CN112575000B

CN112575000B - 青虾sdhb基因及其编码的蛋白和应用

Info

Publication number: CN112575000B
Application number: CN202011559209.3A
Authority: CN
Inventors: 金舒博; 傅洪拓; 蒋速飞; 熊贻伟; 乔慧; 张文宜; 龚永生; 吴滟
Original assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Freshwater Fisheries Research Center of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2020-12-25
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2023-07-11
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: CN112575000A

Abstract

本发明公开了青虾SDHB基因及其编码蛋白和应用，SDHB基因全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，由该基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述青虾SDHB基因在青虾雄性分化过程中起到重要作用，且对青虾雄性系统的发育有正调控作用，参与青虾雄性雄发育机制，因此为青虾雄性分化研究提供理论指导和试验思路；(2)本发明所述SDHB基因能够用于青虾全雄群体选育；(3)本发明所述亲虾SDHB基因能用于青虾雄性系统发育调控，延缓雄性系统发育过程，包括精巢和促雄腺，降低种内自交的风险，延缓种质资源退化，提高青虾群体抗逆能力以及个体大小，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和巨大的应用前景。

Description

青虾SDHB基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及青虾的发育调控，具体为青虾SDHB基因及其编码蛋白和应用。

背景技术

青虾，学名日本沼虾(Macrobrachium nipponense)，俗称河虾，隶属十足目(Decapoda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Macrobrachium)，广泛分布于我国各地水域，生长快、适应性强、养殖经济效益高，是我国重要的淡水养殖虾类。在青虾养殖过程中存在明显雌雄生长差异现象，即雄性青虾的生长速度显著快于雌性青虾，在收获季节，雄性青虾的个体大小为雌性青虾的2-2.5倍，因此，青虾全雄群体选育具有良好的经济价值以及应用前景。此外，性早熟也是青虾生产养殖过程中的一个主要问题，其制约着青虾产业的可持续性发展。雄性青虾在生产养殖过程中存在着性快熟的现象，精巢在幼虾变态后25天即可发育成熟，与其他全同胞家系的子代进行交配，近亲繁殖导致种质资源衰退，抗逆能力下降，上市虾个体偏小等问题。因此，全面了解青虾雄性分化以及发育机制，建立青虾性别选育以及性腺发育调控技术刻不容缓。

促雄腺是甲壳类动物特有的内分泌腺，其分泌的激素对甲壳类动物雄性分化及雄性特征维持起重要的作用。先前研究结果表明，在雄性罗氏沼虾中拔除促雄腺，可诱使雄性罗氏沼虾分化出雌性特征；在雌性罗氏沼虾中植入促雄腺，可诱使雌性罗氏沼虾分化出雄性特征。精巢中表达的基因也已证明其在甲壳动物雄性分化以及雄性特征维持方面起重要的作用。基于促雄腺和精巢在甲壳类动物雄性分化及发育过程中的重要作用，对促雄腺中表达基因的研究成为近些年来的热点。环境因素已证明可影响甲壳动物性别相关基因的表达，对甲壳动物性别分化和发育过程起调控作用。现已证明，主要的环境因素包括温度、光照以及营养物质等。

现有技术中，SDHB基因已证明参与氧化磷酸化和三羧酸循环过程，为靶组织提供能量支持。SDHB基因在日本刺参中证明参与免疫应答机制，对抵抗亮狐菌的感染起重要的作用。

RNAi(RNA interference,RNAi)是一种广泛存在于真核生物中的高效的序列特异性基因剔除技术。RNAi是由不同来源和长度的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)前体所诱发的，可以有效地抑制靶基因RNA的翻译。近年开始在甲壳动物基因功能研究中使用。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，阐明SDHB基因在青虾雄性分化及发育过程中的重要作用，为青虾雄性分化及其发育机制的研究提供理论依据和思路。本申请从青虾繁殖季节和非繁殖季节促雄腺和精巢转录组文库中筛选得到编码SDHB基因的mRNA序列以及蛋白质序列。SDHB基因的表达在繁殖期和非繁殖期精巢和促雄腺中的表达呈显著性差异，因此推测该基因可能参与青虾雄性分化和发育过程。鉴于此，本发明提供了青虾SDHB基因及其编码蛋白和应用。

技术方案：青虾SDHB基因，SDHB基因全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。SEQ IDNO:1序列如下：

CACCGGACGGCCAGACCTAAAAGGCGGAGCGGAGGCCGTTTCATCCCCAGAAAGAATCTGAGCGAGTGTTTGCGATGGCGAGTGTCACCAGGGCTTTAACCCCGGGGAAGTTTGGCAGTGCCTGCCGTCTGATTGCTATACGCTCCCAAAGTACAGCAGCTGCACCAGCAGAGCAAGTGGAATCCGTACGGGAGAAACGACTCAAGAAATTCACAGTCTACCGATGGGATCCCGAGAAGCAGGGAGACAAGCCTCACATGCAGACGTACGAAGTAGATCTCAATGCTTGTGGACCCATGGTTCTTGATGCCTTGTTGAAAATCAAGAATGAGATCGATCCTTCTCTGACTTTCCGAAGATCATGCCGTGAAGGTATCTGTGGTTCCTGTTCTATGAACATTGGTGGTGTGAACACCCTAGCTTGTATCAGCAAAATTGACACCAACCTGACCAAGGCTACGAAGATCTATCCTCTACCTCACATGTATGTGATCAAAGATTTAGTCCCTGACATGAACAACTTTTACGAGCAGTACAGATCAATCCAGCCTTGGTTACAGCGGGACGATGGTCTTCAGCCTGGAGACAAGCAGTACCTTCAGTCTGTTGATGACCGCAAGAAGTTGGATGGTCTATACGAATGCATCCTTTGCGCTTGCTGTTCTACTTCTTGCCCATCATATTGGTGGAATGGAGACAAGTACCTGGGACCCGCTGTGCTCATGCAGGCCTACCGTTGGATCATCGACTCTCGAGATGAAATGTCTGAGGAACGTCTGAAAAGACTGCGCGATCCTTTCTCAGTTTACCGATGCCACACTATCATGAACTGCACAAAGACTTGCCCAAAGGTGAGAGAAATGGCAATTTATACCCTGTGATGCTGGTACTATTCTTGTTTTGCCAATGAAGAGGTCTTGTTGTATAAATGTGAAACCAGATCAACCAGTTTACAGACTAATGTGGACTGGGGAAATGGGGCCTTAACCCAGGTAGAGCCATTGCTGAAGTGAAGAAGCTGTTGTCAGGAATTGCCAAGAAGGGAGACCCCGGTCTAGATGCATTAGGTGCTGCTAATTAATTTTTAATGATTTTATTTTTATTTTTGTTTCTCAAACCGTACACACGTGACACTAATATCCGGGTAAATTGTTCTATTTTATTGTAATTTATTTTAGACATCTTGATTAGCTAGAATTGTTTTCTGTGCGTATAATTATGTGCATACAGTGTAGAGGGAAGTTACTGTACTCCCCTAAAAAAAAAAA。

优选的，SDHB基因全长cDNA序列克隆的特异性正向引物为：

3SDHB-F1(SEQ ID NO:3)：AAGTACCTGGGACCCGCTGT；和

3SDHB-F2(SEQ ID NO:4)：AAAGACTGCGATCCTTTCTC；

特异性反向引物为：

5SDHB-R1(SEQ ID NO:5)：TCCCTGCTTCTCGGGATCCCA；和

5SDHB-R2(SEQ ID NO:6)：TCCACTTGCTCTGCTGCTGCA。

优选的，SDHB基因的荧光定量PCR引物为：

SDHB-RTF(SEQ ID NO:7)：ACCGCAAGAAGTTGGATGGT；

SDHB-RTR(SEQ ID NO:8)：TCGATGATCCAACGGTAGGC。

优选的，SDHB基因的原位杂交试验中，正义原位杂交探针为(SEQ ID NO:9)：GGAGCGTATAGCAATCAGACGGCAGGCACTG，反义原位杂交探针为(SEQ ID NO:10)：CAGTGCCTGCCGTCTGATTGCTATACGCTCC。

优选的，SDHB基因的RNAi实验引物为：

SDHB-RTF(SEQ ID NO:11)：

TAATACGACTCACTATAGGGACCAGCAGAGCAAGTGGAAT；

SDHB-RTR(SEQ ID NO:12)：

TAATACGACTCACTATAGGGCCAAGGCTGGATTGATCTGT。

由青虾SDHB基因编码的蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQID NO:2序列如下：

MASVTRALTPGKFGSACRLIAIRSQSTAAAPAEQVESVREKRLKKFTVYRWDPEKQGDKPHMQTYEVDLNACGPMVLDALLKIKNEIDPSLTFRRSCREGICGSCSMNIGGVNTLACISKIDTNLTKATKIYPLPHMYVIKDLVPDMNNFYEQYRSIQPWLQRDDGLQPGDKQYLQSVDDRKKLDGLYECILCACCSTSCPSYWWNGDKYLGPAVLMQAYRWIIDSRDEMSEERLKRLRDPFSVYRCHTIMNCTKTCPKVREMAIYTL。

以上任一所述青虾SDHB基因在调控青虾雄性分化过程中的应用。

以上任一所述青虾SDHB基因在调控青虾雄性发育过程中的应用。

以上任一所述青虾SDHB基因在青虾全雄群体选育中的应用。

以上任一所述青虾SDHB基因在青虾雄性系统发育调控中的应用。

有益效果：(1)本发明所述青虾SDHB基因在青虾雄性分化过程中的重要作用，为青虾雄性分化研究提供理论指导和试验思路；(2)本发明所述青虾SDHB基因对青虾雄性系统的发育有正调控作用，参与青虾雄性雄发育机制，为青虾雄性分化研究提供理论指导和试验思路；(3)本发明所述SDHB基因能够用于青虾全雄群体选育，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和巨大的应用前景；(4)本发明所述亲虾SDHB基因能用于青虾雄性系统发育调控，延缓雄性系统发育过程，包括精巢和促雄腺，降低种内自交的风险，延缓种质资源退化，提高青虾群体抗逆能力以及个体大小，在青虾养殖过程中具有显著的经济价值和巨大的应用前景。

附图说明

图1是青虾SDHB基因在不同成体组织中的相对表达量结果图，图中大写字母代表显著性差异分析，字母不同代表组织间的表达存在着显著性差异；

图2是青虾SDHB基因在不同发育时期过程中的相对表达量结果图，其中，L为出膜后发育时期，PL为变态后发育时期，图中大写字母代表显著性差异分析，字母不同代表组织间的表达存在着显著性差异；

图3是在雄性青虾中，外源性注射SDHB-dsRNA后，对雄性青虾内源SDHB基因的表达量的影响，图中大写字母代表显著性差异分析，字母不同代表组织间的表达存在着显著性差异；

图4是在雄性青虾中，外源性注射SDHB-dsRNA后，对雄性青虾内源IAG基因的表达量的影响，图中大写字母代表显著性差异分析，字母不同代表组织间的表达存在着显著性差异；

图5是在雄性青虾中，外源性注射SDHB-dsRNA后，对青虾精巢发育的影响，其中，SG为精原细胞，SC为精母细胞，S为精子，CT为连接组织。

图6是在雄性青虾中，外源性注射SDHB-dsRNA后，对青虾促雄腺发育的影响，其中EB为结缔组织，Ⅰ为促雄腺Ⅰ期细胞，Ⅱ为促雄腺Ⅱ期细胞，Ⅲ为促雄腺Ⅲ期细胞。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本研究的目的就是通过用SDHB-dsRNA注入雄性青虾体内，研究该基因在dsRNA刺激下的表达变化，与IAG基因的调控关系以及对精巢和促雄腺发育的影响，阐释dsRNA对青虾精巢和促雄腺发育的调节机制，为利用SDHB-dsRNA制备全雄群体以及干扰技术抗青虾性快熟的实用化提供新思路和参考依据。

实施例1：青虾SDHB基因全长CDNA的获得

总RNA提取：选取5只健康成熟的雄性青虾精巢，迅速放入盛有液氮的预冷研钵中，迅速的研磨。总RNA的提取使用Takara公司的RNAiso Plus提取试剂结合传统的酚仿抽提法进行，提取方法参照使用说明书。经过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，分光光度计分析该样品OD260/280比值在1.8～2.0之间，并测定RNA的浓度。

从青虾促雄腺转录组中获得SDHB基因cDNA中间片段序列。根据SDHB基因cDNA中间片段序列，设计特异性正向引物3SDHB-F1(SEQ ID NO:3)、3SDHB-F2(SEQ ID NO:4)；和反向引物5SDHB-R1(SEQ ID NO:5)、5SDHB-R2(SEQ ID NO:6)分别进行cDNA 3’和5’快速扩增，操作步骤按TaKaRa 3’-RACE和TaKaRa5’-RACE试剂盒说明书进行。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。采用上海生工生物工程有限公司(Sangon)的柱式DNA胶回收试剂盒进行目的片段的回收，将产物连接到pMD18-T载体(Takara)，并转化入大肠杆菌DH5α，进行蓝白斑筛选，挑取单克隆白斑扩增培养后，将插入目的片段的阳性克隆送至上海铂尚生物公司进行测序分析。将得到的几段产物进行拼接，得到青虾SDHB基因全长cDNA序列。经过序列比对显示，青虾SDHB基因与其他物种的同源性为75％，但覆盖度达到98％。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例2：青虾SDHB基因不同组织和不同发育时期表达

以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用NCBI在线引物设计软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计制备青虾SDHB基因的荧光定量PCR的引物(SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8)。从健康成熟的青虾中获取精巢、卵巢、肝胰腺、肌肉、眼柄、腮、脑以及心脏等组织(N≥3)，并将组织保存在RNA保存液中(Takara)。从全同胞家系青虾幼虾中根据发育过程每隔5天分别取样(N≥3)。取按实施例1所述方法提取各组织总RNA并使用iScriptTM cDNA Synthesis Kit perfect Real Time(Bio-Rad)试剂盒将总RNA反转成cDNA，采用Bio-Rad iCycler iQ5荧光定量PCR分析系统检测SDHB基因在青虾各组织中的相对表达量。

实施例3：青虾SDHB基因dsRNA的合成

以SEQ ID NO:1核苷酸序列为依据，在开放阅读框以内采用NCBI在线dsRNA引物设计软件(http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl)设计制备双链RNA的引物(SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12)，根据Transcript AidTM T7 High YieldTranscription kit(Fermentas,Inc.,USA)试剂盒说明进行体外转录合成dsRNA。将制备好的dsRNA溶解在DEPC水中，测定其浓度并在1.5％琼脂糖凝胶上检测其纯度。将上述dsRNA溶液以4μg/g的剂量注射到雄性青虾的围心腔内。对照组注射相同体积的GFP作为阴性对照。在注射后的第1、7、14天分别收集精巢和促雄腺样品(N≥3)，并将组织保存在RNA保存液中(Takara)用于SDHB和IAG基因表达量验证。同时在注射后的第1、4、7、10/14天分别收集精巢和促雄腺样品(N≥3)用于组织学切片观察。最后提取各样品的总RNA并反转成cDNA，采用Real Time PCR检测SDHB和IAG基因相对于对照组的表达量变化，以此来分析SDHB基因干扰的效率以及是否与IAG基因具有调控关系。组织学切片用于观察注射青虾SDHB dsRNA后，实验组精巢和促雄腺相较于对照组组织学变化。

实验结果

如图1所示，青虾SDHB基因在精巢中的表达量显著高于其他检测的基因，并且呈显著性差异(P<0.05),因此推测该基因可能在青虾精巢发育过程中起重要的作用。

如图2所示，总体来说，SDHB基因在变态后发育时期的表达量高于其在出膜后发育时期的表达量，同时在变态后第25天雄性幼虾中的表达量显著高于雌性幼虾。通过组织学观察已经证明，变态后第5天到第25天为青虾性别分化和性腺发育的关键时期，这一研究结果表明，该基因在青虾雄性分化及其发育过程中起重要的作用。青虾全雄育种技术路线应该为通过基因编辑手段在雄性青虾中敲除雄性分化相关基因的表达，从而使雄性青虾性逆转成“假雌虾”(遗传特征为雄性，生理特征为雌性)，再用正常的雄性与“假雌虾”进行交配，从而获得青虾全雄群体。本申请已证明，SDHB基因参与青虾雄性分化过程，为青虾雄性分化相关基因，可用于“假雌虾”的繁殖、生产，也为后续将该方法应用到全雄虾生产实践提供指导意义。

如图3所示，相对于对照组的表达量，精巢中SDHB基因的表达量在注射后第1天下降了22％，在第7天和第14天分别下降了95％和85％，这一结果表明，本申请优化的青虾SDHB dsRNA可有效的敲降SDHB基因在青虾中的表达量。

如图4所示，相对于对照组的表达量，促雄腺中IAG基因的表达量在注射后第1天下降了20％，在第7天和第14天分别下降了57％和48％。IAG基因在甲壳类物种中已证明，对甲壳类动物雄性分化以及雄性特征维持方面起重要的作用。这一结果表明，青虾SDHB基因对IAG基因具有正调控作用。

图5所示，在对照组精巢中，主要的细胞类型为精子，精原细胞和精母细胞的数量较少。相较于对照组，实验组精巢中精子的数量随着干扰时间的增加而减少，在干扰后的第14天，实验组精巢中基本观察不到精子的存在，而精原细胞和精母细胞的数量随着干扰时间的增加而增多，结果表明，外源注射的SDHB-dsRNA可以有效的延缓青虾精巢发育过程，为解决青虾精巢性快熟这一生产难题提供了理论依据，也为后续将该方法应用到生产实践提供指导意义。

图6所示，在对照组促雄腺中，促雄腺Ⅰ期细胞、促雄腺Ⅱ期细胞、促雄腺Ⅲ期细胞的数量大致相同，无显著性差异。相较于对照组，实验组促雄腺中促雄腺Ⅲ期细胞的数量随着干扰时间的增加而显著下降，在干扰后的第14天，实验组促雄腺中促雄腺Ⅲ期细胞的数量显著少于促雄腺Ⅰ期细胞和促雄腺Ⅱ期细胞的数量，组织学切片结果显示青虾促雄腺的发育对青虾精巢的发育具有调控作用。结果表明，外源注射的SDHB-dsRNA可以有效的延缓青虾促雄腺发育过程，从而减少雄性激素的分泌量，延缓青虾精巢的过程，为解决青虾精巢性快熟这一生产难题提供了理论依据，也为后续将该方法应用到生产实践提供指导意义。

序列表

<110> 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心

<120> 青虾SDHB基因及其编码的蛋白和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1268

<212> DNA

<213> 青虾(freshwater shrimp)

<400> 1

caccggacgg ccagacctaa aaggcggagc ggaggccgtt tcatccccag aaagaatctg 60

agcgagtgtt tgcgatggcg agtgtcacca gggctttaac cccggggaag tttggcagtg 120

cctgccgtct gattgctata cgctcccaaa gtacagcagc tgcaccagca gagcaagtgg 180

aatccgtacg ggagaaacga ctcaagaaat tcacagtcta ccgatgggat cccgagaagc 240

agggagacaa gcctcacatg cagacgtacg aagtagatct caatgcttgt ggacccatgg 300

ttcttgatgc cttgttgaaa atcaagaatg agatcgatcc ttctctgact ttccgaagat 360

catgccgtga aggtatctgt ggttcctgtt ctatgaacat tggtggtgtg aacaccctag 420

cttgtatcag caaaattgac accaacctga ccaaggctac gaagatctat cctctacctc 480

acatgtatgt gatcaaagat ttagtccctg acatgaacaa cttttacgag cagtacagat 540

caatccagcc ttggttacag cgggacgatg gtcttcagcc tggagacaag cagtaccttc 600

agtctgttga tgaccgcaag aagttggatg gtctatacga atgcatcctt tgcgcttgct 660

gttctacttc ttgcccatca tattggtgga atggagacaa gtacctggga cccgctgtgc 720

tcatgcaggc ctaccgttgg atcatcgact ctcgagatga aatgtctgag gaacgtctga 780

aaagactgcg cgatcctttc tcagtttacc gatgccacac tatcatgaac tgcacaaaga 840

cttgcccaaa ggtgagagaa atggcaattt ataccctgtg atgctggtac tattcttgtt 900

ttgccaatga agaggtcttg ttgtataaat gtgaaaccag atcaaccagt ttacagacta 960

atgtggactg gggaaatggg gccttaaccc aggtagagcc attgctgaag tgaagaagct 1020

gttgtcagga attgccaaga agggagaccc cggtctagat gcattaggtg ctgctaatta 1080

atttttaatg attttatttt tatttttgtt tctcaaaccg tacacacgtg acactaatat 1140

ccgggtaaat tgttctattt tattgtaatt tattttagac atcttgatta gctagaattg 1200

ttttctgtgc gtataattat gtgcatacag tgtagaggga agttactgta ctcccctaaa 1260

aaaaaaaa 1268

<210> 2

<211> 268

<212> PRT

<213> 青虾(freshwater shrimp)

<400> 2

Met Ala Ser Val Thr Arg Ala Leu Thr Pro Gly Lys Phe Gly Ser Ala

1 5 10 15

Cys Arg Leu Ile Ala Ile Arg Ser Gln Ser Thr Ala Ala Ala Pro Ala

20 25 30

Glu Gln Val Glu Ser Val Arg Glu Lys Arg Leu Lys Lys Phe Thr Val

35 40 45

Tyr Arg Trp Asp Pro Glu Lys Gln Gly Asp Lys Pro His Met Gln Thr

50 55 60

Tyr Glu Val Asp Leu Asn Ala Cys Gly Pro Met Val Leu Asp Ala Leu

65 70 75 80

Leu Lys Ile Lys Asn Glu Ile Asp Pro Ser Leu Thr Phe Arg Arg Ser

85 90 95

Cys Arg Glu Gly Ile Cys Gly Ser Cys Ser Met Asn Ile Gly Gly Val

100 105 110

Asn Thr Leu Ala Cys Ile Ser Lys Ile Asp Thr Asn Leu Thr Lys Ala

115 120 125

Thr Lys Ile Tyr Pro Leu Pro His Met Tyr Val Ile Lys Asp Leu Val

130 135 140

Pro Asp Met Asn Asn Phe Tyr Glu Gln Tyr Arg Ser Ile Gln Pro Trp

145 150 155 160

Leu Gln Arg Asp Asp Gly Leu Gln Pro Gly Asp Lys Gln Tyr Leu Gln

165 170 175

Ser Val Asp Asp Arg Lys Lys Leu Asp Gly Leu Tyr Glu Cys Ile Leu

180 185 190

Cys Ala Cys Cys Ser Thr Ser Cys Pro Ser Tyr Trp Trp Asn Gly Asp

195 200 205

Lys Tyr Leu Gly Pro Ala Val Leu Met Gln Ala Tyr Arg Trp Ile Ile

210 215 220

Asp Ser Arg Asp Glu Met Ser Glu Glu Arg Leu Lys Arg Leu Arg Asp

225 230 235 240

Pro Phe Ser Val Tyr Arg Cys His Thr Ile Met Asn Cys Thr Lys Thr

245 250 255

Cys Pro Lys Val Arg Glu Met Ala Ile Tyr Thr Leu

260 265

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagtacctgg gacccgctgt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaagactgcg atcctttctc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccctgcttc tcgggatccc a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccacttgct ctgctgctgc a 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accgcaagaa gttggatggt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcgatgatcc aacggtaggc 20

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggagcgtata gcaatcagac ggcaggcact g 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagtgcctgc cgtctgattg ctatacgctc c 31

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taatacgact cactataggg accagcagag caagtggaat 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taatacgact cactataggg ccaaggctgg attgatctgt 40

Claims

1.青虾SDHB基因，其特征在于，SDHB基因全长cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的青虾SDHB基因，其特征在于，SDHB基因全长cDNA序列克隆的特异性正向引物为：3SDHB- F1、SEQ ID NO:3和3SDHB- F2、SEQ ID NO:4，特异性反向引物为：5 SDHB-R1、SEQ ID NO:5和5 SDHB-R2、SEQ ID NO:6。

3.根据权利要求1所述的青虾SDHB基因，其特征在于，SDHB基因的荧光定量PCR引物为：SDHB-RTF、SEQ ID NO:7，SDHB-RTR、SEQ ID NO:8。

4.根据权利要求1所述的青虾SDHB基因，其特征在于，SDHB基因的原位杂交试验中，正义原位杂交探针为SEQ ID NO:9，反义原位杂交探针为SEQ ID NO:10。

5.根据权利要求1所述的青虾SDHB基因，其特征在于，SDHB基因的RNAi实验引物为：SDHB-RTF，序列为SEQ ID NO:11；SDHB-RTR ，序列为SEQ ID NO:12。

6.由权利要求1-5任一所述青虾SDHB基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

7.权利要求1-5任一所述青虾SDHB基因在调控青虾雄性分化过程中的应用。

8.权利要求1-5任一所述青虾SDHB基因在调控青虾雄性发育过程中的应用。

9.权利要求1-5任一所述青虾SDHB基因在青虾全雄群体选育中的应用。

10.权利要求1-5任一所述青虾SDHB基因在青虾雄性系统发育调控中的应用。