CN101076341A - 酪蛋白激酶2反义疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与酪蛋白激酶2核酸序列杂交的反义寡核苷酸，以及使用该反义寡核苷酸抑制酪蛋白激酶2的表达以及减小实体瘤的尺寸的方法。

Description

酪蛋白激酶2反义疗法
技术领域
本发明涉及癌症疗法，更具体地说，涉及使用酪蛋白激酶2反义分子的癌症疗法。
背景技术
酪蛋白激酶2(CK2)是普遍存在的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶，它与细胞的多种功能有关，包括调节细胞生长和增殖以及凋亡(参见，例如Tawfic等人，2001，Histol.Histopathol.，16：573-82)。CK2是高度保守的酶，而且被认为对细胞存活至关重要。该激酶是由复合了两个β亚基的两个催化亚基(α和/或α’)构成的异四聚物。CK2调节细胞生长的一种方式是通过在核中信号传递，在核中，核基质和染色质看上去上是其优先的目标。
因为CK2在各种肿瘤中的水平升高，它与肿瘤过程密切相关。包括CK2的转基因表达在内的研究已经提供证据表明CK2-α的适度过表达赋予细胞致癌可能，并进一步表明，在第二致癌信号存在下，极大地增加了瘤形成的发生率。
发明内容
本发明提供了与酪蛋白激酶2核酸序列杂交的反义寡核苷酸，以及使用该反义寡核苷酸抑制CK2的表达，并减小实体瘤尺寸的方法。
本申请公开的内容报道了通过不同路径输送到前列腺或膀胱肿瘤异种移植物的CK2α反义物的作用。使用注射入鼠的皮下组织中的PC3-LN4细胞来产生裸鼠中的前列腺癌异种移植物。CK2α反义寡核苷酸的肿瘤内注射导致前列腺癌肿瘤以依赖于剂量和时间的方式在体内根除。用CK2α反义寡核苷酸治疗肿瘤的分析证实了CK2信息和与核相关的活性的下调。在类似的实验条件下，正常的细胞和组织较为耐CK2α反义寡核苷酸的影响，证据为细胞死亡最少。对具有同位前列腺肿瘤的裸鼠静脉传递裸露的CK2α硫代磷酸酯寡核苷酸也可有效下调CK2，诱导肿瘤中凋亡。也可以利用包囊在小于50nm的肌腱蛋白毫微囊剂中的呈磷酸二酯形式的CK2α反义寡核苷酸。当通过静脉内路径输送时，发现这些毫微囊剂化制剂比裸露的反义寡核苷酸明显更有效。
一方面，本发明提供了一种抑制实体瘤中的酪蛋白激酶2的表达的方法。该方法包括传递反义寡核苷酸至肿瘤，其中，该反义寡核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交，并降低了其表达。
另一方面，本发明提供了一种减小个体中的实体瘤尺寸的方法。该方法包括传递反义寡核苷酸至肿瘤，其中，该反义寡核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交，并降低了其表达。通常，酪蛋白激酶2表达的降低导致肿瘤尺寸的减小。
传递酪蛋白激酶2反义寡核苷酸的方法可包括，例如肿瘤内的或静脉内的。此外，可将反义寡核苷酸包囊。在本发明的一个实施方式中，反义寡核苷酸是硫代磷酸酯反义寡核苷酸。有代表性的反义寡核苷酸具有示于SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2的序列。在本发明的另一个实施方式中，酪蛋白激酶2是酪蛋白激酶2-α或酪蛋白激酶2-β。可用本发明方法治疗的有代表性的实体瘤包括源自诸如前列腺、膀胱、乳腺、肝脏、肾脏、脑、头部或颈部等部位的那些。
再一方面，本发明提供了一种组合物，它包括反义寡核苷酸及其药学上可接受的载体，其中，该反义寡核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交，并降低了其表达。该组合物可以包囊的形式提供。在一个实施方式中，该组合物可包括具有示于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列的反义寡核苷酸。
除非另有限定，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员普遍所知的含义。虽然与本文中描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或试验中，但是下文中描述了合适的方法和材料。另外，这些材料、方法和例子仅仅是说明性的，不起限制作用。本文中提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献作为整体引用作为参考。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。
本发明的一个或多个实施方式的细节将参照附图在下文中描述。本发明的其它特征、目的和优点将从附图、具体实施方式、以及权利要求书中看出。
附图说明
图1示出了在肿瘤内施用了CK2反义寡核苷酸之后无胸腺的裸鼠中的前列腺肿瘤尺寸。肿瘤尺寸每2天评估。各个点代表3个肿瘤。
图2示出了多特异性的反义序列的作用。序列(示于表5)体外施用于肿瘤细胞，并使用胸苷掺入来评估生长率。使用96-孔板一式两份实验，，重复1-2次。
图3示出了用反义序列治疗后的肿瘤生长。用测径仪跟踪测定肿瘤直径，并使用公式V＝0.5(L*W*W)估算体积，式中L等于两个肿瘤测定值中长的那个。
在各个附图中相同的附图标记表示相同的元素。
具体实施方式
本发明使用反义化合物，具体的是寡核苷酸，用以抑制目标核酸分子的表达。本文中使用的术语“目标核酸”是指RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA和合成(例如，化学合成的)DNA。该目标核酸可以是双链的或单链的(即，有义或反义单链)。在一些实施方式中，目标核酸编码酪蛋白激酶2(CK2)多肽。因此，“目标核酸”包括编码CK2的DNA、由该DNA转录的RNA(包括前-mRNA和mRNA)、以及得自该RNA的cDNA。“反义”化合物是含有核酸或核酸类似物的化合物，它可以1)特异地与目标核酸杂交以影响目标核酸的功能、调控或加工；2)特异地结合蛋白质以干扰目标蛋白质的功能；或者3)模拟病原体感染从而引起对作为目标的核酸种类的细胞加工。用反义寡核苷酸抑制目标核酸或蛋白质的表达通常称为反义技术。因此，反义分子包括siRNA、antagomir、适体、以及与mRNA或其它目标RNA、DNA或蛋白质互补的序列。
本文中使用的术语“杂交”是指氢键合，可以是互补的核苷或核苷酸碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen、或者反Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶，以及鸟嘌呤和胞嘧啶分别是互补的核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)，它们通过形成氢键配对。本文中使用的“互补的”是指在两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果在寡核苷酸的特定位置上的核苷酸能够与目标核酸分子上的核苷酸氢键键合，则认为该寡核苷酸和目标核酸在该位置是互补的。当各个分子上的足量的相应位置被能够相互氢键键合的核苷酸占据时，寡核苷酸和目标核酸是彼此互补的。因此，“可特异性杂交的”用来表示足够程度的互补或精确配对，使得在寡核苷酸与目标核酸之间产生稳定的、特异的结合。
本领域中明白，反义寡核苷酸的序列不需要与和其可特异性杂交的目标核酸的序列100％互补。当(a)寡核苷酸与目标核酸的结合干扰目标核酸的正常功能时，以及(b)具有足够的互补性以避免在需要特异结合的条件下(即，进行体外测试的条件下，或者进行体内测试或治疗用途的生理学条件下)反义寡核苷酸与非目标序列的非特异性结合时，反义寡核苷酸是可特异性杂交的。
体外的严格条件取决于温度、时间和盐浓度(参见，例如Sambrook等人的Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY(1989))。通常，高度至中等严格的条件用于体外特异杂交，使得基本上类似的核酸之间(并非不同的核酸之间)发生杂交。特异杂交条件是在40℃下，在5X SSC(0.75M氯化钠/0.075M柠檬酸钠)中杂交1小时，然后在40℃的1X SSC中洗涤10次，并在室温下的1X SSC中洗涤5次。
体内杂交条件由细胞内条件(例如，生理学pH和细胞内离子条件)构成，该条件控制反义寡核苷酸与目标序列的杂交。体内条件可通过严格性较低的条件在体外模拟。例如，杂交可在37℃下，在2X SSC(0.3M氯化钠/0.03M柠檬酸钠)，0.1％ SDS中体外进行。含有4X SSC、0.1％ SDS的洗液可在37℃使用，在45℃下在1X SSC中进行最后的洗涤。
反义分子与其目标核酸的特异杂交会干扰目标核酸的正常功能。对于目标DNA核酸，反义技术可中断复制和转录。对于目标RNA核酸，反义技术可中断，例如RNA向蛋白质翻译位点的转运、来自RNA的蛋白质的翻译、RNA剪接以产生一种或多种mRNA、以及RNA的催化活性。对于编码CK2的核酸，这一干扰核酸功能的总的效果是抑制CK2的表达。在本发明中，“抑制CK2的表达”意味着中断CK2核酸序列的转录和/或翻译，导致CK2多肽水平下降或完全不存在CK2多肽。
CK2反义寡核苷酸的目标序列的鉴定
反义寡核苷酸优选针对CK2核酸分子内的特异目标。来自小鼠的有代表性的CK2-α序列可在GenBank登录号NM 009974中找到；来自人类的有代表性的CK2-α序列可在GenBank登录号NM 001892、S72393和X70251中找到；来自人类的有代表性的CK2-β序列可在GenBank登录号NM 001320中找到。有代表性的CK2反义寡核苷酸公开在本文中，以及US公开文本No.2002/0147163中。
靶向方法包括鉴定CK2核酸分子内的位点，在那里发生反义相互作用，从而得到所需的效果，例如抑制CK2表达。通常，反义寡核苷酸的优选的目标位点包括这样的区域，该区域包含基因的开放读框(ORF)的翻译起始或终止密码子。另外，ORF在反义技术中有效地作为目标，因其具有5’和3’的未翻译的区域。此外，反义寡核苷酸已成功地针对内含子区和内含子-外显子连接区域。
然而，对目标核酸的序列和区域结构(例如，翻译起始密码子、外显子或内含子)的简单了解通常不足以确保针对特异区域的反义寡核苷酸能有效地结合到目标核酸上，并抑制目标核酸的转录和/或翻译。在其天然状态下，mRNA分子折叠为复杂的二级和三级结构，并且在这些结构内部的序列是反义寡核苷酸难以达到的。为了使效果最好，可将反义寡核苷酸导向到最可能达到的目标mRNA的区域，即，处于或靠近折叠的mRNA分子表面的区域。mRNA分子可达到的区域由本领域中已知的方法鉴定，这些方法包括使用RiboTAGTM或mRNA可达到的位点标记(MAST)技术。RiboTAGTM技术公开于PCT申请SE 01/02054。
CK2反义寡核苷酸
一旦确定了一个或多个目标位点，可合成与该目标充分互补(即，杂交具有足够的强度和特异性，以得到所需效果)的反义寡核苷酸。在本发明中，所需的效果是抑制CK2的表达，使得CK2的细胞水平下降。反义寡核苷酸抑制目标核酸表达的效果可通过使用例如RNA印迹法、RT-PCR、蛋白质印迹法、ELISA或免疫组织化学染色测定CK2 mRNA或蛋白质的水平来评估。对抗-CK2抗体的描述可在例如Faust等人的文章(1999，Int.J.Biochem.Cell.Biol.，31：941-9)、Nastaincyzyk等人的文章(1995，Hybridoma，14：335-9)、以及这些文章中所引用的参考文献中找到。
在一些实施方式中，可将目标核酸的多个可达到的区域作为目标。在这些实施方式中，可使用多个反义寡核苷酸，它们各自与不同的可达到的区域特异性杂交。可一同使用或顺序使用多个反义寡核苷酸。
本发明的反义寡核苷酸的长度可以是约10-50个核苷酸(例如，长12-40、14-30、或15-25个核苷酸)。特别优选长度为15-23个核苷酸的反义寡核苷酸。但是，要理解含有少于10个核苷酸的反义寡核苷酸(例如，优选的反义寡核苷酸之一的一部分)也包括在本发明的范围之内，只要它证实具有抑制CK2的表达的所需的活性。
“反义寡核苷酸”可以是本文中描述的寡核苷酸。术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物的寡聚物或聚合物。该术语包括由天然产生的核碱基、糖和共价核苷(骨架)键组成的寡核苷酸，以及具有非天然产生的部分但功能类似的寡核苷酸。与天然形式的寡核苷酸相比，一些修饰的或取代的寡核苷酸通常是优选的，因为在核酶存在下它们具有所需的性能，例如增强的细胞摄取、增强的对核酸目标的亲和性、以及增强的稳定性。
应注意，反义寡核苷酸可以主要由与目标核酸可达到的区域特异杂交的核苷酸序列组成。但是，这些反义寡核苷酸可在任一端含有5-10个核苷酸的额外侧翼序列。侧翼序列可包括，例如目标核酸的其它序列、与扩增引物互补的序列、或者对应于限制酶位点的序列。
为了达到最大的效果，还可对反义寡核苷酸的设计应用其它标准。这些标准是本领域所熟知的，并被广泛使用在例如寡核苷酸引物的设计中。这些标准包括缺乏可能的反义寡核苷酸的预测的二级结构、合适的G和C核苷酸含量(例如，约50％)，以及缺少序列基序如单个核苷酸重复(例如，GGGG连缀)。
虽然反义寡核苷酸是反义化合物的优选的形式，但是本发明包括其它的寡聚反义化合物，包括但不限于，如下述的那些寡核苷酸类似物。如本领域所知，核苷是碱基-糖结合物，其中碱基部分通常是杂环碱基。两类最普通的杂环碱基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括共价地连接到核苷的糖部分上的磷酸基团的核苷。对于那些包括五呋喃糖基糖的核苷，磷酸根基团可连接到糖的2’、3’或5’羟基部分上。在形成寡核苷酸时，磷酸根基团互相共价连接，形成线性聚合分子。该线性聚合分子的各端可进一步结合以形成环形分子，但是通常优选线性分子。在寡核苷酸分子中，磷酸根基团普遍指形成寡核苷酸的核苷间骨架的那些。RNA和DNA的通常键或骨架是3’→5’磷酸二酯键。
可用于本发明的CK2反义寡核苷酸包括含有修饰的骨架的或非天然的核苷间键的寡核苷酸。如本文中定义的，具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中具有磷原子的那些，以及在骨架中不具有磷原子的那些。为了达到本发明的目的，并且如有时在本领域中所引用的，在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷酸。
修饰的寡核苷酸骨架可包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(例如，3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(例如，3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、和具有正常3’-5’键的硼磷酸酯，以及它们的2’-5’键合的类似物，以及具有反极性的那些，其中相邻的核苷单元配对为3’-5’至5’-3’或者2’-5’至5’-2’连接。还包括各种盐、混合盐、以及游离酸形式。教导制备这些修饰的骨架的寡核苷酸的参考文献提供在例如美国专利4,469,863和5,750,666中。
具有不包括磷原子的修饰的寡核苷酸骨架的CK2反义分子可具有这样的骨架，该骨架由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成。它们包括这样的分子：具有吗啉键(由核苷的糖部分的一部分形成)；硅氧烷骨架；硫、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；含亚烷基的骨架；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2成分部分的其它分子。教导制备这些修饰的骨架的寡核苷酸的参考文献提供在例如美国专利5,235,033和5,596,086中。
在另一个实施方式中，CK2反义化合物可以是寡核苷酸类似物，其中，核苷酸单元的糖和核苷间键(即，骨架)均被新的基团取代，而碱基单元保留以与合适的核酸目标杂交。显示出具有极好的杂交性能的一种这样的寡核苷酸类似物指肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被含酰胺的骨架(例如，氨基乙基甘氨酸)取代。核碱基保留，并直接或间接结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。教导制备这些修饰的骨架寡核苷酸的参考文献提供在例如Nielsen等人的Science 254：1497-1500(1991)和美国专利5,539,082中。
其它有用的CK2反义寡核苷酸可具有硫代磷酸酯骨架和具有杂原子骨架的寡核苷，具体是CH2NHOCH2、CH2N(CH3)OCH2、CH2ON(CH3)CH2、CH2N(CH3)N(CH3)CH2和ON(CH3)CH2CH2(其中，天然磷酸二酯骨架表示为OPOCH2)，如美国专利5,489,677中所教导的，并且酰胺骨架公开在美国专利5,602,240中。
取代的糖基团也可包括在修饰的寡核苷酸中。本发明的CK2反义寡核苷酸可包括在2’位置的以下基团中的一种或多种：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-链烯基；O-、S-或N-炔基；或者O-烷基-O-烷基，其中烷基、链烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-C10烷基或C2-C10链烯基和炔基。有用的修饰还可包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(C2)nCH3]2，式中，n和m为1至约10。另外，寡核苷酸可包括在2’位置的以下基团中的一种：C1-C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药物动力学或药物动力性能的基团、以及具有类似性能的其它取代基。其它有用的修饰包括烷氧基烷氧基，例如2’-甲氧基甲氧基(2’-OCH2CH2OCH3)、二甲基氨基氧代乙氧基(2’-O(CH2)2ON(CH3)2)或二甲基氨基-乙氧基乙氧基(2’-OCH2OCH2N(CH2)2)。其它改性可包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)或2’-氟(2’-F)。还可在寡核苷酸内的其它位置上进行类似的修饰，例如在3’末端核苷酸或者2’-5’键合寡核苷酸中的糖的3’位置上，以及在5’末端核苷酸的5’位置上。寡核苷酸也可具有糖模拟物，例如取代五呋喃苷的环丁基部分。教导制备这些取代的糖部分的参考文献包括美国专利4,981,957和5,359,044。
有用的CK2反义寡核苷酸还可包括核碱基修饰或取代。本文中使用的“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基可包括其它合成的和天然的核碱基如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(尤其是5-溴代)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它有用的核碱基包括公开在例如美国专利3,687,808中的那些。
某些核碱基取代物可特别适用于增加本发明的反义寡核苷酸的结合亲和力。例如，5-甲基胞嘧啶取代显示了能增加核酸双链的稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi等人，eds.，Antisense Research and Applications，第276-278页，CRC出版社，Boca Raton，FL(1993))。其它有用的核碱基取代包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，例如2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
本发明的反义寡核苷酸还可通过化学键合与增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个基团或缀合物连接来修饰。这些基团包括，但不限于脂质基团(例如，胆固醇基团)；胆酸；硫醚基团(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)；硫代胆固醇基团；脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)；磷脂基团(例如，二-十六烷基-外消旋(rac)-甘油，或三乙基-铵1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯)；聚胺或聚乙二醇链；金刚烷乙酸；棕榈基；或者十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧代胆固醇基团。这些寡核苷酸缀合物的制备公开在例如美国专利5,218,105和5,214,136中。
无需将给定的反义寡核苷酸中的所有的核碱基基团都均一修饰。可在一条寡核苷酸中或者甚至寡核苷酸内的单个核苷中掺入一种以上的前述修饰。本发明还包括作为嵌合寡核苷酸的反义寡核苷酸。“嵌合的”反义寡核苷酸可含有两个或多个化学上不同的区域，它们各自由至少一个单体单元(例如，在寡核苷酸的情况下，为核苷酸)构成。嵌合的寡核苷酸通常含有至少一个区域，其中，寡核苷酸修饰为赋予例如，对核酸酶降解的提高的抗性，增加的细胞摄取，和/或对目标核酸增加的亲和性。例如，嵌合的寡核苷酸的区域可用作用于酶如RNase H的底物，它能够切割RNA:DNA双链的RNA链，例如在目标mRNA与反义寡核苷酸之间形成的RNA:DNA双链。因此，通过RNase H切割该双链可极大地增强反义寡核苷酸的效果。
本发明的CK2反义寡核苷酸可在体外合成，并且不包括生物起源的反义组合物，除了包含目标物反义寡核苷酸且已从生物材料纯化或分离的寡核苷酸以外。用于本发明的反义寡核苷酸可通过熟知的固相合成技术常规制备。用于该合成的设备购自几家厂商，例如Applied Biosystems(Foster City，CA)。另外，可使用本领域熟知的用于该合成的其它方式。也可使用类似的技术来制备修饰的寡核苷酸，例如硫代磷酸酯或者烷基化的衍生物。
使用CK2反义寡核苷酸的方法
本发明的反义寡核苷酸可用于研究和诊断，以及治疗用途。例如，基于反义寡核苷酸杂交到编码CK2的核酸的测试可用来评估组织样品中的CK2水平。本发明的反义寡核苷酸与编码CK2的核酸的杂交可通过本领域已知的方式检测。这些方式可包括酶与反义寡核苷酸的缀合，反义寡核苷酸的放射性标记，或者任何其它适合的检测方式。
本领域技术人员可将反义技术的特异性和灵敏性用于治疗用途。已使用反义寡核苷酸作为动物(包括人类)的疾病状态治疗中的治疗手段。对于治疗方法，细胞和组织通常在脊椎动物(例如，哺乳动物如人类)内。
本发明提供了抑制实体瘤中的CK2表达并减小实体瘤的尺寸的方法。通过这些方法，将本发明的反义寡核苷酸肿瘤内引入实体瘤中，以抑制CK2的表达。本发明的方法和组合物可用来杀死细胞，抑制细胞生长，抑制转移，抑制血管生成，或者以其它方式逆转或减少肿瘤细胞的恶性表型。重要的是，可使用本发明方法治疗的实体瘤包括源自部位或身体部分如前列腺、乳腺、肝脏、肾脏、脑、头部和颈部的那些肿瘤。
本发明的药物组合物通常肿瘤内施用。肿瘤内施用可以是迅速的(例如，通过直接注射)，或者可以在一段时间内发生(例如，通过缓慢输液)。适于注射或输液使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；制剂，包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；以及用于无菌可注射溶液或分散液的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是易于通过注射器注射程度的流动形式。它在制造和储藏条件下必须是稳定的，并且必须是防腐的，不受微生物如细菌和真菌的污染。
CK2反义寡核苷酸抑制CK2表达的能力可通过，例如在治疗之前或之后测试个体的CK2 mRNA或蛋白质的水平来评估。用于测试组织或生物样品中的mRNA和蛋白质水平的方法是本领域熟知的，包括RNA印迹法、蛋白质印迹法、原位杂交、以及免疫组织化学染色。
用于配制和随后给药的治疗组合物的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Remington的The Science and Practice of Pharmacy(20版.，Gennaro & Gennaro，编，Lippincott，Williams & Wilkins(2000))。预期用于肿瘤内注射的剂量由肿瘤的质量和密度确定，而不是由病人的大小确定。剂量还取决于要治疗的肿瘤的严重程度和反应程度，治疗过程由单次治疗至几天或几个月的治疗构成，或者直到治疗起作用或肿瘤尺寸减小。通常，反义寡核苷酸以抑制量(即，对抑制与反义寡核苷酸接触的细胞或组织中的CK2产生有效的量)施用。因此，单次肿瘤内注射约2.5-10μg或更多的CK2反义寡核苷酸可显著地减小3-5mm大的肿瘤。其它用量可用于各种组织密度、尺寸和细胞间通透性的肿瘤。本领域技术人员常规地确定最优剂量、定量给药方法和重复率。最优剂量可根据各寡核苷酸的相对功效而改变，并且可通常根据发现在体外和体内模型中有效的EC50来评估。在成功的治疗之后，理想的是使病人经历维持治疗，以防止肿瘤的扩大。
本发明提供了包括本发明的CK2反义寡核苷酸的药物组合物和制剂。“药学上可接受的载体”(在本文中也称作“赋形剂”)是药学上可接受的溶剂、悬浮剂、或者任何其它用于输送一种或多种治疗化合物(例如，CK2反义寡核苷酸)至个体的药物学上惰性的载体。当与治疗化合物中的一种或多种和任何给定的药物组合物的其它成分组合时，药学上可接受的载体可根据肿瘤内给药来选择，用以提供所需的体积、一致性、以及其它有关的运输和化学性能。不与核酸产生不良反应的一般的药学上可接受的载体包括，例如但不限于：水；盐溶液；粘合剂(例如，聚乙烯基吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖和其它糖，明胶，或硫酸钙)；润滑剂(例如，淀粉、聚乙二醇、或乙酸钠)；崩解剂(例如，淀粉或淀粉羟乙酸钠)；以及湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。
本发明的CK2反义寡核苷酸还包括任何药学上可接受的盐、酯、或这些酯的盐，或者任何其它化合物，它们在施用于动物(包括人类)时，能够提供(直接地或间接地)生物活性代谢物或其残余物。因此例如，本发明提供了CK2反义寡核苷酸的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指本发明的寡核苷酸的生理学和药学上可接受的盐(即，保持母体寡核苷酸的所需的生物活性，而不赋予不良毒物学效应的盐)。寡核苷酸的药学上可接受的盐的例子包括，但不限于：用阳离子(例如，钠、钾、钙、或聚胺如精胺)形成的盐；用无机酸(例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸或硝酸)形成的酸加成盐；用有机酸(例如，乙酸、柠檬酸、草酸、棕榈酸、或者富马酸)形成的盐；以及由元素阴离子(例如，氯、溴和碘)形成的盐。
本发明的某些实施方式提供了药物组合物，它包含(a)一种或多种反义寡核苷酸，以及(b)通过非反义机制起作用的一种或多种其它药剂。例如，消炎药，包括但不限于非固醇类消炎药和皮质类固醇；以及抗病毒药，包括但不限于病毒唑(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韦和更昔洛韦，可包括在本发明的组合物中。其它非反义试剂(例如，化疗剂)也在本发明的范围之内。这些组合的化合物可组合使用或顺序使用以治疗实体瘤。
本发明的反义组合物还可包含其它在药物组合物中常规找到的辅助成分。因此，所述组合物还可包括相容的药学上活性的材料，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉药或消炎剂，或者可用于在储藏或运输过程中保持组合物的贮藏寿命或保持组合物的完整性的额外材料，例如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂、润湿剂、用于影响渗透压力的盐、缓冲液、以及稳定剂。但是，当添加时，这些材料不应不适当地干扰本发明的组合物中反义成分的生物活性。如果需要，可以对制剂灭菌，只要灭菌不会不利地影响制剂的核酸。
核酸构建物
核酸构建物(例如，质粒运载体)能够将核酸运输到宿主细胞中。合适的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌，昆虫细胞，酵母细胞和哺乳动物细胞)。一些构建物能够在它们被引入的宿主细胞内自主地复制(例如，具有细菌复制起点的细菌运载体和游离体哺乳动物运载体)。其它运载体(例如，非游离体哺乳动物运载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并随宿主基因组复制。
核酸构建物可以是，例如质粒运载体或病毒运载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒、以及腺伴随病毒)。核酸构建物包括一种或多种可操作性连接到感兴趣的核酸上的调控序列(例如，编码一种转录物的核酸，该转录物以其天然的形式特异地与CK2 mRNA杂交)。关于调控元件，“可操作性连接”是指调控序列和感兴趣的核酸的位置使得核苷酸序列被转录(例如，当运载体被引入宿主细胞中时)。
调控序列包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)(参见，例如Goeddel的Gene expression Technology：Methods in Enzymology，185，Academic出版社，San Diego，CA(1990))。调控序列包括指导多种类型的宿主细胞中的核苷酸序列表达和仅仅指导某些宿主细胞中的核苷酸序列(例如，细胞类型或组织特异性调控序列)表达的那些。
制造的产品
本发明的反义寡核苷酸可与包装材料组合，并以用于抑制CK2的表达的药盒出售。用于制造产品的组件和方法是熟知的。制造的产品可结合前述段落中列出的反义寡核苷酸中的一种或多种。另外，制造的产品还可包括缓冲液、杂交试剂、或者用于减少和/或监测CK2的表达的其它控制试剂。该药盒可包括描述如何使用反义寡核苷酸来抑制CK2的表达的说明书。
将在以下实施例中进一步描述本发明，但是，这些实施例并不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
                            实施例
            实施例1：CK2反义寡核苷酸的肿瘤内给药
干扰各个癌细胞系(ALVA-41、PC-3、LNCaP和Ca9-22)中的CK2信号的效果通过使用抗CK2的α和β亚基的反义寡核苷酸来检测。结果证明，当细胞接触低浓度的反义寡核苷酸时，反义CK2α和反义CK2β引起了细胞中的强凋亡反应。结果表明，仅需适度下调CK2α就能在癌细胞中实现强凋亡反应。
确定了CK2α反义寡核苷酸消除前列腺肿瘤的能力。将转移性的人类前列腺癌细胞系PC3-LN4(在200μl中的2×106个细胞)注射入无胸腺的裸鼠的皮下组织中。允许肿瘤生长3周，直至其达到3-5mm的尺寸。将裸鼠随机分为4组，每组4只。将反义CK2α寡核苷酸[5’-cct gct tgg cac ggg tcc cga cat-3’(SEQID NO：1)(高纯度，无盐，1.0μmol规格，由NC州Highpoint的MWG Biotech制备)硫代磷酸酯；50μl溶液，浓度为50或200μg/ml]于当天(day 0)和第三天(day3)直接注射入肿瘤中，然后观察肿瘤7-10天。使用DNA寡核苷酸和盐水作为对照治疗。
用较低剂量(2.5μg)的治疗导致了在第二次注射后肿瘤尺寸在7天内下降30-40％。用较高剂量(10μg)治疗导致了在第7天肿瘤尺寸下降95％，表明较低剂量的CK2α反义寡核苷酸在该模型中有效诱导凋亡(表1)。每隔2天重复用来评估肿瘤尺寸的实验，证明了对CK2反义寡核苷酸肿瘤内治疗有剂量依赖性响应(图1)。
为了评估反义CK2α的效果，用苏木精和曙红对石蜡包埋的肿瘤切片进行染色，用于组织学分析和凋亡分析的TUNEL。染色后，各癌细胞散布在坏死和凋亡基质上。对5个不同视野中的凋亡细胞目测检查，在无义对反义治疗的异种移植的肿瘤中分别给出9±5和56±22的值(凋亡细胞百分数±S.D.(标准偏差))。通过免疫印迹法和激酶活性测试来证实CK2α信号的减小(Slaton等人，Mol.Can.Res.，2004；2(12)：1-10)。因此，CK2α反义寡核苷酸的肿瘤内注射引起前列腺癌异种移植模型中的凋亡。
                    表1
  疗法   最终的肿瘤重量
  盐水   225mg(200-530mg)
  对照寡核苷酸   180mg(220-460mg)
  CK2反义(50μg/ml)   131mg(125-290mg)
  CK2反义(200μg/ml)   30mg(＜10-55mg)
    实施例2：裸露的反义CK2α在前列腺癌的常位模型中的全身给药
因为需要静脉内给药来治疗不能直接注射或远端转移的肿瘤，确定了CK2α反义寡核苷酸在静脉内给药后体内消除前列腺和膀胱肿瘤的能力。首先，转移性的人类前列腺癌细胞系PC3-LN4(在200μl中的2×106个细胞)被在前列腺内注射入雄性无胸腺裸鼠中。允许肿瘤生长3周，直至其达到6-8mm的尺寸。将裸鼠随机分为3组，每组3-4只。将反义CK2α寡核苷酸[5’-cct gct tgg cac ggg tcc cgacat-3’(SEQ ID NO：1)硫代磷酸酯；高纯度无盐，1.0μmol规模，由NC州Highpoint的MWG Biotech制备；在200μl盐水中有300μg，或者约10mg/kg]于当天和第三天通过尾静脉注入，然后观察肿瘤7天。在对照治疗中使用随机序列的DNA寡核苷酸或盐水。在开始治疗后10天收集肿瘤，测量，称重，并为坏死评分。用硫代磷酸酯-CK2α反义寡核苷酸进行静脉内治疗导致了在第二次治疗后的7天肿瘤体积减小65％，表明CK2α在仅有限的静脉内定量给药后对于减小肿瘤尺寸有效(表2)。
            表2：常位前列腺肿瘤模型中的静脉内反义CK2治疗
  疗法  最终的肿瘤体积(mm3)   最终的肿瘤重量(gm)   坏死评分
  盐水  1227(320-2240)   1.25(0.2-2.3)   1.33(0-4)
  对照寡核苷酸  594(407-800)   0.93(0.3-1.5)   1.33(0-2)
  CK2反义裸露  425(292-665)   0.53(0.3-0.9)   0.33(0-2)
坏死评分：0＝无，1＝小于5％的肿瘤面积，2＝＜25％，没有中心坏死，3＝＜25％，包括中心坏死，4＝＞25％的肿瘤面积，包括中心坏死。
作为其它对照，评估正常的鼠前列腺中的反义CK2α ODN的效果。如上述，对鼠的前列腺常位注射20μg的无义ODN(对照)或20μg的反义CK2α ODN硫代磷酸酯(治疗的)。7天时杀死小鼠。对对照和治疗的小鼠组织切片染色，用于组织学分析(H&E染色)，用TUNL测定凋亡，并用免疫组织荧光测定CK2α。与无义CK2α相比，在用反义CK2α治疗的正常前列腺中观察到在完整的腺体结构中没有差异。在用反义CK2α处理的正常的前列腺中观察到的CK2α免疫信号也没有任何差异，并且也不存在任何凋亡的证据。
  实施例3：在前列腺癌常位模型中全身施用毫微囊剂化的反义CK2α
虽然反义寡核苷酸的传递可以是全身性的，但是其效力受到不能特异地以肿瘤为目标的限制。GeneSegues，Inc.(Chaska，MN)y已开发了传递系统，它包括将分子尺寸的物品包囊为毫微囊剂(小于50nm)，该囊剂包裹有特异针对瘤上受体的配体。PC3-LN4(在200μl中的2×106个细胞)前列腺内注射入雄性无胸腺裸鼠中。允许肿瘤生长3周，直至其达到6-8mm的尺寸。将CK2α硫代磷酸酯反义寡核苷酸(SEQ ID NO：1；在200μl盐水中有300μg，或者约10mg/kg)作为物品包装入毫微囊剂(GeneSegues Inc.，参见例如美国专利6,632,671)中。该毫微囊剂化的反义CK2α于第0日和第3日通过尾静脉注入，然后观察肿瘤7天。使用DNA寡核苷酸和盐水作为对照治疗。在开始治疗后10天收集肿瘤，并评估肿瘤减小和坏死。用毫微囊剂化的CK2α静脉内治疗导致了在7天后前列腺肿瘤完全液化，产生囊性损伤，仅有最小的活肿瘤残留(表3)。
                                        表3
 疗法   最终的肿瘤体积   最终的肿瘤重量   坏死评分
 CK2反义，配制为用于针对蛋白质，胶体传递   947(816-1122)mm3   1.5(1.2-1.9)g 3.67(3-4)
坏死评分：0＝无，1＝小于5％的肿瘤面积，2＝＜25％，没有中心坏死，3＝＜25％，包括中心坏死，4＝＞25％的肿瘤面积，包括中心坏死。
    实施例4：凋亡的诱导，抑制常位前列腺癌异种移植物增殖
为了评估反义CK2α的分子效果，在CK2α、组蛋白脱乙酰基转移酶1(HDAC1)、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)3(aC3)和Cd 31(Pecam-1)存在下，通过免疫组织荧光分析石蜡包埋的肿瘤切片。这些蛋白质分别确定了以下特征：反义CK2α对其分子目标的作用，细胞分化的过程，凋亡过程，以及肿瘤脉管系统的优势。HDAC1，CK2的直接目标，是作用于染色质以改变染色体结合位点对转录因子的利用性的酶。高HDAC1活性对应于细胞中的增殖活性，低活性与末期分化和生长停止的程序一致。CK2的免疫信号在未治疗的肿瘤内是明亮的、位于核中、非常均一的。伴随地，分别通过i)在活化的Caspase 3中没有上升，ii)明亮的、均匀的HDAC1免疫信号，以及iii)由Cd31/Pecaml检测的血管充分的存在，证明没有凋亡、分化/HDAC1抑制或抗凋亡。在剩余的活肿瘤区域中，反义CK2部分减少CK2核免疫信号，同时伴随着HDAC1免疫信号的消除，与诱导组织分化一致。这些数据表明，反义CK2能够在有限的静脉内定量给药后，使肿瘤组织内发生所需的分子变化。
虽然在静脉内施用了反义CK2α后没有观察到凋亡，但是施用配制为胶体剂型以用于增强传递的反义CK2α导致了i)CK2核免疫信号的均一减少，ii)均一发亮的aC3免疫信号表明诱导凋亡，iii)保持HDAC1抑制，以及iv)肿瘤血管均一减少证明抗血管生成。增强传递后诱导凋亡与尸检时经毫微囊剂治疗的肿瘤中观察到的显著中心坏死和体液潴留的表现一致。在前列腺癌常位模型中的这些结果与肿瘤内施用后观察到的诱导凋亡一致。因此，在静脉内施用后，CK2α反义寡核苷酸诱导了前列腺癌异种移植模型中的凋亡。
      实施例5：通过静脉内施用反义CK2α抑制突变p53
超过一半的人类肿瘤具有在p53肿瘤抑制因子蛋白质中的使其过度稳定的突变(Mutp53)。作为显性突变蛋白以活化多药物转运蛋白(例如，MDR-1)和多个生长/生存级联系统，Mutp53癌蛋白被认为在抗药性现象和晚期疾病进程中起普遍作用。通过直接的蛋白质结合，突变p53还使野生型p53失活，使得在明显的细胞破坏后，凋亡的正常活化失效。肿瘤细胞中基因组的不稳定性增加也与Mutp53高度相关，并且可能是通过其与拓扑异构酶I的直接结合介导的，伴随着错配DNA修复酶msh的下调。因此，对病人而言，该中心蛋白质中稳定性增强的结果能够抗化疗、放疗和预后不良。
将攻击性的人类膀胱癌细胞系253J-BV(在200μl中的2×106个细胞)注射入雄性无胸腺的裸鼠的膀胱中。允许肿瘤生长3周，直至其达到3-4mm的尺寸。将裸鼠随机分为2组，每组3-4只。将CK2硫代磷酸酯反义寡核苷酸(5’-gtc ccg aca tgt cag aca gg-3’(SEQ ID NO：2)；Oligos，Etc.，Wilsonville，OR；在200μl盐水中有300μg，或者约为10mg/kg)毫微包囊(参见，例如美国专利6,632,671；GeneSegues公司；Chaska，MN)，并于当天和第三天腹膜内注射。然后观察肿瘤7天。使用类似包囊的DNA无义寡核苷酸作为对照。在开始治疗后10天收集肿瘤，测量并称重。用毫微囊剂化的CK2α反义寡核苷酸进行静脉内治疗导致了在第二次治疗后的7天肿瘤体积显著地减小22％。这些实验表明，CK2α对于减小除了前列腺之外的器官中的实体瘤的尺寸有效(表4)。
表4：在常位的膀胱肿瘤模型中的静脉内反义CK2疗法
  疗法，通过靶向的的胶体传递配制   最终的肿瘤体积(mm3)   最终的肿瘤重量(gm)
  无义寡核苷酸CK2反义寡核苷酸   55±2，SE(51-58)43±2，SE(31-53)   0.17(0.1-1.2)0.12(0.1-1.0)
CK2是p53的主要的调节蛋白，直接蛋白质结合于p53的C-末端。蛋白质结合是细胞蛋白质的CK2稳定化机制。已经在体外显示，在直接结合到癌蛋白上之后，p53的分离的C-末端区域增加了CK2酶的活性。使用同时对突变和正常的p53具有特异性的的泛嗜性单克隆抗体(克隆DO-1)，通过免疫组织荧光检查p53的石蜡包埋切片。免疫组织荧光仅能检测突变体53，而不能检测野生型p53。与无义CK2α相比，观察到用反义CK2α治疗的肿瘤中的CK2α核免疫信号和p53的均一消除。对用反义CK2α治疗的组织进行核对染，以证实反义治疗的组织中活组织的存在。
通过蛋白质印迹法证实CK2α和p53膀胱异种移植组织的减少。将肿瘤合并以产生各个治疗的单一蛋白质裂解物。这些裂解物在4-12％的丙烯酰胺凝胶上电泳，转移到硝基纤维素上，并使用检测所有3种CK2同种型的多克隆抗体检测CK2。使用市售的鼠小脑裂解物作为阳性对照参比泳道。使用考马斯染色的凝胶证明相等的蛋白质上样。蛋白质印迹显示，与随机的寡核苷酸和盐治疗的裂解物相比，用于反义治疗的合并裂解物的方法将CK2α降低到低于检测水平。观察到CK2α和CK2β的减少，与CK2α在稳定这些结构中的作用一致。
使用泛嗜性单克隆DO-1检测p53。引入盐治疗的膀胱肿瘤的合并裂解物与其它合并的裂解物作比较。使用重组的市售p53蛋白质作为阳性对照。该蛋白质含有7kD融合标记物用于60kD的总分子量。使用考马斯染色的凝胶确认了相等的蛋白质上样量。蛋白质印迹显示，与无义治疗的合并的裂解物相比，p53减少＞70％。与先前的对照相比，p53在有义治疗的裂解物中显著上升。这一结果与p53和CK2α在调节对应激的响应中的作用一致。基于这些结果，反义CK2α的静脉内施用降低了肿瘤内突变p53的水平。
    实施例6：针对CK2的多特异性和单特异性反义序列的体外比较
为了鉴定可能抑制CK2作用的有效反义序列，通过在表5所示的反义寡核苷酸存在下，在几个SSCHN(头部和颈部的鳞状上皮细胞癌)肿瘤系内体外掺入胸苷来测试生长抑制。
                                    表5：反义序列
名称   序列(5’-3’)(反义或指导) 化学 目标区域 来源   SEQ IDNO
ascK2 gtc ccg aca tgtcag aca gg 磷酸二酯，2’-O-甲基RNA 3’-嵌合体 CK2α的翻译起始位点   Pepperkok等人，1991，ExpCell Res.，197：245-253 2
CK2-740   aag gtc ctg agctac ttg tag siRNA  编码区域，CK2α 5
CK2-816   aag tat gat ctt tcggaa gga siRNA  编码区域，CK2α 6
LCK   ata caa ccc aaactc cac at   PO，嵌合体，siRNA  CK2αα’的3’UTR 7
CK2-剪接   tat ctc ttgt actcac ctt gag aat 吗啉代  CK2α外显子2的3’末端 8
A10 uca aga uga cuacca gcu gdt dt siRNA  编码区域，CK2α和CK2α’ Kinsella，2005 9
CK2mid   cag aau cuc auacau gua a siRNA  编码区域，CK2α 10
CR-4   tgc tcc att gcc tctctt gc 嵌合体  编码区域，CK2α   美国申请号10/958,999 11
MasCK2   atg tca gac aggttg gcg gac aaa g 吗啉代  CK2α的5’UTR   Wang等人，2005 12
3’-嵌合体的RNA含量由划线后的数字表征，例如-6。
以下述两种方式中的一种将反义序列施用到癌细胞中：1)从在TE缓冲液中的800μM的浓缩储液到最终浓度为1-3.75μM，施用磷酸二酯和嵌合序列，或者2)根据厂商说明(Roche Biochemicals)将siRNA序列与Dotap复合，达到最终浓度为0.5μM。将癌细胞置于96-或6-孔的板上，该板已用模型肿瘤基质(2∶1肌腱蛋白∶纤连蛋白)预处理，所述细胞浓度为0.5μg/cm2于细胞培养基(MEM，0.5％胎牛血清)上浓度下。用含有1微居里的胸苷的孔处理细胞48小时，最后16-18小时作为增殖状态的指数。参照用缓冲液或Dotap处理的孔计算处理的孔的增殖指数。实验进行两次并重复至少一次。
在试验的3个SSCHN肿瘤细胞系中，LCK序列提供最高水平的生长抑制(对于RNA嵌合体，Fadu下咽(hyphopharynx)：61±4％，UM-11b喉：67±4％，SCC-15舌：56±5％，平均数±SE)，并且这一效果不取决于序列的药物化学产品。结果示于图2A和2B，显示基于LCK的序列持续抑制肿瘤细胞生长的能力强于同一药物化学产品中的其它序列，与使用的药用化学产品无关。在24小时的处理后用蛋白质印迹法测试未配制的磷酸二酯和siRNA反义序列对CK2蛋白水平的反义作用，并通过密度计定量为相对于β-肌动蛋白的总的CK2(α、α’和β)。蛋白质激酶CK2在调节细胞对多重应激的响应上起关键作用，例如，在施加了应激如化疗之后，已知肿瘤细胞通过同时增加CK2α活性和核水平来响应(Wang，2001)。对于由施加Dotap引起的CK2水平的增加，siLCK抑制了这一增加的57％，而另一种siRNA显示不抑制蛋白质水平。在施用了asCK2序列之后，甚至磷酸二酯LCK抑制了这一增加的20％。
           实施例7：新颖的CK2反义序列的体内试验
在几种SSCHN异种移植肿瘤模型中体内测试新序列的抗肿瘤活性。在小鼠侧腹皮内接种UM-11b或Fadu系的3×106个细胞。研究两种肿瘤系的抗辐射性。另外，UM-11b系是高度炎症性的并且立刻转移，而Fadu系随后转移的，但是突变体p53-(+)和高度抗化学性的。当肿瘤为4-5mm直径或者约50至100mm3体积时，通过i.v.注射试验产品对小鼠进行治疗。用测径仪跟踪局部肿瘤体积，将各组3-8只小鼠的平均值作图，得到图3A和3B。通常，老鼠间隔48小时施用两剂。使用序列作为磷酸二酯嵌合体，并用PBS(“裸露的”)或配制为基于tenfibgen的毫微颗粒来给药(“毫微颗粒”；Wang等人，2005，Mol.Cell Biochem.，274：77-84)。
选择在25-50mg/kg范围内的起始剂量用于基于毫微颗粒的序列。在该范围内，Fadu(和SCC-15)肿瘤在实验研究中，在3-4周的时间内，显示具有完全萎缩或分化。UM-11b肿瘤仅仅部分地响应毫微颗粒配制的asCK2序列。在UM-11b模型中，利用磷酸二酯嵌合体化学产品并确定CK2α和α’的3’UTR区域(SEQ NO.7)的未配制的LCK序列，令人吃惊地在2×25mg/kg(约625mcg，5/5小鼠，具有箭头的灰线)的剂量下，在两个月内，通过坏死机制分解了小的肿瘤。通常，未配制的反义序列是在小鼠中作为单一药剂抑制细胞生长(需要持续给量以控制或减缓生长)。在毫微颗粒配制的序列中观察到相同的结果，但是较慢(8/8，短划线和箭头)。肿瘤尺寸在高剂量的毫微颗粒组(4/8，划线)中不即刻受控制，这表明较低的剂量是更优选的，并且肿瘤尺寸在施用了毫微颗粒配制的有义序列的小鼠中不受控制，这表明药物调节的效果是显著的。
在Fadu模型中，25-50mg/kg的剂量导致快速死亡的肿瘤造成的开放伤口，该开放伤口难以在免疫受损的小鼠中管理。图3B概括了从0.01-10mg/kg处理组的肿瘤生长数据。在该模型中，在这些剂量范围内，未配制的序列显示仅有部分抗肿瘤活性(1/7，带有箭头的灰线)。在用毫微颗粒配制的糖或对照序列处理的小鼠中没有观察到生长抑制，也没有在用2×0.01mg/kg(0.5mcg)的毫微颗粒配制的嵌合体形式的Pepperkok序列(在1×50mg/kg(1250mcg)下显示活性(具有配方))处理的小鼠中观察到任何活性。两个毫微颗粒组都显示出早期肿瘤控制(带有箭头的短划线)。较低的剂量组显示，与混合的溶解和分化相比，在完全溶解方面具有更理想的结果(0.5mcg与500mcg；3/3与4/8)。这些结果表明，与现有的序列相比，CK2的新反义序列具有显著的体内抗血管生成和抗肿瘤活性
                    其它实施方式
要明白的是，虽然已经结合具体实施方式描述了本发明，但是前面的描述是为了说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围是由所附的权利要求书的范围限定的。其它方面、优点和改变也落入所附权利要求书的范围之内。
                            序列表
<110>明尼苏达大学董事会(Regents of the University of Minnesota)
<120>酪蛋白激酶2反义治疗
<130>09531/231WO2
<140>PCT/US2005/045820
<141>2005-12-14
<150>US 60/636,299
<151>2004-12-14
<150>US 60/657,049
<151>2005-02-28
<160>12
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>1
cctgcttggc acgggtcccg acat                                       24
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>2
gtcccgacat gtcagacagg                                            20
<210>3
<211>55
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
gtttggatat gtggagtttg gttgtatgct ggcaagtatg atctttcgga aggag     55
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>4
catacttgcc agcatacaac ccaaactcca catatccaaa c                    41
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>5
aaggtcctga gctacttgta g                                          21
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>6
aagtatgatc tttcggaagg a                                          21
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>7
atacaaccca aactccacat                                            20
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>8
tatctcttgt actcaccttg agaat                                      25
<210>9
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>9
tcaagatgac taccagctgd tdt                                        23
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>10
cagaatctca tacatgtaa                                             19
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>11
tgctccattg cctctcttgc                                            20
<210>12
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>12
atgtcagaca ggttggcgga caaag                                      25

Claims (16)

1.一种抑制实体瘤中的酪蛋白激酶2的表达的方法，它包括：
对所述肿瘤传递反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交，并降低其表达。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传递是肿瘤内的或静脉内的。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸是包囊的反义寡核苷酸。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸是硫代磷酸酯反义寡核苷酸。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸具有示于SEQID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反义寡核苷酸具有示于SEQID NO：3、4、5、6、7或8的序列。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酪蛋白激酶2是酪蛋白激酶2-α。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酪蛋白激酶2是酪蛋白激酶2-β。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述实体瘤源自选自下组的部位：前列腺、膀胱、乳腺、肝脏、肾脏、脑、头部和颈部。
10.一种减小个体中的实体瘤尺寸的方法，它包括：
对所述肿瘤传递反义寡核苷酸，其中，所述反义寡核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交，并降低了其表达；其中，酪蛋白激酶2的表达的降低导致该瘤尺寸的减小。
11.一种组合物，它包括反义寡核苷酸及其药学上可接受的载体，其中，所述反义寡核苷酸与酪蛋白激酶2核酸序列杂交，并降低其表达。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物是包囊的。
13.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述反义寡核苷酸具有示于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的序列。
14.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述反义寡核苷酸具有示于SEQ ID NO：3、4、5、6、7或8的序列。
15.一种长度高达50个碱基的反义寡核苷酸，它包含至少SEQ ID NO：1或2的8个核碱基部分，其中，所述反义寡核苷酸抑制人类酪蛋白激酶2-α的表达。
16.一种长度高达50个碱基的反义寡核苷酸，它包含至少SEQ ID NOs：3、4、5、6、7或8的8个核碱基部分，其中，所述反义寡核苷酸抑制人类酪蛋白激酶2-α的表达。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116271050A (zh) * 2023-05-10 2023-06-23 细胞生态海河实验室 Csnk2b基因靶点在制备肿瘤治疗中防止免疫细胞耗竭药物应用、抑制剂及联合物

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MXPA02008361A (es) * 2000-02-28 2004-05-17 Genesegues Inc Sistema y metodo de encapsulacion de nanocapsulas.
CU23431B6 (es) * 2005-05-12 2009-10-16 Ct Ingenieria Genetica Biotech Método para la inhibición de la proliferación de células tumorales y el tratamiento del cáncer
WO2008095192A2 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Genesegues, Inc. Gene silencing by single-stranded polynucleotides
JP6679593B2 (ja) 2014-09-03 2020-04-15 ジーンセグエス，インコーポレイテッド 療法用ナノ粒子および関連する組成物、方法、およびシステム
RU2018108165A (ru) 2015-08-10 2019-09-12 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Механизм устойчивости к ингибиторам бромодомена (bet)

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
FR2567892B1 (fr) * 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4981863A (en) 1987-01-27 1991-01-01 Merrell Dow Pharmaceuticals 3-aryl-5-alkylthio-4H-1,2,4-triazoles
US5750666A (en) 1988-05-26 1998-05-12 Competitve Technologies, Inc. Polynucleotide phosphorodithioate compounds
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
MXPA02008361A (es) 2000-02-28 2004-05-17 Genesegues Inc Sistema y metodo de encapsulacion de nanocapsulas.
US20020187482A1 (en) 2000-09-25 2002-12-12 Zicai Liang Methods and means of RNA analysis
US6455307B1 (en) * 2001-02-08 2002-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of casein kinase 2-alpha prime expression
US6440738B1 (en) * 2001-02-08 2002-08-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of casein kinase 2-beta expression
US6607916B2 (en) * 2001-02-08 2003-08-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Casein kinase 2-alpha expression
US20040038303A1 (en) 2002-04-08 2004-02-26 Unger Gretchen M. Biologic modulations with nanoparticles
FR2857013B1 (fr) 2003-07-02 2005-09-30 Commissariat Energie Atomique Petits arn interferents specifiques des sous-unites alpha, alpha prime et beta de la proteine kinase ck2 et leurs applications
EP1911451A1 (en) 2006-10-10 2008-04-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) Protein-kinase CK2 inhibitors and their therapeutic applications

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116271050A (zh) * 2023-05-10 2023-06-23 细胞生态海河实验室 Csnk2b基因靶点在制备肿瘤治疗中防止免疫细胞耗竭药物应用、抑制剂及联合物
CN116271050B (zh) * 2023-05-10 2023-08-18 细胞生态海河实验室 Csnk2b基因靶点在制备肿瘤治疗中防止免疫细胞耗竭药物应用、抑制剂及联合物

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