JP5183064B2 - 甲殻類動物、及び他の無脊椎動物における、dsRNAで誘導された特異的、及び非特異的免疫、及びそこで使用する生物送達媒体 - Google Patents
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Description
本発明は、無脊椎動物の免疫、好ましくは、甲殻類動物などの海洋無脊椎動物の免疫、及び特に、無脊椎動物の抗ウイルス免疫のより深い理解を提供する。さらに、本発明は、少なくとも1種の二本鎖RNAの投与による、無脊椎動物、好ましくは、甲殻類動物(エビ、ロブスター、カニなど)、軟体動物(ウミウシ、貝、イカなど)、又は他の無脊椎動物における、非特異的(全身性)免疫応答誘導方法、及び物質を提供する。
さらに、本発明は、脊椎動物の免疫系のアナログの、無脊椎動物の免疫系が、dsRNAをウイルス関連分子パターンとして認識でき、生得的抗ウイルス応答の活性化をもたらす、最初の実証を提供する。
本発明は、dsRNA分子の使用による、遺伝子発現を調節する、好ましくは抑制する、標的、及び非標的方法に関するものである。遺伝子発現の抑制を達成する方法は、当技術分野においてよく知られている。例を挙げると、アンチセンス核酸、三重らせんアプローチ、共抑制、及びRNA干渉、又はRNAサイレンシングの使用がある。
アンチセンステクノロジーは、遺伝子特異的干渉を達成するプロトコルの中で、最も一般的に記載されたアプローチである。アンチセンスストラテジーでは、ストキメトリック(stochiometric)な量の、目的の遺伝子のメッセンジャーRNAに相補的な一本鎖核酸を、細胞に導入する。アンチセンスに基づくアプローチのいくつかの難点は、送達、安定性、及び必須投与量である。一般に、細胞は一本鎖核酸を取り込むメカニズムをもたず、従って、改質されていない一本鎖物質の取り込みは、非常に非効率的である。細胞への取り込みを待っている間に、該一本鎖物質は、分解されやすい。アンチセンス干渉は、干渉する物質が比較的高い濃度で(内在性mRNAの濃度、又はそれ以上で)蓄積することが必須なので、送達するのに必須な量が、効率の主要な制約要因である。結果として、アンチセンス技術の開発における取り組みの大半は、ヌクレアーゼ分解に安定であり、かつ細胞内に容易に拡散できる、改質核酸の産生に重点が置かれてきた。遺伝子治療、又は生物全体への適用のための、アンチセンス干渉の使用は、限定されている。それは、非天然アナログから合成されることが必要な、多量のオリゴヌクレオチド、その合成の経費、及び高投与量でさえ、各細胞に、十分濃縮され、かつ単一の干渉物質の貯留を維持することが難しいためである。
第二の工学的干渉の方法は、三重らせん核酸構造に基づいている。このアプローチは、特定な核酸群の、三本鎖構造を示す稀な能力に依存する。生理条件下で、事実上、核酸は全て一本鎖、又は二本鎖であり、かつ三本鎖はめったに形成されない。しかしながら、特定の単純なプリン、又はピリミジンが豊富な配列が、極端なpH条件下で(すなわち、試験管内で)三本鎖分子を形成し得ることは、知られて久しい。一般に、そのような構造は生理条件下でごく一時的であり、従って三本鎖を産生するように設計された、非改質核酸の単純な送達では、干渉をもたらさない。アンチセンスと同様に、インビボで使用する三本鎖技術の開発は、より安定であり、かつインビボで細胞に容易に吸収される、改質核酸の開発に重点が置かれてきた。この技術の開発におけるさらなる目標は、該三本鎖物質の形成が生理的pH で効率的に進行するように、改質核酸を産生することであった。
第三の遺伝子特異的干渉のアプローチは、"共抑制"の名称下でグループ化される、一連の操作手段である。最初に、このアプローチは植物で記載されており、非連鎖であるが相同性をもつ遺伝子のサイレンシングをもたらす、導入遺伝子の能力のことを言う。ごく最近、共抑制と同様の現象が、2種の動物:線虫、及びショウジョウバエにおいて報告されている。最初に、共抑制は、導入遺伝子を使って、潜在的に有用性のある遺伝子座の過剰発現を試みようと導入遺伝子を使っているグループからの報告で、偶然見い出された。該過剰発現が成功した場合もあったが、多くの場合は、結果は予想と反対であった。それらの場合において、実際には、トランスジェニック植物の方が、より低い内在遺伝子の発現を示した。これまでに、様々な植物における導入遺伝子を介した共抑制のメカニズムが提唱されてきた;全てのこれらのメカニズムの提唱は、依然として仮説であり、かつそのプロセスの決定的なメカニズムの記載は示されてきていない。共抑制を説明するために提唱されているモデルは、2つの異なったカテゴリーに分類することができる。一連の提唱において、2つの異なった染色体部位間の、DNA、又はクロマチンレベルでの 直接的物理的相互作用が起こることが仮説となっている。その後、まだ同定されていないメカニズムが、デノボメチル化、及びその後の遺伝子発現の抑制につながるのであろう。
細胞、又は動物における標的遺伝子の発現を抑制する、さらなるプロセスはRNA 干渉(RNAi)、又はRNAサイレンシングである。該プロセスは、部分的、又は完全に二重鎖形質をもつRNA(dsRNA)の、細胞へ、又はその細胞外環境への導入を含む。抑制は、該二本鎖抑制RNAを産生するために選択された、標的遺伝子の一部分からのヌクレオチド配列に特異的である。この工程は、(1)遺伝子発現の抑制を実現するのに効果的であり、(2)標的遺伝子に特異的であり、かつ、(3)多くの異なった種類の標的遺伝子の発現の抑制をもたらす。
RNA干渉、又は RNAサイレンシングによる、標的遺伝子の発現抑制に用いる方法、及び物質は、様々な発行された特許、及び多くの最近公表された特許出願書類に報告されている。例えば、Fireらによる米国特許第6,506,559号;Liuらによる米国特許6,326,193号;Grahamらによる国際公開第99/49029号;Grahamらによる米国特許第6,573,099を参照されたい。
かなり予想外に、本発明者らは、非特異的dsRNA(いかなる公知の無脊椎動物の内在性遺伝子とも相同性をもたないdsRNA)の投与が、少なくとも海洋エビ、リトペナエウス バンナメイにおいて、一般的抗ウイルス応答を生じさせることを発見した。これらの結果に基づくと、おそらく、他の甲殻類動物、及び無脊椎動物においても同様であろう。この発明は、無脊椎動物が、真正のウイルス関連分子構造(dsRNA)に応答して、誘導性抗ウイルス免疫を示すことができる、初めての証拠を提供する。該独創的発見は、無脊椎動物の生得的抗ウイルス免疫が、dsRNAにより誘導される免疫応答も含め、いくつかの脊椎動物抗ウイルス応答の分子特性を共有することを示唆する。
実際に、本発明に先立ち、甲殻類動物、及び無脊椎動物種の全身性効果は知られていなかった。さらに、本発明に先立ち、甲殻類動物、特にエビ、及びおそらく他の海洋無脊椎動物が、RNA干渉応答を起こす必須細胞機構を有することは知られていなかった。
従って、本発明の目的は、無脊椎動物免疫、例えば、甲殻類動物免疫の理解を深めることである。本発明は、その実験項では甲殻類動物、特にエビにおける対象発見を例示するが、その対象方法は、他の無脊椎動物においても有用であることが予想される。特に、甲殻類に近縁関係にある無脊椎動物、例えば、他の海洋無脊椎動物である。例を挙げると、イカ、貝、タコ、ウミウシ、巻き貝などの有殻、又は無殻軟体動物;海綿動物門(カイメン);刺胞動物門(クラゲ、サンゴ、ヒドロ虫)、有櫛動物門(クシクラゲ)、棘皮動物門(ヒトデ、クモヒトデ)、及び海洋ミミズ(marine worm)がある。しかしながら、本発明は、一例として昆虫類、蛛形類、唇脚類、及び多足類を含む、他の無脊椎動物を含む。
本発明をより詳細に記載するに先立ち、下記の定義を与える。その他の点では、全ての用語、及び慣用句は、関係同業者により、解釈されるものとする。
"緩やかなストリンジェンシー条件"は、ハイブリダイゼーションが50% ホルムアルデヒド、5Xデンハルト溶液、5xSSPE、0.2% SDS溶液中、42℃で起こり、続いて0.2XSSPE、0.2% SDS 中、65℃で洗浄することを意味する。
具体的に、dsRNA化合物がハイブリダイズしやすいのは、該化合物の該標的核酸への結合が、該標的核酸の正常機能を干渉し、活性の低下を起こし、かつ、十分な程度の相補性があり、特異的結合が所望される条件下で、アンチセンス化合物の非標的核酸配列への非特異的結合が生じない場合である。上記所望される条件の例を挙げると、インビボ測定、及び治療上の処置の場合の生理的条件、及びインビトロ測定の場合に測定を行う条件がある。
この発明の文脈において、dsRNA化合物が特定の核酸分子を"標的にすること"は,多工程プロセスであり得る。通常、該工程は、その機能が調整されるべき標的核酸の同定から始まる。この標的核酸の例を挙げると、発現が特定の障害、又は疾患に関連している、細胞性遺伝子(又は、該遺伝子から転写されたmRNA)、又は好ましくは、感染性因子(例えば、ウイルス)由来の核酸分子があり得る。
"生物として許容される塩"という用語は、本発明の該化合物の生理的に、かつ医薬として許容される塩のことを言う:すなわち、該親化合物の所望される生物活性を保持し、それに所望しない毒性効果を与えない塩である。
本発明の文脈において、"共投与"は、2種の異なる化合物、好ましくは、dsRNAの、個別、又は組合せての、いずれかの順での投与を意味する。好ましくは、そのようなdsRNAが、下記記載の生物送達媒体に含まれる。
一般的に、エマルジョンは、一方の液体が他方に、通常直径0.1 μmを超える液滴状に分散している、不均一系である。乳濁液は、該分散相に加えて、さらなる成分を含むことができ、活性薬物は溶液として、該水相、油相、又はそれ自身が別の相として存在し得る。マイクロエマルジョンは、本発明の態様として含まれる。エマルジョン、及びその使用は、当技術分野において十分知られている。さらに、米国特許第6,287,860号に記載されており、その全体が本明細書に取り込まれる。
当業者は、製剤が、通常、その目的とされる使用、すなわち投与経路に応じて、設計されることを認識するであろう。
非経口投与のための組成物、又は製剤は、滅菌水性溶液を含むことができ、また緩衝剤、希釈剤、及び下記のような他の適切な添加剤を含む。浸透増強剤、担体化合物、及び他の医薬として許容し得る担体、又は賦形剤であるが、これらに限定されない。
また、本発明は、幅広く、配列非特異的dsRNA、一般的に,共投与により、配列特異的dsRNAにより生じる該応答を増強する、長鎖dsRNAの使用を対象にする。
生物送達方法が好ましいが、本発明は、前記記載のような、他の送達系、及び組成物を含む。
該配列特異的dsRNAの効果的な、好ましい投与量は、前記記載と同様である。該配列特異的dsRNAの大きさは、少なくとも20〜50,000ヌクレオチド鎖長、より好ましくは、約20〜約5000ヌクレオチド鎖長、さらにより好ましくは、20〜500ヌクレオチド鎖長の範囲である。
動物、及び実験的ウイルス感染:これらの研究に使用した生物測定系、実験動物、ホワイトスポットシンドロームウイルス(WSSV)、及びタウラシンドロームウイルス(TSV)接種は、別記されている。簡潔に述べると、エビ(L. バナメイ)を個々に260 ml組織培養フラスコに入れ、毎日100%の水交換(人工海水、Marine Environment社)をしながら、2〜3日間馴らした。餌は、市販餌料ペレットのほぼ半分を毎日与えた。記載の時(図2参照)は、エビを、一定水量、及び給気での再循環システムに結合している、10 ガロン水槽(10〜15 エビ/水槽)で 飼育した。馴化後、エビをdsRNAの筋肉注射で処置し、かつ感染エビの0. 45 μrnろ過抽出液の筋肉内注射により感染させた。TSV の場合は、最終希釈は1 x 10-8、又は1 x 10-5、かつWSSV の場合は、最終希釈は4〜6 x 10-8 (重量/体積 希釈)であった。1 x 10-8 (TSV用)、及び4〜6 x 10-8 (WSSVの場合)の該希釈は、多数の実験、及び滴定試験上で、常に60%と90%の間の死亡率をもたらす投与量として選んだ。ネガティブコントロールには、特定の病原体フリーのエビからの抽出液を、対応する希釈で注射した。特記されない限り、注入容量は、20 μlであった。死亡率を毎日記録し、かつ水交換、及び給餌法は、前記の通り行った。
1) 非特異的なdsRNA 免疫誘導において検討されたもの
アヒルυ:
CTGGCAGGGCGGCGTGTCCTACGCCTGCATGGTGGTCCACGAAGGGTTGCCCATGAG
GT
TCACCCAACGGCCTCTCCAGAAGACCCCCGAGCTGGACATCTCCACCGCCCTCTGCC
CG
GACGCCGGCGACCAAGAACTGGACGGGCTCTGGGCCACCATCGCCGTCTTCATCACC
CT
CTTCCTCCTCAGCGTCTGCTACAGCGCCACCGTCACCTTCTTCAAGGTCAAGTGGCT
TT
TCTCCACCGTCCTGCAGCTGAAGAGCGCCGGCGGCCCCTACCGCAACGTCCTGAAGG
AG
GCGGCGTGAGCGGC(配列番号:1)
CTTTCTAGGGCTAGATATTGCAAACAATTTGGCAGTTTTATTCCTATATATATGGTT
TC
GATGGAAAATTCGATCCAATATCGATTCGTTATCAATATTTCATTTAAAATGTTAGT
TT
TGCAGGCACAGATTCCATGTTTTAATATAAATGCTGGTAACTGAAACCCTCCTGCTT
GG
CTACATTACTGAAATACACATTTACGTTACCAATAAGACCTGCACAATTATGTTTCA
TT
ACTTTTTACTTTTACTTTGAGTAACATTGTAAAAGGAAATCATAAATATGTGCATAC
AG
TGCACACAAGGTAAGCACAAATGGCACGTAATTGTAAAAAAACAAACAAAAAAACAA
AA
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AA
AACCATTTTCAAAATTCAGAACGTGAAAGAATCTGGAGATTATCTGTAGTGCTCCTC
GT
CCTGAAGGAGCACTATAGATAATATTCACATCCTCTCAAGTAAATCACACGCATTAA
GA
ATCGATTTAGGGATTTCCCAAATCCATATCATTTTGTTAAATTGCTdATCGAATAAA
AC
GGAGAATTGCTATTTTTTACCCAGCCCTAGTGCTTTTACACCTGGTTGTCAGTCCAC
CC
AGTCTGAATATGAGCAAAATTGGTACTTTTGCTTCATTTGCTATTTGGTTTGTTTTT
TC
ATCCACACTGCACATAGTTAATTGAGCAACAAAAAGTTGTCAGGGCTTGTACGTTCA
TC
AGTCTGAATTATCCTCAATGAAAAAAATTATAAGCAAACTTTATGCATATAAAATCT
CA
AAGATTACTTGAGCACAGAGAGCATGGAACCGGTGCTAAAGAATTAGGTAGTCTGTA
TA
AACAACTTTTTCTTTTGCGTGCCACATCCAGCTTTAATTTTCTCTTTTTGTTTGTCG
GA
CCAAATATTTAGAACATGTGGCATTTCTGTTGCGCTACAGTGGTAGTTCAGTGGTTA
AG
AAGTTAGACTACTGATCAGAAGCTTGTGAGTTCAAGTCCTAATACTGCTAACCTTCC
AC
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TT
TTACTTTATTAAAATATTAGAGTCCATATAAGTACATTTTTAAAGGCAAATCAATTG
TA
TACTGTAGTAAATTGTGTGCTGTGGTTCACATTTTGGCCTTGACCATGATTTAATTT
TT
TGTTGATGGAGCTGGGTGGACAGTGCACACTCAGCTCAAAACATCCAAGCCCAACTA
TA
TCACCCAAAACCATGTGG(配列番号:2)
CGACGGCGACTCCCATCGGCAATTTCTATGACACCAGATACTCTTCGACCGAACGCC
GG
TGTCTGTTGACCAGTCAGTAGAAAAGAAGGGATGAGATCATCCAGTGCGTCCTCAGT
AA
GCAGCTCCTGGTCACGTTCATTACCTGACCATACCCGAGAGGTCTTCTCAACACTAT
CA
CCCCGGAGCACTTCAAGAGTAAACTTCACATCCCGACCACATACAGGCAAAGTAATG
GC
ATTACCGCGAGCCATTACTCCTACGCGCGCAATTAACGAATCCACCATCGGGGCAGC
TG
GTGTCGATAACGAAGTATCTTCAACCGGTTGAGTATTGAGCGTATGTTTTGGAATAA
CA
GGCGCACGCTTCATTATCTAATCTCCCAGCGTGGTTTAATCAGACGATCGAAAATTT
CA
TTGCAGACAGGTTCCCAAATAGAAAGAGCATTTCTCCAGGCACCAGTTGAAGAGCGT
TG
ATCAATGGCCTGTTCAAAAACAGTTCTCATCCGGATCTGACCTTTACCAACTTCATC
CG
TTTCACGTACAACATTTTTTAGAACCATGCTTCCCCAGGCATCCCGAATTTGCTCCT
CC
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TC
AGGCTCGAACCCTTTAAGATCAACGTTCTTGAGCAGATCACGAAGCATATCGAAAAA
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GCAGTGCGGAGGTGTAGTCAAACAACTCAGCAGGCGTGGGAACAATCAGCACATCAG
CA
GCACATACGACATTAATCGTGCCGATACCCAGGTTAGGCGCGCTGTCAATAACTATG
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TC
GTCCTTTTCCCCAAGATAGAAAGGCAGGAGAGTGTCTTCTGCATGAATATGAAGATC
TG
GTACCCATCCGTGATACATTGAGGCTGTTCCCTGGGGGTCGTTACCTTCCACGAGCA
AA
ACACGTAGCCCCTTCAGAGCCAGATCCTGAGCAAGATGAACAGAAACTGAGGTTTTG
TA
AAC(配列番号:3)
GCCCCCAAGACGGCCCCATCGGTCTACCCTCTGGCCCCCTGCGGCAGGGACGTGTCT
GG
CCCTAACGTGGCCTTGGGCTGCCTGGCCTCAAGCTACTTCCCCGAGCCAGTGACCGT
GA
CCTGGAACTCGGGCGCCCTGACCAGTGGCGTGCACACCTTCCCATCCGTCCTGCAGC
CG
TCAGGGCTCTACTCCCTCAGCAGCATGGTGACCGTGCCGGCCAGCAGCCTGTCCAGC
AA
GAGCTACACCTGCAATGTCAACCACCCGGCCACCACCACCAAGGTGGACAAGCGTGT
TG
GAATACACCAGCCGCAAACATGTCCCATATGCCCAGGCTGTGAAGTGGCCGGGCCCT
CG
GTCTTCATCTTCCCTCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCAGACCCCCGAG
GT
CACGTGCGTGGTGGTGGACGTCAGCAAGGAGCACGCCGAGGTCCAGTTCTCCTGGTA
CG
TGGACGGCGTAGAGGTGCACACGGCCGAGACGAGACCAAAGGAGGAGCAGTTCAACA
GC
ACCTACCGTGTGGTCAGCGTCCTGCCCATCCAGCACCAGGACTGGCTGAAGGGGAAG
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CCATGTTGAGTGGAAGAGCAACGGACAGCCGGAGCCAGAGAACACATACCGCACCAC
CC
CGCCCCAGCAGGACGTGGACGGGACCTTCTTCCTGTACAGCAAACTCGCGGTGGACA
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GCAAGATGGGACCATGGAGACAAATTTGAGTGTGCGGTGATGCACGAGGCTCTGCAC
AA
CCACTACACCCAGAAGTCCATCTCCAAGACTCAGGGTAAATGAGCCACCCGCTGCAC
CC
CACGTGCTCTCGGGTCCCGCGAGCTCGCCTGAGCCCCAGCGCTGTGTACATACGTCC
CG
GGCCAGCATGAAATAAA(配列番号:4)
RR (WSSVのリボヌクレオチド還元酵素の小ユニット):
ACATTTCCCAGAGATCTTCATGGACAATGGAGCGGGATACAAAACGGTTGGGGTTTT
CT
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ATGGATCTTTCTTTCACTCTTTCGGTCGTGTCGGCCATCCTCGCCATCACTGCTGTG
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TT
GGCGCACCAATTGCAGCTACCGCCGGTGGAAATCTTTTCGACATGTACGTGCACGTC
AC
CTACTCTGGCACTGAGACCGAGTAA(配列番号:6)
(海洋エビ、リトペナエウス バンナメイにおけるウイルス感染を防止する、dsRNA介在遺伝的干渉の使用)
この実施例において、WSSVのゲノムにおいてコードされる遺伝子に相当するdsRNAでのエビの処理が、WSSVの感染から効果的にエビを防御することが示される。これらの結果は、エビにおけるRNA干渉の最初の証拠を提供し、かつ水産養殖における、dsRNA関連治療法を使用する抗ウィルスストラテジーを開発する可能性を広げる。
(Qiagen社)を用いて単離した。ノーザン解析には、RNAをホルムアルデヒド-アガロース電気泳動で分離し、ナイロン膜に転写し、記載のとおり32P標識DNAでプローブした。ナイロン膜を標準的手法で洗浄し、データをオートグラフィーにより得た。プローブは、完全長のEST 挿入断片から調整した。RT-PCR には、一本cDNAをパワースクリプト RT(Powerscript
RT)(Clontech社)を用いて調製し、オリゴdTを起点として反応が開始された。その後、該反応物を2倍に希釈し、1 μlを遺伝子特異的プライマーによるPCRの鋳型として使用した。PCRの条件は、94℃で2分間(94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で1分間)の反応26 サイクル、72℃で 2分間であった。STAT
mRNAは、下記プライマーで検出した:順方向、CTG TCT GAG CGA AAC TTC ACA(配列番号:7)、及び逆方向、AAG TCA GCG ATC ACA TCA GCT(配列番号:8)。IKBK
mRNAは、下記プライマーで検出した:順方向、CCA GCA ACT AGA AGG CTC ACT(配列番号:9)、及び逆方向、CGG TTC TTG CTG CAT CTT GCA(配列番号:10)。リボソームタンパク質S3A mRNAは下記プライマーで検出したを用いて検出された:順方向、CCA GAA
TGA GAC TGA TGC TGA(配列番号:11)、及び逆方向、CAC GGG TGA TAA TGT
CTA CCA(配列番号:12)。
dsRNAは、エビにおける同起源細胞のmRNAの特異的消失を引き起こす:RNAi経路の幅広い保存に基づいて、我々は、RNAiに類似したメカニズムが L. バンナメイに存在するという仮説を立てた。これを調べるために、我々は、エビ遺伝子の部分へのdsRNAをエビに注入し、標的mRNAの相対的レベルをノーザンブロット解析と、RT-PCRにより解析した。図1aは、ヘモシアニンdsRNAの注入が、肝膵臓におけるヘモシアニンmRNAのレベルを劇的に低下させることを示している。このmRNAの消失が、ヘモシアニンの配列特異的であるのは、無関係な遺伝子(PJV627様)をコードするdsRNAの注入はヘモシアニンの発現に影響せず、ヘモシアニンのdsRNA注入エビは、この無関係なmRNAを、正常なレベルで発現するからである(図1a)。また、dsRNAで、この機能未知の遺伝子を標的にしても、その相当するmRNAの検出可能な消失をもたらさないことは、明らかである。この効果なく標的にされたmRNAに関連した、低分子のハイブリダイゼーションシグナルは観察できることは、中間体の分解産物が、推定上のRNAiメカニズムの活性化に由来することを示唆する。同様の中間体は、ショウジョウバエ細胞において、RNAiの誘導時に見い出されている。dsRNA誘導のmRNA消失が遺伝子特異的であり、かつ転写、及び翻訳の調節、細胞内細分化、及び、各々のmRNAに特異的な他の特徴により、影響を受け得ることは妥当であると思われる。
(4種のWSSV遺伝子をコードするdsRNAによる抗WSSV防御性のさらなるキャラクタリゼーション)
課題1は、選択されたWSSV遺伝子の初期の比較を提供することを目的とする。ESTクローンの質、及びウイルス複製における、該遺伝子の予測される役割に基づいて、dsRNAの、防御効果を生じる有効性の違いを見い出し得る。これらの実験により、dsRNA作製方法が確立され、我々のWSSVのESTコレクション由来の最も重要なクローンのいくつかの評価が可能になるであろう。
(方法)
4種より、むしろ6種のWSSV遺伝子を使用した。これらは、vp19(外殻タンパク質、GenBankアクセッション番号AA069661);vp26(ヌクレオキャプシドタンパク質、GenBankアクセッション番号AA069663);vp28(外殻タンパク質、GenBankアクセッション番号AAL33423);VF(機能未知のウイルスタンパク質、GenBankアクセッション番号AAL33255)、DNAポリメラーゼ(ウイルスゲノムの複製に関与する酵素、GenBankアクセッション番号NP_478036)、及びZF(推定上のジンクフィンガー転写因子、フィンガー転写因子NP_477987)。これらの遺伝子を、それらの公知、又は推側される機能に基づいて、潜在的標的として選んだ;そのうち2種は(vp19、及びvp28)は、宿主細胞のウイルスの感染に関与し、かつワクチン作成のための標的であることが示唆されてきた外殻タンパク質である(Witteveldt J、 Vlak JM、及びVan Hulten MCの論文「WSSVのサブユニットワクチンを用いた、ペナエウス モノドンのホワイトスポットシンドロームウイルスに対する防御性」(Fish Shellfish Immunol. 2004 May ; 16 (5): 571-9));該vp26タンパク質はヌクレオキャプシドの構成要素として知られている;DNAポリメラーゼはウイルスゲノムの複製に必須であるはずである;かつ、ZFは、該WSSVゲノムの発現制御に推定上関与している。従って、これらの遺伝子は、WSSVの少なくとも4種の相異なる機能に相当し、それゆえ、RNAi介在発現低下による、感染に対する防御性のための標的範囲に相当する。該遺伝子を、我々のESTコレクションからPCRにより増幅し、互いに逆の方向性をもつファージプロモーターをもつベクター(対象の挿入断片がT7、及びT3の側面に位置される、Invitrogen 社のpCR4)へサブクローニングした。プラスミドDNAを精製し、直線化し、該RNAのインビトロ転写に使用した。そのRNAを精製し、アニールし、質をゲル電気泳動により調べ、かつ定量した。ミリグラム量のRNAの作成のため、合成反応の規模拡大を許容する、改質されたRNA合成プロトコルに従った。
vp19、及びチミジン酸キナーゼを除く、上記同定遺伝子は、該ESTコレクションからうまく増幅され、対象となるベクターにクローニングされた。vp19をコードする遺伝子は、WSSV感染エビの組織からのPCR増幅によってクローニングされた。クローニングされた全ての遺伝子の同定は、配列決定により確認され、組み換えコンストラクトの機能性は、インビトロ転写により調べられた。一本鎖RNAと、アニールされたdsRNA産物は、図3に見られるように、アガロース電気泳動により分析された。典型的なインビトロ転写反応は、lμg DNA鋳型あたり、約25μg dsRNAの収率である。
結論:1. ウイルス遺伝子のクローニング、及びインビトロ転写の方法が応用され、かつ標準化されている。2. ここで応用された該技術を用いて、ESTクローンや配列情報が入手可能な、任意のエビウィルスの選択された対象の遺伝子から、dsRNAを作成することが可能であるはずである。
(WSSV感染に対する防御性のための、単独、及び組合せのdsRNAの調製)
(方法)
該先行実施例の5つの遺伝子の、WSSVによる感染からエビを防御する能力を調べた。行った実験は、下記のとおりであった:1) WSSV感染エビの組織(1日当たり体重の5%)を2日間給餌し、ウイルスの感染量を与えた。コントロール(非感染)動物には、非感染エビの組織(1日当たり5%)を、2日間給餌した。WSSVのLD90量の注入より、このウイルスの致死量の経口チャレンジを選択したのは、それが、現実の世界の環境における、ウイルスチャレンジのより典型であり、かつ該エビの耐性の、より一層ストリンジェントな試験を提供するからである。WSSV遺伝子の防御効果は、非特異的dsRNA(例えば、アヒルIgY)の効果と比較しなかった。非特異的刺激を用いた、この研究において得られた結果を、ウイルス特異的配列を用いた我々の初期の結果と比較すると、任意のWSSV遺伝子のdsRNAを用いて、数倍高い防御効果が達成され得ることが、かなり明らかであった。その上、特異的dsRNA(vp19)、及び非特異的dsRNA(ポリC:G)の防御効果の比較は、実施例5の表、及び図9に示された実験に含まれる。dsRNA(12 μg)の注入は、経口チャレンジを開始する4〜6時間前に、筋肉内に行った。Kruskal-Wallis方法を用いる一元配置ANOVAを使用して、統計解析を行った。
該防御性実験において、5種の選択されたWSSV遺伝子の有効性は、多様であった(図4):該ZF、及びとvpl9遺伝子は、良好な防御性を示した(非感染動物より、より良好:80〜86%生存)のに対し、他の3種の遺伝子(vp26、vp28、及びVF)は、低い防御性を示した(40〜52%の間)。5種全てのdsRNAの混合物を調べたところ、10日間で70%の生存率という、中間の防御性を示した。全ての遺伝子、及びdsRNAの混合物は、VFを除いては、ポジティブコントロールから、有意に異なっていた(P=0.072)。vpl9、ZF、及びその混合物 (P<0.001) は、WSSVのポジティブ処理と比較して、ネガティブコントロールより、若干より有意な生存をもたらした(P=0.003)。該ネガティブグループの死亡率は、予想外であったが、PCRにより調べたところ、不慮のWSSV感染によるものではなかった。該ネガティブグループの死亡率は、該結果の解釈、又は有意性に影響を与えなかった。最も防御性の高い遺伝子、vpl9、及びZFは、最も防御性の低い遺伝子VFより、有意に異なっていた(各々、P=0.011、及び0.016)。
2. 5種のdsRNAの混合物は、5種の遺伝子が個々にもたらす効果の範囲の中間の防御性をもたらした。
(dsRNAは海洋性無脊椎動物(エビ)における、一般的な抗ウィルス免疫を誘導する)
最初に、我々が、エビへのdsRNAの注入が、抗ウイルス防御性をもたらすことを見い出したのは、タウラシンドロームウイルス(TSV)でのウイルスチャレンジの結果における、シグナル伝達経路のRNAi介在発現減少の影響を調べているときであった。我々の実験アプローチは、精製された同起源dsRNAを注射し、その後、動物をTSVでチャレンジし、対象の遺伝子が発現低下した動物が、ウイルス感受性の増大を示すかどうかを検討することである。驚いたことに、任意のdsRNAの注入が、エビの遺伝子に相当していようが、非特異的dsRNAコントロールであろうが、TSVチャレンジに対する生存増加をもたらした(図示せず)。この初期の観察が、脊椎動物においてと同様に、dsRNAが、エビにおいて抗ウイルスプログラムを誘導し得るという可能性に我々が取り組むきっかけになった。
(方法)
WSSVチャレンジに対してもたらされる防御性における、dsRNAの投与量の効果を調べるために、下記の実験計画を採用した。最大、及び最小の防御性をもたらす2種のdsRNA、各々vp19、VFを、"最強"(10 μg)と、10倍毎の低い希釈(1、及び 0.1 μg)での実験に選んだ。該dsRNAを、WSSV感染組織での経口チャレンジの4〜6時間前に、筋肉内に注入し、10日間にわたり生存を評価した。Kruskal-Wallis法を使用し、統計的有意性を判断した。
結果(図6)により、vp19がウイルスチャレンジに対して、より優れた防御物であったことが確認され、また、両遺伝子において該防御効果が希釈され得ることが示された。1 μg投与量のvp19は、10 μg投与量ほど良好な防御性をもたらした(80%対90%)が、0.1 μgでは、該防御性は、36%に落ちた。全てのvp19投与量(10、1、及び0.1 μg)は、統計的に、該ポジティブコントロールとは異なっていた(各々、P<0.001、<0.001、及び0.023)。該0.1 μg投与量は、他の2種の投与量より、有意に防御効果が低かった(P=0.002)。VF dsRNAの場合、3種の投与量での防御性は、各々、72%、46%、及び38%であった。また、これらの全ての投与量(10、1、及び0.1 μg)は、ポジティブコントロールとは有意に異なっていた(P<0.001、0.013、及び 0.016)。統計的解析により、VFの最高投与量は、vp19の高い投与量と同様である(10 μg P=0.009、及び1 μg P=0.010)こと、かつVFの低い投与量は、vp19の最低投与量とグループ化されることが示された(P=0.002〜0.003)。
1. 10、及び1 μg の投与量で、VFと比べて、vpl9のより優れた防御効果を確認した。
2. dsRNAによる防御性の有効性を、希釈による力価の評価を行い、0.1 μgではvp19、及びVF両方において、約36〜38%であった。
(特異的(WSSV)dsRNAにより生じた防御性における、非特異的dsRNAのアジュバント効果)
(方法)
遺伝子特異的dsRNAの調製の経費と複雑さは、商品化に対する重大な障害となりうるだろう。このため、非特異的dsRNA(ポリC:G)の添加が、希釈によって見られるWSSV特異的dsRNAの活性の消失を補償できるかを検討する、実験を計画した。従って、表1に示されるように、量が0.012〜1 μgの様々な量のvp19 dsRNAを、ポリC:Gと混合し、一定の投与量1 μgを保った。経口ウィルスチャレンジが開始される4〜6時間前に、エビにp19/ポリC:Gの混合物を注射し、かつ10日に渡って生存率をモニターした。Kruskal-Wallis方法を用いる一元配置ANOVAで、統計解析を行った。
図9に図示されるように、1 μg vpd19 dsRNAで処理したエビは、0.3331 μg vp19 dsRNAに0.6671 μgポリC:G添加と、本質的に等しい86〜92%の生存率を示した(P=0.574)。0.111 μg vp19 dsRNAで処理されたグループは70%の生存率を示し、0.037 μg、及び0.012 μg vp19 dsRNAで処理されたグループ(各々、0.963 μg、又は0.988 μg ポリC:G)は、20〜 30%の生存率を示したが、1 μgポリC:Gで処理した動物は、わずかな6%の生存率を示した。該vp19投与量を0.111 μgから0.037 μgへ減少させた時に、防御性の有意な低下が観察された(P<0.001)。
該実験実施例の累積された結果より、WSSV遺伝子をコードするdsRNAへのポリC:Gの添加が、ウイルスチャレンジ残存エビの割合を約2倍増加させることが示唆される。このことは、ウイルス遺伝子特異的dsRNAの生産経費が、ポリC:Gのものよりかなり高いと予想され得るので、非常に重要である。該増強効果の理由は不明であるが、全身性抗ウイルス応答の上昇に関連し得る。
(サッカロミセスにおける誘導的にウィルスdsRNAを発現する酵母発現ベクターの構築)
所望される遺伝子(WSSVのvp19、又はZFの配列)が操作上連結される、GAL1(ガラクトース誘導性プロモーター)、2種の選択マーカーURA(ウラシル遺伝子)、及びAMP(アンピシリン遺伝子)、該所望されるdsRNAに連結される所望される遺伝子を含む、プラスミドを構築した結果、サッカロミセスに導入されるときには、選択的条件下(ウラシル非存在下)で選択され得て、かつガラクトース誘導条件下で培養されるときには、該所望される遺伝子、及びdsRNAを発現するベクターが生じた(図10を参照)。図11に図式的に示すように、さらに、任意に酵母菌の実験が行い、発現の最適レベル、及びタイミング、及びdsRNAの収率を最適化するような培養の諸条件をもつ酵母株を選択する。
(海洋エビにおける抗ウイルス免疫を調節するシグナル伝達経路への機能ゲノム学的アプローチ)
リトペナエウス バンナメイは、世界で最も幅広く養殖されているエビの種類で、甲殻類免疫の研究の重要なモデルである。十数の病原性ウイルスがエビに感染することが知られているので、生得的抗ウイルス応答、無脊椎動物免疫の従来軽視され一面の研究を行うの唯一の機会を提供する。これらのウイルス応答性遺伝子をキャラクタリゼーションすることにより、エビ‐ウイルス関係に関与する経路の種類に関する理解を得ることを目的とする。この目的へ向けて、我々は、コントロール、及びホワイトスポットシンドロームウイルス(WSSV)感染エビの組織を使用して、サプレッションサブトラクションライブラリー(SSH)を作製し、キャラクタリゼーションを行った。SSHライブラリー由来の単離クローンの発現解析により、推定上の免疫機能をもつ数種の遺伝子が、WSSV感染中に調節されていることが明らかにされる。エビ‐WSSV系を律する分子メカニズムの新規性は、配列解析に基づき機能がないとされている遺伝子の有意な割合により、強調される。我々は、2800種のエビ単一遺伝子を含む L. バンナメイのcDNAマイクロアレイを作成し、これらの動物における抗ウイルス応答に関連した遺伝子発現の変化を解析した。RNAiを使用する標的サイレンシングを組み合わせた、このエビcDNAマイクロアレイを用いる遺伝子発現の包括的解析は、甲殻類における、抗ウイルス応答と同様に、他の表現型応答を律する分子事象の理解の手掛かりになるであろう。
ここに示されるデータより、dsRNAが、海洋無脊椎動物における、ウイルス感染に対する防御性を誘導することが示される。これは、誘導性の一般的抗ウイルス免疫応答が、無脊椎動物において発現され得るという、最初の証拠を提供する。他の研究では、特定のウイルスタンパク質と同様に、微生物産物(例えば、LPS、及びβグルカン)が、エビにおける抗ウイルス耐性を増強できることが示唆されている(Changらの論文、Fish Shellfish Immunol. 15: 297-310 (2003); Hwangらの論文、Deu. Comp. Immunol. 23: 54552 (1999);Songらの論文、Dev. Biol. Stand. 900: 413-21 (1997);Takahashiらの論文、Fish Shellfish Immunol. 10: 555-8 (2000); Witteveldtらの論文、J. Virol. 78 : 2057-61 (2004))。しかしながら、我々の結果より、三様に、甲殻類における抗ウイルス免疫に関する我々の知識を向上させる。第一に、我々の結果より、2種の無関係なウイルス、TSV、及びWSSVに対して活性をもつ抗ウイルス免疫反応が示される。これらの結果をもとに提起される作業仮説は、dsRNAが、エビにおける一般的抗ウイルス応答を誘導するということである。第二に、エビの抗ウイルス免疫系は、(ポリI-Cの場合を除いて)その塩基配列、及び塩基組成にかかわらず、分子の型としてdsRNAに応答することが、示される。第三に、脊椎動物と、無脊椎動物との生得的抗ウイルス免疫間の、有力な進化的関連(dsRNAの認識)が示唆される。
(図面の詳細な説明)
Claims (25)
- エビにおいて、全身性の抗ウイルス応答、及びエビに感染するウイルスに含まれる内在性遺伝子の発現の阻害の両方を誘導する方法であって、エビに感染するウイルスに含まれる内在性遺伝子と配列相同性を有する配列を含み、かつ該エビにおいて全身性の抗ウイルス応答を誘導し、かつエビに感染するウイルスに含まれる内在性遺伝子の発現を阻害する少なくとも1種のdsRNAの有効量を該エビに投与することを含み、該dsRNAがVP26、VP28、VP19、リボヌクレオチド還元酵素、DNAポリメラーゼ、ZF、及びこれらの組合せからなる群から選択される内在性遺伝子を標的とする、前記方法。
- 前記配列が、配列番号5及び6からなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- 前記dsRNAが100ヌクレオチド鎖長以上である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記エビが、アキカミパストシュリンプ、バルチックプローン、テンジククルマエビ、ブルーシュリンプ、ブラインシュリンプ、ブラウンタイガープローン、カラモテプローン、イースタンキングプローン、イースタンスクールシュリンプ、タイショウエビ、淡水エビ、ジャイアントリバープローン、ブラックタイガー、ヨシエビ、クマエビ、インディアンホワイトプローン、カルマエビ、メタペナエウス属エビ、ノーザンホワイトシュリンプ、パラエモニドシュリンプ、アカオエビ、サザンホワイトシュリンプ、パシフィックホワイトシュリンプ、アトランティックホワイトシュリンプ、及びホワイトレッグシュリンプであるからなる群から選択される、請求項1又は2記載の方法。
- 前記エビが、リトペナエウス バナメイ、又はペナエウス モノドンである、請求項1又は2記載の方法。
- 前記ウイルスが、伝染性皮下造血器壊死ウイルス(IHHNV);ペナエイドシュリンプのバキュロウイルス(BP)、ホワイトスポットシンドロームウイルス(WSSV);タウラシンドロームウイルス(TSV);ペナエイドシュリンプのラブドウイルス(RPS);鰓関連ウイルス(GAV);イエローヘッドウイルス(YHV);リンパ器官関連ウイルス(LOV);肝膵臓パボウイルス(HPV)、バキュロウイルス中腸壊死ウイルス(BMN)、モノドン型バキュロウイルス(MBV)、レオ様ウイルス疾患ウイルス(REO)、及びラブドウイルス(RPS)からなる群から選択される、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが、注入により投与される、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが、浸漬により投与される、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが、フィードストックで投与される、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが、該dsRNAを発現する微生物、又は微細藻類で投与される、請求項1又は2記載の方法。
- 異なるdsRNAの混合物が投与される、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが、前記エビに感染する細菌ベクターに含まれる、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが人工送達系内にある、請求項1又は2記載の方法。
- 前記送達系がカプセル、ポリマー、又は脂質である、請求項13記載の方法。
- 前記dsRNAがヘアピンループを含む、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが人工餌料に含まれる、請求項1又は2記載の方法。
- 前記dsRNAが組み換え微生物に含まれる、請求項1又は2記載の方法。
- エビ種親を生産するために用いられる、請求項1又は2記載の方法。
- エビ幼生を生産するために用いられる、請求項1又は2記載の方法。
- ウイルス耐性のエビ系統が生産される、請求項1又は2記載の方法。
- 異なるウイルス遺伝子を標的にする複数の異なるdsRNAが投与される、請求項1又は2記載の方法。
- エビに感染するウイルスに対する抗ウイルス防御性が誘導されたエビを生産する方法であって、エビに感染するウイルスに含まれる内在性遺伝子と配列相同性を有する配列を含む少なくとも1種のdsRNAを該エビに投与することを含み、該dsRNAがVP26、VP28、VP19、リボヌクレオチド還元酵素、DNAポリメラーゼ、ZF、及びこれらの組合せからなる群から選択される内在性遺伝子を標的とする、前記生産方法。
- 前記配列が、配列番号5及び6からなる群から選択される、請求項22記載の方法。
- 非特異的ヌクレオチド配列を含む少なくとも1種のdsRNAを前記エビに投与することを更に含む、請求項22又は23記載の方法。
- 非特異的ヌクレオチド配列を含む少なくとも1種のdsRNAを前記エビに投与することを更に含む、請求項1又は2記載の方法。
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