WO2018084077A1 - 有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 - Google Patents

有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法 Download PDF

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奉廷 姜
マーシー ワイルダー
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国立研究開発法人国際農林水産業研究センター
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Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling the natural biological function of shrimps in vivo using molecular biology techniques. Specifically, the present invention relates to a method for controlling gene maturation of shrimps using RNA interference techniques. The present invention relates to a method of suppressing expression and releasing suppression of egg maturation.
  • RNA interference is a phenomenon in which mRNA is cleaved in a sequence-specific manner by double-stranded RNA (dsRNA), resulting in suppression of gene expression, and is a defense system at the nucleic acid level common to living organisms.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • siRNA short interfering RNA
  • siRNA recognizes the target sequence as a guide RNA, and cleaves the target mRNA, thereby suppressing gene expression.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 2 and Non-patent Document 3.
  • Patent Document 3 There is also a case of a patent application complaining that maturation can be promoted by this method (see Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a method for canceling egg maturation suppression by suppressing the expression of a gene that suppresses egg maturation of shrimps using an RNA interference technique.
  • the present inventors use the principle of RNA interference as a method for controlling the egg maturation of shrimp, and suppress the egg maturation of shrimp using dsRNA that binds to the mRNA of a gene that suppresses egg maturation of shrimp Intensive study was conducted to suppress gene expression.
  • This study is the first step to enable efficient maturation control based on biochemical research, and cancels gene expression of hormones that suppress maturation in vivo.
  • the dsRNA can efficiently suppress the expression of a gene that suppresses egg maturation of shrimps and can cancel the suppression of egg maturation.
  • the present inventors have been involved in the suppression of egg maturation, and more effectively suppressed egg maturation by using a mixture of multiple dsRNAs that can suppress the expression of each gene.
  • the present inventors have found that the expression of genes to be suppressed can be suppressed and have completed the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • VIH egg yolk formation inhibitory hormone
  • Double-stranded RNA (dsRNA) that targets the yolk formation inhibitor hormone (VIH) gene mRNA has the same base sequence as part of the base sequence of the yolk formation inhibitor hormone (VIH) gene [1] to [3] are double-stranded RNAs (dsRNA) in which a sense strand capable of hybridizing to the gene and an antisense strand comprising a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand are complementarily bound ]
  • dsRNA double-stranded RNAs
  • the yolk formation inhibitor hormone gene is a peptide derived from the scabbard shrimp stalk
  • dsRNA double-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • SGP-C double-stranded RNA
  • SGP-F single-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • Double-stranded RNA that targets the yolk formation inhibitor hormone (VIH) gene mRNA, and has the same base sequence as part of the base sequence of the yolk formation inhibitor hormone (VIH) gene
  • a shrimp egg yolk formation-inhibiting hormone comprising a double-stranded RNA in which an antisense strand comprising a sense strand capable of hybridizing to the gene and a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand is complementarily bound
  • a composition that suppresses gene expression and cancels egg maturation suppression in cultured shrimps.
  • the composition according to [7] wherein the cultured shrimp is a shrimp belonging to the familyshrimp.
  • composition according to [8], wherein the cultured shrimp is adult shrimp or sub-shrimp of vaname shrimp or carr shrimp.
  • One or more selected from the group consisting of SGP-A, SGP-B, SGP-C, SGP-F, and SGP-G, wherein the egg yolk formation inhibitor hormone gene is a vanilla shrimp eye stalk derived peptide The composition according to any one of [7] to [9], which is a gene.
  • a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the SGP-A gene the sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 28; the SGP comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 30
  • a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the -B gene a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the SGP-C gene, the sense strand comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 33
  • a SGP-G gene comprising the base sequence represented by SEQ ID No. 39 as the target strand
  • dsRNA double-stranded RNA
  • expression of a gene that suppresses egg maturation of shrimps can be suppressed by the principle of RNA interference, and egg maturation suppression can be released.
  • egg maturation suppression can be released.
  • the gene expression level can be eliminated in all individuals in 10 days, and at least this state is maintained for 30 days.
  • the gene expression knockdown rate when using the dsRNA of the present invention is 76.9-99.9%.
  • the knockdown rate of gene expression was only 64-73% after administration. It was.
  • the estimated cleavage site is ( ⁇ ), the double underline indicates the primer site for dsRNA, and the bold character indicates the dsRNA site to be synthesized.
  • the number of base sequences is shown on the right. It is a figure which shows the base sequence and deduced amino acid sequence of SGP-B (TM) cDNA of vaname shrimp.
  • the estimated cleavage site is ( ⁇ ), the double underline indicates the primer site for dsRNA, and the bold character indicates the dsRNA site to be synthesized. The number of base sequences is shown on the right. The difference between the reported peptide sequence and the deduced amino acid sequence from cDNA is underlined.
  • the present invention is a method of canceling egg maturation suppression by suppressing the expression of a gene that suppresses egg maturation of shrimps by RNA interference.
  • the shrimp that cancels egg maturation suppression by the method of the present invention is a shrimp that belongs to the family Shrimp, and is a shrimp (Penaeus japonicus), shrimp (Litopenaeus vannamei), Taisho shrimp (Penaeus chinensis), bear shrimp (Penaeus semisulcatus), Examples thereof include cattle shrimp (Penaeus monodon), and shrimp (Melicertus latisulcatus). Among these, vaname shrimp or tiger shrimp that are produced in large quantities as edible shrimp are preferred. Moreover, it is good also as a target for adult shrimp or sub-shrimp. Here, a weight of 10 g or more and less than 25 g is called sub-shrimp, and 35 g or more is called adult shrimp.
  • the gene that suppresses egg maturation of shrimp that suppresses expression by the method of the present invention is a gene belonging to the crustacean hyperglycemic hormone (CHH) family.
  • the genes belonging to the CHH family include crustacean hyperglycemic hormone (CHH) gene, egg yolk formation-inhibiting hormone (VIH) gene, molt-inhibiting hormone (MIH) gene, etc. Belongs.
  • CHH crustacean hyperglycemic hormone
  • VIH egg yolk formation-inhibiting hormone
  • MIH molt-inhibiting hormone
  • the expression of the yolk formation inhibitory hormone (VIH) gene belonging to the crustacean hyperglycemic hormone (CHH) family is suppressed.
  • An example of an egg yolk formation inhibitory hormone (VIH) gene is an ophthalmic stalk-derived peptide (SGP) gene.
  • SGP ophthalmic stalk-derived peptide
  • the five optic patterns of SGP-A, AGP-B, SGP-C, SGP-F and SGP-G are used.
  • SEQ ID NOs: 1 to 10 show the nucleotide sequences of the genes and the amino acid sequences of the peptides encoded by the genes.
  • SEQ ID NO: 1 SGP-A nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 2 SGP-A amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 3 SGP-B nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 4 SGP-B amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 5 SGP-C nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 6 SGP-C amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 8 SGP-F amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 9 SGP-G nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 10 SGP-G amino acid sequence
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence and amino acid sequence of SGP-A.
  • FIG. 7 shows the base sequence and amino acid sequence
  • FIG. 5 shows the base sequence and amino acid sequence of SGP-C
  • FIG. 8 shows the base sequence and amino acid sequence of SGP-F
  • FIG. 2 shows the base sequence and amino acid sequence of SGP-G. Shown in
  • dsRNA double-stranded RNA: double-stranded RNA
  • dsRNA suppresses (silences) the expression of a target gene by RNA interference.
  • One strand of the dsRNA has a base sequence identical to a part of the base sequence of each gene and is a sense strand capable of hybridizing to the gene, and the other strand is complementary to the base sequence of the sense strand
  • An antisense strand comprising a typical base sequence, and the sense strand and the antisense strand are complementarily bound to form dsRNA.
  • the sense strand and the antisense strand do not necessarily have to be completely complementary, and one or more, that is, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 as long as they are complementarily bonded. There may be ⁇ 3, particularly preferably 2 or 1 mismatches.
  • the target sequence in the above-mentioned eye-strain-derived peptide gene may be a coding region or a non-coding region. Moreover, both the coding region and the non-coding region may be included.
  • dsRNA includes shRNA (small hairpin RNA) and siRNA (small interfering RNA).
  • shRNA has a stem-loop structure that includes a double-stranded part and in which a sense strand and an antisense strand are linked via a loop sequence.
  • shRNA the 3 'end of the sense strand and the 5' end of the antisense strand are linked via a loop (hairpin loop sequence).
  • the hairpin loop sequence is not limited, but includes a sequence beginning with UU consisting of 5 to 12 bases, such as UUCAAGAGA.
  • dsRNA and shRNA are processed in vivo by Dicer to generate siRNA. DsRNA can also form miRNAs.
  • the dsRNA of the present invention is provided with a length of 30 bases or more, it is processed by the action of an RNaseIII-like enzyme called Dicer and has a 21-27 base siRNA having a 2 base overhang at the 3 ′ end. (Small interfering RNA) molecules can be generated.
  • the number of bases of dsRNA is not limited, but is 50 to 800 bases, preferably 100 to 500 bases, and more preferably 100 to 300 bases.
  • the base sequence of the SGP-A gene represented by SEQ ID NO: 1, represented by SEQ ID NO: 3 The base sequence of the SGP-B gene, the base sequence of the SGP-C gene represented by SEQ ID NO: 5, the base sequence of the SGP-F gene represented by SEQ ID NO: 7, and the SGP-G represented by SEQ ID NO: 9 Examples thereof include partial sequences of gene base sequences, which have an RNA sequence having a base sequence in which thymine in the gene sequence is replaced with uracil.
  • a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the SGP-A gene consisting of a base sequence represented by SEQ ID NO: 28; a base sequence represented by SEQ ID NO: 30
  • dsRNA double-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA
  • SGP-C double-stranded RNA
  • SGP-G double-stranded RNA
  • the sense strand consists of a base sequence represented by SEQ ID NO: 36, double-stranded RNA (dsRNA) targeting the SGP-F gene
  • the sense strand consists of a base sequence represented by SEQ ID NO: 39
  • dsRNA double-stranded RNA
  • dsRNA double-stranded RNA selected from the group consisting of double-stranded RNA (dsRNA) targeting a gene can be used.
  • An antisense strand consisting of a complementary sequence is hybridized to these sense strands to form dsRNA.
  • the sense strand can be prepared using a dsRNA primer.
  • a primer for a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the SGP-A gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 27 can be mentioned.
  • a primer for a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the SGP-B gene consisting of the base sequence represented by 30 a primer comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 29 can be mentioned.
  • the primer As a primer for a double-stranded RNA (dsRNA) targeting the SGP-C gene comprising the nucleotide sequence represented, the primer comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 31 and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 32
  • the primer comprises the base sequence represented by SEQ ID NO: 34 ply -And a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35
  • dsRNA double-stranded RNA
  • Examples include a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37 and a primer consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 38.
  • the sense strand constituting the dsRNA of the present invention is preferably the same as the base sequence of the eye-stem-derived peptide gene, but may be a substantially identical sequence. That is, as long as the sense strand of dsRNA and the mRNA sequence of the peptide actually derived from the eye pattern are hybridized, one or more bases, that is, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 Mismatches may be generated by deletion, substitution or addition of ⁇ 3, or 2 or 1 bases.
  • the expression of at least one, preferably 2, 3, 4, or 5 genes of the above-mentioned eye stalk-derived peptide genes is suppressed.
  • suppression of egg maturation can be released more efficiently.
  • a plurality of dsRNA that can suppress the expression of each gene may be used.
  • the sense strand or antisense strand constituting the dsRNA molecule may have an overhang at the 3 'end.
  • the type and number of overhang bases are not limited. For example, a sequence consisting of 1 to 5 bases, preferably 1 to 3 bases, more preferably 1 or 2 bases can be mentioned. Specific examples include TTT, UU, and TT.
  • the overhang refers to a base added to the end of one strand of the dsRNA molecule and having no base capable of complementary binding to the corresponding position of the other strand.
  • the dsRNA of the present invention can be synthesized in vitro by chemical synthesis or a transcription system using a promoter and RNA polymerase.
  • RNA single strands having sequences complementary to each other as reverse sequences and having self-complementarity may be synthesized and combined at the self-complementary part. Annealing of the synthesized sense strand and antisense strand can be performed by a general method known to those skilled in the art.
  • RNA polymerase when synthesizing using a promoter and RNA polymerase, a template DNA having a structure in which a sense strand and an antisense strand are linked by a loop is synthesized downstream of one promoter and RNA is transcribed by RNA polymerase.
  • the promoter in the case of producing in vitro, T7 promoter, T3 promoter and the like are used.
  • PolIII promoters such as H1 promoter and U6 promoter are used. .
  • a vector a plasmid vector, a viral vector, etc.
  • a vector can be used as a vector.
  • a plasmid vector a pSUPER vector, a pBAsi vector, or the like can be used.
  • a virus vector an adenovirus vector, a lentivirus vector, a retrovirus vector, or the like can be used.
  • the present invention also includes a vector that expresses the dsRNA molecule.
  • the dsRNA of the present invention cleaves the mRNA of the eye pattern derived peptide gene in a sequence-specific manner, and as a result, causes RNA interference (RNAi) that suppresses the expression of the eye pattern derived peptide gene. Can be suppressed.
  • RNAi RNA interference
  • the dsRNA of the present invention may be administered into the shrimp in vivo. Administration can be by the oral route, as well as intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection or parenteral routes.
  • dsRNA may be administered intraperitoneally by injection. At this time, it is preferable to use an injection needle for insulin injection having a thin needle of about 30G to 33G.
  • the dsRNA of the present invention can be administered by mixing with food and feeding.
  • the dsRNA of the present invention is used in combination with a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Carriers include physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution and buffered saline.
  • the content of the dsRNA of the present invention may be appropriately selected depending on the preparation, and varies depending on the preparation, but is preferably 0.001 to 1% by weight.
  • the dosage of the dsRNA of the present invention to shrimp may be 0.0001-1 mg divided into once to several times a day.
  • RNA interference to suppress (silencing) the expression of a target gene by RNA interference is when the expression of the gene is determined using the expression level of mRNA or protein of the gene as an index, and the siRNA of the present invention is not introduced.
  • the degree of expression suppression may be compared between the amount of gene mRNA or protein produced before and after the introduction of siRNA.
  • mRNA it can be measured by Northern hybridization, RT-PCR, in situ hybridization, etc.
  • protein it can be measured by a known method such as Western blotting or ELISA.
  • the present invention includes a method of releasing the suppression of shrimp egg maturation by administering the dsRNA of the present invention to shrimp and suppressing the expression of a gene that suppresses egg maturation of shrimp.
  • the method is also a method for producing shrimp that is released from suppression of egg maturation by administering the dsRNA of the present invention to shrimp and suppressing expression of a gene that suppresses egg maturation of shrimp.
  • the expression of a gene that suppresses egg maturation can be completely suppressed within a few days to a few dozen days.
  • the state in which gene expression is suppressed is maintained for 10 to 50 days, preferably at least 30 days.
  • the suppression rate of gene expression when using the dsRNA of the present invention is 76.6 to 99.9%.
  • artificially matured shrimp can be produced by promoting egg maturation against shrimp that have been released from inhibition of egg maturation. From the shrimp, juvenile shrimp can be produced systematically and efficiently.
  • Example 1 Inhibition of gene expression of yolk formation inhibitory hormone (VIH; SGP-G) in adult female shrimp 1.
  • VH yolk formation inhibitory hormone
  • ds-RNA double-stranded RNA
  • VIH vitellogenesis-inhibiting hormone
  • the VIH gene is a sequence reported by Tsutsui et al. (2013) Fish. Sci., 79: 357-365 (SGP Based on the -G gene sequence), the VIH gene was cloned to prepare a plasmid.
  • the gene-specific primer (T7-VIH-L, T7-VIH-R, see Table 1) linked to the T7 promoter was used to amplify the mature VIH site and use it as a template for the MEGAscript RNAi Kit was used to prepare VIH-dsRNA (FIG. 2).
  • VIH-dsRNA In the sequence shown in Table 1, the part represented by TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO: 20) is the sequence of the t7 promoter. 2.
  • Administration of VIH-dsRNA Individuals of the internadal stage (stage C0-C1) of female female shrimp (weight 39g-70g) were selected and used for the experiment.
  • VIH-dsRNA was dissolved in TE buffer (10 mM Tris-HCl pH 7, 1 mM EDTA) (1 ⁇ g / ⁇ L), and 3 ⁇ g was injected per body weight (g) (VIH-dsRNA group).
  • TE buffer was injected in an amount of 3 ⁇ L per body weight (g) (TE buffer group).
  • dsRNA (1 ⁇ g / ⁇ L) against a green fluorescent protein (GFP) gene not present in the shrimp organism was prepared, and 3 ⁇ g per body weight (g) was injected (GFP-dsRNA section).
  • GFP green fluorescent protein
  • Total RNA was purified from the sampled eyepiece using RNeasy mini kit (Qiagen) and Clean-up kit (Qiagen). In some purified total RNA samples (TE10-3, TE10-4, VIH10-2), the hue remained and the color was on. The purified total RNA was reverse transcribed with a high capacity RNA to cDNA kit (Applied Biosystems) to synthesize cDNA, and the VIH gene was expressed by semi-quantitative PCR and quantitative PCR using a 4-fold diluted template as a template. The amount was examined.
  • PCR was similarly performed using primers (Liv-act-Fw1: CGACCTCACAGACTACCTGATGAAGAT (SEQ ID NO: 23), Liv-act-Rv2: GTGGTCATCTCCTGCTCGAAG (SEQ ID NO: 24)) that amplify the beta-actin gene (ACTB) as an internal standard gene. And compared relatively.
  • VIH The expression level of the VIH gene was shown by relative quantification which calculated the expression level of the target gene (VIH; SGP-G) with respect to the internal standard gene (ACTB). 4. Results Of the total RNA samples purified from the eye pattern, the TE10-3, TE10-4, and VIH10-2 RNA samples had a residual hue. As a result of confirmation by DNA electrophoresis after semi-quantitative PCR, the internal standard gene was not amplified in TE10-3 and TE10-4 (FIG. 3), so it was excluded from the analysis of gene expression level. In VIH10-2 sample, the number of internal standard genes increased, but the remaining hue might interfere with VIH amplification, so it was also excluded from the expression level analysis.
  • VIH was not observed in the individuals of Initial-2, GFP10-2, 5, TE20-1, and GFP20-5, but in the Initial, TE buffer, and GFP-dsRNA groups Overall, the expression of VIH was confirmed. On the other hand, in the experimental group injected with VIH-dsRNA, expression of VIH was not observed in all individuals on the 10th and 20th days.
  • Example 2 Control of VIH gene expression in subgenus shrimp 1. Cloning of Ophthalmic Derived Peptides Seven ophthalmic derived peptides (sinus gland peptides: SGP-A to G) have been identified in Vanamae shrimp, of which six ophthalmic derived peptides (A, B, C, E, F, G) has been reported to suppress the expression of egg yolk protein (Tsutsui et al., 2007, Mar. Biotechnol., 9: 360-369). Since SGP-G is the most abundant, SGP-G has been the subject of further research as the main VIH.
  • the base sequence of SGP-C is structurally similar to crustacean hyperglycemic hormore (CHH) and has the same action as CHH, so it has the properties of both hormones.
  • CHH crustacean hyperglycemic hormore
  • the expression level of VIH can be suppressed by injecting not only SGP-G (VIH) but also dsRNA against the above SGP-C and other similar SGP genes into shrimp.
  • SGP-C cDNA sequence was obtained from the ophthalmic cDNA library, and SGP-A, SGP-B, and SGP-F cDNAs were newly cloned.
  • SGP-A, SGP-B, and SGP-F cDNAs were newly cloned.
  • Creation of dsRNA for peptide derived from eye pattern As in the case of adult shrimp, a gene fragment at the mature VIH site was amplified by PCR based on the VIH gene plasmid, and VIH-dsRNA was negatively expressed using the MEGAscript RNAi Kit as a template. GFP-dsRNA was prepared as a control.
  • VIH-dsRNA gene-specific primers and T7 linked to the T7 promoter are used to synthesize dsRNA targeting the mature sites of SGP-A, SGP-B, SGP-C, and SGP-F genes.
  • a promoter primer see Table 1
  • a gene fragment was amplified by PCR using each cloned plasmid as a template, and dsRNA of each gene was synthesized in the same manner as VIH-dsRNA using that as a template.
  • the obtained GFP-dsRNA, VIH-dsRNA, and SGP-C-dsRNA were used after dissolving in TE buffer at a concentration of 3 ⁇ g / 4 ⁇ L.
  • SGP-A-dsRNA, SGP-B-dsRNA, and SGP-F-dsRNA are mixed in TE buffer so that each dsRNA is 1 ⁇ g / 4 ⁇ L and the total dsRNA concentration is 3 ⁇ g / 4 ⁇ L.
  • VIH-dsRNA was injected only once at a concentration of 3 ⁇ g per body weight (g) (VIH-1) on a randomly selected female subshrimp (15 g to 25 g body weight) for 7 days. Three injections were made at intervals (VIH-2).
  • SGP-C-dsRNA was injected only once at a concentration of 3 ⁇ g per body weight (g) (SGP-C section).
  • SGP-A-dsRNA, SGP-B-dsRNA and SGP-F-dsRNA were mixed at the same concentration and injected only once at a concentration of 3 ⁇ g per body weight (g) (Mix group).
  • GFP-dsRNA was injected only once at a concentration of 3 ⁇ g per body weight (g) (GFP group).
  • Sampling was performed on the 10th, 20th, and 30th days after the first injection, and the VIH expression level in the eye stalk was examined.
  • Gene expression analysis total RNA extraction, semi-quantitative PCR, quantitative PCR
  • the gene expression level was analyzed in the same manner as in Example 1-3. 5.
  • the SGP-C gene cloned from the ophthalmic cDNA library encodes a 115-residue amino acid sequence, and its primary structure is a signal peptide (24 residues), CPRP (CHH precursor-related peptide). 16 residues) and mature SGP-C (75 residues) (FIG. 5).
  • cDNAs that appear to be SGP-A, SGP-B, and SGP-F genes could also be cloned. Comparison of each cDNA with the peptide sequence previously extracted from the eye pattern revealed that SGP-A matched the deduced amino acid sequence of the mature site (Fig. 6), but SGP-B (Fig. 7) and SGP-F ( In FIG.
  • FIGS. 2 and 5 to 8 the sequence of the primer for dsRNA used for the production of dsRNA is shown in the double underline. Using this primer, dsRNA for suppressing the expression of each ocular stalk-derived peptide gene was prepared.
  • the dsRNA sequence for SGP-G in FIG. 2 is shown in SEQ ID NO: 39
  • the sequences of dsRNA primers for producing dsRNA for SGP-G are shown in SEQ ID NOs: 37 and 38.
  • SEQ ID NO: 33 the sequences of dsRNA primers for preparing dsRNA for SGP-C are shown in SEQ ID NOs: 31 and 32.
  • the dsRNA sequence for SGP-A in FIG. 6 is shown in SEQ ID NO: 28, and the sequence of the primer for dsRNA for producing dsRNA for SGP-A is shown in SEQ ID NO: 27.
  • the dsRNA sequence for SGP-B in FIG. 7 is shown in SEQ ID NO: 30, and the sequence of a dsRNA primer for producing dsRNA for SGP-B is shown in SEQ ID NO: 29.
  • the dsRNA sequence for SGP-F in FIG. 8 is shown in SEQ ID NO: 36, and the sequences of dsRNA primers for producing dsRNA for SGP-F are shown in SEQ ID NOs: 34 and 35.
  • VIH expression level decreased significantly on the 10th day after the injection, but on the 20th and 30th days there was no significant difference from the VIH expression level in the Initial group. I was not able to admit.
  • the expression level of the VIH gene can be significantly suppressed by using dsRNA against VIH (SGP-G) even in sub-adult shrimp. Similar effects can be obtained by using other genes similar to VIH.

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Abstract

本発明は、RNA干渉の手法を用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除する方法の提供を目的とする。本発明は、養殖エビ類の卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)を用いて、RNA干渉法により、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する方法である。

Description

有用エビ類の卵成熟抑制を解除する方法
　本発明は、分子生物学手法を用いてエビ類の生体内において本来の生物学的機能を制御する方法に関し、具体的にはRNA干渉の手法を用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除する方法に関する。
　現在、年間350万トンにのぼるバナメイエビ養殖生産を支えるために世界で年間約2,000億尾の稚エビが生産されており、その親エビとして米国ハワイ州だけで80万尾が生産・輸出されている。バナメイエビを含むクルマエビ類は人為的に成熟させることが困難であり、現状では眼柄切除を行い、成熟を促している。しかし、眼柄切除は成熟成功率が低いだけでなく、エビの片方の眼柄を焼き切ることから、動物虐待との非難も浴びている。眼柄切除に代わる成熟促進技術を開発し、計画的、効率的な稚エビ生産を可能にすることは喫緊の課題である。
　RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA（dsRNA）によって、その配列特異的にmRNAが切断され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象であり、生物共通の核酸レベルの防御システムであることが報告されている（非特許文献１を参照）。RNAiにおいては、dsRNAがダイサー(Dicer)の作用によりプロセッシングされsiRNA(short interfering RNA)が形成され、siRNAがガイドRNAとしてターゲット配列を認識し、ターゲットmRNAを切断することにより、遺伝子の発現が抑制される。
　現在、ふ化場等において人為的にエビ類を成熟・産卵させるためには、眼柄切除に代わる技術は存在しない。しかしながら、最近ではRNA干渉法を用いウシエビ（Penaeus monodon）などのエビ類でVIHの発現を抑制することを目的とした研究事例が報告されている（非特許文献１、非特許文献２及び非特許文献３を参照）。また、同方法で成熟を促すことが可能であると訴える特許出願の事例もある（特許文献１を参照）。
米国特許出願公開第US2015/0099702号明細書
Tiu and Chan, 2007, FEBS Journal, 274: 4385-4395. Treerattrakool et al., 2008, FEBS Journal, 275: 970-980. Treerattrakool et al., 2013, Aquaculture, 404-405: 116-121.
　RNA干渉の手法を用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除する方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、エビ類の卵成熟を制御する方法として、RNA干渉の原理を利用し、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子のmRNAに結合するdsRNAを用いエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することについて鋭意検討を行った。この検討は、生化学的研究に基づいた効率的な成熟制御を可能にするための第一歩であり、生体内で成熟を抑制するホルモンの遺伝子発現を解除するものである。その結果、前記dsRNAにより効率的にエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟の抑制を解除し得ることを見出した。
　さらに、本発明者らは、複数の遺伝子が卵成熟の抑制に関与しており、それぞれの遺伝子の発現を抑制し得る複数のdsRNAを混ぜて使用することにより、より効果的に卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　養殖エビ類の卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)を用いて、RNA干渉法により、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する方法。
[２]　養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、[１]の方法。
[３]　養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、[２]の方法。
[４]　卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)が、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNA(dsRNA)である、[１]～[３]のいずれかの方法。
[５]　卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ぺプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、[１]～[４]のいずれかの方法。
[６]　センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を用いる、[１]～[５]のいずれかの方法。
[７]　卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)であって、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNAを含む、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する組成物。
[８]　養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、[７]の組成物。
[９]　養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、[８]の組成物。
[１０]　卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ペプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、[７]～[９]のいずれかの組成物。
[１１]　センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を含む、[７]～[１０]のいずれかの組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-214411号の開示内容を包含する。
　本発明の二本鎖RNA（dsRNA）を用いることにより、RNA干渉の原理でエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除することができる。このようにして卵成熟抑制が解除されたエビ類の卵成熟を促進することにより、計画的かつ効率的な稚エビの生産が可能になる。
　本発明の二本鎖RNA（dsRNA）を使用することより、10日で全個体において、遺伝子発現レベルを皆無にすることができ、少なくともこの状態が30日間保たれる。また、本発明のdsRNAを用いた場合の遺伝子発現ノックダウン率は76.9～99.9％である。これに対してRNA干渉法を用いた他グループの結果では、例えばFeijo et al (2016), Mar Biotechnol. 18: 117-123において、遺伝子発現のノックダウン率は投与後64～73%のみであった。
本発明の方法の概念を示す図である。 バナメイエビのVIH (SGP-G) cDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。推測された切断部位は矢印（▼）で、二重下線部はdsRNA用のプライマー部位を示す。塩基配列数は右に表記してある。 半定量PCRによる眼柄内の VIH遺伝子発現の測定結果を示す図である。Initialは注射無し区を、TEはTE buffer注射区を、GFPはGFP-dsRNA注射区を、VIHはVIH-dsRNA注射区を示す。 定量PCRによる成エビ眼柄内のVIH遺伝子発現量の測定結果を示す図である。（N）は分析した個体数を示し、＊はInitialに対して有意差あり（P<0.05）を示す。 バナメイエビのSGP-C cDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。推測された切断部位は（↓）で、二重下線部はdsRNA用のプライマー部位を示す。塩基配列数は右、アミノ配列数は左に表記してある。 バナメイエビのSGP-A cDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。推測された切断部位は（↓）で、二重下線部はdsRNA用プライマー部位を示し、太文字は合成されるdsRNA部位を示す。塩基配列数は右に表記してある。 バナメイエビのSGP-B cDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。推測された切断部位は（↓）で、二重下線部はdsRNA用プライマー部位を示し、太文字は合成されるdsRNA部位を示す。塩基配列数は右に表記してある。報告されているペプチド配列とcDNAからの推定アミノ酸配列が異なる所は下線で示してある。 バナメイエビのSGP-F cDNAの塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。推測された切断部位は（↓）で、二重下線部はdsRNA用プライマー部位を示し、太文字は合成されるdsRNA部位を示す。塩基配列数は右に表記してある。報告されているペプチド配列とcDNAからの推定アミノ酸配列が異なる所は下線で示してある。 定量PCRによる亜成エビ眼柄内のVIH遺伝子発現量の測定結果を示す図である。（N）は分析した個体数、＊はInitialに対して有意差あり（P<0.05）を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本願発明は、RNA干渉法により、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟抑制を解除する方法である。
　養殖エビ類では、卵成熟が抑制されてしまい、従来は眼柄切除により、卵成熟を促進していた。本発明においては、養殖エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、卵成熟抑制を解除する。
　本願発明の方法により、卵成熟抑制を解除するエビ類は、クルマエビ科に属するエビ類であり、クルマエビ（Penaeus japonicus)、バナメイエビ（Litopenaeus vannamei）、大正エビ（Penaeus chinensis）、クマエビ（Penaeus semisulcatus）、ウシエビ（Penaeus monodon）、フトミゾエビ（Melicertus latisulcatus）等が挙げられる。この中でも、食用エビとして大量に生産されているバナメイエビ又はクルマエビが好ましい。また、成エビを対象としても亜成エビを対象としてもよい。ここで、体重10g以上25g未満を亜成エビ、35g以上を成エビと称する。
　本願発明の方法により、発現を抑制するエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子は、甲殻類血糖上昇ホルモン（CHH：crustacean hyperglycemic hormone)ファミリーに属する遺伝子である。CHHファミリーに属する遺伝子としては、甲殻類血糖上昇ホルモン（CHH: crustacean hyperglycemic hormone)遺伝子、卵黄形成抑制ホルモン（VIH: vitellogenesis-inhibiting hormone)遺伝子、脱皮抑制ホルモン（MIH：molt-inhibiting hormone）遺伝子等が属する。なお、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)をGonad-inhibiting hormoneともいう。
　本発明では、甲殻類血糖上昇ホルモン（CHH：crustacean hyperglycemic hormone)ファミリーに属する卵黄形成抑制ホルモン（VIH）遺伝子の発現を抑制する。卵黄形成抑制ホルモン（VIH）遺伝子として、眼柄由来ペプチド（SGP：sinus gland peptide)遺伝子が挙げられる。眼柄由来ペプチドには、SGP-A～SGP-Gの７つが存在するが、本発明においては、SGP-A、AGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gの５つの眼柄由来ペプチド遺伝子の１種又は複数種の遺伝子の発現を抑えることにより、卵黄形成抑制ホルモンの発現を抑制し、卵黄タンパク質を作りやすくし卵成熟させることにより、卵成熟を制御する。
　以下のように、配列番号１～１０に遺伝子の塩基配列及び遺伝子がコードするペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号１　SGP-A　塩基配列
配列番号２　SGP-A　アミノ酸配列
配列番号３　SGP-B　塩基配列
配列番号４　SGP-B　アミノ酸配列
配列番号５　SGP-C　塩基配列
配列番号６　SGP-C　アミノ酸配列
配列番号７　SGP-F　塩基配列
配列番号８　SGP-F　アミノ酸配列
配列番号９　SGP-G　塩基配列
配列番号１０　SGP-G　アミノ酸配列
　また、SGP-Aの塩基配列及びアミノ酸配列を図６に、SGP-Bの塩基配列及びアミノ酸配列を図７に、SGP-Cの塩基配列及びアミノ酸配列を図５に、SGP-Fの塩基配列及びアミノ酸配列を図８に、SGP-Gの塩基配列及びアミノ酸配列を図２に示す。
　上記の遺伝子の発現を抑制するためには、それぞれの遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖からなるdsRNA(double stranded RNA；二本鎖RNA)を用いればよい。dsRNAは、RNA干渉により標的遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）する。該dsRNAの一方の鎖は各遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖であり、該センス鎖とアンチセンス鎖は相補的に結合し、dsRNAを形成する。ただし、センス鎖とアンチセンス鎖は完全に相補的である必要は必ずしもなく、相補的に結合する限り、１又は複数、すなわち、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは、１～３個、特に好ましくは２個若しくは１個のミスマッチがあってもよい。上記の眼柄由来ペプチド遺伝子中の標的配列は、コーディング領域であっても、非コーディング領域であってもよい。また、コーディング領域と非コーディング領域の両方を含んでいてもよい。
　本発明において、dsRNAは、shRNA(small hairpin RNA)及びsiRNA（small interfering RNA)を含む。shRNAは２本鎖部分を含みセンス鎖とアンチセンス鎖がループ配列を介して連結しているステムループ構造を有する。shRNAにおいて、センス鎖の3’末端とアンチセンス鎖の5’末端がループ（ヘアピンループ配列）を介して連結されている。ヘアピンループ配列は限定されないが、５～12塩基からなるUUで始まる配列、例えばUUCAAGAGAが挙げられる。dsRNA及びshRNAは、生体内でダイサーによりプロセシングされてsiRNAを生成する。また、dsRNAはmiRNAを形成し得る。本発明のdsRNAが、30塩基以上の長さで提供される場合、ダイサー（Dicer）と呼ばれるRNaseIII様酵素の作用によってプロセッシングされ、３’末端に2塩基のオーバーハングを有する21～27塩基のsiRNA（small interfering RNA）分子を生じ得る。
　dsRNAの塩基数は、限定されないが、50～800塩基、好ましくは100～500塩基、さらに好ましくは100～300塩基である。
　dsRNAの眼柄由来ペプチド遺伝子の標的配列にハイブリダイズし、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制し得るセンス鎖として、配列番号１で表されるSGP-A遺伝子の塩基配列、配列番号３で表されるSGP-B遺伝子の塩基配列、配列番号５で表されるSGP-C遺伝子の塩基配列、配列番号７で表されるSGP-F遺伝子の塩基配列及び配列番号９で表されるSGP-G遺伝子の塩基配列の部分配列であって、遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列を有するRNA配列を有するものが挙げられる。
　具体的には、例えば、センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を用いることができる。これらのセンス鎖に、相補的な配列からなるアンチセンス鎖がハイブリダイズしてdsRNAが形成される。上記センス鎖は、dsRNA用のプライマーを用いて作製することができる。配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号２７で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号２９で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号３１で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３２で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)用のプライマーとして、配列番号３４で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３５で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられ、配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA) 用のプライマーとして、配列番号３７で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号３８で表される塩基配列からなるプライマーが挙げられる。
　本発明のdsRNAを構成するセンス鎖は、眼柄由来ペプチド遺伝子の塩基配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一な配列であってもよい。すなわち、dsRNAのセンス鎖と実際に標的となる眼柄由来ペプチドのmRNA配列がハイブリダイズする限り１又は複数個の塩基、すなわち、１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは、１～３個、あるいは、２個若しくは１個の塩基が欠失、置換又は付加してミスマッチが生じていてもよい。
　エビ類の卵成熟抑制を解除するために、上記の眼柄由来ペプチド遺伝子の少なくとも１種、好ましくは２種、３種、４種又は５種の複数の遺伝子の発現を抑制する。複数種の遺伝子の発現を抑制した場合、より効率的に卵成熟抑制を解除することができる。複数種の遺伝子の発現を抑制するためには、各遺伝子の発現を抑制し得る複数のdsRNAを用いればよい。
　dsRNA分子を構成するセンス鎖又はアンチセンス鎖は、3’末端にオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングの塩基の種類、数は限定されない。例えば、１～５塩基、好ましくは１～３塩基、さらに好ましくは１若しくは２塩基からなる配列が挙げられる。具体的には、例えば、TTT、UUやTTが挙げられる。ここで、オーバーハングとは、dsRNA分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。
　本発明のdsRNAは、化学合成や、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いた転写系によりin vitroで合成することができる。例えば、化学合成により合成する場合、互いに相補的な配列を逆方向配列として有しており自己相補性を有するRNA一本鎖を合成し、自己相補性部分で結合させればよい。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖のアニーリングは、当業者に公知である一般的な方法によって行うことができる。
　また、プロモーター及びRNAポリメラーゼを用いて合成する場合、１つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有する鋳型DNAを合成しRNAポリメラーゼによりRNAを転写すればよい。プロモーターとしては、in vitroで製造する場合、T7プロモーター、T3プロモーター等が用いられる。また、ベクターに本発明のdsRNAの鋳型DNAを導入し、該ベクターをエビ類の生体内に投与して生体内でdsRNAを合成する場合、H1プロモーター、U6プロモーター等のPolIII系プロモーター等が用いられる。ベクターを用いる場合、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドベクターとしては、pSUPERベクター、pBAsiベクター等を用いることができ、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができる。
　本発明は、上記dsRNA分子を発現するベクターをも包含する。
　本発明のdsRNAは、配列特異的に眼柄由来ペプチド遺伝子のmRNAを切断し、その結果、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制するRNA干渉（RNAi）を引き起こし、眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制し得る。
　本発明のdsRNAを用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制し、卵成熟を解除するためには、本発明のdsRNAをエビ類の生体内に投与すればよい。投与は、経口ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は非経腸的ルートで行うことができる。例えば、dsRNAを注射により腹内に投与すればよい。この際、30G～33G程度の細い針を有するインスリン注射用注射針を用いることが好ましい。また、本発明のdsRNAを餌に混合し、摂食させることにより投与することもできる。
　本発明のdsRNAは、薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤と配合して使用される。担体としては、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液及び緩衝生理食塩水が挙げられる。担体と配合される場合、本発明のdsRNAの含有量は、製剤により適宜選択されればよく、製剤により種々異なるが、0.001～１重量％であることが好ましい。本発明のdsRNAのエビ類への投与量は、0.0001～１mgを１日１回～数回に分けて投与すればよい。また、１投与単位あたり、dsRNA分子量で1nM～100μM、好ましくは10nM～50μM、より好ましくは100nM～20μM投与するのが好ましい。
　本発明において、RNA干渉により標的遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）するとは、遺伝子の発現をその遺伝子のmRNA又はタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、本発明のsiRNAを導入しない場合に対して、100％抑制される場合のみならず、75％以上、50％以上あるいは20％以上抑制される場合も含まれる。発現抑制の程度は、遺伝子のmRNA又はタンパク質の産生量をsiRNA導入前後で比較すればよい。mRNAの場合は、ノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、in situ hybridization等により測定することができ、タンパク質の場合は、ウエスタンブロッティング、ELISA等の公知の方法により測定することができる。
　本発明のdsRNAを用いてエビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、エビ類の卵成熟抑制を解除することができる。すなわち、本発明は、本発明のdsRNAをエビ類に投与して、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、エビ類の卵成熟抑制を解除する方法を包含する。該方法は、本発明のdsRNAをエビ類に投与して、エビ類の卵成熟を抑制する遺伝子の発現を抑制することにより、卵成熟抑制を解除したエビ類を製造する方法でもある。
　エビ類に本発明のdsRNAを投与した場合、数日から十数日程度で、卵成熟を抑制する遺伝子の発現を完全に抑制することができる。また、遺伝子発現が抑制された状態は10～50日、好ましくは少なくとも30日保たれる。また、本発明のdsRNAを用いた場合の、遺伝子発現の抑制率は、76.6～99.9％である。
　このように、卵成熟抑制を解除したエビ類に対して、卵成熟を促進することにより、人為的に成熟させたエビ類を製造することができる。該エビ類から、計画的かつ効率的に稚エビを生産することができる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例１　バナメイ雌成エビにおける卵黄形成抑制ホルモン（VIH；SGP-G）の遺伝子発現の抑制
1.　VIH(vitellogenesis-inhibiting hormone)遺伝子の二本鎖RNA(ds-RNA)の作製
　VIH遺伝子はTsutsui et al.（2013）Fish. Sci., 79: 357-365で報告されている配列（SGP-G遺伝子配列）を基に、VIH遺伝子をクローニングしてプラスミドを作製した。作製したプラスミドを鋳型にT7プロモーターと結合した遺伝子特異的なプライマー（T7-VIH-L、T7-VIH-R、表１を参照）を用いmature VIH部位を増幅し、それを鋳型にMEGAscript RNAi Kitを用いてVIH-dsRNAを作製した（図２）。表１に示す配列中、TAATACGACTCACTATAGGG(配列番号２０）で表される部分はt7プロモーターの配列である。
2.　VIH-dsRNAの投与
　バナメイ雌成エビ（体重39g～70g）の脱皮間期（ステージC0-C1）の個体を選び実験に用いた。作製したVIH-dsRNAはTE buffer(10mM Tris-HCl pH 7, 1mM EDTA)に溶解して（1μg/μL）、体重（g）あたり3μgを注射した（VIH-dsRNA区）。また、bufferの影響を調べるため、TE bufferを同量の体重（g）あたり3μLを注射した（TE buffer区）。ネガティブコントロールとして、エビの生体に存在しない緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子に対するdsRNA（1μg/μL）を作製し、体重（g）あたり3μgを注射した（GFP-dsRNA区）。各実験区は注射後10日、20日にサンプリングを行い、眼柄でのVIH発現を調べた。また、本来の生体内でのVIH発現量を基準とするため、何も注射していない雌成エビ（Initial区）もサンプリングして眼柄でのVIH遺伝子の発現を調べた。なお、各実験区でサンプリングされた個体は、実験区・サンプリング日・番号順にラベルした。つまり、TE bufferを注射し（TE buffer区）10日後にサンプリングした個体はTE10-1～TE10-5に、注射20日後にサンプリングした個体はTE20-1～TE20-5に略称した。
3.　遺伝子発現量の分析（全RNA抽出、半定量PCR法、定量PCR法） 
　サンプリングした眼柄からRNeasy mini kit（Qiagen）とClean-up kit（Qiagen）を用いて全RNA（total RNA）を精製した。精製した一部のtotal RNAサンプルでは（TE10-3、TE10-4、VIH10-2）、色相が残り色がついていた。精製したtotal RNAはHigh capacity RNA to cDNA kit（Applied Biosystems）で逆転写することでcDNAを合成し、これを4倍希釈したものを鋳型として、半定量PCR法及び定量PCR法によりVIH遺伝子の発現量を調べた。
　半定量PCR法では、目的遺伝子の発現量を調べるため、VIH遺伝子に対する特異的なプライマー（Liv-SGP-G-F：CGGAGTGCAGGAGCAACTG（配列番号２１）、Liv-R3：CCTCTCTGTGTCTTCTGGCCGTTGG（配列番号２２））とTaqMan Fast Universal PCR Master Mix（2x NoAmpErase UNG、Applied Biosystems）を用いてPCR（94℃2分間変性後、94℃30秒、62℃30秒、72℃30秒で30サイクル）を行い、発現量を分析した。また、内部標準遺伝子としてbeta-actin遺伝子（ACTB）を増幅するプライマー（Liv-act-Fw1：CGACCTCACAGACTACCTGATGAAGAT（配列番号２３）、Liv-act-Rv2：GTGGTCATCTCCTGCTCGAAG（配列番号２４））を用いて同様にPCRを行い、相対的に比較した。
　定量PCR法では、上記の遺伝子特異的なプライマーとキットにプローブ（VIHにはLiv-SGP-G-Prb：TCTACAACCCCGTGTTCGTCCAGTGC（配列番号２５）を、ACTBにはLiv-act-Prb：CGACCACCGCCGAGCGAGAAATCGTTCGT（配列番号２６））を加え、以下の条件でリアルタイムPCR（7500Fast Real-Time PCR system、Applied Biosystems）を行った：95℃2分の変性後、95℃10秒、62℃30秒で40サイクル。VIH遺伝子の発現量は内部標準遺伝子（ACTB）に対する目的遺伝子（VIH; SGP-G）の発現量を計算した相対定量で示した。
4.　結果
　眼柄から精製したtotal RNAサンプルのうち、TE10-3、TE10-4、VIH10-2のRNAサンプルでは色相が残り色がついていた。半定量PCR後、DNA電気泳動で確認した結果、TE10-3、TE10-4では内部標準遺伝子が増幅されていなかったので（図３）、遺伝子発現量の分析から外した。VIH10-2サンプルでは内部標準遺伝子が増えていたが、残っていた色相がVIHの増幅を妨害する恐れがあるため、同様に発現量の分析から外した。30サイクルの半定量PCRでは、Initial-2、GFP10-2、5、TE20-1、GFP20-5の個体ではVIHの発現が見られなかったが、Initial区、TE buffer区、GFP-dsRNA区の全般的にVIHの発現が確認された。一方、VIH-dsRNAを注射した実験区では10日及び20日のすべての個体でVIHの発現が見られなかった。
　また、図４で示したように、定量PCRの結果では、Initial区に対し、TE buffer区とGFP-dsRNA区では10日、20日ともにVIH発現量の有意的な変動が見られなかったが、VIH-dsRNA区では10日、20日ともにVIH発現量が有意に減少した。以上のように、成エビにおいて、VIH-dsRNAの投与によりVIH遺伝子発現を抑制することができると立証された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２　バナメイ雌亜成エビにおけるVIH遺伝子の発現制御
1.　眼柄由来ペプチドのクローニング
　バナメイエビにおいては7つの眼柄由来ペプチド（sinus gland peptides：SGP- A～G）が同定されており、そのうち6つの眼柄由来ペプチド（A、B、C、E、F、G）が卵黄タンパク質の発現を抑制することが報告されている（Tsutsui et al., 2007, Mar. Biotechnol., 9:360-369）。そのうちSGP-Gが最も多く存在していることから、SGP-Gは主なVIHとして研究のさらなる対象となっていた。しかしながら、SGP-Cの塩基配列は構造的に甲殻類血糖上昇ホルモン（crustacean hyperglycemic hormore: CHH）に類似しており、またCHHと同様な作用を有すること突き止めたので、両方のホルモンの性質を有すると判断された（Lago-Leston et al., 2007, Aquaculture, 270: 343-357; Liu et al., 2014, Peptides, 53: 115-124）。本発明では、SGP-G（VIH）のみならず、上記のSGP-C及びその他の類似したSGP遺伝子に対するdsRNAをエビの生体内に注入することでVIHの発現量を抑制することができる。そのため、眼柄のcDNAライブラリーからSGP-Cの全cDNA配列を得て、SGP-A、SGP-B、SGP-FのcDNAを新たにクローニングした。
2.　眼柄由来ペプチドのdsRNA作成
　成エビと同様にVIH遺伝子のプラスミドを基に、mature VIH部位の遺伝子断片をPCRにより増幅し、それを鋳型にMEGAscript RNAi Kitを用いてVIH-dsRNAを、ネガティブコントロールとしてGFP-dsRNAを作成した。また、VIH-dsRNAと同様に、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F遺伝子のmature部位を標的としたdsRNAを合成するため、T7プロモーターと結合した遺伝子特異的なプライマーとT7プロモータープライマー（表１を参照）を用いて、クローニングした各プラスミドを鋳型にPCRにより遺伝子断片を増幅し、それを鋳型にVIH-dsRNAと同じ方法で各遺伝子のdsRNAを合成した。得られたGFP-dsRNA 、VIH-dsRNA、SGP-C-dsRNAは3μg/4μL濃度でTE bufferに溶解して使用した。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNAの3つは、各dsRNAが1μg/4μL濃度になるように混ぜて総dsRNA濃度が3μg/4μLになるようTE bufferで溶解して使用した。
3.　dsRNAの投与
　無作為に選んだ雌亜成エビ（体重15g～25g）個体に、VIH-dsRNAは体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射（VIH-1区）と、7日間隔で3回注射した（VIH-2区）。SGP-C-dsRNAは体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（SGP-C区）。SGP-A-dsRNA、SGP-B-dsRNA、SGP-F-dsRNAは同濃度に混ぜて、体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（Mix区）。ネガティブコントロールとして、GFP-dsRNAを体重（g）あたり3μgの濃度で1回のみ注射した（GFP区）。サンプリングは最初注射後、10日、20日、30日で行い、眼柄でのVIH発現量を調べた。
4．遺伝子発現量の分析（全RNA抽出、半定量PCR法、定量PCR法）
　実施例１の3と同様の方法で遺伝子発現量の分析を行った。
5.　結果
　眼柄のcDNAライブラリーからクローニングしたSGP-C遺伝子は、115残基のアミノ酸配列をコードしており、その一次構造は、Signal peptide（24残基）、CPRP（CHH precursor-related peptide；16残基）、mature SGP-C（75残基）で構成されていた（図５）。また、SGP-A、SGP-B、SGP-Fの遺伝子と思われるcDNAもクローニングすることができた。それぞれのcDNAを以前眼柄から抽出されたペプチド配列と比較したことろ、SGP-Aではmature部位の推定アミノ酸配列と一致したが（図６）、SGP-B（図７）とSGP-F（図８）ではアミノ酸の2残基が異なっていた。これらのcDNAはそれぞれのdsRNAの合成で鋳型として使用した。図２及び５～８には、dsRNAの作製に用いたdsRNA用のプライマーの配列を二重下線部に示す。該プライマーを用いて各眼柄由来ペプチド遺伝子の発現を抑制するためのdsRNAを作製した。図２のSGP-G用のdsRNA配列を配列番号３９に示し、SGP-G用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３７及び３８に示す。図５のSGP-C用のdsRNA配列を配列番号３３に示し、SGP-C用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３１及び３２に示す。図６のSGP-A用のdsRNA配列を配列番号２８に示し、SGP-A用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号２７に示す。図７のSGP-B用のdsRNA配列を配列番号３０に示し、SGP-B用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号２９に示す。図８のSGP-F用のdsRNA配列を配列番号３６に示し、SGP-F用のdsRNAを作製するためのdsRNA用プライマーの配列を配列番号３４及び３５に示す。
　dsRNAの注射による眼柄でのVIH遺伝子発現を定量PCR法で分析した結果、Initial区（注射無し）に対し、GFP-dsRNAを注射したGFP区では10日、20日、30日ともにVIH発現量に有意な減少は見られなかったが、VIH-dsRNAを注射したVIH-1区（1回）とVIH-2区（3回）では、注射後10日、20日、30日にVIHの発現量が有意に減少した（図９）。類似したSGP-C遺伝子のdsRNAを注射したSGP-C区では、注射後10日ではVIH発現量が有意に減少したが、20日、30日にはInitial区のVIH発現量に対し有意差は認められなかった。また、SGP-A、SGP-B、SGP-F遺伝子のdsRNAを混ぜて注射したMix区では、注射後10日、30日ではVIH発現量が有意に減少したが、20日ではInitial区のVIH発現量に対し有意差は認められなかった。
　以上、亜成体エビにおいてもVIH（SGP-G）に対するdsRNAを使用することで VIH遺伝子の発現量を大幅に抑制することができる。また、VIHに類似したその他の遺伝子を用いても同様な効果を得ることができる。
　本発明のdsRNAを用いてエビ類を計画的かつ効率的に生産することができる。
配列番号１１～１９、２１～２７、２９、３１、３２、３４、３５、３７、３８　プライマー
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. 　養殖エビ類の卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)を用いて、RNA干渉法により、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する方法。
  2. 　養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、請求項１記載の方法。
  3. 　養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、請求項２記載の方法。
  4. 　卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)が、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNA(dsRNA)である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ぺプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を用いる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA)であって、卵黄形成抑制ホルモン（VIH)遺伝子の塩基配列の一部に対して同一な塩基配列を有し、該遺伝子にハイブリダイズし得るセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖が相補的に結合した二本鎖RNA（dsRNA)を含む、エビ類の卵黄形成抑制ホルモン遺伝子の発現を抑制し、養殖エビ類の卵成熟抑制を解除する組成物。
  8. 　養殖エビ類がクルマエビ科に属するエビ類である、請求項７記載の組成物。
  9. 　養殖エビ類がバナメイエビ又はクルマエビの成エビ又は亜成エビである、請求項８記載の組成物。
  10. 　卵黄形成抑制ホルモン遺伝子がバナメイエビの眼柄由来ペプチドである、SGP-A、SGP-B、SGP-C、SGP-F及びSGP-Gからなる群から選択される１種又は複数種の遺伝子である、請求項７～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 　センス鎖が配列番号２８で表される塩基配列からなる、SGP-A遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３０で表される塩基配列からなる、SGP-B遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３３で表される塩基配列からなる、SGP-C遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；センス鎖が配列番号３６で表される塩基配列からなる、SGP-F遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)；及びセンス鎖が配列番号３９で表される塩基配列からなる、SGP-G遺伝子を標的とする二本鎖RNA（dsRNA)からなる群から選択される二本鎖RNA（dsRNA)の１種又は複数種を含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載の組成物。
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