CN104212813A - 青虾性腺抑制激素基因、加速卵巢发育的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种青虾性腺抑制激素基因、加速卵巢发育的试剂盒及方法，属于发育调控领域。该方法步骤如下：1.根据NCBI上公布的青虾GIH基因序列的开放阅读框设计RNA干扰的引物；2.提取青虾总RNA并反转为cDNA，通过上述引物进行PCR扩增及纯化；3.将上述纯化产物进行体外转录合成dsRNA；4.将dsRNA注射到雌性青虾的围心腔后，可以显著加速青虾卵巢发育。本发明为培育发育快、生长好的青虾优良品种提供新的思路和有效手段。

Description

青虾性腺抑制激素基因、加速卵巢发育的试剂盒及方法

 

技术领域

    本发明涉及一种青虾性腺抑制激素基因、加速卵巢发育的试剂盒及方法，属于发育调控领域。

 

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目（Decapoda）、长臂虾科（Palaemonidae）、沼虾属（Macrobrachium），广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。据2012年《中国渔业年鉴》记载，全国养殖青虾年产量超过23万吨，年产值超过150亿元，青虾养殖已在我国水产养殖中发挥了举足轻重的作用。近年来，随着规模化养殖的不断扩大和消费需求的不断提高，培育出发育快、生长好的性状更加优良的新品种是当前青虾遗传育种的关键。

性腺抑制激素（gonad-inhibting hormone，GIH），又称为卵黄发生抑制激素(vitellogensis inhibiting bormone，VIH)，是甲壳动物眼柄中合成分泌的甲壳动物高血糖激素（crustacean hyperglycemic hormone，CHH）家族中一种重要的神经肽，具有调控甲壳动物生殖、发育活动的作用。有多项生理学及遗传学研究发现，性腺抑制激素能够抑制性腺的发育，是甲壳动物生殖发育调控中一种重要激素。

RNAi（RNA interference, RNAi）技术是一种由双链RNA诱发的基因沉默技术。在此过程中，与双链RNA有同源序列的mRNA被降解，从而抑制了该基因的表达。RNAi被认为是在基因功能研究中最有效的方法之一，已成为甲壳动物重要基因的功能的研究等很多领域中的重要工具。

 

发明内容

本发明的目的在于提供一种青虾性腺抑制激素基因、加速卵巢发育的试剂盒及方法。利用本发明提供的方法可以有效的加速青虾卵巢的发育，为培育发育快、生长好的青虾优良品种提供新的思路和有效手段。

青虾性腺抑制激素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

由上述的青虾性腺抑制激素基因所合成的dsRNA。

一种利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的试剂盒，包括有如SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物。

上述的试剂盒中还包括有体外转录合成dsRNA试剂盒。

一种非治疗目的的利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的方法，包括如下步骤：第1步、提取青虾的RNA，反转录为cDNA，通过SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物对cDNA进行PCR扩增，得到扩增产物；第2步、将扩增产物转录合成dsRNA；第3步、将dsRNA注射至青虾体内。

第2步中PCR反应程序如下：94℃ 总变性3 min；30 个循环：94 ℃ 变性 30 s, 55℃ 退火30 s，72℃ 延伸2 min，72 ℃总延伸10 min。

第3步的注射剂量是4μg/g。

 

有益效果

    采用本发明的方法可以显著加速卵巢发育，且卵巢发育周期比对照组明显缩短；本发明为培育发育快、生长好的青虾优良品种提供新的思路和有效手段。

 

附图说明

图1. 处于卵巢发育I期的雌性青虾注射不同浓度的（0.4μg/μl和 4μg/μl）dsRNA-I注射蒸馏水后测量得到的性腺发育指数的对比示意图。

图2. 处于卵巢发育I期的雌性青虾注射不同浓度的（0.4μg/μl和 4μg/μl）dsRNA-II和注射蒸馏水后测量得到的性腺发育指数的对比示意图。

1d，5d, 9d, 13d, 15d分别为注射后1天，5天，9天，13天和15天(N = 3)不同字母代表差异显著（P < 0.05），图中的a、b、c、d用于标识对照组和试验组之间差异的显著性，当显示为相同字母时代表差异不显著（P > 0.05）。对照组注射相同剂量的蒸馏水。

 

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

 

实施例1青虾GIH基因的dsRNA的获得

1. 青虾总cDNA的获得

选取成熟雌性青虾4只，解剖并获得卵巢，迅速置于液氮中速冻，并放于-80℃冰箱中保存待用。

RNA提取，具体操作步骤参照Takara Trizol试剂盒。

参照Takara M-MLV反转录试剂盒进行第一链cDNA的合成。

 

2. 青虾GIH基因dsRNA引物的设计

在NCBI上搜索GIH序列，获得青虾GIH基因（Accession No. HQ724326）。采用NCBI在线序列分析软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定GIH基因的开放阅读框位置为206-521bp。根据上述结果，采用NCBI在线dsRNA引物设计软件（http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl），在青虾GIH开放阅读框内设计dsRNA引物，并在其前面添加T7启动子序列5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’，组成dsRNA合成引物，其引物序列分别为：确定引物组I：上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；引物组II：上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；引物组III：上游引物SEQ ID NO.5和下游引物SEQ ID NO.6。所有引物均在铂尚生物技术（上海）有限公司合成。

引物组序列如下：

SEQ ID NO. 1

TAATACGACTCACTATAGGGTCTCAACAAAGCTTTCACGC

SEQ ID NO. 2

TAATACGACTCACTATAGGGACTTGCGTCCGACTCGTATT

SEQ ID NO. 3

TAATACGACTCACTATAGGGGATAACCATGGCTGTGTTCG

SEQ ID NO. 4

TAATACGACTCACTATAGGGGTCGACCATGTCTTGGGAGT

SEQ ID NO.5

TAATACGACTCACTATAGGGCCTTCCGAGTCTTTGTCGAAAA

SEQ ID NO. 6

TAATACGACTCACTATAGGGCGACTCGTATTATGCTCATCGC

3. 青虾GIH基因dsRNA的合成

采用上述青虾引物组I、II和III在青虾总cDNA上进行PCR扩增，获得PCR产物。

PCR反应程序如下：

94℃ 总变性3 min, 30 个循环：94 ℃ 变性 30 s, 55℃ 退火30 s， 72℃ 延伸2 min,  72 ℃总延伸10 min.

PCR扩增反应体系如下：

cDNA模板1μl，10μM引物各1μl，5U/μl Taq酶0.2μl，10×Taq酶Buffer 2.5 μl，2.5 mM dNTP 4μL，25mM MgCl₂ 2μl，补ddH₂O至总体积25μl。

引物组I产物条带清晰唯一，引物组II产物模糊且暗淡，引物组III无产物条带。对引物组I和II产物进行纯化并测序，分别获得SEQ ID NO. 7和序列SEQ ID NO. 8.

测序结果如下：

SEQ ID NO: 7

TTCAGAAATTAACATATGTTGCGATAACCATGGCTGTGTTCGGAATACTACTAGTGGATCAGACTTCGGCCCGGTTTTTGGACGACGAGTGTCGAGGAGTCATGGGAAATCGTGACTTGTACGAATACGTCGTCAGGATATGCGACGACTGCGAAAACATATTCAGGAAAAGCAACGTTGGACCCAAATGCAAGAAAAACTGCTTCTACAACATGGACTTCATGTGGTGCGTCCATGCCACTGAGCGAACCGACGAGCTGGAACATCTGAACCGAGCGATGAGCAT

SEQ ID NO: 8

GATAACCATGGCTGTGTTCGGAATACTACTAGTGGATCAGACTTCGGCCCGGTTTTTGGACGACGAGTGTCGAGGAGTCATGGGAAATCGTGACTTGTACGAATACGTCGTCAGGATATGCGACGACTGCGAAAACATATTCAGGAAAAGCAACGTTGGACCCAAATGCAAGAAAAACTGCTTCTACAACATGGACTTCATGTGGTGCGTCCATGCCACTGAGCGAACCGACGAGCTGGAACATCTGAACCGAGCGATGAGCATAATACGAGTCGGACGCAAGTGAGAATCGCCCAAAACTTCAGCCATCGAGAGACACACTACCGCCCCCGCCACCGCCGCTACGACTAATGCCTCACCCAACTCCCAAGACATGGTCGAC

引物组I和II产物经过生工生物工程（上海）股份有限公司的SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒纯化后，按照Transcript AidTM T7 High Yield Transcription kit (Fermentas, Inc., USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA，两组PCR扩增产物制备得到的dsRNA分别命名为dsRNA-I、dsRNA-II。dsRNA浓度采用BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg, Germany)在260 nm进行测定，并至终浓度分别为0.4μg/μl和 4μg/μl。

 

实施例2注射青虾GIH基因的dsRNA对青虾卵巢发育的影响

1. 试验用虾的选择

根据青虾生物学研究结果及卵巢发育不同阶段颜色变化，将青虾卵巢发育分为5个时期。分别是：I期（卵原细胞增殖期，透明）II期（初级卵黄发生期，黄色）III期（次级卵黄发生期，草绿色）IV期（成熟期，墨绿色）和V期（消退期，灰色）。为达到卵巢发育同步观察的研究目的，本研究统一采用卵巢处于I期、体重在1.26～2.85g之间的雌性青虾200只，平均分成5组。5组均饲养于相同的户外大塘的网箱内，同池饲养（实时水温28℃±1℃），塘内辅以充氧设备，每天早晚各投喂1次虾用混合饲料。

2.青虾GIH基因的dsRNA的注射和检测

根据每克体重注射1μl dsRNA的剂量（即4μg/g和0.4μg/g），以内径为1.2mm的毛细管尖端拉细作为注射针，将dsRNA溶液从青虾头胸甲基部注入围心腔内，对照组注射蒸馏水。共分为：dsRNA-I-0.4注射组，dsRNA-I-4注射组，dsRNA-II-0.4注射组，dsRNA-II-4注射组和蒸馏水注射组（对照组）.采样分别于注射后第1天、第5天、第9天、第13天和第15天，每个采样点设计3个生物重复，采集卵巢迅速置于液氮中速冻，并放于-80℃冰箱中保存待用。采样前记录每只虾的体重和性腺重（均为湿重）。

3. 青虾GIH基因dsRNA对卵巢发育的影响

性腺指数是评价动物性腺发育状况的重要指标。根据性腺发育指数（Gonad Somatic Index，GSI)计算雌性青虾的GSI。计算公式GSI=性腺湿重/体重湿重×100%。

4. 结果分析 

如图1所示，在注射后第5天开始，dsRNA-I-0.4组和对照组的GSI无显著差异。dsRNA-I-4组和对照组的GSI出现显著差异，处理组的卵巢发育显著快于对照组。在第9天时处理组的GSI约为对照组的2倍。在第13天时dsRNA-I-4组和对照组的GSI仍有显著差异。第15天时，dsRNA-I-4组青虾已排空卵巢，进入消退期，卵巢已完成一轮发育周期，且有71.4% (10/14)的雌虾抱卵，而对照组仍处于发育成熟期。而dsRNA-II的两组处理组和对照组的GSI均没有显著差异。

由以上结果可知，与对照组相比，以每克体重注射4μg的dsRNA的剂量，一次注射青虾GIH基因的dsRNA-I后，青虾卵巢发育的速度显著加快。该干扰作用能持续约13天，在第5天时干扰效果达到最大，在13天后已没有干扰效果。本实验研究采用直接注射合成的dsRNA，与以往研究将合成的dsRNA转化到大肠杆菌中增殖再抽提纯化获得干扰物相比，更加便捷，一样能够达到显著的干扰效果。本实验研究结果表明，本发明提供一种利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的方法可以有效的加速青虾卵巢的发育，为培育青虾性状优良品种提供新的思路和有效手段。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

 <120>  青虾性腺抑制激素基因、加速卵巢发育的试剂盒及方法

 <130> 

 <160>  8    

 <170>  PatentIn version 3.5

 <210>  1

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  1

taatacgact cactataggg tctcaacaaa gctttcacgc                             40

 <210>  2

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  2

taatacgact cactataggg acttgcgtcc gactcgtatt                             40

 <210>  3

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  3

taatacgact cactataggg gataaccatg gctgtgttcg                             40

 <210>  4

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  4

taatacgact cactataggg gtcgaccatg tcttgggagt                             40

 <210>  5

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  5

taatacgact cactataggg ccttccgagt ctttgtcgaa aa                          42

 <210>  6

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  6

taatacgact cactataggg cgactcgtat tatgctcatc gc                          42

 <210>  7

<211>  286

<212>  DNA

<213>  GIH-2

 <400>  7

ttcagaaatt aacatatgtt gcgataacca tggctgtgtt cggaatacta ctagtggatc       60

 agacttcggc ccggtttttg gacgacgagt gtcgaggagt catgggaaat cgtgacttgt      120

 acgaatacgt cgtcaggata tgcgacgact gcgaaaacat attcaggaaa agcaacgttg      180

 gacccaaatg caagaaaaac tgcttctaca acatggactt catgtggtgc gtccatgcca      240

 ctgagcgaac cgacgagctg gaacatctga accgagcgat gagcat                     286

 <210>  8

<211>  382

<212>  DNA

<213>  GIH-2

 <400>  8

gataaccatg gctgtgttcg gaatactact agtggatcag acttcggccc ggtttttgga       60

 cgacgagtgt cgaggagtca tgggaaatcg tgacttgtac gaatacgtcg tcaggatatg      120

 cgacgactgc gaaaacatat tcaggaaaag caacgttgga cccaaatgca agaaaaactg      180

 cttctacaac atggacttca tgtggtgcgt ccatgccact gagcgaaccg acgagctgga      240

 acatctgaac cgagcgatga gcataatacg agtcggacgc aagtgagaat cgcccaaaac      300

 ttcagccatc gagagacaca ctaccgcccc cgccaccgcc gctacgacta atgcctcacc      360

 caactcccaa gacatggtcg ac                                               382

 

 

Claims (7)

1.青虾性腺抑制激素基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

2.由权利要求1所述的青虾性腺抑制激素基因所合成的dsRNA。

3.一种利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的试剂盒，其特征在于：包括有如SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物。

4.根据权利要求3所述的利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的试剂盒，其特征在于：还包括有体外转录合成dsRNA试剂盒。

5.一种非治疗目的的利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的方法，其特征在于，包括如下步骤：第1步、提取青虾的RNA，反转录为cDNA，通过SEQ ID NO.1～2所示的上、下游引物对cDNA进行PCR扩增，得到扩增产物；第2步、将扩增产物转录合成dsRNA；第3步、将dsRNA注射至青虾体内。

6.根据权利要求5所述的非治疗目的的利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的方法，其特征在于：第2步中PCR反应程序如下：94℃ 总变性3 min；30 个循环：94 ℃ 变性 30 s, 55℃ 退火30 s，72℃ 延伸2 min，72 ℃总延伸10 min。

7.根据权利要求5所述的非治疗目的的利用RNA干扰技术加速青虾卵巢发育的方法，其特征在于：第3步的注射剂量是4μg/g。