KR100971571B1 - 치료적으로 유용한 트리에틸렌글리콜 콜레스테릴올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8인 5'-OR, 3'-TEG 콜레스테릴 합성 서열 및 약학적 허용성 담체를 함유하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 이 조성물을 약물 제조에 사용하는 방법 및 세포내 반응, 예컨대 비제한적으로 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 카스페이즈 활성화 유도, 폴리(ADP-리보스)폴리머레이즈 절단, 아폽토시스 유도 또는 세포외간질-세포 상호작용 조정 또는 이의 복합 반응을 비롯한 반응을 암 세포 및/또는 윤활 세포에서 유도하는데 상기 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
트리에틸렌글리콜 콜레스테릴, 올리고뉴클레오타이드, 카스페이즈, 증식 억제, 아폽토시스, 암 세포, 관절염

Description

치료적으로 유용한 트리에틸렌글리콜 콜레스테릴 올리고뉴클레오타이드 {THERAPEUTICALLY USEFUL TRIETHYLENEGLYCOL CHOLESTERYL OLIGONUCLEOTIDES}
본 발명은 콜레스테릴기가 접합된 올리고뉴클레오타이드 조성물, 이것의 세포 증식 억제, 아폽토시스 유도, 세포 주기 발달 변형 및 세포외간질-세포 상호작용의 조정에 대한 용도에 관한 것이다.
증식은 1개 세포를 2개 세포로 분열시키는 세포 주기를 통한 세포 발달의 결과이다. 세포 주기에는 5가지 주 시기가 있는데, 즉 G0, G1, S, G2 및 M이 그것이다. G0 기의 세포는 정지 상태이다. 체내의 대부분의 세포들은 한번은 이 단계에 존재한다. G1 기 동안의 세포는 분열하라는 신호에 반응하여 DNA 합성에 필요한 단백질과 RNA를 생산한다. S 기(SE, S 초기; SM, S 중기; SL, S 후기) 동안의 세포는 자신의 DNA를 복제한다. G2기 동안에는 단백질들은 함께 세포 분열을 위해 준비한다. 유사분열(M)기 동안에 세포는 2개의 딸세포로 분열한다. 세포 주기 발달의 변화는 모든 암에서 나타나는 것으로서, 유전자의 과잉발현, 조절 유전자의 변이 또는 DNA 손상 점검점들의 폐기 등에 의해 일어날 수 있다(Hochhauser D., Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents, 8:903, 1997).
아폽토시스(apoptosis) 또는 세포예정사(programmed cell death)는 불필요한 세포를 사멸 및 제거하는 생리적 과정으로서, 화학치료제가 암 세포를 사멸시키는 기구이다. 아폽토시스는 세포내의 독특한 형태적 변화를 특징으로 하는데, 그 변화에는 핵 염색질의 응축, 세포 수축, 핵 붕괴, 혈장막 수포 및 막 결합성 아폽토시스체의 형성 등이 있다(Wyllie et al., Int. Rev. Cytol., 68:251, 1980). 혈장막의 내면에서부터 외면으로의 포스파티딜세린의 전위는 염색질 응축과 동시에 일어나서, 세포의 아폽토시스 지표로 간주되고 있다(Koopman, G. et al., Blood, 84:1415, 1994). 아폽토시스 기구는 카스페이즈(caspase)로 알려진 시스테인 프로테아제 군의 활성화를 통해 조정되는 것으로 알려져 있다.
카스페이즈는 기질로서 다음과 같은 3가지 주요 펩타이드 서열을 인식한다(Thornberry et al., J.Biol.Chem. 272:17907, 1997): (i) Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD, 카스페이즈-1, -4), (ii) Asp-Glu-Val-Asp(DEVD, 카스페이즈-2, -3 및 -7), 및 (iii) Ile-(Leu)-Glu-X-Asp(I(L)EXD; 카스페이즈-8 및 -10). 표적 단백질 내의 서열이 인식되면 표적의 제한적이고 특이적인 단백분해가 일어나는데, 그 예로서 카스페이즈-3에 의한 카스페이즈-7의 활성화, 라민(이에 한정되지 않음) 등의 구조 단백질 표적의 분해 또는 폴리(ADP-리보스)폴리머레이즈(이에 한정되지 않음) 등의 효소 활성화 등이 있다. 카스페이즈-3은 전구아폽토시스 신호 다음의 자신의 촉매적 활성 서브유닛으로 절단되어 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고되었다(Susin et al., J.Exp.Med. 186:25, 1997).
아폽토시스 동안, 카스페이즈의 활성화는 다양한 기질을 단백분해 절단한다. DNA 수복에 관여하는 핵 효소인 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈(PARP)는 아폽토시스 동안 카스페이즈-3 절단의 기질로 공지되어 있다. 이 절단은 아폽토시스의 지표로 간주되고 있다(O'Brien et al., Biotechniques 30:886, 2001).
세포외간질(ECM)은 정상 세포와 종양 세포의 작용에 영향을 미친다(Radisky et al., Seminars Cancer Biol., 11:87, 2001). 따라서, ECM 상에 종양 세포를 도말하면, 종양 세포와 ECM 성분 간의 상호작용이 생체내 종양의 몇몇 생물병리학적 특징, 예를 들어 세포-세포 접촉 조정과 유사한 신호 도입 사건을 활성화할 것이다(Weaver et al., J.Cell Biol., 137:231, 1997).
합성 올리고뉴클레오타이드는 세포 내에 흡수되는 다음이온 서열이다(Vlassov et al., Biochim. Biophys. Acta, 11197:95, 1994). 합성 올리고뉴클레오타이드는 핵산(Wagner, R., Nature, 372:333, 1994), 특정 세포 단백질(Bates et al., J.Biol.Chem., 274:26369, 1999) 및 특정 핵 단백질(Scaggiante et al., Eur.J.Biochem., 252:207, 1998)에 선택적으로 결합하여 암세포의 증식을 억제한다고 보고되었다.
콜레스테릴 기를 가진 올리고뉴클레오타이드의 물리적 성질과 합성에 대해서는 이미 알려져 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에 대한 콜레스테릴 기의 부착은, 그 올리고뉴클레오타이드의 활성을 향상시킨다(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:6553, 1989; Boutorin et al., FEBS Letter, 254:129, 1989; Corrias et al., J.Neurooncol. 31:171, 1997; 미국 특허 제4,958,013호; WO 특허 제9714440호). 3'-말단에 대한 콜레스테릴 기의 부착은 세 포의 안티센스 분자 흡수능을 향상시키고(Corrias et al., J.Neurooncol. 31:171, 1997), 생체내 안티센스 혈관 유지능을 증가시킨다(Fleser et al., Circulation 92:1296, 1995). 안티센스 분자의 활성을 증가시키는 변형으로서, 포스포아미데이트 결합을 통해 인에 결합된 뉴클레오사이드간 콜레스테릴 측쇄들이 개시된 바 있다(미국 특허 제4,958,013호). 5'-말단에 콜레스테릴 기를 가진 15개 시티딘 또는 티미딘 잔기의 단일중합체는 전골수세포 백혈병 세포 내의 세포질 Ca2+ 농도를 조정하는 것으로 밝혀진 반면, 5'-말단에 콜레스테릴 기를 가진 이종중합체 서열이나 콜레스테릴 기로 변형된 포스포로티오에이트 서열은 불활성이었다(Saxon et al., Antisense Res. Dev. 2:243, 1992). 사이토신 잔기와 아데노신 잔기가 교대로 반복되는 15개 포스포로티오에이트 데옥시뉴클레오타이드로 이루어진 이종중합체 또는 15개의 사이토신 잔기 또는 티미딘 잔기로 이루어진 단일중합체는 콜레스테릴 기가 5'-말단에 결합되었을 때 메토트렉세이트 운반의 강력한 억제제인 것으로 밝혀졌다(Henderon et al., Nucl. Acids Res. 25:3726, 1995). 또한, 5'-말단에 콜레스테릴 기를 가진 10개 염기로 이루어진 호모시티딘 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드의 공유 변형은 HIV 역전사효소의 억제를 통해 HIV-1 또는 HIV-2로 감염된 T 림프구에서의 합포체 형성을 차단시켰다(Stein et al., Biochemistry 5:2439, 1991).
올리고뉴클레오타이드에 대한 콜레스테릴 기의 부착은 암세포의 성장에 거의 영향을 미치지 않는다(Henderon et al., Nucl. Acids Res. 25:3726, 1995). 세포의 아폽토시스 사멸의 일반적 특징은 3'-말단에 콜레스테릴 기를 가진 올리고뉴클레오 타이드로 처리된 암세포주에서 관찰되지 않았다(Corrias et al., J.Neurooncol. 31:171, 1997).
대부분의 항암 치료법은 그 치료방향이 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 아폽토시스 유도, 면역계의 자극, 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정인지의 여부를 불문하고 임상적 적용에 부적당한 것으로 입증되어 있다. 이러한 치료법들은 대부분 효과적이지 못하거나 유독하고, 그 부작용도 상당하며, 약물 내성이나 면역감작을 발생시키고 환자를 쇠약하게 만든다.
따라서, 당해 기술분야에서는 암세포의 세포 주기 정지를 유도하고, 암세포의 아폽토시스를 유도하며, 세포외간질-세포 상호작용을 조정하는 신규 조성물과 방법의 필요성이 계속 요구되고 있다.
이와 같은 요구를 충족시키기 위한 본 발명은 트리에틸렌글리콜(TEG) 콜레스테릴 기를 합성 올리고뉴클레오타이드 서열, 즉 서열번호 1(5' OH-GGGTGG-OH-3'), 서열번호 2(5' OH-GGGAGG-OH 3'), 서열번호 3(5' OH-CCACCC-OH 3') 또는 서열번호 4 (5' OH-GTG-OH 3')의 3' 말단에 결합시킨, 각각의 5'-OH, 3'TEG 콜레스테릴 신규 합성 올리고뉴클레오타이드 서열, 즉 서열번호 5(5' OH-GGGTGG(TEG-콜레스테릴) 3'), 서열번호 6(5' OH-GGGAGG(TEG-콜레스테릴) 3'), 서열번호 7(5' OH-CCACCC(TEG-콜레스테릴) 3'), 또는 서열번호 8(5' OH-GTG(TEG-콜레스테릴) 3')을 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 신규 합성 올리고뉴클레오타이드 서열을 허용성 담체와 배합하여 조성물화 한 뒤, 이 조성물을 시험관내 또는 생 체내로 투여하는 것을 포함하는, 상기 신규 합성 올리고뉴클레오타이드 서열을 사용하는 방법을 제공한다. 이 조성물은 인간을 비롯한 동물에게 투여되어 세포내에서 반응을 유도한다. 이러한 반응으로는, 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 아폽토시스 유도, 카스페이즈 활성화, 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈의 활성화 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정 또는 이의 복합 반응을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 이러한 반응이 유도되기에 바람직한 세포는 암세포 또는 윤활 세포이다. 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는 모든 질환이나 증상은 본 발명의 조성물로 치료될 수 있다. 이러한 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는 질환이나 증상으로는 자가면역 질환, 염증, 림프증식성 질환, 관절염 및 암이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 약물 제조에 사용되는 상기 신규 합성 올리고뉴클레오타이드 서열의 용도를 제공한다. 이러한 약물은 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는, 예컨대 자가면역질환, 염증, 림프증식성 질환, 관절염 또는 암 등을 비제한적으로 포함하는 질환이나 증상을 치료하는데 유용하다.
본 발명의 1종 또는 그 이상의 신규 서열은 허용성 담체와 배합된 뒤, 조성물로서 시험관내에서 배양 중인 세포 또는 조직에 투여하거나 동물이나 인간의 생체내로 투여할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 1종 또는 그 이상의 치료제와 함께 투여할 수 있다. 이와 같은 본 발명의 조성물의 투여는 의학이나 수의학 분야에 통상의 기술을 가진 자(이하, 당업자)에게 공지된 1종 또는 그 이상의 치료제를 투여하기 전, 투여하는 동안 또는 투여한 후 실시할 수 있다. 의학이나 수의학 기 술분야의 당업자에게 공지되고 질환 치료에 사용된 치료제라면 모두 본 발명의 신규 서열과 함께 사용될 수 있다. 이러한 배합은 치료제 용량을 줄일 수 있어 불필요한 부작용을 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 1종 또는 그 이상의 서열의 유효량을 포함하는 조성물의 인간이나 동물에 대한 투여는 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는 질환이나 증상을 예방하거나 치료하거나 제거하는 치료적 처치이다. 상기 질환 및 증상은 의학이나 수의학 기술분야의 당업자에게 공지되어 있는데, 그 예를 들면 암, 염증, 관절염, 림프증식성 질환, 천식 및 혈관성형술 후의 동맥의 재협착증이지만 이에 국한되는 것은 아니다. 암에는, 편평세포 암종, 섬유육종, 사르코이드 암종, 흑색종, 유방암, 폐암, 결장직장암, 신장암, 골육종, 피부 흑색종, 기저세포 암종, 췌장암, 방광암, 뇌암, 난소암, 전립선암, 백혈병, 림프종 및 이로부터 유도된 전이암이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
동물과 인간에게 치료제를 투여하는 방법과 경로는 당업자에게 공지되어 있는 것으로서, 본 발명의 서열과 약학적 허용성 담체를 함유하는 조성물을 투여하는데 사용할 수 있다.
작용적으로 불활성인 3'-OH 올리고뉴클레오타이드의 3'-산소에 대한 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 기의 공유 부착물이 나타내는 예상치 않은 놀라운 능력, 즉 암세포 및 윤활 세포 증식 억제, 암세포 및 윤활 세포의 아폽토시스 유도, 암세포의 세포외간질-세포 상호작용 조정 및 암세포의 세포 주기 발달 변형 능력 등은 오랫동안 실현되기를 바래왔던 의학 분야의 요구를 해결하면서, 인간을 비롯 한 동물에게 중요한 혜택을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 5'-OH, 3'-TEG 콜레스테릴 합성 서열을 함유하는 신규 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간을 비롯한 동물의 질환 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는 질환이나 증상 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 관절염 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 카스페이즈 활성화 유도, 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈 절단, 아폽토시스 유도 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정이나, 이들의 복합 반응 등(이에 국한되는 것은 아님)을 포함하는 세포내 반응을 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 내약물성 암이나 윤활 세포를 비롯한 암이나 윤활 세포내에서의 반응, 예컨대 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 카스페이즈 활성화 유도, 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈 절단, 아폽토시스 유도 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정이나, 이들의 복합 반응 등(이에 한정되는 것은 아님)을 포함하는 반응을 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 BCR-ABL(염색체 22 상의 BCR 유전자와 염색체 9 상의 ABL 유전자의 융합체)과 무관한 세포내에서의 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p53 돌연변이와 무관한 세포내에서의 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 제조가 간편한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 환자에게 거의 유독하지 않은 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는 질환이나 증상을 치료하는데 유용한 약물 제조에 사용되는, 상기 신규 합성 올리고뉴클레오타이드 서열의 용도를 제공하는 것이다.
이와 같은 본 발명의 목적 및 기타 다른 목적, 특징 및 장점은 이하 본 명세서에 개시된 비제한적 구체예의 상세한 설명과 첨부되는 청구의 범위를 통해 명백하게 알 수 있을 것이다.
도 1은 정규 배양 배지(RCM) 만을 사용하여 전배양하거나 또는 서열번호 1(SEQ ID NO.1) 또는 서열번호 5(SEQ ID NO.5)의 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 전배양한 MATRIGEL® 상에서의 MCF-7, MDA-MB-231(MDA-231), Hs578T 및 Mpanc-96 세포의 성장을 나타낸 사진.
도 2는 정규 배양 배지(RCM) 만을 사용하여 전배양하거나 또는 서열번호 4 또는 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드를 첨가하여 전배양한 MATRIGEL® 상에서의 인간 유방암 세포의 성장을 나타낸 사진.
도 3은 MATRIGEL®이 코팅된 웰에서 48시간 동안 성장시킨 MCF-7 세포의 사진이다. 그 결과 얻어지는 3차원 세포 구조를 정규 배양 배지(RCM) 단독물에, 또는 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트, 서열번호 3(SEQ ID NO.3) 또는 서열번호 7(SEQ ID NO.7)을 첨가한 RCM에 노출시켰다.
도 4는 MATRIGEL®이 코팅된 웰에서 48시간 동안 성장시킨 MDA-231 세포의 사진이다. 그 결과 얻어지는 3차원 세포 구조를 정규 배양 배지(RCM) 단독물에, 또는 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트, 서열번호 3 또는 서열번호 7을 첨가한 RCM에 노출시켰다.
도 5는 구형으로 성장시킨 뒤 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트(chol-TEG), 서열번호 3, 서열번호 7을 첨가하거나 첨가하지 않은 정규 배양 배지(RCM) 또는 이에 상응하는 대조군(RCM + 물(RCMW) 및 RCM + 아세토니트릴(RCMA))에 3일 동안 노출시킨 Hs578T 세포의 사진이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 5'-OH, 3'-TEG 콜레스테릴 합성 서열, 즉 서열번호 5(5' OH-GGGTGG(TEG-콜레스테릴)3'), 서열번호 6(5' OH-GGGAGG(TEG-콜레스테릴)3'), 서열번호 7(5' OH-CCACCC(TEG-콜레스테릴)3') 또는 서열번호 8(5' OH-GTG(TEG-콜레스테릴)3')을 함유하는 신규 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 이러한 신규 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 세포 내에서 반응을 유도하기에 효과적인 양으로 동물이나 인간에게 투여했을 때 세포 내에서 반응을 유도하기에 유용하다. 이러한 반응으로는 세포 증식의 억제, 세포 주기 정지, 아폽토시스 유도, 카스페이즈 활성화, 세포내에서의 폴리(ADP-리보스)폴리머레이즈의 절단 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정이나, 또는 이의 복합 반응을 포함하며, 이것에 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 동물이나 인간은 암 또는 관절염이 있는 동물이나 인간이다. 바람직한 구체예에서, 세포는 암세포이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 세포는 윤활세포이다.
본 발명의 조성물은 불필요한 세포 증식을 특징으로 하는 질환이나 증상을 치료하는데 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 암에 걸린 동물이나 인간의 암을 치료하는데 효과적인 양으로 상기 동물이나 인간에게 투여된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 관절염이 있는 동물이나 인간의 관절염을 치료하는데 효과적인 양으로 상기 동물이나 인간에게 투여된다.
3'-TEG 콜레스테릴 올리고뉴클레오타이드의 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 아폽토시스 유도, 카스페이즈 활성화 또는 세포 내에서의 세포외간질-세포 상호작용 조정 또는 세포 내에서의 이들 반응들의 복합적인 유도 능력 등은 예상치 못한 놀라운 것으로서, 오랫동안 실현되기를 바래왔던 의학 분야의 요구를 충족시키면서, 인간을 비롯한 동물에게 중요한 혜택을 제공하는 것이다.
본 명세서에 사용된, "서열"이란 용어는 서열번호 1(5' OH-GGGTGG-OH-3'), 서열번호 2(5' OH-GGGAGG-OH 3'), 서열번호 3(5' OH-CCACCC-OH 3') 또는 서열번호 4 (5' OH-GTG-OH 3')를 포함하는 3'-OH, 5'-OH 합성 올리고뉴클레오타이드, 또는 서열번호 5(5' OH-GGGTGG(TEG-콜레스테릴) 3'), 서열번호 6(5' OH-GGGAGG(TEG-콜레스테릴) 3'), 서열번호 7(5' OH-CCACCC(TEG-콜레스테릴) 3'), 또는 서열번호 8(5' OH-GTG(TEG-콜레스테릴) 3')을 포함하는 5'-OH, 3'-TEG 콜레스테릴 합성 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "3'-TEG 콜레스테릴 올리고뉴클레오타이드" 및 "3'-TEG 콜레스테릴 합성 올리고뉴클레오타이드"란 용어는 3'-트리에틸렌글리콜 콜레스테릴 변형 올리고뉴클레오타이드, 3' 말단에 TEG 콜레스테릴 기가 결합된 5'-OH 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 예컨대, 5'-OH, 3'-TEG 콜레스테릴 합성 올리고뉴클레오타이드의 일 예인 서열번호 7의 화학식 구조는 하기에 제시하는 바와 같다:
Figure 112004013594055-pct00001
본 명세서에 사용된 "반응"이란 용어는 비제한적으로 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 카스페이즈 활성화, 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈 절단, 세포 아폽토시스 유도 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정 또는 이의 복합 반응의 유도를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "반응성 세포에서 효과적인"이란 용어는 비제한적으로 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 카스페이즈 활성화 유도, 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈 절단 유도, 세포 아폽토시스 유도 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정 또는 이의 복합 반응을 포함하는 반응을 유도하는 서열의 능력을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "치료적 처치", "유효량" 및 "~에 효과적인 양"이란 용어는 비제한적으로 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 카스페이즈 활성화 유도, 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈 절단 유도, 세포 아폽토시스 유도 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정 또는 이의 복합 반응을 포함하는 반응을 유도하기에 효과적인 서열의 양을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "질환"이란 용어는 육체 건강이 손상된 상태를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "치료제"란 용어는 인간을 비롯한 동물의 질환을 치료하는데 사용되는 것으로, 미국 약전이나 기타 보편적으로 인정받는 약전에 등록되어 있거나 또는 국가나 주정부의 관할청으로부터 승인을 받은 방사선을 비롯한 모든 제제를 의미한다.
본 발명에 사용된, "화학치료"란 용어는 인간을 비롯한 동물의 질환을 치료하는 것으로, 미국 약전이나 기타 보편적으로 인정받는 약전에 등록되어 있거나 또는 국가나 주정부의 관할청으로부터 승인을 받은 모든 제제를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "항관절염성"이란 용어는 인간을 비롯한 동물의 관절염을 치료하는데 사용되는 것으로, 미국 약전이나 기타 보편적으로 인정받는 약전에 등록되어 있거나 또는 국가나 주정부의 관할청으로부터 승인을 받은 모든 제제를 의미한다.
본 명세서에 사용된 "항종양성"이란 용어는 암세포의 발생, 발달, 증식 또는 전파를 예방하는 것을 의미한다.
동물이나 인간에게 본 발명의 조성물의 유효량을 투여하는 것은 반응을 유도하고, 질환을 예방, 치료 또는 제거하거나 또는 이의 복합 작용인 치료적 처치이다. 상기 반응으로는, 세포 증식 억제, 세포 주기 정지 유도, 카스페이즈 활성화, 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈의 절단, 세포 아폽토시스 유도, 세포외간질-세포 상호작용의 조정 또는 이의 복합 반응을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 질환으로는 암, 관절염, 림프증식성 질환 및 염증이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 암으로는, 편평 세포 암종, 섬유육종, 혈관육종, 림프관육종, 횡문근육종, 평활근육종, 지방육종, 연골육종, 사르코이드 암종, 흑색종, 유방암, 폐암, 결장직장암, 신장암, 골육종, 피부 흑색종, 기저세포 암종, 췌장암, 방광암, 뇌암, 난소암, 전립선암, 백혈병, 림프종, 골수종 및 이들 유래의 전이암이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 관절염의 예로는 소아 관절염, 골관절염 및 류마티스성 관절염이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
서열의 치료 효과는 염기, 당 또는 인산염 주쇄의 화학적 변형을 통해, 적당한 서열을 함유하는 박테리아 플라스미드를 사용한 서열의 화학적 보강 또는 생명공학적 증폭을 통해, 생물학적 또는 화학적 담체에 대한 서열의 복합체화를 통해 또는 조직 유형별 또는 세포 유형별 지향성 리간드 또는 항체에 대한 서열의 커플링을 통해, 또는 이에 국한되지 않는 기타 다른 방법을 통해 증가시킬 수 있다.
1종 또는 그 이상의 서열과 약학적 허용성 담체를 함유하는 조성물은 서열과 약학적 허용성 담체를 균일하게 충분히 혼합하여 제조한다. 본 명세서에 사용된 "약학적 허용성 담체" 또는 "약학적 허용성 매개체"란 용어는 생리적 부작용을 일으킴이 없이 인간이나 동물의 생 조직과 접촉하에 사용하기에 적합하고, 조성물의 다른 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않는, 물이나 식염수, 젤, 크림, 연고, 용제, 희석제, 유체 연고 베이스, 연고, 페이스트, 임플란트, 리포좀, 미셀, 거대 미셀 등을 비제한적으로 포함하는 임의의 액체, 고체 또는 반고체형을 의미하는 것이며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이외에 당업자에게 공지된 다른 약학적 허용성 담체 또는 매개체도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 서열을 전달하는 조성물 제조에 사용될 수 있다. 액체 담체는 수성 담체, 비수성 담체 또는 이 양자를 의미하는 것으로서, 비제한적으로 수성 현탁제, 디메틸설폭사이드, 에탄올, 유상 에멀젼, 유중수 에멀젼, 수중유중수 에멀젼, 부위 특이적 에멀젼, 장기체류성 에멀젼, 점착성 에멀젼, 마이크로에멀젼 및 나노에멀젼을 포함한다. 고체 담체는 생물학적 담체 또는 화학적 담체 또는 이 양자를 의미하는 것으로서, 서열을 지속적으로 방출시킬 수 있는, 바이러스 벡터 시스템, 파티클, 마이크로파티클, 나노파티클, 마이크로스피어, 나노스피어, 미니펌프, 박테리아 세포벽 추출물 및 생물분해성 또는 비생물분해성 천연 또는 합성 폴리머를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 에멀젼, 미니펌프 및 폴리머는 전달해야 하는 장소 부근에 삽입할 수 있다. 고체 담체에 서열을 결합시키는 방법으로는 고체 담체 표면에 대한 직접적인 흡착, 고체 담체 표면에 대한 직접적 또는 연결 기를 통한 공유 커플링, 및 고체 담체 제조에 사용된 폴리머와의 공유 커플링 또는 정전기적 커플링이 사용되지만, 이것에 국한되는 것 은 아니다. 경우에 따라, 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레이트(Tween), 하이알우론산 또는 수산화알루미늄과 같은 비이온성 또는 이온성 폴리머를 첨가하여 서열을 안정화시킬 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 기타 다른 담체도 이용할 수 있다.
바람직한 수성 담체로는, 물, 식염수 및 약학적 허용성 완충액을 포함하지만, 이것에 국한되는 것은 아니다. 바람직한 비수성 담체로는, 비제한적으로 광유 또는 중성유를 포함하며, 그 예로서 디글리세라이드, 트리글리세라이드, 인지질, 지질, 오일 및 이의 혼합물 등이 있으며, 상기 오일은 다불포화 지방산과 포화 지방산의 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 대두유, 캐놀라유, 팜유, 올리브유 및 미글리올 등이 있으며, 여기에서 지방산은 포화성이거나 불포화성일 수 있다. 경우에 따라, 반응 세포에 서열을 제공하는데 사용된 약학적 허용성 담체에 관계없이 부형제가 첨가될 수도 있다. 이러한 부형제로는 항산화제, 완충액 및 세균발육저지제 등을 포함하며, 현탁화제 및 농조화제도 포함될 수 있다.
본 발명의 서열은 약학적 허용성 담체와 함께 배합된 후, 조성물로서 시험관내의 배양 세포 또는 조직에 또는 동물이나 인간의 생체내로 투여될 수 있다. 투여 형태로는, 주사제, 용제, 크림, 젤, 임플란트, 펌프, 연고, 에멀젼, 현탁제, 마이크로스피어, 파티클, 마이크로파티클, 나노파티클, 리포좀, 페이스트, 패취, 정제, 경피성 전달 기구, 스프레이, 분무제 또는 당업자에게 익숙한 기타 다른 수단을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 일반적으로, 이와 같은 약학적 허용성 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 약학적 제제는 공지의 입수용이한 성분을 사용하여 당해기술분야에 공지된 절차에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명 의 화합물은 일반적인 부형제, 희석제, 또는 담체와 배합된 후 정제, 캅셀, 현탁제, 산제 등으로 제형될 수 있다. 이와 같은 제형에 적합한 부형제, 희석제 및 담체의 예로는 다음과 같은 것이 있다: 충진제 및 증량제(예, 전분, 당, 만니톨, 및 규산 유도체); 결합제(예, 카르복시메틸 셀룰로스 및 기타 다른 셀룰로스 유도체, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈); 보습제(예, 글리세롤); 붕해제(예, 탄산칼슘 및 중탄산나트륨); 용해지연제(예, 파라핀); 재흡수 촉진제(예, 4차 암모늄 화합물); 계면활성제(예, 세틸 알코올, 글리세롤 모노스테아레이트); 흡착성 담체(예, 카올린 및 벤토나이트); 유화제; 보존제; 감미제; 안정화제; 착색제; 방향제; 향미제; 윤활제(예, 탈크, 스테아르산칼슘 및 스테아르산마그네슘); 고체 폴리에틸 글리콜; 및 이의 혼합물.
상기 제형은 활성 성분만을 방출하거나 또는 바람직하게는 특정 위치에서, 가능하게는 일정 시간 동안 활성 성분을 방출하도록 구성될 수 있다. 이와 같은 구성은 방출 속도 조절을 위한 추가 기구를 제공한다. 예를 들어, 중합체 물질이나 왁스로부터 코팅제, 엔벨로프제 및 보호 매트릭스를 제조할 수 있다.
1종 또는 그 이상의 서열은 단독으로 또는 다른 치료 양식, 예컨대 화학치료제, 항관절염제, 면역치료제, 항미생물제 또는 항바이러스제 등(이에 국한되지 않음)과 함께 또는 방사선 치료와 함께, 또는 이들의 임의의 복합 방식으로 투여될 수 있다. 화학치료제로는 항대사제, DNA 손상제, 미세관 불안정화제, 미세관 안정화제, 액틴 해중합제, 성장 억제제, 토포이소머레이즈 억제제, HMG-CoA(3-하이드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A) 환원효소 억제제, 퓨린 합성 억제제, 피리미딘 합성 억제제, 멜라로프로테이네이즈 억제제, CDK(사이클린 의존성 단백질 카이네이즈) 억제제, 혈관형성 억제제, 분화 향상제 및 면역치료제 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 항관절염제로는 비스테로이드성 소염제(NSAID)를 비롯한 소염제, 진통제, 생물학적 반응 변형제, 질환 변형성 항류마티스성 약물(DMARD), 항대사제, 아폽토시스 전구물질, DNA 손상제, 미세관 불안정화제, 미세관 안정화제, 액틴 해중합제, 성장 억제제, 토포이소머라제 억제제, 퓨린 합성 억제제, 피리미딘 합성 억제제, 메탈로프로테이나제 억제제, CDK 억제제 또는 혈관형성 억제제 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. NSAID로는 통상적인 NSAID, 예컨대 디클로페낙 칼륨, 디클로페낙 나트륨, 디클로페낙 나트륨과 미소프로스톨, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 칼슘 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트, 나트륨 메페나믹, 산 멜록시캄, 나부메톤, 나프록센, 나프록센 나트륨, 옥사프로진, 피록시캄, 술린닥 및 톨메틴 나트륨; 사이클로옥시게나제-2(COX-2) 억제제, 예컨대 셀레콕시브 및 로페콕시브; 살리실레이트, 예컨대 아스피린, 콜린 살리실레이트, 마그네슘 살리실레이트, 살살레이트 및 나트륨 살리실레이트가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 진통제로는 아세트아미노펜, 아세트아미노펜과 코데인, 하이드로코돈과 아세트아미노펜, 옥시코돈, 프로폭시펜 염산염 및 트라마돌이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 생물학적 반응 변조제로는 에타너셉트 및 인플릭시마브가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 글루코코르티코이드로는 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니솔론 나트륨 포스페이트 및 프레드니손 트리암시놀론이 있으며, 이것 에 국한되는 것은 아니다. DMARD로는 아우라노핀(경구용 골드), 아자티오프린, 사이클로포스파미드, 사이클로스포린, 하이드록시클로로퀸 설페이트, 레플루노미드, 메토트렉세이트, 미노사이클린, 페니실아민, 설파살라진, 아우로티오글루코스 및 골드 나트륨 티오말레이트가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
투여 경로는 당업자에게 공지된 것으로서, 경구(예, 협측 또는 설하), 직장(좌약이나 관장제로서), 국소, 비경구, 피하, 경피, 진피하, 근육내, 복강내, 소포내, 동맥내, 정맥내, 진피내, 두개골내, 병변내, 척추강, 종양내, 안내, 안구, 에어로졸, 폐내, 척추내, 전립선내, 설하, 체강내 배치, 비측 흡입, 폐 흡입, 피부내 인상 및 전기침투, 자궁내, 질내, 체강내, 종양이나 체내 상처 부위에 외과적 투여, 종양에 직접적으로, 기관의 내강이나 실질 중으로, 그리고 골수 중으로의 투여를 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 전술한 각종 투여 형태에 유용한 기법으로는 국소 투여, 섭취, 외과적 투여, 주사, 스프레이, 경피 전달 장치, 삼투압 펌프, 목적 부위에 직접적인 전기침착 또는 당업자에게 익숙한 기타 다른 기법을 포함하며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 투여 부위는 표피 상과 같은 체외 부위이거나 또는 관절낭, 종양, 위궤양, 수술 부위 등과 같은 체내 부위일 수 있다.
본 발명의 조성물은 크림, 젤, 용제, 현탁제, 리포좀, 파티클, 또는 제형과 조성물의 조제 및 전달에 관한 당업자에게 공지된 기타 다른 수단의 형태로 투여될 수 있다. 치료제의 흡입 전달에는 초미세 입자 크기가 사용될 수 있다. 피하 투여에 적당한 제형의 몇몇 예로는 삽입체, 축적체, 침상체, 캅셀 및 삼투압 펌프가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 질 투여에 적당한 제형의 몇몇 예로는 크림, 좌약, 스폰지, 젤, 포말 및 링이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 경구 투여에 적당한 제형의 몇몇 예로는 환제, 캅셀, 액제, 시럽, 현탁제가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 경피 및 경점막 투여에 적당한 제형의 몇몇 예로는 크림, 페이스트, 패치, 스프레이 및 젤 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 피하 투여에 적당한 전달 기작의 몇몇 예로는 삽입체, 축적체, 침상체, 캅셀 및 삼투압 펌프 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 비경구 투여에 적당한 제형으로는 항산화제, 완충액, 세균발육저지제 및 해당 환자의 혈액과 등장성인 제제로 만들기 위한 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사제, 및 현탁화제와 농조화제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁제가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 당업자가 통상적으로 사용하는 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 즉석식 주사용 용제와 현탁제를 제조할 수도 있다.
본 발명의 서열은 조성물로 만들어지기 위하여 1종 이상의 약학적 허용성 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 이러한 조성물은 편리하게 단위 투여량 형태로 제공될 수 있는데, 이것은 통상의 약제 기법에 따라 제조될 수 있다. 이 기법은 활성 성분과 약학적 담체 또는 부형제를 함유하는 조성물을 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성성분과 액체 담체를 균일하게 충분히 혼합하여 제조한다. 바람직한 단위 투여량의 제제는 투여 성분의 1회 용량 또는 1 유닛을 함유하는 것이거나 또는 이의 적당한 분획인 것이다. 상기 구체적으로 기술한 성분 외에도 본 발명의 조성물을 함유하는 제제는 당업자가 일반적으로 사용하는 기타 다른 성분을 함유할 수 있다.
투여 용량은 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 이러한 용량은 동물이나 인간에게 조성물을 투여하는 기술 분야의 당업자라면 잘 알고 있는 것이다. 투여 경로에 따라, 단위 용량당 부피는 바람직하게는 약 0.001 내지 100 ml, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 50 ml, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 30 ml이 좋다. 바람직하게는, 단위 용량 당 투여되는 서열의 양은 약 0.001 내지 100 mg/체중kg인 것이 좋고, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 10 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mg/kg인 것이다. 상기 서열, 서열의 조합 및/또는 추가 치료제는 단일 용량 치료 형식으로, 복수 용량 치료 형식으로 투여하거나 또는 치료받는 질환, 환자의 상태 및 투여 경로에 적당한 시간 동안 시간표대로 연속 주입하여 투여할 수 있다. 또한, 서열은 치료제의 투여 이전에, 또는 치료제 투여와 동시에, 또는 치료제 투여 후에 투여할 수 있다. 투여되는 특정 서열과 특정 치료제, 단위용량당 함량 및 투여 경로는 당업자가 당업계에 공지된 방법에 따라 결정해야 하며, 이는 치료할 질환이나 상태, 예컨대 암의 종류, 암의 정도, 암 위치 및 기타 환자의 체격, 체중 및 신체 상태 등과 같은 임상 요인에 따라 달라지는 것이다. 또한, 다양한 시험관내 분석과 생체내 분석을 선택적으로 이용하여 서열의 최적 투여 범위 및 서열과 치료제의 최적 투여 범위를 결정할 수 있다.
서열과 함께 치료제, 예컨대 화학치료제 또는 항관절염제를 암이나 관절염이 있는 동물이나 인간에게 화학치료제의 항종양 효과를 향상시키기에 효과적인 양이나 항관절염제의 항관절 효과를 향상시키기에 유효한 양으로 투여한다. 단위 용량 당 투여되는 치료제의 함량은 바람직하게는 약 0.001 내지 1000 mg/체표면m2 또는 약 0.01 내지 1000 mg/체중kg, 보다 바람직하게는 약 0.01 내지 500 mg/체표면m2 또는 약 0.01 내지 500 mg/체중kg, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 100 mg/체표면m2 또는 약 0.1 내지 100 mg/kg 범위이다. 투여되는 특정 서열과 특정 치료제, 단위 용량당 함량, 용량 시간표 및 투여 경로는 당업계에 공지된 방법에 따라 당업자가 결정해야 하며, 이것은 질환의 종류, 질환의 정도, 질환의 위치 및 기타 환자의 체격, 체중 및 신체 상태와 같은 임상적 요인에 따라 달라지는 것이다. 또한, 다양한 시험관내 분석 및 생체내 분석을 선택적으로 이용하여 서열 및 서열과 치료제 투여의 최적 범위를 결정할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 다양한 분석법에 대해서는 PCT CA00/01467(WO 01/44465)에 설명되어 있다. 본 발명의 서열의 효능과, 다른 치료제와 혼합된 상기 서열의 효능은 온코진 리서치 프로덕츠(미국 캘리포니아주 92039 라졸라 피.오.박스 12087 소재)에서 개시한 바(Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003, 특히 p.5-295)와 같이 평가할 수 있다. 이러한 분석법으로는 DNA 단편화, 아폽토시스, 미토콘드리아 마커, 세포질세망 마커, 유리 뉴클레오좀, 핵간질 단백질의 분석, 다양한 카스페이즈와 관련 단백질, 예컨대 비제한적으로 카스페이즈 1 내지 14, 글루타치온, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, bcl-2 계열 성분의 검출 및 활성, Fas/TNR-R 상과(superfamily)의 분석, PARP 관련 산물의 분석, 아폽토시스 신호 변환인자의 분석, 다양한 신호 수용체, 예컨대 사멸 수용체, Apo2, 유인 수용체의 분석, 아폽토시스 막 단백질 분석, 신경계 아폽토시스 마커, 세포 주기와 세포 증식의 다양한 마커들, 유사분열 카이네이즈, 브로모데옥시우리 딘 분석 및 p53 분석이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 서열들의 효능은 다른 제제, 예컨대 비제한적으로 항류마티스제 등과 같은 치료제 또는 온코진 리서치 프로덕츠[Oncogene Research Products, P.O.Box 12087, La Jolla, California, 92039 (Apoptosis Catalog and Technical Guide 2002-2003, 구체적으로 p.99-104 및 p.214-255)]에서 제시한 바와 같은 아폽토시스 유도인자 및 세포 동기화 시약에 의해 평가될 수 있다. 이러한 제제로는 악티노마이신 D, 암피도콜린, A23187, 카페인, 캄토테신, 사이클로헥시미드, 덱사메타손, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 하이드록시우레아, 파클리탁셀, 스타우로스포린, 티미딘, 빈블라스틴, 레틴산, 에토포사이드, 옥카다산, 빈크리스틴 및 메토트렉세이트가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
당업자에게 공지된 다양한 시험관내 및 생체내 분석 및 모델을 이용하면 서열 단독물이나, 관절염 치료에 대한 치료제 또는 치료제들과의 혼합물로서의 서열의 효능과 최적 용량 범위를 평가할 수 있다. 동물 모델로는 보조제 질환 모델, 유상 보조제 유도 모델, 미생물과 이들의 세포벽 성분 유도 모델, 연골 성분 유도 모델, 돌연변이 및 녹아웃 모델, 비면역성 골관절염 모델 및 부분 증후군 모델이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다(Waxman, B.H., Scand. J. Immunol., 56:12, 2002). 모델 동물로는 래트, 마우스, 영장류, 기니아 피그 및 토끼가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
세포 주기의 시기 측정에는 당업자에게 공지된 다양한 분석과 절차를 이용할 수 있다. 이러한 절차 중 하나는 CYCLETEST™PLUS DNA 시판 키트(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)를 이용하는 것이다. 간략히 설명하면, 세포 막을 비이온성 계면활성제에 용해시킨 후 세포골격과 핵 단백질을 트립신으로 제거한 다음, 세포 RNA를 RNase로 분해한 뒤 핵 염색질을 스퍼민으로 안정화시켜 세포 핵을 수득한다. 이 세포 핵에 요오드화프로피듐을 첨가하고, 전자 이중선 구별 능력이 있는 유동 세포분석기로 형광도를 분석하였다(FACSCalibur, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 세포 주기 중 G0/G1, S 초기(SE), S 중기(SM), S 후기(SL) 또는 G2/M 기 세포의 축적은 MODFIT LT 소프트웨어(Verity Software House Inc., Topsham, MA) 또는 다른 적당한 소프트웨어를 사용하여 분석할 수 있다.
세포외 미소환경이 정상 세포 및 종양 세포의 행동에 미치는 영향을 평가하기 위하여 다양한 시험관내 및 생체내 분석을 이용할 수 있다. 이러한 분석들에는 엔젤브레스-홀름-스웜(Engelbreth-Holm-Swarm) 뮤린 육종에서 추출한 가용화된 기저막 제조물인 MATRIGEL®(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)을 이용할 수 있다.
다세포 구상체(MS)는 종양 세포를 3차원 방식으로 배양하여 "종양 유사" 구조를 만드는 특별한 시험관내 분석법의 일예이다. 이 시스템에서는, 고형 종양내의 악성 세포들이 세포내에서 겪는 미소환경 조건과 비슷한 세포-세포 상호작용을 보강하고 있다. 이러한 유형의 분석법에는 세포외 간질 성분이 전혀 첨가되지 않는다. 이러한 MS 시스템에서 배양된 세포는 2차원 시스템(단층 배양 조건)에서 배양된 것과 다른 점이 있다. 이러한 다른 점 중 몇가지는 종양 세포의 구조 및 기능적 분화, 종양 세포의 세포 주기의 변화, "다세포 약물 내성" 및 종양 세포 층을 통과하는 약물의 확산 및 투과성의 변화와 관련된 것이다(Green et al., Anticancer Drug Des. 14:153, 1999).
다음 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로, 이들로 본 발명을 임의적으로 제한하기 위한 것은 아니다. 이에 반해, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 본 명세서를 통해 당업자에게 암시될 수 있는 다양한 다른 구체예, 변형예 및 이의 동등물에도 본 발명의 권한이 있다는 것은 자명한 것이다.
실시예 1
뉴클레오타이드 서열의 제조
포스포디에스테르 합성 뉴클레오타이드 서열 및 접합성 3'-TEG 콜레스테릴 합성 뉴클레오타이드 서열은 시그마-제노시스(Sigma-Genosys, 미국 텍사스주 우드랜즈 소재)에서 아바커스 분절화 합성 기법(Abacus Segmented Synthesis Technology)을 사용하여 제조한 것이다. 3'-말단이 TEG 콜레스테릴로 종결되는 서열은 TEG CPG 지지체를 이용하여 합성하였다(Glen Research, Sterling, VA, USA). 이 서열은 사용 직전에 물이나 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 분산시켜 사용하였다.
실시예 2
세포
모든 세포주는 미국모식균배양수집소(ATCC, 미국 매릴랜드주 록빌에 소재)에서 입수하여 ATCC가 추천하는 배지에서 배양하였다. 유방암세포주는 ATCC에서 추천 하는 배지에서 배양하거나 공개 문헌(Herrera-Gayol and Jothy, Int.J.Exp.Path., 82:193, 2001)에 기술된 바와 같은 배지에서 배양하였다. 표 1은 세포주와 이들의 기원 및 문헌에 개시된 바와 같은 이들의 생물병리학적 특성을 제시한 것이다.
세포주
세포주 설명
MEG-01* 인간 만성 골수성 백혈병 세포주
EL-4* 뮤린 T 림프종 세포주
HIG-82** 토끼 윤활세포주
MCF-7** 인간의 유방 샘암종(흉수), 분화성 양호, 시험관내 및 생체내에서 비침습성, 생체내에서 비전이성, 카스페이즈-3 음성.
MDA-MB-231** 인간의 유방 샘암종(흉수), 분화성 불량, 시험관내 및 생체내에서 침습성, 전이성, p53 돌연변이.
Hs578T** 인간의 유방 샘암종(원발성 종양), 분화성 불량, 시험관내 생체내에서 침습성, 전이성, p53 돌연변이.
Mpanc-96** 인간의 췌장 샘암종(원발성 종양), 중간 정도 분화된 샘암종, 생체내에서 비침습성.
*비부착성 세포
**부착성 세포
실시예 3
서열번호 5 및 서열번호 6에 의한 MEG-01 세포의 아폽토시스 유도
아폽토시스 동안 세포에 나타나는 특징은 혈장막 포스파티딜세린의 재분배이다(Martin et al., J.Exp.Med., 182:1545, 1995). 아폽토시스 동안 나타나는 혈장막 내의 포스파티딜세린의 재분배는 FITC(플루오레세인 이소티오시아네이트) 결합된 안넥신 V(BD Pharmingen, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재)를 이용하는 유동 세포분석기로 측정하였다. 필라델피아 염색체 양성이고 BCR-ABL 유전자 융합체를 가진 인간의 만성 골수성 백혈병 세포주인 MEG-01 세포를 2.5x105 세포/ml 농도로, 최종 농도가 5.3μM, 26.5μM, 53.0μM인 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 6 및 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 분자와 함께 항온처리하였다. 서열번호 1, 2, 5, 6 또는 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 처리에 노출된 후 세포의 아폽토시스율을 표 2에 기록하였다. 미처리 MEG-01 세포의 아폽토시스율은 12%였다.
MEG-01 세포 중 포스파티딜세린 양성 세포(아폽토시스 세포)의 비율
조성물 농도(μM)
5.3 26.5 53.0
서열번호 1 12 12 12
서열번호 5 12 27 42
서열번호 2 12 12 12
서열번호 6 13 22 39
콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 12 12 12
표 2에 제시한 바와 같이 서열번호 1, 서열번호 2 및 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트는 MEG-01에 대해 불활성이다. 하지만, 서열번호 1의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(서열번호 5 산출), 및 서열번호 2의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(서열번호 6 산출)는 예상치 않게도 이들 불활성 올리고뉴클레오타이드에 MEG-01 세포의 아폽토시스 유도 능력(세포 표면의 포스파티딜세린의 전위를 통해 측정)을 부여하였다.
실시예 4
서열번호 7에 의한 EL-4 세포의 아폽토시스 유도
뮤린 T 림프종 세포주인 EL-4 세포 2.5x105 세포/ml를 0.53μM, 5.3μM 및 53.0μM 농도의 서열번호 3, 서열번호 7 또는 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트와 24시간 동안 항온배양하였다. 서열번호 3, 서열번호 7 또는 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 처리에 노출된 후 나타나는 세포의 아폽토시스율은 표 3에 기록하였다. 미처리 EL-4 세포의 아폽토시스율은 7%였다.
EL-4 세포 중 포스파티딜세린 양성 세포(아폽토시스 세포)의 비율
조성 농도(μM)
0.53 5.3 53.0
서열번호 3 7 7 7
서열번호 7 8 11 49
TEG 콜레스테릴-포스포아미다이트 7 7 7
표 3에 기록된 바와 같이, 서열번호 3이나 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트는 EL-4 세포의 아폽토시스를 유발하지 못했다. 하지만, 서열번호 3의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(서열번호 7)는 상기 불활성 올리고뉴클레오타이드에 EL-4 세포의 아폽토시스를 유도하는 능력을 부여하였다(세포 표면에 포스파티딜세린의 전위로 측정).
실시예 5
서열번호 7에 의한 카스페이즈 3의 활성화
EL-4 세포(2.5x105 세포/ml)를 0μM(대조군), 53μM의 서열번호 3 또는 53μM의 서열번호 7과 72시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 대조군과 처리된 세포 모두를 세척하고, 고정시킨 뒤, 투과성을 부여하고, 카스페이즈 3의 활성 촉매 단위를 인식하는 피코에리트린(PE) 접합 항체(클론: C92-605; BD Pharmingen, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재)와 제조자가 추천하는 조건을 사용하여 항온배양 하였다. 활성 카스페이즈 3에 결합된 형광을, 프로그램 CellQUEST를 사용하는 FACSCALIBUR에서 유동 세포분석법으로 분석하였다(모두 미국 캘리포니아주 산요세에 소재하는 벡톤 디킨슨 제품). 상기 서열들 53μM로 처리된 EL-4 세포 중 활성 카스페이즈 3을 함유하는 세포의 비율을 표 4에 기록하였다.
EL-4 세포 중에서 활성 카스페이즈 3을 함유하는 세포의 비율
처리 활성화된 카스페이즈-3을 함유하는 세포의 비율
미처리된 EL-4 세포 3
EL-4 세포 + 53μM의 서열번호 3 4
EL-4 세포 + 53μM의 서열번호 7 38
표 4에 제시된 바와 같이, 서열번호 3은 EL-4에 대하여 불활성이다. 하지만, 서열번호 3의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 첨가(서열번호 7)는 불활성 올리고뉴클레오타이드에 아폽토시스 유도능(카스페이즈-3의 활성화로 측정)을 부여하였다.
실시예 6
서열번호 7에 의한 폴리(ADP-리보스)폴리머레이즈의 절단
EL-4 세포(2.5x105 세포/ml)를 0μM(대조군), 53μM의 서열번호 3 또는 53μM의 서열번호 7과 72시간 동안 항온배양하였다. 항온배양 후, 대조군과 처리된 세포 모두를 세척하고, 고정시킨 뒤, 투과성을 부여하고, 절단된 PARP의 85kDa 단편을 특이적으로 인식하는 FITC-접합 항체(미국 캘리포니아주 카마릴로에 소재하는 BioSource 제품)와 제조자가 추천하는 조건에 따라 항온배양하였다. 절단된 PARP에 결합된 형광을, 프로그램 CellQUEST를 사용하는 FACSCalibur에서 유동 세포분석법 으로 분석하였다(모두 벡톤 디킨슨 제품). 상기 53μM의 최종 농도의 서열들로 처리된 EL-4 세포 중 절단된 PARP를 함유하는 세포의 비율을 표 5에 기록하였다.
EL-4 세포 중 절단된 PARP를 함유하는 세포의 비율
처리 절단된 PARP를 함유하는 세포의 비율
미처리된 EL-4 세포 1
EL-4 세포 + 53μM의 서열번호 3 1
EL-4 세포 + 53μM의 서열번호 7 84
표 5에 제시된 바와 같이, 서열번호 3은 EL-4에 대하여 불활성이다. 하지만, 서열번호 3의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(서열번호 7)는 불활성 올리고뉴클레오타이드에 아폽토시스 유도능(PARP의 절단으로 측정)을 부여하였다.
실시예 7
윤활세포 증식에 대한 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 효과
윤활세포주인 부착성 HIG-82 세포 1.0x105 세포/ml를 53μM(최종 농도)의 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8과 48시간 동안 항온배양하였다. 디메틸티아졸-디페닐-테트라졸륨(MTT) 감소를 통해 세포 증식을 측정하였다(Mosman et al., J.Immunol.Methods 65:55, 1983). MTT는 멀티플 분광분석 판독기(ELX800, Bio-TEK, Instruments Inc., Winooski, VT)를 사용하여 570nm의 파장에서 측정하였다. HIG-82 세포 증식의 억제율[(대조군 흡광도-처리군 흡광도)/대조군 흡광도x100%]은 표 6에 제시하였다.
HIG-82 세포 증식 억제율(%)
처리(53μM) 억제율(%)
서열번호 2 6%
서열번호 6 75%
서열번호 3 0%
서열번호 7 53%
서열번호 4 -7%
서열번호 8 64%
표 6에 제시한 바와 같이, 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4는 윤활 HIG-82 세포의 증식을 억제하지 못했다. 하지만, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4의 3'-말단에 대한 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8 산출)는 놀랍게도 HIG-82 세포의 세포 증식을 억제하는 능력을 부여하였다.
실시예 8
서열번호 5 및 서열번호 6에 의한 증식성 윤활세포의 아폽토시스 유도
부착성 HIG-82 세포 1.0x105 세포/ml를 53μM(최종 농도)의 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5 또는 서열번호 6과 48시간 동안 항온배양하였다. 트립신 처리(van Engeland, Cytometry, 31:1, 1998)와 같은 부착성 세포 수거 기법 후 아폽토시스의 포스파티딜세린/안넥신 V 검출법은 믿을만하지 않으므로, HIG-82 세포의 아폽토시스는 상용 분석법(APO-BRDU™킷트; BD Pharmingen)을 사용하여, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트란스퍼라제 효소 매개의 브로모데옥시우리딘 트리포스페이트-비오틴 닉 말단 표지화(TUNEL)로 단편화된 DNA를 검출하는 유동 세포분석법으로 평가하였다. 핵 DNA 단편화를 함유하는 세포 비율을 측정하였다. 24시간 후 미처리 HIG-82 세포에서는 핵 DNA 단편화가 사실상 일어나지 않았다.
HIG-82 세포에서의 DNA 단편화(세포 아폽토시스)를 함유하는 세포 비율
처리(53μM) DNA 단편화를 함유하는 세포 비율
서열번호 1 1
서열번호 5 17
서열번호 2 1
서열번호 6 18
표 7에 도시한 바와 같이, 서열번호 1 및 서열번호 2는 지수 증식성 윤활 세포에 대하여 불활성이다. 하지만, 서열번호 1 및 서열번호 2의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(각각 서열번호 5 및 서열번호 6 산출)는 HIG-82 세포에서의 아폽토시스 유도능을 부여하였다(단편화된 핵 DNA를 나타내는 세포 비율로 측정).
실시예 9
서열번호 6에 의한 세포 주기 정지 유도
지수 증식성 MEG-01 세포(2x105 세포/ml)를 0μM(대조군), 53μM의 서열번호 2 또는 53μM의 서열번호 6과 24시간 동안 항온배양하였다. 세포를 수거하고, 원심분리한 뒤, 세포 주기 단계를 측정하였다.
서열번호 6에 의한 MEG-01 백혈병 세포의 세포주기 정지 유도
처리(53μM) 각 시기의 세포 비율%
G0/G1+SE SM SL+G2/M
미처리 세포 71.4 10.8 17.8
서열번호 2 68.6 11.6 19.8
서열번호 6 51.6 6.5 41.9
표 8에 제시한 바와 같이, 서열번호 2는 미처리 대조군 세포와 비교해 보아도 MEG-01에 대하여 불활성이었다. 하지만, 서열번호 2의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(서열번호 6 산출)는 놀랍게도 MEG-01 세포가 SL+G2/M기에 세포주기 정지되도록 하는 능력을 부여하였다.
실시예 10
인간 유방암 세포의 세포 증식에 대한 서열번호 3 및 서열번호 7의 효과
53μM(최종 농도)의 서열번호 3, 서열번호 7, 53μM의 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트가 첨가 또는 무첨가된(대조군) 정규 배양 배지(RCM) 또는 해당 대조군 배지(서열번호 3에 대해서는 정규 배양 배지(RCM), 서열번호 7이 첨가된 양과 동량의 물이 첨가된 RCM, 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트가 첨가된 양과 동량의 아세토니트릴이 첨가된 RCM)를 함유하고 있는 24웰 평판의 각 웰에 20x103 MDA-MB-231 (MDA-231) 또는 Hs578T 세포 중 어느 하나를 플레이팅하였다. 72시간 동안 세포를 배양하고, 트립신 처리로 세포를 붕괴시킨 후, 트립판 블루 배제 기법을 사용하여 혈구측정기로 계수하였다. 3가지 각 분석 결과(대조군에 대한 평균 변화율 및 표준편차)는 표 9에 제시하였다.
3일간 배양한 MDA-231 및 Hs578T 인간 유방암 세포의 세포 증식* 변화율
서열번호 3 서열번호 7 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 *P값
MDA-231 +6.9±5 -97.9±2.5 -2.3±15.9 <0.01
Hs578T -6.5±5 -91.8±10.5 +13±9.2 <0.01
*"+" 변화는 증식 자극을 나타내고, "-" 변화는 증식 억제를 나타낸다[(대조군 흡광도-처리군 흡광도)/(대조군 흡광도)x100%].
**p값은 변수의 반복 측정 분석(RM ANOVA) 후 던넷(Dunnett) 다중 비교 시험으로 얻은 값.
표 9에 제시한 바와 같이, 서열번호 3 및 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트는 세포 증식에 유의적으로 영향을 미치지 못했다. 놀랍게도, 서열번호 3의 3'말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(서열번호 7 산출)는 공격성이 강한 상기 2종의 인간 유방암 세포의 세포 증식을 억제하는 능력을 부여하였다.
실시예 11
MATRIGEL ® 증식 실험에서 서열번호 5에 의해 유도된 3차원 구조 형성의 변화
MCF-7, MDA-MB-231(MDA-231), Hs578T 및 Mpanc-96 세포를 각각 정규 배양 배지에서 배양하고, 트립신 처리한 뒤 계수하였다. MDA-231 세포 100x103, Hs578T 세포 100x103, MCF-7 세포 150x103 및 Mpanc-96 세포 150x103을 각각 53μM(최종 농도)의 서열번호 1, 53μM(최종 농도)의 서열번호 5 또는 RCM 중에서 37℃하에 1시간 동안 전배양하고, MATRIGEL® 코팅 평판(MATRIGEL® 기저막 매트릭스가 코팅된 셀 웨어 24웰 평판) 상부에 플레이팅하여 3일 동안 배양하였다. 이 평판을 10% 포르말린으로 고정시켰다. 24웰 평판의 세포를 니콘 역현미경 모델 TMS가 연결된 니콘 쿨픽스(Nikon Coolpix) 990 디지털 카메라(Nikon Corporation, 일본 도쿄도 소재)를 사용하여 디지털 사진을 촬영하였다. 서열번호 1은 세포 형태를 변화시키지 않는 반면, 서열번호 5는 세포가 MATRIGEL® 상의 정규 배양 배지에서 배양되었을 때 형성한 것과 같은 3차원 구조의 형성을 방해하였다(도 1).
도 1에 도시한 바와 같이, 서열번호 1은 불활성인 반면, 서열번호 1의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트가 첨가된 서열번호 5는 세포를 MATRIGEL® 상의 정규 배양 배지에서 배양했을 때 형성된 것과 같은 3차원 구조의 형성을 방해하는 능력을 나타내었다. 서열번호 5는 세포-세포외간질 상호작용을 방해하여 세포-세포 부착 기작 및 세포-세포외간질 부착 기작을 조정하는 것으로 추정된다.
실시예 12
MATRIGEL ® (벡톤 딕킨스, 미국 뉴저지 프랭클린 레익스 소재) 증식 실험에서 서열번호 8에 의해 유도된 3차원 구조 형성의 변화
MDA-MB-231(MDA-231) 및 Hs578T를 각각 정규 배양 배지에서 배양하고, 트립신 처리한 뒤 계수하였다. MDA-MB-231 세포 100x103 또는 Hs578T 세포 100x103을 각각 53μM(최종 농도)의 서열번호 4, 53μM(최종 농도)의 서열번호 8 또는 RCM 중에서 37℃하에 1시간 동안 전배양하고, MATRIGEL® 코팅 평판 상에 플레이팅하여 3일 동안 배양하였다. 이 평판을 10% 포르말린으로 고정시켰다. 24웰 평판의 세포를 니콘 역현미경 모델 TMS가 연결된 니콘 쿨픽스(Nikon Coolpix) 990 디지털 카메라(Nikon Corporation, 일본 도쿄도 소재)를 사용하여 디지털 사진을 촬영하였다. 서열번호 4는 세포 형태를 변화시키지 않는 반면, 서열번호 8은 MATRIGEL® 상에 플레이팅된 종양 세포의 증식 패턴을 방해하였다(도 2).
도 2에 도시한 바와 같이, 서열번호 4는 불활성인 반면, 서열번호 4의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트가 첨가된 서열번호 8은 세포를 MATRIGEL® 코팅 웰 상의 정규 배양 배지에서 배양했을 때 형성된 것과 유사한 3차원 구조의 형성을 방해하는 능력을 나타내었다. 서열번호 8은 세포-세포외간질 상호작용을 방해하여 종양 세포와 ECM 성분 간의 상호작용을 조정하는 것으로 추정된다.
실시예 13
MATRIGEL ® 증식 실험에서 서열번호 7에 의해 유도된 MCF-7 세포의 3차원 구조 형성 변화
MCF-7 세포를 정규 배양 배지(RCM)에서 배양하고, 트립신 처리한 뒤 계수하였다. MATRIGEL® 350㎕가 코팅된 24웰 평판의 각 웰에 MCF-7 세포 150x103을 플레이팅하였다. 어떤 처리 없이 48시간 동안 3차원 구조를 형성시킨 후, 배지를 교체하여, 상기 3차원 구조를 최종 농도 53μM의 서열번호 3, 53μM의 서열번호 7, 53μM의 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트, RCM 또는 이들의 각 대조 배지(RCM+물, RCM+DMSO, 또는 RCM+아세토니트릴)에 노출시켰다. 이 처리를 3 내지 4일 마다 반복하여 최고 19 내지 20일까지 배양하였다. 이 실험을 3회 반복하였다. 24웰 평판의 세포를 니콘 역현미경 모델 TMS가 연결된 니콘 쿨픽스(Nikon Coolpix) 990 디지털 카메라(Nikon Corporation, 일본 도쿄도 소재)를 사용하여 디지털 사진을 촬영하였다. 각각의 대조 배지(데이터는 미제시), 서열번호 3 및 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트는 대조군과 비교했을 때 3차원 구조에 영향을 미치지 않은 반면, 서열번호 7은 그 3차원 구조의 증식 패턴을 방해하여 세포-세포 및 세포-세포외간질 상호작용에 영향을 미치는 것으로 나타났다(도 3).
도 3에 도시한 바와 같이, 서열번호 3과 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트는 불활성인 반면, 서열번호 3의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트가 첨가된 서열번호 7은 놀랍게도 예형된 3차원 구조를 붕괴시키는 능력을 나타내었다.
실시예 14
MATRIGEL ® 증식 실험에서 서열번호 7에 의해 유도된 MDA-MB-231 세포의 3차원 구조 형성의 변화
MDA-MB-231(MDA-231) 세포를 정규 배양 배지에서 배양하고, 트립신 처리한 뒤 계수하였다. MATRIGEL® 350㎕가 코팅된 24웰 평판의 웰에, 정규 배양 배지(RCM) 중의 MDA-231 세포 100x103을 플레이팅하였다. 어떤 처리 없이 48시간 동안 3차원 구조를 형성시킨 후, 배지를 교체하고, 상기 3차원 구조를 최종 농도 53μM의 서열번호 3, 53μM의 서열번호 7, 53μM의 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트, RCM 또는 이들의 각 대조 배지(RCM+물, RCM+DMSO, 또는 RCM+아세토니트릴)에 노출시켰다. 이 처리를 3 내지 4일 마다 반복하여 최고 17 내지 21일까지 배양하였다. 이 실험을 3회 반복하였다. 24웰 평판의 세포를 니콘 역현미경 모델 TMS가 연결된 니콘 쿨픽스(Nikon Coolpix) 990 디지털 카메라(Nikon Corporation, 일본 도쿄도 소재)를 사용하여 디지털 사진을 촬영하였다. 각각의 대조 배지(데이터는 미제시), 서열번호 3 및 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트는 RCM(음성 대조군 배지)에서 배양된 구조와 유사한 3차원 구조에 영향을 미치지 않는 반면, 서열번호 7은 그 3차원 구조의 증식 패턴을 붕괴시켜 세포-세포 및 세포-세포외간질 상호작용을 방해하는 것으로 나타났다(도 4). 도 4에 도시한 바와 같이, 서열번호 3과 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트는 불활성인 반면, 놀랍게도 서열번호 3의 3'-말단에 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트가 첨가된 서열번호 7은 세포-세포 및 세포-세포외간질 상호작용을 방해하여 3차원 구조를 붕괴시키는 능력을 나타내었다.
실시예 15
Hs578T 세포가 다세포 구상체로 배양되었을 때 서열번호 7에 의해 유도된 세포주기 변화
구상체 당 약 100x103 Hs578T 세포를 최종 농도 53μM의 서열번호 3, 서열번호 7, 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트(cholTEG) 또는 이들 각각의 대조 배지(정규 배양 배지(RCM), RCM + 서열번호 7 첨가량과 동량의 물(RCMW), RCM + 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 첨가량과 동량의 아세토니트릴(RCMA))의 존재하에 배양하였다. 각 실험 조건 마다 5개의 구상체를 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포 주 기 발달을 FACScalibur 유동 세포분석기(Becton Dickinson, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스에 소재)를 사용하여 요오드화프로피듐(PI) 염색(Calbiochem, Novabiochem Corporation, 미국 캘리포니아주 산디에고 소재)으로 평가하였다. 세포 주기 중 상이한 시기에 있는 세포의 비율% 변화를 MODFIT LT 소프트웨어(Verity Software House Inc.)를 사용하여 분석하였다. 그 결과는 도 5에 도시하였다.
도 5에 도시한 바와 같이, 서열번호 3, 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트 또는 대조 배지는 정규 배양 배지에만 노출된 구상체와 비교했을 때 세포 주기 발달의 유의적 변화를 나타내지 않았다. 하지만, 서열번호 7에 노출된 경우에는 놀랍게도 G2M 및 S 기의 세포 비율이 증가하였고, G0/G1 기의 세포 비율은 감소하였다(p<0.05, χ-스퀘어 테스트). 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가는 MS 분석에서 시험된 불활성 올리고뉴클레오타이드에, 복잡한 3차원 시스템(생체내 종양의 여러 생태병리학적 특징과 유사)의 세포 주기 발달을 변화시키는 능력을 부여하였다.
실시예 16
인간 유방암 세포 MDA-MB-231 세포가 서열번호 5와 함께 배양될 때 나타내는 핵 유사분열 기구 단백질(NuMA)의 방출 변화
MDA-MB-231 세포를 각 대조 배지에서, 최종 농도 53μM의 서열번호 1과 함께 또는 최종 농도 53μM의 서열번호 5와 함께 72시간 동안 단층으로서 배양하였다. 핵 유사분열 기구 단백질(NuMA)의 방출을 아폽토시스의 척도로서 관찰하였다. NuMA는 상용화된 엘리사 킷트(ELISA kit, Oncogene, 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재) 를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 그 결과는 표 10에 제시하였는데, 광학 밀도 측정값에 근거하여 각 대조군에 상대적인 NuMA 방출의 증가율%로서 나타내었다.
MDA-MB-231 인간 유방암 세포가 나타내는 핵 유사분열 기구 단백질(NuMA)의 방출량 변화
서열 대조군에 상대적인 NuMA 방출율(%)
서열번호 1 +5%
서열번호 5 +430%
표 10에 제시한 바와 같이, 세포를 서열번호 5와 배양한 후에는 핵유사분열 기구 단백질(NuMA)의 방출량이 430% 증가하였다. 서열번호 1의 3'-말단에 대한 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가(서열번호 5 산출)는 아폽토시스를 유도하는 능력을 부여하였다.
실시예 17
서열번호 6과 배양된 Hs578T 인간 유방암 세포에 의한 핵 유사분열 기구 단백질(NuMA) 방출량의 변화
Hs578T 세포를 음성 대조 조건에서, 또는 최종 농도 53μM의 서열번호 2와 함께 또는 최종 농도 53μM의 서열번호 6과 함께 72시간 동안 단층으로서 배양하였다. 핵 유사분열 기구 단백질(NuMA)의 방출을 아폽토시스의 척도로서 관찰하였다. NuMA는 상용화된 엘리사 킷트를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 그 결과는 표 11에 제시하였는데, 광학 밀도 측정값에 근거하여 각 대조군에 상대 적인 NuMA 방출의 증가율%로서 나타내었다.
Hs578T 인간 유방암 세포가 나타내는 핵 유사분열 기구 단백질(NuMA)의 방출량 변화
서열 대조군에 상대적인 NuMA 방출율(%)
서열번호 2 +8%
서열번호 6 +288%
표 11에 제시한 바와 같이, 세포를 서열번호 6과 배양한 후에는 핵유사분열 기구 단백질(NuMA)의 방출량이 288% 증가하였다. 서열번호 2의 3'-말단에 대한 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트의 첨가는 불활성 올리고뉴클레오타이드에 아폽토시스를 유도하는 능력을 부여하였다.
실시예 18
무흉선 누드 마우스 중의 MEG-01 세포에 대한 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6의 효과
MEG-01 세포를 종래 제시된 바와 같은 무흉선 누드 마우스에게 피하 접종하였다(Takeo et al., Leukemia 7:1286, 1993). 이 마우스를 10마리씩 13그룹으로 나누었다. 0일째, 1그룹의 마우스에게는 식염수를, 2그룹 마우스에게는 1mg/kg의 서열번호 1, 3그룹 마우스에게는 10mg/kg의 서열번호 1, 4그룹 마우스에게는 100mg/kg의 서열번호 1, 5그룹 마우스에게는 1mg/kg의 서열번호 2, 6그룹 마우스에게는 10mg/kg의 서열번호 2, 7 그룹 마우스에게는 100mg/kg의 서열번호 2, 8그룹 마우스에게는 1mg/kg의 서열번호 5, 9그룹 마우스에게는 10mg/kg의 서열번호 5, 10 그룹 마우스에게는 100mg/kg의 서열번호 5, 11그룹 마우스에게는 1mg/kg의 서열번호 6, 12그룹 마우스에게는 10mg/kg의 서열번호 6 및 13그룹 마우스에게는 100mg/kg의 서열번호 6을 투여하였다. 처리 4주 후, 마우스를 죽여서 종양의 질량을 측정하였다. 8 내지 13그룹의 마우스는 1 내지 7그룹의 마우스 보다 종양 질량이 적었다. 8 내지 13 그룹의 마우스는 용량 의존적 양상으로 적은 종양 질량을 나타냈다.
실시예 19
마우스의 림프종 세포 증식에 대한 서열번호 3 및 서열번호 7의 효과
EL-4 뮤린 T 림프종 세포를 종래 기술된 바와 같이(Krawczyk et al., Cancer Immunol. Immunother. 40:347, 1995) C57/BL6 마우스에게 피하 이식하였다. 마우스를 10마리씩 7 그룹으로 나누었다. 0일째, 1그룹 마우스에게는 식염수를, 2그룹 마우스에게는 1mg/kg의 서열번호 3, 3그룹 마우스에게는 10mg/kg의 서열번호 3, 4그룹 마우스에게는 100mg/kg의 서열번호 3, 5그룹 마우스에게는 1mg/kg의 서열번호 7, 6그룹 마우스에게는 10mg/kg의 서열번호 7, 7그룹 마우스에게는 100mg/kg의 서열번호 7을 투여하였다. 처리 4주 후, 마우스를 죽이고 종양 질량을 측정하였다. 그룹 5 내지 7은 그룹 1 내지 4 보다 종양 질량이 적었다. 그룹 5 내지 7의 마우스는 용량 의존적 양상으로 적은 종양 질량을 나타냈다.
실시예 20
스트렙토코커스 세포벽 유도 관절염이 있는 래트에 대한 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 6의 효과
LEW/N 래트의 스트렙토코커스 세포벽 유도 관절염은 부분적으로 섬유아세포계 윤활 세포의 증식 및 침습성 집단으로 이루어진 국소 종양과 유사하다(Yocum et al., Am.J.Pathol. 132:38, 1988). 이 관절염은 그룹 A의 스트렙토코커스 파이오제네스 유래의 스트렙토코커스 세포벽(SCW)을 관절내 주사하여 LEW/N 래트에서 유도시킨 것이다. 이 래트를 10마리씩 13 그룹으로 나누었다. 0일째, 1그룹 래트에게는 SCW를, 2그룹 래트에게는 SCW + 1 mg/kg의 서열번호 1, 3그룹 래트에게는 SCW + 10 mg/kg의 서열번호 1, 4그룹 래트에게는 SCW + 100 mg/kg의 서열번호 1을, 5그룹 래트에게는 SCW + 1 mg/kg의 서열번호 2를, 6그룹 래트에게는 SCW + 10 mg/kg의 서열번호 2, 7그룹 래트에게는 SCW + 100 mg/kg의 서열번호 2, 8그룹 래트에게는 SCW + 1 mg/kg의 서열번호 5, 9그룹 래트에게는 SCW + 10 mg/kg의 서열번호 5, 10그룹 래트에게는 SCW + 100 mg/kg의 서열번호 5, 11그룹 래트에게는 SCW + 1 mg/kg 서열번호 6, 12그룹 래트에게는 SCW + 10 mg/kg의 서열번호 6, 13그룹 래트에게는 SCW + 100mg/kg의 서열번호 6을 투여하였다. 2주 동안 매일 마다 관절 염증을 관찰하였다. 그룹 8 내지 13의 래트는 그룹 1 내지 7의 래트 보다 적은 염증을 나타내었다. 그룹 8 내지 13의 래트는 용량 의존적 양상으로 적은 염증을 나타냈다.
실시예 21
MATRIGEL ® 상에 단층으로서 또는 다세포 구상체로서 증식시킨 암세포의 세포 형태 및 세포 주기에 대한 TEG 콜레스테릴 접합된 서열의 효과
유방, 췌장, 결장, 난소 및 전립선에서 유래하는 여러 종류의 악성 세포주를 MATRIGEL® 코팅 웰에 단층으로 배양하거나 다세포 구상체(MS)로 배양하였다. 세포를 각각 콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트를 접합시키거나 접합시키지 않은 여러 길이(3개 염기 및 6개 염기)의 올리고뉴클레오타이드 서열로 적어도 1 내지 3일 동안 처리하였다. 이와 같은 서열로는, 비제한적으로 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 4 또는 서열번호 8이 있다. 세포 증식/괴사(트립판 블루 배제 시험으로 측정), 아폽토시스(유동세포분석법, 핵 유사분열 기구 단백질(MuMA)의 방출, 말단 데옥시뉴클레오타이드 트란스퍼레이즈 효소 매개의 브로모데옥시우리딘 트리포스페이트-바이오틴 닉 말단 표지화(TUNEL)에 의한 단편화된 DNA 검출로 측정), 유동 세포분석법에 의한 세포 주기 발달 연구(PI 염색) 및 MATRIGEL® 코팅 웰 상에 플레이팅된 것이거나 다세포 구상체(MS)로서의 종양 세포들의 형태를 조사하였다.
콜레스테릴-TEG 포스포아미다이트가 접합된 올리고뉴클레오타이드 서열은 세포 사멸(괴사 및 아폽토시스)을 증가시키고, 세포를 MS로서 배양하거나 MATRIGEL® 코팅 평판 상에서 배양할 때의 세포 주기 발달을 조정하고, 세포를 MS로서 배양하 거나 MATRIGEL® 코팅 웰에서 배양할 때 세포 형태를 변화시킨다. 미접합 올리고뉴클레오타이드는 불활성이다.
실시예 22
MDA-MB-231 이종이식 종양에 대한 서열번호 3 및 서열번호 7의 효과
MDA-MB-231 세포를 누드 마우스에게 피하로 이종이식하였다. 이 마우스를 10마리씩 7 그룹으로 나누었다. 종양의 직경이 5mm에 도달한 후, 1그룹 마우스에게는 식염수를, 2그룹 마우스에게는 0.5mg/kg의 서열번호 3, 3그룹 마우스에게는 5mg/kg의 서열번호 3, 4그룹 마우스에게는 50mg/kg의 서열번호 3, 5그룹 마우스에게는 0.5mg/kg의 서열번호 7, 6그룹 마우스에게는 5mg/kg의 서열번호 7, 7그룹 마우스에게는 50mg/kg의 서열번호 7을 투여하였다. 3일마다 최대 6회 용량을 정맥내로 투여하였다. 종양의 직경이 1cm에 도달하거나, 임의의 고통의 증후를 나타내는 시기에 또는 연구 말기(세포 주사 3개월 후)에 마우스를 죽였다. 완전 부검을 실시하였다. 종양 질량, 침습 존재 및 전이 존재를 측정하였다. 그룹 5 내지 7의 마우스는 그룹 1 내지 4의 마우스 보다 적은 종양 질량을 나타내었다. 그룹 5 내지 7의 마우스는 용량 의존 양상으로 적은 종양 질량을 나타냈다.
실시예 23
MDA-MB-231 이종이식 종양에 대한 서열번호 3 및 서열번호 7의 효과
유방암 MDA-MB-231 세포를 누드 마우스에게 피하로 이종이식하였다(1x107 세포). 이 마우스를 10마리씩 7 그룹으로 나누었다. 종양의 직경이 5mm2에 도달한 후, 1그룹 마우스에게는 식염수를, 2그룹 마우스에게는 0.4mg/kg의 서열번호 3, 3그룹 마우스에게는 4mg/kg의 서열번호 3, 4그룹 마우스에게는 40mg/kg의 서열번호 3, 5그룹 마우스에게는 0.4mg/kg의 서열번호 7, 6그룹 마우스에게는 4mg/kg의 서열번호 7, 7그룹 마우스에게는 40mg/kg의 서열번호 7을 투여하였다. 3일마다 최대 6회 용량을 정맥내로 투여하였다. 종양의 직경이 1cm에 도달하거나, 임의의 고통의 증후를 나타내는 시기에 또는 연구 말기(세포 주사 3개월 후)에 마우스를 죽였다. 완전 부검을 실시하였다. 종양 질량, 침습 존재 및 전이 존재를 측정하였다. 그룹 5 내지 7의 마우스는 그룹 1 내지 4의 마우스 보다 적은 종양 질량과 전이를 나타내었다. 그룹 5 내지 7의 마우스는 용량 의존 양상으로 적은 종양 질량과 전이를 나타냈다.
본 명세서에 기술된 모든 특허, 공개 공보 및 발췌문들은 그 전체내용이 본원에 참고인용된 것이다. 상기 기술된 모든 내용은 본 발명의 바람직한 구체예만을 예시한 것으로서, 이의 다양한 변형이나 수정이 첨부되는 청구의 범위에 기술된 본 발명의 범위 및 영역을 벗어나지 않는 한도내에서 이루어질 수 있음은 자명한 것이다.



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Claims (23)

  1. 5'-OH, 3'-TEG 콜레스테릴 합성 서열을 포함하되, 이 서열이 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8인 것이 특징인, 암 또는 관절염 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 추가로 약학적 허용성 담체를 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 추가로 치료제를 포함하는 것이 특징인 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 합성 서열이 세포 반응을 유도해내는 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 반응이 세포 증식 억제, 세포 주기 정지, 아폽토시스 유도, 카스페이즈 활성화, 세포 내의 폴리(ADP-리보스) 폴리머레이즈 절단, 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정 또는 이의 복합 반응인 것이 특징인 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 세포가 암세포 또는 윤활세포인 것이 특징인 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 암이 림프종, 백혈병 또는 유방암인 것이 특징인 약학 조성물.
  10. 5'-OH, 3'-TEG 콜레스테릴 합성 서열을 약학적 허용성 담체에 첨가하는 단계를 포함하는 암 또는 관절염 치료용 약학 조성물의 제조 방법으로서,
    상기 합성 서열이 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 또는 서열번호 8인 것이 특징인 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 약학 조성물이 세포 내에서 반응을 유도하는 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 약학 조성물이 동물이나 인간에게 투여하기에 유용한 것임이 특징인 제조 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 반응이 세포 증식 억제, 세포 주기 정지, 아폽토시스 유도, 카스페이즈 활성화, 세포 내에서의 폴리(ADP-리보스)폴리머레이즈 절단, 또는 세포외간질-세포 상호작용의 조정 또는 이의 복합 반응인 것이 특징인 제조 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포가 암세포 또는 윤활세포인 것이 특징인 제조 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제10항에 있어서, 암이 림프종, 백혈병 또는 유방암인 것이 특징인 제조 방법.
  18. 제10항에 있어서, 합성 서열의 유효량이 체중을 기준으로 0.001 내지 100 mg/kg인 것이 특징인 제조 방법.
  19. 제18항에 있어서, 합성 서열의 유효량이 체중을 기준으로 0.01 내지 10 mg/kg인 것이 특징인 제조 방법.
  20. 제18항에 있어서, 합성 서열의 유효량이 체중을 기준으로 0.1 내지 5 mg/kg인 것이 특징인 제조 방법.
  21. 제10항에 있어서, 약학 조성물에 추가로 치료제를 첨가하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서, 치료제가 항종양제, 항관절염제, 항염증제, 항자가면역제, Fas 조절제, 방사선 치료제, 또는 이들의 조합인 것이 특징인 제조 방법.
  23. 제1항에 따른 약학 조성물 및 약학적으로 허용가능한 담체를 생체외 세포에 투여하여 세포 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 생체외 세포 반응 유도 방법.
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