊離の標識化プロー
ブの完全な消失によって決定される場合、達成された。しかし、観察された蛍光
強度は、変化した。広範囲のクエンチングを同じハイブリダイゼーション条件下
で顕著なクエンチングを示さないフルオレセインおよびテキサスレッド標識化オ
リゴマーとは対照的に、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−標識化オリゴマーで観
察した。従って、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ色素は、標識化オリゴマーの環
境に対して感受性であり、そしてクエンチングは、その相補体とハイブリダイズ
して二本鎖ＤＮＡを形成するプローブの割合の測定であった。

【００６４】ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬをプローブの３’末端でＴ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ（
Ｔ₅）リンカーを通してこのプローブと連結した場合、特にクエンチングは、この相補体に対するプローブのハイブリダイゼーションに際して観察されなかった
。

【００６５】（実施例２１５部位分枝コームＤＮＡ（ｂＤＮＡ）の合成および増幅マル
チマーへのアセンブリ）検出可能な標識化プローブと相補的な３個の１８マーハイブリダイゼーション
部位を有する２次配列を付けた１５個の分枝部位を有する分枝コームＤＮＡを以
下のように調製した。

【００６６】Ａ．１次配列の合成。Ｎ−サクシニル−アミノプロピルリンカー（４０．５ｍ
ｇ、０．６μｍｏｌ）を使用して、１４．８μｍｏｌ／ｇのジメチルトリチル−
チミジンで誘導体化した制御されたポアグラス（ＣＰＧ）固体支持体（２０００
Åポアサイズ）をカラムに充填した。１次配列を自動化ＤＮＡ合成機（Ｍｏｄｅ
ｌ３８０Ｂ、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ、Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、ＣＡ）で合成した。脱トリ
チル化工程は、トリクロロアセテート／ＣＨ₂Ｃｌ₂（３％ｖ／ｖ）の７秒のパル
スを２回、次いで各４秒のパルスを使用し、次いでカラムに流した。このプロセ
スを２回以上繰り返した。ホスホルアミダイト試薬（アセトニトリル中の１８μ
ｍｏｌの９０ｍＭ溶液）をＡ、Ｇ、Ｃ、またはＴの各カップリングに使用した；
しかし、分枝モノマー（Ｎ−４−（６−ヒドロキシヘキシル）−５−メチル−２
’デオキシシトシン）ホスホルアミダイトに関しては、アセトニトリル中の２０
μｍｏｌの１００ｍＭ溶液を各カップリングに使用した。

【００６７】Ｂ．分枝モノマーのレブリン酸保護基の除去。１次合成から得たＣＰＧを１０
ｍｌのプラスチックシリンジに付着し、１０ｍｌの酢酸／ピリジン（１：１、ｖ
／ｖ）でリンスした。酢酸／ピリジン中の約１１ｍｌの０．５Ｍヒドラジン水
和物を室温で９０分間を超えて、周期的に押し出した。次いで、この固形支持物
を１０ｍｌの酢酸／ピリジンでリンスし、シリンジから切り離し、次いで真空下
での短時間の乾燥の前にアセトニトリルで広範囲にリンスした。

【００６８】Ｃ．２次配列の合成２次配列を合成するために使用されるすべての試薬は、
１次配列におけるものと同じであった；しかし、これらの量は異った。脱トリチ
ル化プロセスは、３回のトリクロロアセテート溶液の８秒間のパルスを使用し、
次いで各４秒間のパルス、続いてトルエン／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１、ｖ／ｖ）の２
０秒間のリンス（５秒間の休止を有する１５秒のパルス）を使用した。このプロ
セスを２回以上繰り返した。ヌクレオシドホスホルアミダイト（９６μｍｏｌ）
をＡ，Ｃ，ＧまたはＴの各カップリングに使用した。このカップリングプロセス
は、８秒間のアクチベーターの添加、８秒間のアクチベーターおよびホスホルア
ミダイトの添加、次いで３０秒の待機からなる。これを全部で８回行った。キャ
ップ形成および酸化プロセスのそれぞれは、５秒の休止で分けられた試薬の２回
の１０秒間のパルスを使用し、次いで６０秒間の待機工程を使用した。２次配列
の５’末端がリン酸化を必要とする場合、次いでこれらをカップリング間でキャ
ップ形成せずにホステルホスホルアミダイト（１００ｍＭで各１０７μｍｏｌ）
でカップリングした。

【００６９】Ｄ．１５部位ｂＤＮＡの脱保護および精製。脱トリチル化したｂＤＮＡを室温
で４５分間、２ｍｌの３０％ＮＨ₄ＯＨで切断した。上清を、４ｍｌのガラスバイアルに集め、これにキャップをし、そして６０℃のオーブンで少なくとも１６
時間加熱し、次いで真空下で乾燥した。粗ｂＤＮＡを７Ｍ尿素を含む７％Ｔ、５
％Ｃポリアクリルアミドゲル（２０×４０×１．５ｃｍ）で精製した。ゲルをブ
ロモフェノールブルー色素が下端から２〜３ｃｍ内に移動するまで電気泳動した
。この産物のバンドを切り取り、そして０．５ＭＮａＣｌおよび５ｍＭＥＤ
ＴＡを有する１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０中に少なくとも
２４時間、振とうして、浸漬した。塩を短いＣ−１８カラムにｂＤＮＡ溶液をロ
ードすることによって除き、そして水でそれをリンスした。精製したｂＤＮＡを
メタノール／Ｈ₂Ｏ（１：１ｖ／ｖ）でカラムから溶出した。乾燥し、水中で再構成した後、そのｂＤＮＡをエタノール／０．３Ｍ酢酸カリウム水溶液（３：１
、ｖ／ｖ）で沈殿させた。

【００７０】Ｅ．１５×３ｂＤＮＡ増幅マルチマーの酵素的アセンブリ。５’−ｐ−ＴＧＡ
ＣＴＧ−３’２次配列を含む１５部位ｂＤＮＡコームオリゴマー（１ｎｍｏｌ
ｅ）、および直線状ＤＮＡ配列５’−（ＧＡＴＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＴ
ＡＣＴＴ）₃−ＧＣＧＴＡＧ−３’（６０マー、１８．７５ｎｍｏｌｅ）を、総容量１４０μｌで反応チューブにおいて直線状ＤＮＡリンカー、５’−Ｃ
ＡＧＴＣＡＣＴＡＣＧＣ−３’（１２マー、１８．７５ｎｍｏｌｅ）と結
合させ、そして２５μｌの連結緩衝液（１０×緩衝液：５００ｍＭＴｒｉｓ、
ｐＨ７．５、１００ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭスペルミジン）を加えた。このチューブを９５℃へ加熱し、次いでゆっくりと室温に冷却した。この時点で、
ＡＴＰ（０．１ＭＡＴＰの５μｌ）、ポリエチレングリコール８０００（５０％
溶液の７０μｌ）およびＴ４−リガーゼ（６．７ユニット／μｌ、総量で５０ユ
ニット）を加えた。この反応物を一晩、室温でインキュベートした。塩化ナトリ
ウムを加え（４Ｍの１６．５μｌ）そして氷冷エタノール（８００μｌ）を加え
た。混合物を−２０℃で３０分間保ち、次いで１２，０００×ｇで３０分間遠心
分離した。この上清をデカントし、そして沈殿を最初に減圧で穏やかに乾燥し、
次いで水に再懸濁した。この産物を上記のように１５部位ｂＤＮＡコームオリゴ
マーについて精製した。

【００７１】（実施例３１５×３増幅マルチマーに対する溶液相ハイブリダイゼーショ
ン：プローブと蛍光団間へのリンカーの挿入の効果）１５の分枝を含む増幅マルチマーにおけるハイブリダイズ可能なＢＬＡ３ｃ
１８マー配列の数（この各々が３個のＢＬＡ３ｃ配列（ａ１５×３ｂＡＭ）
を有する）を、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬハイブリダイゼーション依存クエ
ンチングを使用して決定した。ＢＬＡ３−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ
（０から６０ｐｍｏｌｅ）の漸増量を、１５×３増幅マルチマーとインキュベー
トした。ハイブリダイゼーションおよび希釈の後、蛍光を測定した。この実験の
結果を図１に示す。

【００７２】標識化したプローブ単独に関する標準曲線を構築し、そしてこの標準曲線は、
漸増プローブ濃度に対して直線的応答を有することを示した。対照的に、同量の
ＢＬＡ３−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬを１５×３増幅マルチマーにハ
イブリダイズした場合、生じた曲線は、２個の別々の勾配を有した。低濃度の標
識化プローブで、この蛍光出力は、約８０％クエンチングし、そして平らな勾配
を示した。より多くの標識化プローブを加えると、勾配は、遊離のハイブリダイ
ズしていない標識化プローブの勾配と平行に変化した。これは、ハイブリダイズ
可能な部位の飽和を示唆している。２個の直線領域の妨害から、１５×３増幅マ
ルチマーは、平均で３６個のハイブリダイズ可能な部位または１２個の６０マー
配列を含むことを決定した。

【００７３】ハイブリダイゼーション実験を、ＢＬＡ３−Ｔ₅−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬをＢＬＡ３−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬに置換して、繰り
返した。Ｔ₅は、色素をＢＬＡ３オリゴマーの３’末端に連結した５個の１列に並んだヌクレオチドスペーサーを示す。ＢＬＡ３−３’−ＢＯＤＯＰＹ（登録商
標）ＦＬプローブを使用して得られた結果とは対照的に、クエンチングは、ＢＬ
Ａ３−Ｔ₅−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬプローブを使用しては観察されなかった。図２に示した２個の曲線（ハイブリダイズした標識化プローブおよ
びハイブリダイズしていないプローブの相対的な蛍光）は、本質的に重ね合わせ
ることが可能であった。

【００７４】この観察は、さらに１５×３増幅マルチマーが内部クエンチングのない多くの
標識化したプローブのハイブリダイゼーションに適応し得る足場を提供すること
を示唆した。このことは、標識をお互いの９〜１８塩基対内に置いた場合、蛍光
団間のエネルギー転移が起こることを述べた以前の報告と一致した。オリゴマー
と標識間の連結の長さおよび剛性はまた、発色団間のクエンチングに影響を与え
た。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９９５）、Ｋｒｉｃｋａ編、Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ
Ｐｒｏｂｉｎｇ、Ｂｌｏｔｔｉｎｇ、ａｎｄＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ａｃａ
ｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、ＮＹ）、４３０−４７１頁。１５×３増幅マルチマー
およびＴ₅−改変標識化プローブは、色素分子間で１８塩基対より多い強固なスペーシングを提供するハイブリッドを形成した。

【００７５】（実施例４ＰＡＧＥ検出を使用した１５×３増幅マルチマーに対する溶液
相ハイブリダイゼーション：オリゴマープローブと蛍光色素間へのスペーサーの
挿入効果）ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬのハイブリダイゼーションの特徴をネイティブ
ＰＡＧＥ分析を使用して実施例３に記載のように検査し、これは、電気泳動中に
オリゴヌクレオチドのハイブリッドを不安定化しない。１５×３増幅マルチマー
は、漸増量のＢＬＡ３−Ｔ₅−３’−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬとハイブリダイズすることが可能であった。遊離の標識化プローブは、ゲル中へ移動した；
１５×３増幅マルチマーは、大きすぎてゲルに入ることができなかった。ゲル分
析は、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−標識化プローブを完全に増幅マルチマー
にハイブリダイズした場合、全蛍光をローディングウェル中に保持し、そしてゲ
ル中へ移動しないことを示した。プローブの量が１５×３増幅マルチマー上で、
全ハイブリダイズ可能部位の飽和を超えて増加した場合、過剰な蛍光プローブが
、ゲル中へ移動した。遊離のプローブがゲル中へ移動し始めた場合、このブレイ
クスルーは、約３５個のハイブリダイズ可能な部位に対応する。ハイブリダイゼ
ーションの特異性は、同じ改変した標識化プローブを相補的でない配列を含む１
５×３増幅マルチマーとインキュベートした場合、さらに例示された。全標識化
プローブがゲル中を移動することが観察され、そしてローディングウェル中に保
持される蛍光はなかった。

【００７６】（実施例５蛍光発生的なプローブを使用した単一標識クエンチングＰＣＲ
）Ｌｅｅら（１９９３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：３７６１
−３７６６は、対立遺伝子間で識別するためニックトランスレーションＰＣＲの
結果をモニターするための２重標識化プローブの使用を記載している。この方法
において、プローブを蛍光ホスホルアミダイトで５’末端に標識化し、そしてア
ミノ修飾因子、Ｃ６ｄＴリンカー（Ｇｌｅｎ）および３’−ホスフェートで
３’末端を標識化した。オリゴマープローブを、５’−６−カルボキシフルオレ
セイン、またはクエンチング色素である５’−ＴＥＴおよび３’−６カルボキシ
テトラメチルローダミンで２重標識化オリゴマーに変換する。標識化プローブを
ＰＣＲプライマーの１つから下流の１本鎖ＰＣＲ産物の領域にアニールするよう
設計する。このプローブの３’末端を３’ホスフェートによる伸長からブロック
する。このプローブは、他のＰＣＲ試薬（例えば、ｄＮＴＰ）と共に含まれ、そ
してプライマーがサイクル毎に伸長されるにつれ、Ｔａｑポリメラーゼに固有の
５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって分解される。プローブは、２重に標
識化されている（すなわち、５’末端の蛍光団および３’末端のクエンチャーを
有する）ので、指示色素の蛍光がクエンチされる。この方法の例示を図３Ａに提
供する。核酸分解的切断が２個の色素間で起こる場合、そして起こる場合のみ、
ＰＣＲ間のプローブ消化は、指示色素蛍光を回復する。異なった配列の２個のプ
ローブの分解を、２個の指示色素をスペクトルで区別できる場合、同時にモニタ
ーし得る。

【００７７】Ｒｕｄｅｒｔら（１９９７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２２：１１４０−１
１４５は、５’ヌクレアーゼアッセイにおける類似の二重標識プローブの使用を
記載する。ヘアピン配列を含むプライマーオリゴマーならびに５’−蛍光団（ｆ
ｌｕｏｒｏｐｈｏｒ）および３’−クエンチャーを有するオリゴマープローブを
使用する。このプライマーは３’末端で自発性のヘアピンを形成し、そして蛍光
プローブ内部の相補的配列にハイブリダイズする。クエンチャーの存在に起因し
て、この蛍光団は、プローブがプライマーにハイブリダイズする時には検出不可
能である。さらに、ハイブリダイゼーションの際に、ヘアピンプライマーとプロ
ーブの間に２つのヌクレオチドギャップが存在する。Ｔａｑポリメラーゼはプラ
イマーの３’末端を伸長し、そしてこのプローブの５’末端を切断し、レポータ
ー色素を３’クエンチング色素のクエンチング効果から解放する。この系を図３
Ｂに図示する。

【００７８】ヌクレオチドポリメラーゼ活性をモニターし得るこれらの方法のいずれかにお
いて、本明細書で定義されるような、５’末端のヌクレオチドにおいてＢＯＤＩ
ＰＹ（登録商標）ＦＬまたは他のクエンチ可能な色素で単一に標識したオリゴヌ
クレオチドは標的配列にハイブリダイズし、そして蛍光をクエンチャー色素を使
用せずにクエンチされる。Ｔａｑポリメラーゼはプローブを５’末端から消化し
、そして５’− ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−ヌクレオチドを放出し、従ってこのクエンチングを克服し、そして検出可能なシグナルを生成する。この系を
図３Ｃに図示する。

【００７９】（実施例６単一標識クエンチング分子標識）分子標識系は、同質な溶液中の特定の核酸の存在を示す。これらのプローブは
、自発的な蛍光発生的な構造変化を、これらがそれらの標的にハイブリダイズす
る時に生じる。完全に相補的な標的のみが、この標的がミスマッチのヌクレオチ
ドまたは欠失を含む時にハイブリダイゼーションが生じないのと同じように、こ
の応答を誘発する。このプローブを、特定の核酸の合成をリアルタイムでモニタ
ーするために使用し得る。核酸増幅アッセイにおいて使用する場合、遺伝子検出
は同質かつ感受性であり、そして密封したチューブにおいて実施され得る。Ｔｙ
ａｇｉら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ１４：３０３−３０８を参照のこと。

【００８０】プローブは、ステムおよびループ構造を保有する一本鎖の核酸分子である（図
４Ａを参照のこと）。この分子のループ部分は、この標的核酸中の予め決定され
た配列に相補的であるプローブ配列である。このステムは、プローブ配列のいず
れかの側にある２つの相補的なアーム配列のアニ−リングにより形成され、そし
てこのアーム配列は標的配列には関連しない。

【００８１】蛍光団を１つのアームの末端に付着させ、そして非蛍光性クエンチャー部分を
他のアームの末端に付着させる。このステム構造を蛍光団およびクエンチャーを
互いにすぐ近くに保持するため、そして単離したプローブにおける蛍光共鳴エネ
ルギー転移（ＦＲＥＴ）によるフルオレホアの効率的なクエンチングを確実にす
るために使用する。このプローブが標的分子にハイブリダイズする場合、より長
く、従って、ハイブリッドステム構造よりもさらに安定なハイブリッドを形成す
る。このプローブは、アーム配列を別々にさせる自発的な構造変化を生じ、そし
て蛍光団およびクエンチャーを分離させる。従って、ＦＲＥＴをプローブと標的
のハイブリダイゼーションの際にクエンチされ、そして蛍光団は検出可能な蛍光
シグナルを直ちに放射し得る。

【００８２】この類似する設計を、分離クエンシング色素を必要とすることなく使用し得る
（図４Ｂを参照のこと）。このヘアピンプローブをクエンチ可能な色素で一方の
末端で標識する。このヘアピン構造における場合では、クエンチ可能な色素の蛍
光は、末端のヌクレオチドが二重鎖の一部であることから、本質的には完全にク
エンチされる。標識ヘアピン二重鎖が破損され、そして標的との長い二重鎖が形
成される場合、このクエンチ可能な色素で標識した末端はもはや二重鎖ではなく
、そして色素の蛍光のクエンチングを克服する。

【００８３】遊離のハイブリダイズしていないプローブは、検出可能な放射線を放出せず、
そして、従って、標的にハイブリダイズしているプローブとハイブリダイズして
いないプローブを分離する必要はない。従って、単一標識クエンチング分子標識
を、同質のアッセイにおいて、および生存細胞において核酸を検出するために使
用し得、ならびに核酸が合成されているアッセイ（例えば、ポリメラーゼ連鎖反
応）においてリアルタイムでモニターするために使用し得る。

【００８４】（実施例７リガーゼ連鎖反応）図５において図示されるこの方法において、２つの配列であるＰＳＣＰｃ（５
’−ＴＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＡＧＴＧ−
３’）およびＮＡ１（標的配列であるＴＡ１の第一の部分に相補的である第一の
核酸配列）を含むプローブを、配列ＮＡ２（標的配列ＴＡ２の第二の部分に相補
的な第二の核酸配列）およびＬＬＡ２（ＣｈｉｒｏｎのＱｕａｎｔｉｐｌｅｘア
ッセイにおける標識伸長剤配列）の配列を含む別のプローブと、両方のプローブ
が標的にハイブリダイズされる場合に特異的に連結する。オリゴヌクレオチド産
物を、第一のおよび標的に相補的である第二のセットの隣接するオリゴヌクレオ
チドの存在下での連結反応のサーマルサイクリングにより指数関数的に増幅する
。増幅後、この連結したプローブ産物であるＰＳＣＰｃ−ＮＡ１−ＮＡ２−ＬＬ
Ａ２を、固体基板上（例えば、プレートまたはビーズ）で捕捉し、この基板には
ＰＳＣＰ配列を含むオリゴマーをＰＳＣＰｃテイルを介して付着させる。このＬ
ＬＡ２テイル配列の存在は、連結産物を検出するためのクエンチ可能な色素リン
カーを介して結合させた標識プローブを使用するｂＤＮＡ増幅アッセイの使用を
可能にさせる（図５を参照のこと）。

【００８５】（実施例８クエンチ可能な蛍光オリゴマー）酵素学的なＤＮＡ／ＲＮＡ合成間のクエンチ可能な色素標識化ヌクレオチド三
リン酸の取り込みは、強力に蛍光性のオリゴマーを生成する。しかし、このオリ
ゴマーが二本鎖または三本鎖のハイブリッド複合体である場合は、この色素はク
エンチされる。鎖の分離（例えば、温度上昇への曝露による）は、取り込まれた
標識化ヌクレオチドに由来する強力な蛍光シグナルを生じる。このようなオリゴ
マーは、核酸ハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用である。

【００８６】（実施例９鎖置換アッセイ）Ｅｌｌｗｏｏｄら（１９８６）ＣｌｉｎＣｈｅｍ．３２：１６３１−１６３
６は、ネイティブなオリゴヌクレオチド鎖と点変異を含む鎖との間を識別するア
ッセイ系を記載する。この系において、長いプローブのオリゴマーを、より短い
標識化オリゴマー（２０〜５０ヌクレオチド）にハイブリダイズさせる。このハ
イブリッドを、変異鎖を含むと考えられるサンプルと混合させ；サンプル中に存
在する任意の標的ＤＮＡを標識化オリゴマーと置換する。この結果を定量するた
めに、この置換したオリゴマーをハイブリッドから適切な技術を使用して分離し
なくてはならない。このサンプル技術は、潜在的に核酸種の定量化に非常に価値
があるが、単純かつ信頼性の高い分離方法を有することが重要である。

【００８７】クエンチ可能な色素標識プローブを使用するＥｌｌｗｏｏｄらの系は、二本鎖
ＤＮＡ形態においてはクエンチ可能な色素の蛍光がクエンチされることから、分
離なしで作用する（すなわち、同質のアッセイとして作用する）が、置換後は蛍
光を発する（図６を参照のこと）。

【００８８】（実施例１０点変異の検出）Ｓａｉｋｉら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：１００８−１０
１２（本明細書において参考として援用される）は、点変異を含む遺伝子を検出
するための方法を記載する。野生型遺伝子における標的配列に相補的な短い³²Ｐ
標識オリゴヌクレオチドを調製し、そしてサンプルＤＮＡにハイブリダイズさせ
、それによって新しい制限酵素切断部位を作製する。このサンプルが標的配列中
に点変異を有する遺伝子を含む場合、この変異は、例えば、標識化オリゴヌクレ
オチド−変異遺伝子のハイブリッド複合体形成においてミスマッチ塩基対を生じ
る。このミスマッチ塩基対の存在は、オリゴヌクレオチド−変異遺伝子ハイブリ
ッド二重鎖の制限酵素による切断を妨害する。任意のハイブリダイズしていない
標識化オリゴヌクレオチドを変異特異的オリゴマー（すなわち、標識化オリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズして制限酵素切断部位を有さない複合体を形成する
オリゴマー）の添加によりブロックする。適切な制限酵素の添加は、野生型遺伝
子のみを切断し、オリゴマーの短い標識化一本鎖フラグメントを溶液中に放出す
る。電気泳動による分離およびオートラジオグラフィーは、変異対立遺伝子の場
合と同様に、遺伝子になおも結合している標識が、短いフラグメント上にあるか
否かを明らかにする。

【００８９】クエンチ可能な色素標識化プローブを使用して、この方法を液相において成分
の分離を要求することなく完全に行えるように改変し得る。プローブの野生型遺
伝子へのハイブリダイゼーションの後、制限消化は、標的の部分を有する短い二
重鎖における標識化プローブの一部を放出する。この二重鎖を、非常に短くそし
て安定性の低い二重鎖で自発的に鎖の分離を生じるように設計し得る。二重鎖に
おけるクエンチ可能な色素の蛍光のクエンチングを克服し、そして検出可能なシ
グナルを生じる。この変異遺伝子が存在する場合、この検出可能なシグナルを実
質的に減少させるかまたは排除する。過剰のクエンチ可能な色素標識化プローブ
は、変異特異的オリゴマーとハイブリダイズしたままであり、従って色素シグナ
ルをクエンチし、そして色素シグナルは検出不可能である（図７を参照のこと）
。

【００９０】（実施例１１点変異の検出）遺伝子における点変異を検出するための第二の方法を、図８に図示する。この
方法では、遺伝子中のネイティブな標的核酸配列に相補的である第一の核酸配列
を有する第一のプローブを調製する。この標的核酸配列を、点変異を含むことが
予測される配列に対してごく近傍にあるかまたは隣接するように、そして点変異
を含むことが予測される配列から上流（図示するように）または下流のいずれか
において選択する。この第一のプローブは、第二のプローブにおける核酸配列に
相補的な第二の核酸配列を有する。第一の核酸プローブの第二の核酸配列を、ク
エンチ可能な色素分子に共有結合させる。この遺伝子における野生型核酸配列ま
たは必要に応じて図８で示すように点変異を保有するこの遺伝子中の核酸配列に
相補的な第三の核酸配列を有する第二のプローブを提供する。この遺伝子におけ
る野生型核酸配列または変異核酸配列は、ネイティブな標的核酸配列から下流（
図示するように）または上流にある。この第二のプローブは、第一のプローブの
第二の核酸配列に相補的である第四の核酸配列を有する。

【００９１】このアッセイを、例えば、２つの代わりのプロトコルを使用して行い得る。第
一の代わりにおいて、目的の遺伝子をハイブリダイズする条件下で第一のプロー
ブとともにインキュベートして遺伝子−第一のプローブのハイブリッド複合体を
形成する。次いで、遺伝子−第一のプローブのハイブリッド複合体を第二のプロ
ーブとインキュベートし、ここで第三の配列が野生型配列と相補的かまたは目的
の遺伝子における変異核酸配列と相補的であるかのいずれかである（図８を参照
のこと）。この遺伝子が野生型遺伝子を含み、そして第二のプローブが変異配列
に相補的である場合、この遺伝子−第一のプローブのハイブリッド複合体は第二
のプローブとハイブリダイズせず、そしてクエンチ可能な色素化合物からの発光
放射には影響しない。この遺伝子が変異配列を含み、そして第二のプローブがそ
の変異配列に相補的である場合、遺伝子−第一のプローブ−第二のプローブの複
合体が形成され、そしてこの色素からの発光放射は実質的にクエンチされる。従
って、シグナル発光の減少は、点変異の存在を示す。

【００９２】第二の代わりにおいて、このアッセイを、野生型配列に相補的である第三の配
列を有する第二のプローブを使用して行い得る。この場合において、シグナル発
光の減少は、野生型配列の存在を示すが、この遺伝子が変異核酸配列を含む場合
では存在を示さない。

【００９３】（実施例１２高分解能ファイバー蛍光インサイチュハイブリダイゼーショ
ンの光学マッピング）高分解能ファイバー蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）の
光学マッピングは、ＤａｖｉｄＳｃｈｗａｒｔｚの研究室で開発された方法論
の拡張版である（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７０−７４、および同書において引用される参考
文献；Ｓａｍａｄら（１９９５）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．５：１−４、および同
書において引用される参考文献；Ｍｅｎｇら、（１９９５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ
．９：４３２−４３８；ならびにＣａｉら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：５１６４−５１６８を参照のこと）。

【００９４】ＤＮＡを、延長型のシラン処理したカバーガラスに付着させる。一旦、結合さ
せ、そして伸長させると、このＤＮＡはハイブリダイゼーションについて利用可
能である。同様の方法論が報告されている（例えば、Ｗｅｉｅｒら（１９９５）
ＨｕｍａｎＭｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．４：１９０３−１９１０、ここでビオチ
ンおよびジゴキシゲニン標識プローブとのハイブリダイゼーションによる配列特
異的標識を有する伸長型ＤＮＡ分子を標識する能力が実証された）。しかし、蛍
光標識抗体または蛍光標識アビジン分子の多重層は、検出可能な蛍光シグナルを
生成するために必要とされた。本実施例において記載する実験は、配列特異的様
式においてＤＮＡを標識する分枝ＤＮＡの有用性を実証し、それによってＤＮＡ
の特異的領域を検出するための多重層の必要性を除去する。

【００９５】Ａ．λＤＮＡを、プローブおよび確認目的のためににＷｅｉｅｒらにより報告
されているプロトコルを使用するハイブリダイゼーションにより標識した。ＤＮ
Ａ制限フラグメントの長さを報告されている結果と比較した。

【００９６】Ｂ．モデル系を、より長い分子内のＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌ領域を検出するた
めに構築した。ＨＩＶｇａｇ／ｐｏｌＤＮＡをλＧＴ１０ファージ中に独自
のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。この２つの検出方法（Ｗｅｉｅｒら対ｂＤＮＡ）
を比較した。

【００９７】第一の方法において、プローブをランダムプライマーのプロトコルを使用して
合成した。このｇａｇ／ｐｏｌ領域をジゴキシゲニンで標識したプローブとハイ
ブリダイズし、次いでローダミン標識化抗ジゴキシゲニン抗体およびテキサスレ
ッド標識化抗ヒツジ抗体で検出した。λＤＮＡをフルオレセイン標識プローブと
ハイブリダイズさせ、次いで抗フルオレセイン抗体およびフルオレセイン標識化
抗マウス抗体で多重層において検出した。

【００９８】第二の方法において、ｂＤＮＡ技術を使用してλＧＴ１０構築物のＨＩＶ部分
を標識し、次いでλＤＮＡをオキサゾールの黄色ホモダイマー（ＹＯＹＯ；Ｇｌ
ａｚｅｒら（１９９２）Ｎｅｔｕｒｅ３５９：３５９）で対比染色した。ハイブ
リダイゼーションの結果を、ＩＰＬａｂｓシステムソフトウェアを使用して分
析した。

【００９９】 λＤＮＡのファイバーＦＩＳＨマッピング：λの６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメントを抗ジゴキシゲニンテキサスレッド抗体でマッピングし、そしてＦＩＴ
Ｃ標識化バックボーンに沿う赤色のスポットとして現れた。ファイバーＦＩＳＨ
マッピングは、６ｋｂのフラグメントを２ｋｂの実際のマップ位置内部にマッピ
ングし得た。

【０１００】ＧＴ１０／ＨＩＶＤＮＡのファイバーＦＩＳＨマッピング：２．８ｋｂのＨ
ＩＶフラグメントを抗ジゴキシゲニンテキサスレッド抗体でマッピングし、そし
て赤色のスポットがＦＩＴＣのバックボーンに沿うように現れた。ファイバーＦ
ＩＳＨマッピングは、１ｋｂの実際のマップ部位以内に２．８ｋｂのフラグメン
トをマッピングし得た。

【０１０１】ＧＴ１０／ＨＩＶＤＮＡのファイバーＦＩＳＨｂＤＮＡマッピング：ＨＩ
ＶのフラグメントをｂＤＮＡのテキサスレッド標識プローブでマッピングし、そ
してＹＯＹＯ標識化バックボーンに沿うように赤色のスポットとして現れた。ｂ
ＤＮＡを使用して、ＨＩＶのフラグメントを１ｋｂの予測されるマップ位置内に
マッピングし、ファイバーＦＩＳＨのマッピングに匹敵した。

【０１０２】これらの結果は、大きなバックボーン上におけるＤＮＡの小さな領域のマッピ
ングにおけるｂＤＮＡの有用性を実証する。ｂＤＮＡを使用して、完了までの時
間を大幅に短くしただけではなく（１日未満）、ｂＤＮＡを使用する蛍光シグナ
ルは、極めて高かった。

【０１０３】（実施例１３フローサイトメトリーにおけるｂＤＮＡシグナル増幅の使用
）フローサイトメトリーアッセイは、固相および標識プローブを例外としてはマ
イクロウェル形式ｂＤＮＡアッセイにおいて使用される試薬と同一のものを使用
する。フローサイトメトリー技術において、微粒子（ラテックスビーズ）は捕捉
オリゴヌクレオチドで誘導体化される。ｂＤＮＡおよび蛍光レポータープローブ
でのシグナル増幅後、フローサイトメーターは、アッセイ混合物におけるビーズ
の蛍光を測定する。結合していないレポーター分子またはこのビーズのサイズ（
約３μｍ）以外の任意のサイズの粒子は検出されない。シグナル増幅後、単一の
標的分子を捕捉したこのビーズの蛍光を、標的を捕捉していないビーズの蛍光か
ら明確に分離する。

【０１０４】従って、核酸ハイブリダイゼーションアッセイおよび標識化オリゴマーとその
相補体とのハイブリダイゼーションを含む他の方法における標的依存性シグナル
を生成するための新規な方法が開示された。さらに、オリゴマー−色素結合体が
開示された。本発明の好ましい実施態様が、幾分詳細に開示されたが、明らかな
改変が、添付される請求の範囲により定義されるような本発明の精神および範囲
から逸脱することなくなされ得ることが理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例３に記載される実験の結果の模式図である。三角形は、溶液中
の遊離のクエンチ可能な色素標識プローブについて得られる蛍光を示す。ひし形
は、クエンチ可能な色素標識プローブ−増幅マルチマーハイブリッド複合体につ
いて得られる蛍光を示す。

【図２】図２は、実施例３において記載される実験の結果の模式図であり、ここでクエ
ンチ可能な色素はＴ₅リンカーを介してオリゴマープローブに結合体化される。三角形は、溶液中で遊離のクエンチ可能な色素標識プローブについて得られる蛍
光を示す。ひし形は、オリゴマー−３’−Ｔ₅−クエンチ可能な色素標識プローブ増幅マルチマーハイブリッド複合体について得られる蛍光を示す。

【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、実施例５に示されるように、それぞれニックトランス
レーションＰＣＲおよび５’ヌクレアーゼアッセイにおいて二重標識蛍光産生プ
ローブの使用を示す図である。図３Ｃは、実施例５に記載されるようなＴａｑポ
リメラーゼに基づくアッセイ系における単一のクエンチ可能な色素種を用いて標
識したプローブの使用の図である。

【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、実施例６に記載されるような、それぞれ、二重標識し
た分子標識光および単一標識のヘアピンプローブの操作の原理を示す。

【図５】図５は、実施例７に記載されるようなＬＣＲ蛍光アッセイを使用して、単一塩
基変化の検出および増幅を示す図である。

【図６】図６は、実施例９に記載されるような鎖置換ＤＮＡプローブアッセイの模式図
である。

【図７】図７は、実施例１０に記載されるような、点変異を検出するためのハイブリダ
イゼーションアッセイの模式図である。

【図８】図８は、実施例１１に記載されるような、点変異を検出するためのハイブリダ
イゼーションアッセイの模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スクローダー，ハートマットアール. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02032，イーストウォルポール，コニーストリート 333，カイロンダイアグノスティックスコーポレイション内 (72)発明者ワーナー，ブライアンディー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 02032，イーストウォルポール，コニーストリート 333，カイロンダイアグノスティックスコーポレイション内 (72)発明者フィス，エレンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02032，イーストウォルポール，コニーストリート 333，カイロンダイアグノスティックスコーポレイション内 (72)発明者セルズ，トッドアメリカ合衆国マサチューセッツ 02032，イーストウォルポール，コニーストリート 333，カイロンダイアグノスティックスコーポレイション内 (72)発明者ロー，セイ−ジョンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02032，イーストウォルポール，コニーストリート 333，カイロンダイアグノスティックスコーポレイション内Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 CA10 HA12 4B063 QA17 QQ42 QR32 QR56 QR66 QS03 QS34 QS36 QX02 4C057 BB02 BB05 DD01 MM02 MM04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中の目的のオリゴヌクレオチドを検出するための方
法であって、（ａ）（ｉ）目的のオリゴヌクレオチドにおける第１の核酸配列に相補的な第
１の核酸配列、および（ｉｉ）プローブが１本鎖のハイブリダイズしていない形
態である場合、該プローブが相補的な核酸鎖にハイブリダイズするときに、実質
的にクエンチされる検出可能な発光放射を提供する標識、を含む第１のオリゴヌ
クレオチドプローブを提供する工程；（ｂ）該第１のプローブ−該目的のオリゴヌクレオチドのハイブリッド複合体
を形成するようにハイブリダイズする条件下で、該第１のオリゴヌクレオチドプ
ローブからの発光された放射をモニターしながら、該目的のオリゴヌクレオチド
を含むと疑われるサンプルと該第１のオリゴヌクレオチドプローブとを合わせる
工程；ならびに（ｃ）工程（ｂ）全体を通して生じる発光された放射における任意の変化を該
目的のオリゴヌクレオチドの存在または量と相関させる工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記標識が蛍光色素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記色素がジピロメテンボロンジフルオリド化合物である、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項３に記載の方法
であって：【化１】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、方法。
【請求項５】前記色素が以下：【化２】である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記色素化合物が前記標識プローブに直接的にカップリング
される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記色素化合物が前記標識プローブに間接的にカップリング
される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】前記色素化合物が、前記目的のオリゴヌクレオチドにおける
核酸配列と実質的に特異的にハイブリダイズし得ないリンカーを介して、前記標
識プローブにカップリングされる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記リンカーが核酸配列である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】溶液相において、サンプル中の核酸分析物を検出するため
のサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって、（ａ）該分析物を固
体支持体に間接的に結合する工程、（ｂ）該分析物を標識化する工程、および（
ｃ）該支持体における標識の存在を検出する工程を包含し、（ｉ）該分析物中の核酸配列とハイブリダイズし得る第１のセグメントＬ−１
および第２のセグメントＬ−２を有する標識伸長剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）分子、
（ｉｉ）核酸配列Ｌ−２とハイブリダイズし得る核酸配列Ｍ−１を含む増幅マル
チマーおよび標識プローブとハイブリダイズし得る核酸配列Ｍ−２を含む複数の
同一のオリゴヌクレオチドサブユニット、（ｉｉｉ）Ｍ−２とハイブリダイズし
得る核酸配列Ｌ−３を含む標識プローブ、ならびに該分析物、該標識伸長剤、該
増幅マルチマーまたは標的ヌクレオチド配列における核酸配列と特異的にハイブ
リダイズし得ないリンカーを介して、該プローブとカップリングされたクエンチ
可能な色素、を含むプローブシステムを取り込む工程、を含む改善を包含する、
アッセイ。
【請求項１１】前記クエンチ可能な色素が蛍光色素を含む、請求項１０に
記載のアッセイ。
【請求項１２】前記色素がジピロメテンボロンジフルオリド色素である、
請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項１２に記載の
アッセイであって：【化３】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ１−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニ
ル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、アッセイ。
【請求項１４】前記色素が以下：【化４】である、請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】前記リンカーが核酸配列である、請求項１０に記載のアッ
セイ。
【請求項１６】（ｉ）目的のオリゴヌクレオチドにおける核酸配列に相補
的な核酸配列、および（ｉｉ）プローブが１本鎖のハイブリダイズしていない形
態である場合、該プローブが相補的な核酸鎖にハイブリダイズするときに、実質
的にクエンチされる検出可能な蛍光シグナルを提供する標識を含む、オリゴヌク
レオチドプローブ。
【請求項１７】前記標識が蛍光色素を含む、請求項１６に記載のオリゴヌ
クレオチドプローブ。
【請求項１８】前記色素化合物がジピロメテンボロンジフルオリド色素で
ある、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項１９】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項１８に記載の
オリゴヌクレオチドプローブであって：【化５】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ１−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニ
ル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２０】前記色素が以下：【化６】である、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２１】前記色素化合物が前記標識プローブと直接的にカップリン
グされている、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２２】前記色素化合物が前記標識プローブと間接的にカップリン
グされている、請求項１６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２３】前記色素化合物が、前記目的のオリゴヌクレオチドにおけ
る核酸配列と実質的に特異的にハイブリダイズし得ないリンカーを介して、前記
標識プローブにカップリングされる、請求項２２に記載のオリゴヌクレオチドプ
ローブ。
【請求項２４】前記リンカーが核酸配列である、請求項２３に記載のオリ
ゴヌクレオチドプローブ。
【請求項２５】請求項１に記載の方法であって、ここで前記目的のオリゴヌクレオチドは野生型遺伝子であり、そして前記第１のオリ
ゴヌクレオチドプローブにおける第１の核酸配列は、該野生型遺伝子における標
的配列と相補的であって、ここで、該方法は、（ｉ）該野生型遺伝子における該第１のオリゴヌクレオチドプローブと該標的
配列との間のハイブリッド二重鎖の形成が特異的制限酵素によって切断可能な部
位を作製し；そして（ｉｉ）該第１のオリゴヌクレオチドプローブと該野生型遺伝子の改変体にお
ける、点変異を含む標的配列との間のハイブリッド二重鎖の形成が、該制限酵素
によって切断可能な部位を作製せず；（ｉｉｉ）工程（ｂ）は、該標識化された第１のオリゴヌクレオチドプローブと、改変体プローブハイブ
リッドを形成するように該野生型遺伝子の改変体を含むと疑われるサンプルとを
、インキュベートさせる工程；該サンプルに、該標識化された第１のオリゴヌクレオチドプローブにハイブリ
ダイズし得るオリゴマーを添加して、制限酵素切断部位を含まないハイブリッド
複合体を形成する工程；および該オリゴマーの添加後に、該サンプルに該制限酵素を添加する工程、を包含する、方法。
【請求項２６】前記色素がジピロメテンボロンジフルオリド化合物である
、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項２６に記載の
方法であって：【化７】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、方法。
【請求項２８】前記色素が以下：【化８】である、請求項２７に記載のアッセイ。
【請求項２９】請求項１に記載の方法であって、ここで、工程（ａ）において提供される前記第１のオリゴヌクレオチドプローブが、５
’末端ヌクレオチドにおいて単一に標識されている；工程（ａ’）が、オリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程を包含し、こ
こで、該プライマーは、前記目的のオリゴヌクレオチドにおける前記第２の配列
に相補的であり、そしてさらに該目的のオリゴヌクレオチドにおける該第１の核
酸配列が、該目的のオリゴヌクレオチドにおける該第２の核酸配列から下流にあ
る；工程（ｂ）は、該第１のオリゴヌクレオチドプローブおよび該プライマーが、
該目的のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする条件下で、該第１のオリゴヌ
クレオチドプローブおよび該プライマーを、該目的のオリゴヌクレオチドを含む
サンプルとともにインキュベートする工程、をさらに包含し；工程（ｂ’）は、酵素が３’ポリメラーゼ活性および５’ヌクレアーゼ活性を
有する条件下で、該サンプルに該酵素を添加する工程を包含し、ここで、工程（ｂ’）で生じる発光された放射の変化は、発光された放射の増
加である、方法。
【請求項３０】前記色素がジピロメテニルボロンジフルオリド化合物であ
る、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項３０に記載の
方法であって：【化９】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の
群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で
少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、方法。
【請求項３２】前記色素が以下の構造：【化１０】である、請求項３１に記載のアッセイ。
【請求項３３】（ｉ）第１および第２の相補的ヌクレオチド配列が互いに
ハイブリダイズする場合、ループ構造を形成する第３のオリゴヌクレオチド配列
と隣接する該第１および該第２の相補的オリゴヌクレオチド配列を含む１本鎖核
酸分子であって、ここで、該ループ構造における該第３のヌクレオチド配列が標
的オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を
含む、核酸分子、および（ｉｉ）該第１および該第２のヌクレオチド配列が互い
にハイブリダイズされる場合、実質的にクエンチされ、そして該第３のオリゴヌ
クレオチド配列が目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、該第１およ
び該第２のヌクレオチド配列がハイブリダイズされない形態にある場合、検出可
能な蛍光シグナルを提供する標識を含む、単一の標識化されたオリゴヌクレオチ
ドプローブ。
【請求項３４】前記標識が蛍光色素を含む、請求項３３に記載のオリゴヌ
クレオチドプローブ。
【請求項３５】前記色素化合物がジピロメテンボロンジフルオリド色素で
ある、請求項３４に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３６】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項３５に記載の
オリゴヌクレオチドプローブであって、【化１１】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３７】前記色素が以下：【化１２】である、請求項３６に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３８】請求項１に記載の方法であって、さらに、ここで、工程（ａ’）は、前記目的のオリゴヌクレオチドにおいて前記第１の核酸配列
に相補的な第２の核酸配列を含む、第２のオリゴヌクレオチドプローブを提供す
る工程を包含し：工程（ｂ’）は、前記第１のオリゴヌクレオチドプローブから発光された放射
をモニターしながら、該第１のオリゴヌクレオチドプローブが第１のプローブ−
目的のオリゴヌクレオチド複合体から置換される条件下で、工程（ｂ）で形成さ
れる第１のプローブ−目的のオリゴヌクレオチドハイブリッド複合体を、第２の
オリゴヌクレオチドプローブと合わせる工程を包含する、方法。
【請求項３９】前記色素がジピロメテンボロンジフルオリド化合物である
、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項３９に記載の
方法であって、【化１３】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、方法。
【請求項４１】前記色素が以下の構造：【化１４】である、請求項４０に記載のアッセイ。
【請求項４２】請求項１に記載の方法であって、前記第１のオリゴヌクレ
オチドプローブは単一に標識され、かつ第１および第２の相補的な核酸配列が、
ステム構造として形成させるために、互いにハイブリダイズする場合、ループ構
造を形成する第３の核酸配列に隣接する該第１および第２の相補的な核酸配列を
含む１本鎖核酸分子を含み、ここで、該ループ構造における該第３の核酸は、前
記目的のオリゴヌクレオチドにおける第１の核酸配列に相補的な核酸配列を含み
、そしてここで該標識は、該第１および第２の核酸配列が該ステム構造を形成するためにハイブリダイズ
される場合、発光された放射が実質的にクエンチされるような標識であり、かつ
該第３のオリゴヌクレオチド配列が目的のオリゴヌクレオチドにハイブリダイ
ズされ、そして該第１および第２の核酸配列がハイブリダイズされていない形態
である場合、検出可能な発光放射を提供する標識である、方法。
【請求項４３】前記標識が蛍光色素を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】前記色素化合物が、ジピロメテンボロンジフルオリド色素
である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項４４に記載の
方法であって、【化１５】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、方法。
【請求項４６】前記色素が以下の構造：【化１６】である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】請求項１に記載の方法であって、ここで前記第１のオリゴ
ヌクレオチドプローブが、第２のプローブにおける第３の核酸配列に相補的な第
２の核酸配列をさらに含み、ここで、前記目的のオリゴヌクレオチドにおける第１の核酸配列が、該目的の
オリゴヌクレオチドにおける第２の核酸配列に隣接し、ここで、該目的のオリゴ
ヌクレオチドにおける第２の核酸配列が野生型核酸配列または点変異を含む核酸
配列のいずれかであり、そしてここで、該方法は、（ａ’）第３および第４の核酸配列を有する第２のオリゴヌクレオチドプロー
ブを提供する工程であって、ここで、該第３の核酸配列は、該目的のオリゴヌク
レオチドにおける野生型または第２の変異体核酸配列のいずれかに相補的であり
、そして該第４の核酸配列が該第１のオリゴヌクレオチドプローブにおける第２
の核酸配列に相補的である、工程；ここで、工程（ｂ）は、該第２のオリゴヌクレオチドプローブと、該第１のプ
ローブ−目的のオリゴヌクレオチド複合体とともにインキュベートする工程をさ
らに包含し；そしてここで、工程（ｃ）は、工程（ｂ）全体を通して生じる発光された放射におけ
る任意の変化と、該野生型配列または該変異配列の存在とを相関させる工程を包
含する、方法。
【請求項４８】前記標識が蛍光色素を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記色素化合物がジピロメテンボロンジフルオリド色素で
ある、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】前記色素が以下の化学構造を有する、請求項４９に記載の
方法であって、【化１７】ここで、Ｒ¹〜Ｒ⁷は、独立して、水素；ハロゲン；アルキル；カルボキシアルキ
ル；アシル；アリール；アリールアルキル；スルホニル；ホルミル；式−ＣＸ＝
ＣＹ−Ｚを有する置換型エテニル（ここで、Ｘ、ＹおよびＺは、独立して、ハロ
ゲン、Ｃ₁−Ｃ₁₀アルキル、シアノ、エステル、アミド、エテニル、ポリエテニル、アリールまたはヘテロアリールである）；および−Ｌ−Ｇ（ここで、Ｌは、
連結部分であり、そしてＧは、アミノ酸またはカルボン酸部分に対して色素を結
合し得る反応性基である）からなる群より選択されるか；またはここで、（ａ）Ｒ¹およびＲ²、またはＲ²およびＲ³のいずれか、および
／または（ｂ）Ｒ⁴およびＲ⁵、またはＲ⁵およびＲ⁶のいずれかが、ともに、水素
、ハロゲン、シアノ、スルホニル、スルホネート、カルボキシル、カルボキシレ
ート、アルキル、過フルオロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ニトロ、ア
ミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアミド、アリール、ア
リールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、アリールアミノ、ヘテ
ロアリールアミノ、またはアリールアミドからなる群より選択される０〜４の置
換基で置換されたベンゼン環を形成するか、またはここで、２つのオルト置換基
がさらなるこのような芳香族環を形成するように結合され、ただし、Ｒ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも１つの置換基がヘテロアリールであり、
かつＲ¹〜Ｒ⁷の群内で少なくとも第２の置換基が−Ｌ−Ｇである、方法。
【請求項５１】前記色素が以下：【化１８】である、請求項５０に記載の方法。