CN1599627A - 可用于治疗的三甘醇胆甾烯基寡核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包括5′-OR,3′-TEG胆甾烯基合成序列和可以药用的载体的组合物,其中,所述序列是SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8。本发明还提供了将该组合物用于制备药物的方法,以及利用该组合物诱导细胞中的反应的方法,所述反应包括,但不局限于癌细胞和/或滑膜细胞中细胞增殖的抑制,细胞周期停滞的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活的诱导,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,细胞程序死亡的诱导或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。
Description
发明领域
本发明涉及胆甾烯基-偶联的寡核苷酸组合物,及其用于抑制细胞增殖,诱导细胞程序死亡,修饰细胞周期进程和调节细胞外基质-细胞相互作用的用途。
发明背景
增殖是通过细胞周期进行的细胞发展的顶点,导致了一个细胞分裂成两个细胞。细胞周期的五个主要时期是G0,G1,S,G2,和M期。在G0期,细胞是静止的。体内的大部分细胞在某一时间是处在这一阶段的。在G1期,细胞根据信号进行分裂,产生DNA合成所必需的RNA和蛋白质。在S-期(SE,早S-期;SM,中S-期;和SL,晚S-期),细胞复制它们的DNA。在G2期,蛋白质在致力于细胞分裂的准备。在有丝分裂(M)期,细胞分裂成两个子细胞。细胞周期进程的改变出现在所有癌症中,并且可能是由基因的超量表达,调节基因的突变,或DNA损伤关卡的取消所导致的(Hochhauser D.,Anti-CancerChemotherapeutic Agents,8:903,1997)。
细胞程序死亡或编程性细胞死亡是杀伤和去除不希望的细胞的生理学过程,并且是化疗剂杀伤癌细胞的机制。细胞程序死亡的特征是细胞内独特的形态学改变,所述改变包括核染色质的凝聚,细胞收缩,核分解,质膜起泡,以及膜结合的细胞程序死亡体的形成(Wyllie等,Int.Rev.Cytol.,68:251,1980)。磷脂酰丝氨酸从质膜内表面向外表面的转运,与染色质的凝聚吻合,并且被认为是细胞程序死亡的标志(Koopman,G.等,Blood,84:1415,1994)。已知细胞程序死亡的机制是通过激活被称为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶家族而介导的。
天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶将三种主要肽序列认作底物(Thomberry等,J.Biol.Chem.272:17907,1997):(i)Tyr-Val-Ala-Asp(YVAD,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-1,-4),(ii)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2,-3和-7),和(iii)Ile-(Leu)-Glu-X-Asp(I(L)EXD;天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-8和-10)。蛋白质目标中的序列识别导致了所述目标的有限的和特异性的蛋白水解,如通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-7,包括但不局限于核纤层蛋白的结构蛋白质目标的降解,或包括但不局限于多腺苷二磷酸核糖聚合酶的酶的激活。据报导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3能够根据促-细胞程序死亡信号,切割成它的具有催化活性的亚基(17和13kDa),从而导致细胞程序死亡(Susin等,J.Exp.Med.186:25,1997)。
在细胞程序死亡期间,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活导致了多种底物的蛋白水解切割。多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)——一种参与DNA修复的核内酶,是在细胞程序死亡期间由天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3切割的一种众所周知的底物。它的切割被认为是细胞程序死亡的标志(O′Brien等,Biotechniques 30:886,2001)。
细胞外基质(ECM)能影响正常细胞和肿瘤细胞的行为(Radisky等,Seminars Cancer Biol.,11:87,2001)。因此,当将肿瘤细胞铺平板在ECM上时,肿瘤细胞和ECM成分之间的相互作用将激活模拟体内肿瘤的若干种生物病理学特征的信号传导事件,如细胞-细胞接触的调节(Weaver等,J.Cell Biol.,137:231,1997)。
合成的寡核苷酸是聚阴离子序列,所述序列被内在化到细胞中(Vlassov等,Biochim.Biophys.Acta,11197:95,1994)。据报导,合成的寡核苷酸能选择性地与核酸结合(Wagner,R.,Nature,372:333,1994),与特殊的细胞蛋白质结合(Bates等,J.Biol.Chem.,274:26369,1999),以及与特殊的核蛋白质结合(Scaggiante等,Eur.J.Biochem,252:207,1998),以便抑制癌细胞的增殖。
业已描述了具有胆甾烯基部分的寡核苷酸的合成和物理学特征。胆甾烯基部分与反义寡核苷酸的3’末端的连接能增强它们的活性(Letsinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6553,1989;Boutorin等,FEBS Letter,254:129,1989;Corrias等,J.Neurooncol.31:171,1997;美国专利号4,958,013;WO专利号9714440)。胆甾烯基部分与3′-末端的连接能增强细胞对反义分子的摄取(Corrias等,J.Neurooncol.31:171,1997),并且增强体内反义血管保持(Fleser等,Circulation 92:1296,1995)。业已描述了通过氨基磷酸酯键与磷连接的核苷间胆甾烯基侧链是一种能增强反义分子活性的修饰(美国专利号4,958,013)。发现在5′-末端具有胆甾烯基部分的15个胞苷或胸苷残基的均聚物,能调节早幼粒细胞白血病细胞中的细胞质Ca2+水平,而在5′-末端具有胆甾烯基部分的杂聚序列或胆甾烯基修饰过的硫代磷酸序列是无活性的(Saxon等,Antisense Res.Dev.2:243,1992)。已显示由15个具有交替的胞嘧啶和腺苷残基的硫代磷酸脱氧核苷酸组成的杂聚物或具有15个胞嘧啶或胸苷均聚物,在胆甾烯基团与它的5′-末端连接时,是氨甲蝶呤转运的有效抑制剂(Henderon等,Nucl.Acids Res.25:3726,1995)。在5’-末端具有胆甾烯基部分的10个碱基的同型胞苷硫代磷酸寡核苷酸的共价修饰通过抑制HIV逆转录酶,阻断了受HIV-1或HIV-2感染的T淋巴细胞中的合胞体的形成(Stein等,Biochemistry 5:2439,1991)。
胆甾烯基部分与寡核苷酸的附着对癌细胞生长具有最小的作用(Henderon等,Nucl,Acids Res.25:3726,1995)。细胞程序死亡的一般特征未在用3′-末端胆甾烯基寡核苷酸处理的癌细胞系中观察到(Corrias等,J.Newooncol.31:171,1997)。
业已证实大部分抗癌治疗,无论是针对增殖抑制,细胞周期停滞的诱导,细胞程序死亡的诱导,免疫系统的刺激还是细胞外基质细胞相互作用的调节,更不适合临床应用。这些治疗方法中的很多是无效的或有毒的,具有明显的副作用,导致抗药性或免疫致敏的形成,并且使受体衰弱。
因此,一直需要能在癌细胞中诱导细胞周期停滞的新型组合物和方法,在癌细胞中诱导细胞程序死亡的方法,以及调节细胞外基质-细胞相互作用的方法。
发明概述
本发明通过提供一种组合物满足了这一需要,其中,将一个三甘醇(TEG)胆甾烯基部分与合成的寡核苷酸序列SEQ ID NO:1(5′OH-GGGTGG-OH 3′),SEQ ID NO:2(5′OH-GGGAGG-OH 3′),SEQ ID NO:3(5′OH-CCACCC-OH 3′),或SEQ ID NO:4(5′OH-GTG-OH 3′)的3’末端附着,得到了相应的5′-OH,3′TEG胆甾烯基新型合成的寡核苷酸序列SEQ ID NO:5(5′OH-GGGTGG(TEG-胆甾烯基)3′),SEQ ID NO:6(5′OH-GGGAGG(TEG-胆甾烯基)3′),SEQ ID NO:7(5′OH-CCACCC(TEG-胆甾烯基)3′),或SEQ ID NO:8(5′OH-GTG(TEG-胆甾烯基)3′)。本发明还提供了使用所述新型合成的寡核苷酸序列的方法,包括将所述序列与可以接受的载体组合,以便制备一种组合物,并且体外或体内使用所述组合物。给包括人类的动物施用所述组合物,以便在细胞内诱导一种反应。所述反应包括,但不局限于细胞增殖的抑制,细胞周期停滞的诱导,细胞程序死亡的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。诱导所述反应的一种优选细胞是癌细胞或滑膜细胞。可以用本发明的组合物治疗以不希望的细胞增殖为特征的任何疾病或状况。以不希望的细胞增殖为特征的所述疾病或状况包括,但不局限于自身免疫病,炎症,淋巴增殖性疾病,关节炎和癌症。
本发明还提供了将所述新型合成的寡核苷酸序列用于制备药物的用途。所述药物可用于治疗以不希望的细胞增殖为特征的疾病或状况,包括,但不局限于自身免疫病,炎症,淋巴增殖性疾病,关节炎或癌症。
可以将本发明的一种或多种新型序列与可以接受的载体组合,并且作为一种组合物在体外用于培养中的细胞或组织,或在体内用于动物或人类。另外,本发明的组合物可以与一种或多种治疗剂一起使用。本发明组合物的使用可以在使用医学或兽医学领域的普通技术人员已知的一种或多种治疗剂之前,期间或之后。医学或兽医学领域普通技术人员所公知的可用于治疗疾病的任何治疗剂都可与本发明的新型序列组合使用。所述组合使得可以使用较低剂量的治疗剂,从而减弱不希望的副作用。
给动物或人类施用包括有效量的一种或多种本发明序列的组合物是一种治疗方案,它能预防,治疗或消除以不需要的细胞增殖为特征的疾病或状况。所述疾病或症状为医学或兽医学领域的普通技术人员所公知,并且包括,但不局限于癌症,炎症,关节炎,淋巴增殖性疾病,哮喘和血管成形术之后的动脉再狭窄。癌症包括,但不局限于鳞状细胞癌,纤维肉瘤,类肉瘤癌,黑素瘤,乳腺癌,肺癌,结直肠癌,肾癌,骨肉瘤,皮肤黑素瘤,基底细胞癌,胰腺癌,膀胱癌,脑癌,卵巢癌,前列腺癌,白血病,淋巴瘤,和由此产生的肿瘤转移。
给动物和人类施用治疗剂的方法和途径为本领域普通技术人员所公知,并且可用于施用包括本发明序列和可以药用的载体的组合物。
胆甾烯基-TEG亚磷酰胺部分与功能性情性3′-OH寡核苷酸的3′-氧共价附着之后抑制癌细胞和滑膜细胞增殖,在癌细胞和滑膜细胞中诱导细胞程序死亡,在癌细胞中调节细胞外基质-细胞相互作用,以及改变癌细胞的细胞周期进程的出人预料的和惊人的能力,解决了医学领域长期需要的和未得到满足的需要,并且给包括人类的动物提供了重大利益。
因此,本发明的一个目的是提供一种包括5′-OH,3′-TEG胆甾烯基合成序列的新型组合物。
本发明的另一个目的是提供一种能有效治疗包括人类的动物中疾病的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种能有效治疗以不希望的细胞增殖为特征的疾病或症状的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种能有效治疗癌症的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种能有效治疗关节炎的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种能在细胞中诱导一种反应的组合物和方法,包括,但不局限于细胞增殖的抑制,细胞周期停滞的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活的诱导,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,细胞程序死亡的诱导,或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。
本发明的另一个目的是提供一种能在癌细胞或滑膜细胞,包括抗药癌细胞或滑膜细胞中诱导一种反应的组合物和方法,所述反应包括,但不局限于细胞增殖的抑制,细胞周期停滞的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活的诱导,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,细胞程序死亡的诱导,或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。
本发明的另一个目的是提供一种能在细胞中诱导不依赖于BCR-ABL(22号染色体上的BCR基因和9号染色体上的ABL基因的融合体)的细胞程序死亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种能在细胞中诱导不依赖于p53突变的细胞程序死亡的组合物和方法。
本发明的另一个目的是提供一种便于制备的组合物。
本发明的另一个目的是提供一种对受体具有最低毒性的组合物。
本发明的另一个目的是提供将所述新型合成寡核苷酸序列用于制备药物的用途,所述药物可用于治疗以不希望的细胞增殖为特征的疾病或症状。
通过阅读下面所披露的非限定实施方案和所附权利要求书的详细说明,可以理解本发明的其他目的,特征和优点。
附图简述
图1.在仅用常规培养基(RCM)或添加了SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:5的培养基预培养之后,在MATRIGEL上的MCF-7,MDA-MB-231(MDA-231),Hs578T和Mpanc-96细胞生长的照片。
图2.在仅用常规培养基(RCM),用添加了SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:8的培养基预培养之后,在MATRIGEL上生长的人类乳腺癌细胞生长的照片。
图3.在MATRIGEL-包被的孔上生长48小时之后,MCF-7细胞的照片。然后,让所得到的三维细胞结构接触单独的常规培养基(RCM),或接触添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的培养基。
图4.在MATRIGEL-包被的孔上生长48小时之后,MDA-231细胞的照片。然后,让所得到的三维细胞结构接触单独的常规培养基(RCM),或接触添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7的培养基。
图5.以类球体形式生长的并且接触添加或没有添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺(chol-TEG),SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7的常规培养基(RCM),或接触相应的对照(RCM+水(RCMW)和RCM+乙腈(RCMA))3天时间的Hs578T细胞的照片。
发明详述
本发明提供了包括5′-OH,3′-TEG胆甾烯基合成序列的新型组合物,其中,所述序列是SEQ ID NO:5(5′OH-GGGTGG(TEG-胆甾烯基)3′),SEQ ID NO:6(5′OH-GGGAGG(TEG-胆甾烯基)3′),SEQ ID NO:7(5′OH-CCACCC(TEG-胆甾烯基)3′)或SEQ ID NO:8(5′OH-GTG(TEG-胆甾烯基)3′)。
本发明还提供了使用所述新型组合物的方法。本发明的组合物在以能在细胞中有效诱导一种反应的量给动物或人类施用时可用于在细胞中诱导一种反应。所述反应包括但不局限于细胞增殖的抑制,细胞周期停滞,细胞程序死亡的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活,在所述细胞中多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。在一种实施方案中,所述动物或人类患有癌症或关节炎。在一种优选实施方案中,所述细胞是癌细胞。在另一种优选实施方案中,所述细胞是滑膜细胞。
本发明的组合物可用于治疗以不希望的细胞增殖为特征的疾病或状况。在一种实施方案中,本发明的组合物是以能有效治疗动物或人类的癌症的量给患有癌症的动物或人类施用的。
在另一种实施方案中,本发明的组合物是以能有效治疗动物或人类的关节炎的量给患有关节炎的动物或人类施用的。
3′-TEG胆甾烯基寡核苷酸抑制增殖,诱导细胞周期停滞,诱导细胞程序死亡,激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,或在细胞中调节细胞外基质-细胞相互作用,或在细胞中诱导所述反应的组合的出人预料的和惊人的能力,在医学领域满足了长期期待的、未满足的需要,并且为动物和人类提供了重大利益。
在本文中,术语“序列”表示3′-OH,5′-OH合成寡核苷酸,包括SEQ ID NO:1(5′OH-GGGTGG-OH 3′),SEQ ID NO:2(5′OH-GGGAGG-OH3′),SEQ ID NO:3(5′OH-CCACCC-OH 3′),或SEQ ID NO:4(5′OH-GTG-OH 3′),或表示5′-OH,3′-TEG胆甾烯基合成寡核苷酸,包括SEQ ID NO:5(5′OH-GGGTGG(TEG-胆甾烯基)3′),SEQ ID NO:6(5′OH-GGGAGG(TEG-胆甾烯基)3′),SEQ ID NO:7(5′OH-CCACCC(TEG-胆甾烯基)3′),或SEQ ID NO:8(5′OH-GTG(TEG-胆甾烯基)3′)。
在本文中,术语“3′-TEG胆甾烯基寡核苷酸”和“3′-TEG胆甾烯基合成寡核苷酸”表示3′-三甘醇胆甾烯基-修饰过的寡核苷酸,即在3’末端具有连接的TEG胆甾烯基部分的5′-OH寡核苷酸。为了进行说明,下面示出了SEQ ID NO:7的化学结构,它是5′-OH,3′-TEG胆甾烯基合成寡核苷酸的一种例子。
在本文中,术语“反应”表示一种反应的诱导,包括但不局限于细胞增殖的抑制,细胞周期停滞的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,细胞中细胞程序死亡的诱导,或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。
在本文中,短语“在反应细胞中有效的”表示一种序列诱导一种反应的能力,包括,但不局限于所述序列抑制细胞增殖,诱导细胞周期停滞,诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活,诱导多腺苷二磷酸核糖聚合酶切割,在细胞中诱导细胞程序死亡,或调节细胞外基质-细胞相互作用,或它们的组合的能力。
在本文中,短语“治疗性处理”,“有效量”和“能有效…的量”表示一种序列有效诱导一种反应的量,包括,但不局限于细胞增殖的抑制,细胞周期停滞,激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶,切割多腺苷二磷酸核糖聚合酶,在细胞中诱导细胞程序死亡,调节细胞外基质-细胞相互作用,或它们的组合。
在本文中,术语“疾病”表示一种状况,其中,身体的健康受到破坏。
在本文中,短语“治疗剂”是得到一个国家或政府的管理机构批准的或在美国药典(U.S.Pharmacopoeia)或其他公认的药典中所列举的制剂的任何制剂,包括辐射,所述制剂可用于治疗包括人类的动物的疾病。
在本文中,短语“化疗药物”是得到一个国家或政府的管理机构批准的或在美国药典(U.S.Pharmacopoeia)或其他公认的药典中所列举的可用于治疗包括人类在内的动物疾病的任何制剂。
在本文中,短语“抗关节炎药物”是得到一个国家或政府的管理机构批准的或在美国药典(U.S.Pharmacopoeia)或其他公认的药典中所列举的可用于治疗包括人类在内的动物的关节炎的任何制剂。
在本文中,术语“抗肿瘤”表示抑制癌细胞的,发展,进展,增殖或扩散。
给动物或人类施用有效量的本发明的组合物是一种治疗方案,它能诱导一种反应,预防,治疗或消除疾病或它们的组合。所述反应包括,但不局限于细胞增殖的抑制,细胞周期停滞,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活,多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,在细胞中诱导细胞程序死亡,调节细胞外基质-细胞相互作用,或它们的组合。所述疾病包括,但不局限于癌症,关节炎,淋巴增殖性疾病或炎症。癌症包括,但不局限于鳞状细胞癌,纤维肉瘤,血管肉瘤,淋巴管肉瘤,横纹肌肉瘤,平滑肌肉瘤,脂肉瘤,软骨肉瘤,类肉瘤癌,黑素瘤,乳腺癌,肺癌,结直肠癌,肾癌,骨肉瘤,皮肤黑素瘤,基底细胞癌,胰腺癌,膀胱癌,脑癌,卵巢癌,前列腺癌,白血病,淋巴瘤,骨髓瘤和由它们衍生的转移瘤。关节炎的形式包括,但不局限于幼年性关节炎,骨关节炎和类风湿关节炎。
一种序列的治疗效果可以通过包括,但不局限于下列方法的方法增强:化学修饰碱基,糖或磷酸主链,使用包括合适序列的细菌质粒化学补充或通过生物技术扩增所述序列,让所述序列与生物学或化学载体复合,或让所述序列与组织类型或细胞类型定向配体或抗体偶联。
包括一种或多种序列和可以药用的载体的组合物是通过让所述序列和可以药用的载体均匀而且紧密地结合而制备的。在本文中,术语“可以药用的载体”或“可以药用的媒介物”被用于表示,但不局限于任何液体,固体或半固体,包括,但不局限于水或盐水,凝胶,乳剂,药膏,溶剂,稀释剂,流体软膏基料,软膏,糊剂,植入物,脂质体,胶束,和大胶束等,这些制品适合用于与活的动物或人类组织接触,而又不会导致负面生理学反应,并且,它们不会与所述组合物中的其他成分以有害的方式相互作用。为本领域技术人员所公知的其他可以药用的载体或媒介物可用于制备用于送递本发明寡核苷酸序列的组合物。液体载体是含水载体,无水载体或这两者,并且包括,但不局限于含水悬浮液,二甲基亚砜,乙醇,油类乳液,油包水乳液,水包油包水乳液,位点特异性乳液,长效乳液,粘性乳液,微型乳液和纳米乳液。固体载体是生物学载体,化学载体或这两者,并且包括,但不局限于病毒载体系统,颗粒,微颗粒,纳米颗粒,微球体,纳米球体,小型泵,细菌细胞壁提取物和可生物降解的或不可生物降解的天然或合成聚合物,这些聚合物能够进行所述序列的持续释放。可以将乳液,小型泵和聚合物植入需要送递的部位附近。用于使序列与固体载体复合的方法包括,但不局限于直接吸附到所述固体载体的表面,与所述固体载体的表面共价偶联,直接结合或通过连接部分结合,并且将与所述聚合物的共价偶联或静电偶联用于制备固体载体。任选地可以通过添加非离子型或离子型聚合物,如聚氧乙烯山梨糖醇酣单油酸酯(Tweens),透明质酸或氢氧化铝使序列稳定化。可以采用本领域普通技术人员所公知的其他载体。
优选的含水载体包括,但不局限于水,盐水和可以药用的缓冲液。优选的无水载体包括,但不局限于矿物油或中性油类,包括,但不局限于甘油二酯,甘油三酯,磷脂,脂质,油类和它们的混合物,其中,所述油类包括多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的合适的混合物。其例子包括,但不局限于豆油,低芥酸菜子油,棕榈油,橄榄油和myglyol,其中,所述脂肪酸可以是饱和的或不饱和的。任选地无论是否用可以药用的载体将所述序列呈递给效应细胞,都可以添加赋形剂。所述赋形剂包括,但不局限于抗氧化剂,缓冲液和抑菌剂,并且可以包括悬浮剂和增稠剂。
本发明的序列可以与可以药用的载体组合,并且作为组合物体外给培养中的细胞或组织施用,或在体内给动物或人类施用。施用的形式包括,但不局限于注射,溶液,乳剂,凝胶,植入物,泵,软膏,乳液,悬浮液,微球体,颗粒,微颗粒,纳米颗粒,脂质体,糊剂,膏贴,片剂,经皮送递装置,喷雾剂,气溶胶,或其他为本领域普通技术人员所熟悉的形式。所述可以药用的载体为本领域普通技术人员所普遍公知。本发明的药用制剂可以通过本领域所熟知的方法,使用众所周知的和便于获得的成分制备。例如,所述化合物可以与常用赋形剂,稀释剂或载体配制,并且制成片剂,胶囊,悬浮液,和粉末等。适用于所述制剂的赋形剂,稀释剂和载体的例子包括以下成分:填充剂和补充剂(例如,淀粉,糖,甘露糖醇和硅衍生物);粘合剂(例如羧甲基纤维素和其他纤维素衍生物,藻酸盐,明胶和聚乙烯吡咯烷酮);湿润剂(例如甘油);崩解剂(例如碳酸钙和碳酸氢钠);用于延缓溶解的试剂(例如石蜡);再吸收加速剂(例如季铵化合物);表面活性剂(例如鲸蜡醇,单硬脂酸甘油酯);吸附载体(例如高岭土和皂土);乳化剂;防腐剂;增甜剂;稳定剂;着色剂;加香剂;增香剂;润滑剂(例如,滑石,硬脂酸钙和硬脂酸镁);固体聚乙二醇;和它们的混合物。
所述制剂可以是这样构成的,它们只能或优选在特定位点,可能在一定的时间,释放所述活性成分。所述组合还提供了用于控制释放动力学的其他机制。例如,可以用聚合物质或蜡制备包被剂,包膜和保护性基质。
一种或多种序列可以单独施用,或者与其他治疗剂形式组合,包括,但不局限于化疗剂,抗关节炎制剂,免疫治疗剂,抗微生物剂,或抗病毒剂,或与放射治疗组合,或它们的任意组合。化疗剂包括,但不局限于抗代谢物,DNA损伤,微管脱稳定,微管稳定化,肌动蛋白解聚,生长抑制,拓扑异构酶抑制,HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A)还原酶抑制,嘌呤合成抑制,嘧啶合成抑制,金属蛋白酶抑制,CDK(依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶)抑制,血管发生抑制,分化增强,和免疫治疗剂。抗关节炎制剂包括,但不局限于,抗炎制剂,包括非甾族类抗炎制剂(NSAIDs),止痛剂,生物学反应调节剂,疾病调理抗风湿药物(DMARDs),抗代谢剂,促细胞程序死亡,DNA损伤,微管去稳定化,微管稳定化,肌动蛋白解聚,生长抑制,拓扑异构酶抑制,嘌呤合成抑制,嘧啶合成抑制,金属蛋白酶抑制,CDK抑制,或血管生成抑制剂。NSAIDs包括,但不局限于传统的NSAIDs,如双氯芬酸钾,双氯芬酸钠,具有米索前列醇的双氯芬酸钠,双氟尼酸,依托度酸,苯氧苯丙酸,氟吡咯芬钙,布洛芬,吲哚美辛,酮洛芬,甲氯灭酸,甲灭酸钠,美洛昔康,萘丁美酮,萘普生,萘普生钠,噁丙嗪,吡罗昔康,舒林酸,和甲苯酰吡酸钠,环加氧酶-2(COX-2)抑制剂,如celecoxib和rofecoxib,水杨酸盐,如阿司匹林,胆碱水杨酸盐,水杨酸镁,双水杨酸酯和水杨酸钠。止痛剂包括,但不局限于对乙酰氨基酚,具有可待因的对乙酰氨基酚,具有对乙酰氨基酚的氢可酮,羟氢可待酮,盐酸丙氧芬,和曲马朵。生物学反应调节剂包括,但不局限于etanercept和infliximab。糖皮质素包括,但不局限于可的松,地塞米松,氢化可的松,甲基强的松龙,强的松龙磷酸钠和强的松去炎松。DMARDs包括,但不局限于金诺芬(口服金),硫唑嘌呤,环磷酰胺,环孢菌素,硫酸基羟氯喹,来氟米特,氨甲蝶呤,二甲胺四环素,青霉胺,柳氮磺吡啶,金硫葡糖和硫代苹果酸金钠。
施用途径为本领域普通技术人员所公知,并且包括但不局限于口服(例如,脸颊或舌下),直肠,如栓剂或灌肠剂,局部的,肠胃外,皮下,经真皮,真皮下,肌内,腹膜内,囊泡内,关节内,静脉内,真皮内,颅内,损伤内,鞘内,肿瘤内,眼内,眼部,气溶胶,肺内,脊柱内,前列腺内,舌下,放入体腔内,鼻腔吸入,肺吸入,印入皮肤和电穿孔,子宫内,阴道,进入体腔,在肿瘤或内部损伤的部位手术使用,直接进入肿瘤,进入器官腔体或实质,和进入骨髓。在上述各种施用形式中使用的方法包括,但不局限于局部使用,摄入,手术施用,注射,喷雾,经真皮送递装置,渗透泵,直接电沉积在需要的部位,或为本领域普通技术人员所熟悉的其他方法。使用的部位可以是外部,如在表皮上,或内部,例如,关节囊,肿瘤,胃溃疡,手术区域,或其他部位。
本发明的组合物能够以乳剂,凝胶,溶液,悬浮液,脂质体,颗粒,或组合物制备和送递技术领域技术人员所公知的其他方式使用。超细粒度可用于吸入送递治疗剂。用于皮下使用的合适制剂的某些例子包括,但不局限于植入物,储存装置,针头,胶囊和渗透泵。用于阴道内使用的合适制剂的某些例子包括,但不局限于乳剂,栓剂,海绵,凝胶,泡沫和环。用于口服的合适制剂的某些例子包括,但不局限于:药丸,胶囊,液体,糖浆,和悬浮液。用于经真皮和经粘膜施用的合适制剂的某些例子包括,但不局限于乳剂,糊剂,膏贴,喷雾剂和凝胶。用于皮下施用的合适送递机制的某些例子包括,但不局限于植入物,储存装置,针头,胶囊,和渗透泵。适合肠胃外施用的制剂包括,但不局限于含水和无水无菌注射溶液,该溶液可以包括抗氧化剂,缓冲剂,抑菌剂,和使得该制剂与预期受体的血液等渗的溶质,以及含水和无水无菌悬浮液,它可以包括悬浮剂和增稠剂。临时注射溶液和悬浮液可以用本领域普通技术人员常用的无菌粉末,颗粒,和片剂制备。
本发明的序列可以与一种或多种可以药用的载体或赋形剂组合,以便制成组合物。所述组合物可以方便地以单位剂量形式存在,并且可以通过常规制药技术制备。所述技术包括以下步骤:使含有所述活性成分的组合物和药用载体或赋形剂结合。一般,所述制剂是通过让活性成分与液体载体均匀而且紧密地结合而制成的。优选的单位剂量制剂是含有所施用的成分的一定剂量或单位的制剂,或它的合适的部分。应当理解的是,除了上面具体提到的成分之外,包括本发明组合物的制剂可以包括本领域普通技术人员常用的其他制剂。
施用体积可以根据施用途径而改变。所述体积为给动物或人类施用组合物的技术领域的普通技术人员所公知。根据施用途径,每个剂量的体积优选为大约0.001-100毫升,更优选为大约0.01-50毫升,最优选为大约0.1-30毫升。每个剂量所施用的序列的量优选为大约O.001-100毫克/千克体重,更优选为大约0.01-10毫克/千克,最优选为大约0.1-5毫克/千克。所述序列,序列的组合,和/或其他治疗剂能够以单一剂量治疗形式施用,通过多个剂量治疗施用或根据一种方案用适合要治疗的疾病,受体的状况和施用途径的一定时间连续输液。另外,所述序列可以在施用所述治疗剂之前,同时,或之后施用。所施用的具体序列和具体治疗剂,每个剂量的用量,以及施用途径应当由医生采用本领域技术人员公知的方法确定,并且取决于要治疗的疾病或状况,例如,癌症的类型,癌症的严重程度,癌症的部位以及其他临床因素,如患者的身高,体重和体能状况。另外,可以任选性地采用各种体外和体内测定,以便有助于确定施用的序列和序列加治疗剂的最佳范围。
给患有癌症或关节炎的动物或人类施用能有效增强化疗剂的抗肿瘤作用或抗关节炎制剂的抗关节炎作用的用量的与治疗剂,例如,化疗剂或抗关节炎制剂组合的序列。所施用的每个剂量的治疗剂的量任选为大约0.001-1000毫克/平方米体表面或大约0.01-1000毫克/千克体重,更优选为大约0.01-500毫克/平方米或大约0.01-500毫克/千克,最优选为大约0.1-100毫克/平方米或大约0.1-100毫克/千克。所施用的特定序列和特定治疗剂,每个剂量的用量,用药方案和施用途径应该由医生采用本领域技术人员所公知的方法确定,并且取决于疾病的类型,疾病的严重程度,疾病的位置和其他临床因素,如患者的身高,体重和体能状况。另外,可以选择性地采用体外和体内测定,以便有助于确定序列和序列加治疗剂施用的最佳范围。在PCTCA00/01467(WO01/44465)中描述了可用于这一目的的各种测定。在以下资料中描述了用于评估本发明序列的效力,以及用于评估与其他治疗剂组合的所述序列的效力的其他测定:Oncogene ResearchProducts,P.O.Box 12087,La Jolla,California,92039(ApoptosisCatalog and Technical Guide 2002-2003,特别是5-295页)。所述测定包括为了分析DNA断裂,细胞程序死亡,线粒体标记,内质网标记,游离核小体,核基质蛋白质,许多天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和相关蛋白质的检测和活性而设计的测定,所述蛋白包括,但不局限于天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1-14,谷胱甘肽,超氧化物歧化酶,bc1-2家族的成员,Fas/TNR-R超家族,PARP相关产物的分析,细胞程序死亡信号转导物的分析,包括死亡受体,Apo2,decoy受体在内的各种信号传导受体的分析,细胞程序死亡膜蛋白质,神经系统细胞程序死亡标记,细胞周期和细胞增殖的各种标记,有丝分裂激酶的分析,溴脱氧尿苷测定,和p53测定。本发明序列的效力还可以根据其他制剂评估,包括治疗剂,包括,但不局限于抗关节炎制剂,或在以下资料中描述的细胞程序死亡诱导剂和细胞同步化制剂:Oncogene Research Products,P.O.Box 12087,La Jolla,California,92039(Apoptosis Catalog and Technical Guide2002-2003,特别是99-104和214-255页)。所述制剂包括,但不局限于放线菌素D,amphidocolin,A23187,咖啡因,喜树碱,放线菌酮,地塞米松,阿霉素,5-氟尿嘧啶,羟基脲,紫杉醇,星形孢菌素,胸苷,长春花碱,视黄酸,依托泊苷,冈田酸,长春花新碱和氨甲蝶呤。
为本领域技术人员所公知的各种体外和体内测定,可用于评估序列本身或与治疗剂组合之后用于治疗关节炎的效力和最佳剂量范围。动物模型包括,但不局限于佐剂疾病模型,油性佐剂诱导的模型,微生物以及它们的细胞壁成分-诱导的模型,软骨成分诱导的模型。转基因和剔除模型,非免疫学骨关节炎模型,和部分综合症模型,正如在以下文献中所描述的:Waxman,B.H.,Scand.J.Immunol.,56:12,2002。模型动物包括,但不局限于大鼠,小鼠,灵长类,豚鼠和兔子。
为了确定细胞周期的阶段,可以采用为本领域技术人员所公知的各种测定和方法。一种这样的方法使用CYCLETESTTM PLUS DNA商业试剂盒(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。简单地讲,来自细胞的细胞核是通过以下方法获得的:在非离子去污剂中溶解细胞膜,用胰蛋白酶消除细胞骨架和核蛋白质,用RNase消化细胞RNA,以及用精胺稳定核染色质。将碘化丙锭添加到细胞核中,并且用装配有电子双重分辨能力的流式细胞计分析它们的荧光(FACSCalibur,Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。在细胞周期的G0/G1期,早S(SE)期,中S(SM)期,晚S(SL)期或G2/M期的细胞积累,可以采用MODFIT LT软件(Verity Software House Inc.,Topsham,MA),或其他合适的软件分析。
可以利用各种体外和体内测定评估细胞外微环境对正常细胞和肿瘤细胞行为的影响。所述测定可以采用MATRIGEL(BectonDickinson,Franklin Lakes,NJ),它是从Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤中提取的溶解的基底膜制剂。
多细胞类球体(MS)是一种具体的体外测定的例子,其中,肿瘤细胞是以三维方式培养的,以便形成“肿瘤样”结构。在该系统中,存在一种细胞-细胞相互作用的强化,这种强化模拟了实体瘤的恶性肿瘤细胞在体内的微环境状况。在这种类型的分析中,不添加细胞外基质成分。在MS系统中培养的细胞不同于二维系统中的细胞(单层培养条件)。所述差别中的某一些与肿瘤细胞的结构和功能性分化,肿瘤细胞的细胞周期改变,“多细胞抗药性”,以及药物通过肿瘤细胞层扩散和侵入的改变相关(参见以下文献中的综述:Green等,Anticancer Drug Des.14:153,1999)。
下面的实施例将用于进一步说明本发明,不过,与此同时,这些实施例不构成对本发明的任何限制。相反,应当清楚地理解的是,在不背离本发明精神的前提下,本领域技术人员在阅读本文的说明之后,可以提出各种其他实施方案,改进和等同方案。
实施例1
核苷酸序列的制备
使用Abacus区段合成技术,通过Sigma-Genosys(Woodlands,TX,美国)制备磷酸二酯合成核苷酸序列和偶联的3’-TEG胆甾烯基合成核苷酸序列。在TEG CPG支持物上合成其3’末端为TEG胆甾烯基的序列(Glen Research,Sterling,VA,美国)。在即将使用之前,将该序列分散在水中或分散在二甲基亚砜(DMSO)中。
实施例2
细胞
所有细胞系都是从美国模式培养物保藏所(ATCC,Rockyille,MD)获得的,并且是在由ATCC推荐的培养基中培养的。乳腺癌细胞系是在由ATCC推荐的培养基或描述于公开文献中的培养基中培养的(Herrera-Gayol and Jothy,Int.J.Exp.Path.,82:193,2001)。表1表示在有关文献中描述的细胞系,细胞系的来源和它们的生物病理学特征(Hackett等,Cancer Inst.,58:1795,1977;Price等,Cancer Res.,50:717,1990;Thompson等,J.Cell Physiol.,150:534,1992;和Peiper M等,Int.J.Cancer 71:993,1997)。
表1
细胞系
细胞系 | 说明 |
MEG-01* | 人类慢性髓细胞白血病细胞系 |
EL-4* | 鼠T淋巴瘤细胞系 |
HIG-82** | 兔滑膜细胞系 |
MCF-7** | 人类,乳腺腺癌(胸膜渗出)。分化良好。体外和体内非侵入性。体内非转移的。天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3阴性。 |
MDA-MB-231** | 人类,乳腺腺癌(胸膜渗出)。分化不良。体外和体内侵入性。转移性。P53突变的。 |
Hs578T** | 人类,乳腺癌肉瘤(原发性肿瘤)。分化不良。体外和体内侵入性。转移性。P53突变的。 |
Mpanc-96** | 人类,胰腺癌(原发性肿瘤)。中度分化的腺癌。体内非侵入性。 |
*非贴壁细胞
**贴壁细胞
实施例3
通过SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6诱导MEG-01细胞的细胞程序死亡。
质膜磷脂酰丝氨酸的重分配是发生细胞程序死亡的细胞的一种特征(Martin等,J.Exp.Med.,182:1545,1995)。在细胞程序死亡期间,磷脂酰丝氨酸在质膜中的重分配是采用FITC(荧光素异硫氰酸酯)-偶联的膜联蛋白V(BD Pharmingen,San Diego,CA),通过流式细胞术测定的。将费城染色体阳性,并且具有BCR-ABL基因融合的人类慢性骨髓白血病细胞系MEG-01细胞,以2.5×105细胞/ml的浓度与最终浓度为5.3,26.5和53.0μM的SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6和胆甾烯基-TEG亚磷酰胺分子一起培养48小时。在表2中报道了在进行SEQ ID NOs:1,2,5,6,或胆甾烯基-TEG亚磷酰胺处理之后,发生细胞程序死亡的细胞的百分比。未处理过的MEG-01细胞的细胞程序死亡的百分比为12%。
表2
MEG-01细胞中磷脂酰丝氨酸阳性细胞(细胞程序死亡的细胞)的百分比
组合物 | 浓度(μM)5.3 26.5 53.0 | ||
SEQ ID NO:1 | 12 | 12 | 12 |
SEQ ID NO:5 | 12 | 27 | 42 |
SEQ ID NO:2 | 12 | 12 | 12 |
SEQ ID NO:6 | 13 | 22 | 39 |
胆甾烯基-TEG亚磷酰胺 | 12 | 12 | 12 |
如表2所示,SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和胆甾烯基-TEG亚磷酰胺对MEG-01是无活性的。出人预料的是,在SEQ ID NO:1的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:5,而在SEQ ID NO:2的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ IDNO:6,赋予所述惰性寡核苷酸诱导MEG-01细胞的细胞程序死亡的能力,这种活性是通过磷脂酰丝氨酸在细胞表面的转运衡量的。
实施例4
通过SEQ ID NO:7诱导EL-4细胞的细胞程序死亡
将鼠类T淋巴瘤细胞系EL-4细胞以2.5×105细胞/ml的浓度与0.53,5.3和53.0μM浓度的SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7或胆甾烯基-TEG亚磷酰胺一起培养24小时。在表3中报道了在进行SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:7或胆甾烯基-TEG亚磷酰胺处理之后,细胞程序死亡的细胞的百分比。未处理过的EL-4细胞的细胞程序死亡百分比为7%。
表3
EL-4细胞中磷脂酰丝氨酸阳性细胞(程序死亡的细胞)的百分比
组合物 | 浓度(μM)0.53 5.3 53.0 | ||
SEQ ID NO:3 | 7 | 7 | 7 |
SEQ ID NO:7 | 8 | 11 | 49 |
胆甾烯基-TEG亚磷酰胺 | 7 | 7 | 7 |
如表3所示,SEQ ID NO:3或胆甾烯基-TEG亚磷酰胺都不能导致EL-4细胞的细胞程序死亡。出人预料的是,在SEQ ID NO:3的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:7,赋予所述惰性寡核苷酸诱导EL-4细胞的细胞程序死亡的能力,这种能力是通过磷脂酰丝氨酸在细胞表面的转运衡量的。
实施例5
通过SEQ ID NO:7激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3
将EL-4细胞(2.5×105细胞/ml)与0μM(对照),53μM的SEQ IDNO:3或53μM的SEQ ID NO:7一起培养72小时。在培养之后,洗涤、固定、透化对照细胞和处理过的细胞,并且与藻红蛋白(PE)-偶联的能识别天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的活性催化单位的抗体(克隆:C92-605;BD Pharmingen,San Diego,CA,美国)一起培养,使用由生产商推荐的条件。在FACSCALIBUR上,采用CellQUEST程序(均来自Becton Dickinson,San Jose,CA,美国),通过流式细胞术,分析与活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3相关的荧光。在表4中报道了在用53μM的序列处理过的EL-4细胞中含有活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的细胞的百分比。
表4
EL-4细胞中含有活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的细胞的百分比
处理 | 含有活性天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的细胞的百分比 |
未处理过的EL-4细胞 | 3 |
EL-4细胞+53μM的SEQ ID NO:3 | 4 |
EL-4细胞+53μM的SEQ ID NO:7 | 38 |
如表4所示,SEQ ID NO:3对EL-4是没有活性的。出人预料的是,在SEQ ID NO:3的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:7,赋予所述惰性寡核苷酸诱导细胞程序死亡的能力,这种能力是通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3的激活衡量的。
实施例6
由SEQ ID NO:7切割多腺苷二磷酸核糖聚合酶
将EL-4细胞(2.5×105细胞/ml)与0μM(对照),53μM的SEQ IDNO:3或53μM的SEQ ID NO:7一起培养72小时。在培养之后,洗涤、固定、透化对照细胞和处理过的细胞,并且与FITC-偶联的能特异性识别切割的PARP的85kDa片段的抗体(BioSource,Camarillo,CA,美国)一起培养,使用生产商推荐的条件。在FACSCalibur上采用CellQUEST程序(均来自Becton Dickinson),通过流式细胞术分析与切割的PARP相关的荧光。在表5中报道了在用53μM的最终浓度的序列处理过的EL-4细胞中含有切割的PARP的细胞的百分比。
表5
EL-4细胞中含有切割的PARP的细胞的百分比
处理 | 含有切割的PARP细胞的百分比 |
未处理过的EL-4细胞 | 1 |
EL-4细胞+53μM的SEQ ID NO:3 | 1 |
EL-4细胞+53μM的SEQ ID NO:7 | 84 |
如表5所示,SEQ ID NO:3对EL-4是没有活性的。出人预料的是,在SEQ ID NO:3的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:7,赋予所述惰性寡核苷酸诱导细胞程序死亡的能力,这种能力是通过PARP的切割衡量的。
实施例7
SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,和SEQ ID NO:8对滑膜细胞增殖的影响
以1.0×105细胞/ml的浓度,将滑膜细胞系——贴壁的HIG-82细胞与53μM(最终浓度)的SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,或SEQ ID NO:8一起培养48小时。通过二甲基噻唑-二苯基-四唑(MTT)还原测定细胞增殖(Mosman等,J.Immunol.Methods 65:55,1983)。MTT是在570nm的波长下,使用多重分光光度计读数仪测定的(ELX800,Bio-TEK,Instruments Inc.,Winooski,VT)。在表6中示出了HIG-82细胞增殖的抑制百分比,该百分比是通过以下公式计算的:
表6
HIG-82细胞增殖的抑制(%)
处理(53μM) | 抑制(%) |
SEQ ID NO:2 | 6% |
SEQ ID NO:6 | 75% |
SEQ ID NO:3 | 0% |
SEQ ID NO:7 | 53% |
SEQ ID NO:4 | -7% |
SEQ ID NO:8 | 64% |
如表6所示,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4不能抑制滑膜HIG-82细胞的增殖。出人预料的是,在SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,分别得到了SEQ ID NO:6,7和8,赋予它们抑制HIG-82细胞的细胞增殖的能力。
实施例8
通过SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6诱导增殖的滑膜细胞的细胞程序死亡。
以1.0×105细胞/ml的浓度将贴壁HIG-82细胞与53μM最终浓度的SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:5,或SEQ ID NO:6一起培养48小时。由于在诸如胰蛋白酶消化的贴壁细胞收获技术之后,细胞程序死亡的磷脂酰丝氨酸/膜联蛋白V检测不可靠(vanEngeland,Cytometry,31:1,1998),所以使用流式细胞仪通过检测断裂的DNA评估分析HIG-82细胞的细胞程序死亡,该方法通过采用商业化测定(APO-BRDUTM试剂盒;BD Pharmingen),进行末端脱氧核苷酸转移酶-介导的溴脱氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端标记(TUNEL)。测定含有核DNA断裂的细胞的百分比。在24小时之后,未处理过的HIG-82细胞对于核DNA断裂来说基本是阴性的。
表7
HIG-82细胞中含有DNA断裂的细胞(细胞程序死亡的细胞)的百分比
处理(53μM) | 含有DNA断裂的细胞的百分比 |
SEQ ID NO:1 | 1 |
SEQ ID NO:5 | 17 |
SEQ ID NO:2 | 1 |
SEQ ID NO:6 | 18 |
如表7所示,SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2对指数生长的滑膜细胞是无活性的。出人预料的是,在SEQ ID NO:1,和SEQ ID NO:2的3’末端添加胆甾烯基-TEC亚磷酰胺,分别得到了SEQ ID NO:5和6,赋予它们诱导HIG-82细胞程序死亡的能力。这种能力是通过具有断裂的核DNA的细胞的百分比衡量的。
实施例9
SEQ ID NO6对细胞周期停滞的诱导
将指数生长的MEG-01细胞(2×105细胞/ml)与0μM(对照),53μM的SEQ ID NO:2或53μM的SEQ ID NO:6一起培养24小时。收集所述细胞,离心,并且确定细胞周期阶段。
表8
通过SEQ ID NO:6诱导MEG-01白血病细胞的细胞周期停滞
处理(53μM) | 各期的细胞% | ||
G0/G1+SE | SM | SL+G2/M | |
未处理过的细胞 | 71.4 | 10.8 | 17.8 |
SEQ ID NO:2 | 68.6 | 11.6 | 19.8 |
SEQ ID NO:6 | 51.6 | 6.5 | 41.9 |
如表8所示,与未处理过的对照细胞相比,SEQ ID NO:2对MEG-01是无活性的。出人预料的是,在SEQ ID NO:2的3’-末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:6,赋予它在MEG-01细胞的SL+G2/M7期诱导细胞周期停滞的能力。
实施例10
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7对人类乳腺癌细胞的细胞增殖的影响。
将20×103 MDA-MB-231(MDA-231)或Hs578T铺平板到24孔平板的每一个孔的常规培养基(RCM)中,所述培养基有或没有(对照)53μM(最终浓度)的SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,53μM胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,或相应的对照培养基(SEQ ID NO:3的常规培养基(RCM),具有与所添加的SEQ ID NO:7相同量的水的RCM,和具有与所添加的胆甾烯基-TEG亚磷酰胺相同量的乙腈的RCM)。将细胞培养72小时,用胰蛋白酶消除,并且采用台盼兰排除技术,用血细胞计数量计数。在表9中示出了三次独立测定的结果(与对照相比,变化百分比的平均值和标准误差(s.d.))。
表9
培养3天的MDA-231和Hs578T人类乳腺癌细胞的细胞增殖变化百分比*。
SEQ ID NO:3 | SEQ ID NO:7 | 胆甾烯基-TEG亚磷酰胺 | *P值 | |
MDA-231 | +6.9±5 | -97.9±2.5 | -2.3±15.9 | <0.01 |
Hs578T | -6.5±5 | -91.8±10.5 | +13±9.2 | <0.01 |
*“阳性+”变化表示增殖的刺激,而“阴性-”变化表示增殖的抑制,它是通过以下公式计算的:
**在对方差进行重复测定分析(RM ANOVA)之后,通过Dunnett′s多重比较测试获得的p值。
如表9所示,SEQ ID NO:3与胆甾烯基-TEG亚磷酰胺不会显著影响细胞增殖。出人预料的是,在SEQ ID NO:3的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:7,赋予它对两种高度侵入性人类乳腺癌细胞的细胞增殖的抑制能力。
实施例11
在MATRIGEL肿瘤生长实验中,通过SEQ ID NO:5诱导的三维结构形成的改变。
分别在常规培养基中培养MCF-7,MDA-MB-231(MDA-231),Hs578T和Mpanc-96细胞,用胰蛋白酶消化,并且计数。在37℃下,在最终浓度为53μM的SEQ ID NO:1,53μM的SEQ ID NO:5或RCM中,分别预培养100×103的MDA-231细胞,100×103的Hs578T细胞,150×103的MCF-7细胞和150×103的Mpanc-96细胞1小时,并且在MATRIGEL包被的平板(MATRIGEL基底膜基质包被的cellware 24-孔平板)的顶部平板培养3天时间。用10%的福尔马林固定平板。采用与Nikon倒置显微镜型号TMS连接的Nikon Coolpix 990数码相机(NikonCorporation,Tokyo,日本)拍摄24孔平板上的细胞的数码照片。尽管SEQ ID NO:1不会改变细胞形态学,但SEQ ID NO:5抑制了类似于当细胞在MATRIGEL上的常规培养基上培养时所形成的三维结构的形成(参见图1)。
如表1所示,SEQ ID NO:1是无活性的,不过,出人预料的是,在SEQ ID NO:1的3’-末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQID NO:5,赋予它抑制形成类似于当细胞在MATRIGEL上的常规培养基上培养时所形成的三维结构的形成的能力。据信,SEQ ID NO:5干扰了细胞-细胞外基质相互作用,从而调节了细胞-细胞和细胞-细胞外基质粘附机制。
实施例12
在MATRIGEL(Beckton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)生长实验中,由SEQ ID NO:8诱导的三维结构形成的改变。
在常规培养基中培养MDA-MB-231(MDA-231)和Hs578T,用胰蛋白酶消化,并且计数。在37℃下,在最终浓度为53μM的SEQ ID NO:4,53μM的SEQ ID NO:8或RCM中将100×103的MDA-MB-231细胞或100×103的Hs578T细胞分别预培养1小时,并且在MATRIGEL包被的平板铺平板3天时间。用10%的福尔马林固定平板。采用与Nikon倒置显微镜型号TMS连接的Nikon Coolpix 990数码相机(NikonCorporation,Tokyo,日本)拍摄24孔平板上的细胞的数码照片。尽管SEQ ID NO:4不会改变细胞形态学,但SEQ ID NO:8破坏了在MATRIGEL上铺平板的肿瘤细胞的生长形式(参见图2)。
如图2所示,SEQ ID NO:4是无活性的,不过,出人预料的是,在SEQ ID NO:4的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQID NO:8,赋予它抑制类似于当细胞在MATRIGEL-包被的孔上的常规培养基上培养时所形成的三维结构的形成的能力。据信,SEQ IDNO:8干扰了细胞-细胞外基质相互作用,从而调节了肿瘤细胞和ECM成分之间的相互作用。
实施例13
在MATRIGEL生长实验中,由SEQ ID NO:9诱导的MCF-7的三维结构形成的改变。
在常规培养基(RCM)中培养培养MCF-7细胞,用胰蛋白酶消化,并且计数。将150×103的MCF-7细胞放在用350μL MATRIGEL包被的24孔平板的孔中培养。在没有任何处理的48小时期间形成三维结构之后,更换培养基,并且让所述结构接触最终浓度53μM的SEQ ID NO:5,53μM的SEQ ID NO:7,53μM的胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,RCM或它们各自的对照培养基(具有水的RCM,具有DMSO的RCM,或具有乙腈的RCM)。每隔3-4天重复所述处理,直到达到最长培养时间为19-20天。重复以上实验3次。使用与Nikon倒置显微镜型号TMS连接的NikonCoolpix 990数码相机拍摄24孔平板中的细胞的数码照片。尽管各自的对照培养基(数据未发表),SEQ ID NO:3和胆甾烯基-TEG亚磷酰胺与对照相比不影响三维结构,但SEQ ID NO:7破坏了所述结构的生长形式,从而影响了细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用(参见图3)。
如图3所示,SEQ ID NO:3和胆甾烯基-TEG亚磷酰胺是无活性的,不过,出人预料的是,在SEQ ID NO:3的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:7,赋予它破坏预先形成的三维结构的能力。
实施例14
在MATRIGEL生长实验中,由SEQ ID NO:7诱导的MDA-MB-231的三维结构形成的改变。
在常规培养基中培养MDA-MB-231(MDA-231)细胞,用胰蛋白酶消化,并且计数。将100×103的MDA-231细胞铺平板到用350μLMATRIGEL包被的24孔平板的孔中的常规培养基(RCM)中。在不进行任何处理的情况下,在48小时期间形成三维结构之后,更换培养基,并且让所述结构接触最终浓度为53μM的SEQ ID NO:3,53μM的SEQID NO:7,53μM的胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,RCM,或它们各自的对照培养基(具有水的RCM,具有DMSO的RCM,或具有乙腈的RCM)。每隔3-4天重复所述处理,直到达到最长培养时间为17-21天。重复以上实验3次。使用与Nikon倒置显微镜型号TMS连接的Nikon Coolpix990数码相机拍摄24孔平板中的细胞的数码照片。尽管各自的对照培养基(数据未发表),SEQ ID NO:3和胆甾烯基-TEG亚磷酰胺不影响类似于在RCM(负对照培养基)中培养的结构的三维结构,但SEQ ID NO:7破坏了所述结构的生长形式,从而影响了细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用(参见图4)。
如图4所示,SEQ ID NO:3和胆甾烯基-TEG亚磷酰胺是失活的,不过,出人预料的是,在SEQ ID NO:3的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:7,赋予它通过干扰细胞-细胞和细胞-细胞外基质相互作用破坏三维结构的能力。
实施例15
当Hs578T细胞以多细胞类球体形式培养时,通过SEQ ID NO:7诱导的细胞周期的改变
在存在50μM最终浓度的SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7,53μM的胆甾烯基-TEG亚磷酰胺(cholTEG)或相应的对照培养基(常规培养基(RCM),含有与所添加的SEQ ID NO:7相同量的水的RCM(RCMW),和含有与所添加的胆甾烯基-TEG亚磷酰胺相同数量的乙腈的RCM(RCMA))的条件下,培养大约100×103Hs578T细胞/类球体。将每一种实验条件的5个类球体培养72小时。然后,采用FACScalibur流式细胞计(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ),通过碘化丙锭(PI)染色(Calbiochem,Novabiochem Corporation,San Diego,CA),评估细胞周期进展。用MODFITLT软件(Verity Software HouseInc)分析在细胞周期的不同阶段的细胞的百分比变化。结果如图5所示。
如图5所示,与仅接触常规培养基的类球体相比,SEQ ID NO:3,胆甾烯基-TEG亚磷酰胺或对照培养基不会显著改变细胞周期进展。出人预料的是,接触SEQ ID NO:7增加了G2M和S-期的细胞的百分比,并且减少了G0/G1期细胞的百分比(p<0.05,通过卡方检验)。添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺赋予在MS分析中测定的无活性的寡核苷酸改变复杂的三维系统中细胞周期进展的能力,这种进展类似于体内肿瘤的若干种生物病理学特征。
实施例16
与SEQ ID NO:5一起培养时,MDA-MB-231人类乳腺癌细胞释放的核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的改变
在各自的对照培养基中,将MDA-MB-231细胞与53μM最终浓度的SEQ ID NO:1或53μM最终浓度的SEQ ID NO:5一起培养72小时。将核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的释放用作细胞程序死亡的衡量指标。采用商业化ELISA试剂盒(Oncogene,Cambridge,MA),按照生产商的方法测定NuMA。结果如表10所示,并且以与各自的对照相比,基于光密度测定的NuMA释放的百分比增加形式表示。
表10
在MDA-MB-231人类乳腺癌细胞中,核有丝分裂器蛋白质(NuMA)释放的改变
SEQUENCE | 与对照相比,NuMA释放(%) |
SEQ ID NO:1 | +5% |
SEQ ID NO:5 | +430% |
如图10所示,在细胞与SEQ ID NO:5一起培养之后,核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的释放增加了430%。出人预料的是,在SEQ ID NO:1的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,得到了SEQ ID NO:5,赋予它诱导细胞程序死亡的能力。
实施例17
在与SEQ ID NO:6一起培养时,Hs578T人类乳腺癌细胞释放的核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的改变
将Hs578T细胞在阴性对照条件下或与53μM最终浓度的SEQ IDNO:2,53μM最终浓度的SEQ ID NO:6一起以单细胞层培养72小时。将核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的释放用作细胞程序死亡的衡量指标。采用商业化ELISA试剂盒,按照生产商的方法测定NuMA。结果如表11所示,并且以与对照条件相比,基于光密度测定的NuMA释放的百分比增加形式表示。
表11
Hs578T人类乳腺癌细胞释放的核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的改变
SEQUENCE | 与对照相比,NuMA释放(%) |
SEQ ID NO:2 | +8% |
SEQ ID NO:6 | +288% |
如图11所示,在细胞与SEQ ID NO:6一起培养之后,核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的释放增加了288%。出人预料的是,在SEQ ID NO:2的3’末端添加胆甾烯基-TEG亚磷酰胺,赋予无活性的寡核苷酸诱导细胞程序死亡的能力。
实施例18
SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,和SEQ ID NO:6对无胸腺裸鼠中MEG-01细胞的影响
按以前描述的方法,将MEG-01细胞皮下接种到无胸腺裸鼠体内(Takeo等,Leukemia 7:1286,1993)。将所述小鼠分成13个组,每组10只小鼠。在第0天,第1组小鼠接受盐水,第2组小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO:1,第3组小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO:1,第4组小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO:1,第5组小鼠接受1mg/kgSEQ ID NO:2,第6组小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO:2,第7组小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO:2,第8组小鼠接受1mg/kg SEQ IDNO:5,第9组小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO:5,第10组小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO:5,第11组小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO:6,第12组小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO:6,而第13组小鼠接受100mg/kgSEQ ID NO:6。在处理4周之后,处死所述小鼠,并且测定肿瘤质量。与第1-7组的小鼠相比,第8-13组的小鼠具有较小的肿瘤质量。第8-13组的小鼠表现出剂量依赖形式的较小的肿瘤质量。
实施例19
SEQ ID NO:3,和SEQ ID NO:7对小鼠中淋巴瘤细胞生长的影响
按以前描述的方法,将EL-4鼠T淋巴瘤细胞皮下植入到C57/BL6小鼠体内(Krawczyk等,Cancer Immunol.Immunother.40:347,1995)。将所述小鼠分成7个组,每组10只小鼠。在第0天,第1组小鼠接受盐水,第2组小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO:3,第3组小鼠接受10mg/kg SEQ ID NO:3,第4组小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO:3,第5组小鼠接受1mg/kg SEQ ID NO:7,第6组小鼠接受10mg/kgSEQ ID NO:7,第7组小鼠接受100mg/kg SEQ ID NO:7。在处理4周之后,宰杀所述小鼠,并且测定肿瘤质量。与第1-4组的小鼠相比,第5-7组的小鼠具有较小的肿瘤质量。第5-7组的小鼠以剂量依赖形式表现出较小的肿瘤质量。
实施例20
SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6对患有链球菌细胞壁-诱导的关节炎的大鼠的影响
在LEW/N大鼠体内,由链球菌细胞壁诱导的关节炎类似于局限性肿瘤,所述肿瘤部分由成纤维样滑膜细胞的增殖性和侵入性群体组成(Yocum等,Am.J.Pathol.132:38,1988)。通过关节内注射来自A型酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)的链球菌细胞壁(SCW)在LEW/N大鼠体内诱导关节炎。将大鼠分成13个组,每组10只大鼠。在第0天,第1组大鼠接受SCW,第2组大鼠接受SCW+1mg/kg SEQ IDNO:1,第3组大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO:1,第4组大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO:1,第5组大鼠接受SCW+1mg/kg SEQID NO:2,第6组大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO:2,第7组大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO:2,第8组大鼠接受SCW+1mg/kgSEQ ID NO:5,第9组大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO:5,第10组大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO:5,第11组大鼠接受SCW+1mg/kg SEQ ID NO:6,第12组大鼠接受SCW+10mg/kg SEQ ID NO:6,第13组大鼠接受SCW+100mg/kg SEQ ID NO:6。用2周时间,每天监测关节炎症。第8-13组大鼠表现出比1-7组大鼠更弱的炎症。第8-13组大鼠具有较弱的剂量依赖形式的炎症。
实施例21
当癌细胞以单细胞层形式在MATRIGEL上生长或以多细胞类球体形式生长时,与TEG胆甾烯基偶联的序列对细胞形态学和细胞周期的影响
以单细胞层形式在MATRIGEL包被的孔上或以多细胞类球体(MS)形式培养来自乳腺,胰腺,结肠,卵巢和前列腺的不同类型的恶性肿瘤细胞系。用有和没有偶联的胆甾烯基-TEG亚磷酰胺的具有不同长度(3和6个碱基)的寡核苷酸序列,分别处理细胞至少1-3天。所述序列包括,但不局限于SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:5,SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:7;SEQ IDNO:4,或SEQ ID NO:8。研究了细胞增殖/坏死(通过台盼兰排除方法测定),细胞程序死亡(通过流式细胞仪,核有丝分裂器蛋白质(NuMA)的释放,通过末端脱氧核苷酸转移酶酶-介导的溴脱氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端标记(TUNEL)检测断裂的DNA测定),通过流式细胞仪研究的细胞周期进展(PI染色)和在MATRIGEL-包被的孔上铺平板的或作为多细胞类球体(MS)的肿瘤细胞的形态学。
当细胞以MS形式或在MATRIGEL-包被的平板上培养时,与胆甾烯基-TEG偶联的寡核苷酸序列能增强细胞死亡(坏死和程序死亡),改变细胞周期进展,并且当细胞以MS形式或在MATRIGEL-包被的孔上培养时,可以改变细胞形态学。未偶联的寡核苷酸是无活性的。
实施例22
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7对MDA-MB-231异种移植肿瘤的影响
将MDA-MB-231细胞皮下异种移植到裸鼠体内。将所述小鼠分成7个组,每组10只小鼠。当肿瘤的直径达到5毫米时,第1组小鼠接受盐水,第2组小鼠接受0.5mg/kg SEQ ID NO:3,第3组小鼠接受5mg/kg SEQ ID NO:3,第4组小鼠接受50mg/kg SEQ ID NO:3,第5组小鼠接受0.5mg/kg SEQ ID NO:7,第6组小鼠接受5mg/kg SEQID NO:7,第7组小鼠接受50mg/kg SEQ ID NO:7。每隔3天进行静脉内治疗,最多使用6个剂量。当肿瘤的直径达到1厘米时,在出现任何痛苦的迹象或在研究结束时(从细胞注射开始3个月时间)宰杀小鼠。进行全面尸体解剖。测定肿瘤质量,侵入和转移肿瘤的存在。第5-7组具有比第1-4组小鼠较小的肿瘤质量。第5-7组的小鼠表现出较弱的剂量依赖形式的肿瘤质量。
实施例23
SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:7对MDA-MB-231异种移植肿瘤的影响
将乳腺癌MDA-MB-231细胞皮下异种移植到裸鼠体内(1×107细胞)。将所述小鼠分成7个组,每组10只小鼠。当肿瘤的直径达到5毫米之后,第1组小鼠接受盐水,第2组小鼠接受0.4mg/kg SEQ IDNO:3,第3组小鼠接受4mg/kg SEQ ID NO:3,第4组小鼠接受40mg/kg SEQ ID NO:3,第5组小鼠接受0.4mg/kg SEQ ID NO:7,第6组小鼠接受4mg/kg SEQ ID NO:7,第7组小鼠接受40mg/kg SEQID NO:7。每隔3天进行静脉内治疗,最多使用6个剂量。当肿瘤的直径达到1厘米时,在出现任何痛苦的迹象或在研究结束时(从细胞注射开始3个月时间)宰杀小鼠。进行全面尸体解剖。测定肿瘤质量,侵入和转移肿瘤的存在。第5-7组具有比第1-4组较小的肿瘤质量和转移。第5-7组的小鼠表现出较弱的剂量依赖形式的肿瘤质量和转移。
上面所引用的所有专利,出版物和摘要都以它们的全文形式引入作为参考。当然,应当理解的是,上文所述仅涉及本发明的优选实施方案,并且,在不背离由所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围的前提下,可以对这些实施方案进行多种改进和改变。
序列表
<110>拜奥尼茨生命科学公司
安德烈亚.克里斯蒂娜.赫雷拉—盖奥尔
<120>可用于治疗的三甘醇胆甾烯基寡核苷酸
<130>02811-0271WP 42368-278475
<150>US 60/326,884
<151>2001-10-03
<160>8
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>1
gggtgg 6
<210>2
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>2
gggagg 6
<210>3
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>3
ccaccc 6
<210>4
<211>3
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>4
gtg 3
<210>5
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<223>3’-三甘醇(TEG)胆甾烯基合成寡核苷酸
<400>5
gggtgg 6
<210>6
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<223>3’-三甘醇(TEG)胆甾烯基合成寡核苷酸合成寡核苷酸
<400>6
gggagg 6
<210>7
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<223>3’-3’-三甘醇(TEG)胆甾烯基合成寡核苷酸合成寡核苷酸
<400>7
ccaccc 6
<210>8
<211>3
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<220>
<221>misc_特征
<223>3’-三甘醇(TEG)胆甾烯基合成寡核苷酸合成寡核苷酸
<400>8
gtg 3
Claims (17)
1.一种包括5′-OH,3′-TEG胆甾烯基合成序列的组合物,其中,所述序列是SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7或SEQID NO:8。
2.如权利要求1的组合物,还包括可以药用的载体。
3.如权利要求1的组合物,还包括一种治疗剂。
4.一种方法,包括给动物或人类施用能在细胞中有效诱导一种反应的量的权利要求2的组合物。
5.如权利要求4的方法,其中,所述反应是细胞增殖的抑制,细胞周期停滞,细胞程序死亡的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活,细胞中多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。
6.如权利要求5的方法,其中,所述细胞是癌细胞和滑膜细胞。
7.如权利要求5的方法,其中,所述动物或人类患有疾病。
8.如权利要求7的方法,其中,所述疾病是关节炎或癌症。
9.如权利要求8的方法,其中,所述癌症是淋巴瘤,白血病,或乳腺癌。
10.将权利要求1的组合物用于制备药物的用途。
11.如权利要求10的用途,其中,所述药物能在细胞中有效诱导一种反应。
12.如权利要求10的用途,其中,所述药物可用于给动物或人类施用。
13.如权利要求10,11或12的用途,其中,所述反应是是细胞增殖的抑制,细胞周期停滞,细胞程序死亡的诱导,天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的激活,细胞中多腺苷二磷酸核糖聚合酶的切割,或细胞外基质-细胞相互作用的调节,或它们的组合。
14.如权利要求13的用途,其中,所述细胞是癌细胞和滑膜细胞。
15.如权利要求10,11,或12的用途,其中,所述药物能有效治疗疾病。
16.如权利要求15的用途,其中,所述疾病是癌症或关节炎。
17.如权利要求16的用途,其中,所述癌症是淋巴瘤,白血病,或乳腺癌。
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